9-固定化酶-1&2
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固定化酶
固定化酶的制备及应用摘要：本文主要从酶的固定化载体、固定化方法等方面介绍了固定化酶制备中的研究进展情况，并且从医药、食品、环保、等方面其在其中的新应用出发，对固定化酶在新领域中的应用作了综述，给固定化酶研究的发展前景进行了展望，并且指出了今后酶固定化研究的主要方向是多酶的固定化及制备高活性、高负载、高稳定性的固定化酶。
固定化酶是20世纪60年代发展起来的一项技术。
以往用的酶绝大多数是水溶性性的酶。
这些水溶性的酶催花结束后，极难回收，因而阻碍了酶工业的进一步发展。
60年代后，在美学研究领域内涌现出固定化酶，最早被称为“水不容酶”或“固相酶”，此技术将水不溶性的自然酶与不溶性载体相结合，成为不溶于水的酶的衍生物。
固定化酶（immobilized enzyme）这个术语是在1971 年酶工程会议上被推荐使用的。
利用固定化技术，解决了酶应用过程中的很多问题，为酶的应用开辟了新的前景。
如可使所使用的酶、细胞能反复使用，使产物分离提取容易，并在生产工艺上可以实现连续化和自动化，故在20世纪70年代后得到迅速发展。
其新的功能和新的应用正在迅速不断地扩展，是一项研究领域宽广、应用前景极为引人瞩目的新研究领域和新技术。
1固定化酶的优缺点1.1 优点（1）同一批固定化酶能在工艺流程中重复多次地使用；（2）固定化后，和反应物分开，有利于控制生产过程，同时也省去了热处理使酶失活的步骤；（3）稳定性显著提高；（4）可长期使用，并可预测衰变的速度；（5）提供了研究酶动力学的良好模型。
（6）酶的使用效率提高，产物得率提高，产品质量有保证，成本低。
1.2缺点（1）酶固定化时酶的活力有所损失，同时也增加了固定化的成本。
（2）比较适应水溶性底物和小分子底物。
（3）不适于多酶反应，特别是需要辅酶的反应。
2.固定化酶的制备原则（1 ）必须注意维持酶的催化活性及专一性。
酶的催化反应取决于酶本身蛋白质分子所特有的高级结构和活性中心，为了不损害酶的催化活性及专一性，酶在固定化状态下发挥催化作用时，既需要保证其高级结构，又要使构成活性中心的氨基酸残基不发生变化。
固定化酶
酶
载体
2.共价结合法
又称载体偶联法，是酶表面上的官能团 与固相支持物表面的反应基团之间形成共价 连接，从而固定化酶。该法的特点是：细胞 或酶与载体之间的连接键很牢固，使用过程 不会脱离，稳定性良好，但反应剧烈、操作 复杂、控制条件苛刻。
连接键
酶 固相支持物
共价结合法的结合图
2.1 酶蛋白的功能基团
4.包埋法
包埋法：是将聚合物的单体与酶溶液混合， 在借助于聚合助进剂（包括交联剂）的作用进 行聚合，酶被包埋在聚合物中以达到固定化。 这种方法既操作简单又不会明显影响生物活性， 是一种比较理想的方法，目前应用最多。但在 该方法中，使用的包埋材料（载体）往往会在 一定程度上阻碍底物和氧的扩散，影响作用较 高。
酶蛋白分子中可供共价结合与载体的功能 基团有：酶蛋白分子N端的a-氨基或赖氨酸残 基的ε-氨基；酶蛋白分子C端羧基、天冬氨酸 的β-羧基或谷氨酸的γ-羧基；肽键中半胱氨酸 的巯基；丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的羟基；苯 丙氨酸和酪氨酸的苯环；组氨酸的咪唑基；色 氨酸的吲哚基等。 被偶联的基团还应是酶活性的非必须基团。
我国独创的使用对β-硫酸酯乙砜基苯胺（ABSE）-多糖（纤维 素、葡聚糖、交联琼脂糖、交联琼脂及淀粉）属于此类载体。在碱 性条件下用对β-硫酸酯乙砜基苯胺（ABSE）活化多糖，制得的醚键 连接的乙砜基苯胺衍生物，经重氮化后偶联酶。
3.交联固定法
交联固定法：是利用双功能或多功能试剂 直接与酶表面的反应基团发生反应，使其彼此 交联形成交联形成网状结构的固定化细胞或酶。 由于交联固定化化学反应比较激烈，固定化微 生物和酶的活力在多数情况下较脆弱。
酶的固定化技术
Contents
酶的固定化的产生背景
酶的固定化的概念 酶的固定化的制备原则
《固定化酶》课件
《固定化酶》课件
目
CONTENCT
录
• 酶的介绍 • 固定化酶的原理与技术 • 固定化酶的制备与表征 • 固定化酶的实际应用 • 固定化酶的发展前景与挑战
01
酶的介绍
酶的定义与特性
酶的定义
酶是由生物体产生的一种具有催化作 用的有机物，能够加速化学反应的速 率而自身不发生化学变化。
酶的特性
高效性、专一性和作用条件温和的特 性。
在化学工业中的应用
固定化酶在化学工业中广泛应用于有机合成和手性合成。通过固定化酶技术，可 以将酶固定在载体上，实现高效、环保的有机合成，降低生产成本和环境污染。
固定化酶还可以用于药物的生产和研发，通过酶促反应实现药物的合成和修饰， 提高药物的疗效和降低副作用。
在环境保护中的应用
固定化酶在环境保护中广泛应用于废水处理和污染物降解。通过固定化酶技术，可以将酶固定在载体上，实现高效、稳定的 废水处理和污染物降解，降低环境污染和生态风险。
固定化酶的技术方法
总结词
固定化酶的技术方法
详细描述
固定化酶的技术方法主要包括吸附法、包埋法、交联法和共价结合法等。这些方法各有特点，可根据不同的应用 需求选择适合的方法。
固定化酶的应用领域
总结词
固定化酶的应用领域
详细描述
固定化酶的应用领域广泛，包括生物传感器、生物反应器、药物制造、环境保护等领域。通过固定化 酶技术，可以实现酶的重复利用，提高反应效率，降低生产成本，为相关领域的发展提供有力支持。
智能化
通过与人工智能技术的结合，实现固定化酶的智能 化调控和优化，提高酶的利用效率和生产效益。
固定化酶面临的挑战
80%
稳定性问题
固定化酶在使用过程中可能会受 到环境因素的影响，如温度、pH 值等，导致酶的活性降低或失活 。
目
CONTENCT
录
• 酶的介绍 • 固定化酶的原理与技术 • 固定化酶的制备与表征 • 固定化酶的实际应用 • 固定化酶的发展前景与挑战
01
酶的介绍
酶的定义与特性
酶的定义
酶是由生物体产生的一种具有催化作 用的有机物，能够加速化学反应的速 率而自身不发生化学变化。
酶的特性
高效性、专一性和作用条件温和的特 性。
在化学工业中的应用
固定化酶在化学工业中广泛应用于有机合成和手性合成。通过固定化酶技术，可 以将酶固定在载体上，实现高效、环保的有机合成，降低生产成本和环境污染。
固定化酶还可以用于药物的生产和研发，通过酶促反应实现药物的合成和修饰， 提高药物的疗效和降低副作用。
在环境保护中的应用
固定化酶在环境保护中广泛应用于废水处理和污染物降解。通过固定化酶技术，可以将酶固定在载体上，实现高效、稳定的 废水处理和污染物降解，降低环境污染和生态风险。
固定化酶的技术方法
总结词
固定化酶的技术方法
详细描述
固定化酶的技术方法主要包括吸附法、包埋法、交联法和共价结合法等。这些方法各有特点，可根据不同的应用 需求选择适合的方法。
固定化酶的应用领域
总结词
固定化酶的应用领域
详细描述
固定化酶的应用领域广泛，包括生物传感器、生物反应器、药物制造、环境保护等领域。通过固定化 酶技术，可以实现酶的重复利用，提高反应效率，降低生产成本，为相关领域的发展提供有力支持。
智能化
通过与人工智能技术的结合，实现固定化酶的智能 化调控和优化，提高酶的利用效率和生产效益。
固定化酶面临的挑战
80%
稳定性问题
固定化酶在使用过程中可能会受 到环境因素的影响，如温度、pH 值等，导致酶的活性降低或失活 。
固定化酶技术
1.4交联法 交联法是用多功能试剂进行酶蛋白 之间的交联，使酶分子和多功能试 剂之间形成共价键，得到三向的交 联网架结构，除了酶分子之间发生 交联外，还存在着一定的分子内交 联。多功能试剂制备固定化酶方法 可分为：(1) 单独与酶作用；( 2) 酶 吸附在载体表面上再经受交联；( 3) 多功能团试剂与载体反应得到有功 能团的载体，再连接酶。交联剂的 种类很多，最常用的是戊二醛，其 他的还有异氰酸衍生物、双偶氮二 联苯胺、N，N-乙烯马来酰亚胺等。 交联法的优点是酶与载体结合牢固， 稳定性较高；缺点是有的方法固定 化操作较复杂，进行化学修饰时易 造成酶失活。
用固定化酶处理受污染水体中的农药也取 得了很好的效果。
用聚丙烯负载二氧化钛膜固定农药降解酶， 降解农药甲基对硫磷。研究发现，甲基对 硫磷在30 min 内降解了70%以上。尤其等 以壳聚糖为载体，戊二醛为交联剂，固定 化真菌漆酶对农药氯苯嘧啶醇进行降解。 研究认为，在酸性条件下，固定化漆酶对 氯苯嘧啶醇具有良好的降解作用。
4.2.3 其他应用
CO2是一种重要的温室气体。目前全球每 年排放的数十亿吨CO2需要得到妥善的处 置。固定化酶技术在固定CO2方面也取得 了成果。据报道，以工业固体废弃物为原 料， 利用固定化碳酸酐酶和超重力强化反 应可得到CO2的有效固定 固定化酶技术在清洁生产领域具有潜在的 应用价值。固定化的木聚糖酶和漆酶用于 纸浆漂白， 可以避免产生传统造纸工艺过 程中用氯漂白产生的难以生物降解的各类 氯代有机物。
包埋固定化法是把酶固定聚合物材料的格子结构或微囊结构等 多空载体中，而底物仍能渗入格子或微囊内与酶相接触。这个方法 比较简便，酶分子仅仅是被包埋起来，生物活性被破坏的程度低， 但此法对大分子底物不适用。
(1)网格型 将酶包埋在凝胶细微网 格中，制成一定形状的 固定化酶，称为网格型 包埋法。也称为凝胶包 埋法。
固定化酶简述 PPT课件 通用
固定化酶的应用固定能源开发化学分析生物工程临床诊断医学环境保护酶的固定化及应用研究已得到长足进展开发新型固定化技术进传统固定化方法和注重天然高分子载体改性是酶固定化研究的主要趋生物学及生物工程医学及生命科学仍是固定化酶应用的重要场合适于化学化工及环境科学领域应用的固定化酶具有生态环境材料的鲜明特应给予足够重视
不足：由于包埋 优点：酶不参加化
学反应，整体结 构保持不变，酶 的催化活性得到 很好保留。
物或半透膜具 有一定的空间 或立体阻碍作 用，因此对一 些反应不适用
• 形式较物理法少 • 过程较物理法复杂 • 与物理法比较可形成相对 分子质量更大、不溶性的 固定化酶
传统固定化技术的改进
• 基于传统载体材料的各自优点与不足，通 过改性充分发挥其优势并弥补不足，将会 显著提高所得固定化酶的性能，已成为固 定化酶载体材料研究的主要内容之一。 • 经过近几十年的不断发展，已经产生了很 多制备载体固定化酶的新方法。
水不溶性大分子载体结合或把酶包 埋在水不溶性凝胶或半透膜的微囊 体中制成的。
┌─┬─┬─┬─┬─┬─┬─┬─┬─┬─┐ │景┆等┆生┆的┆酶┆于┆便┆制┆系┆稳│ │。┆方┆产┆酶┆是┆自┆于┆，┆统┆定│ │ ┆面┆、┆应┆近┆动┆运┆能┆中┆性│ │ ┆有┆化┆用┆十┆化┆输┆反┆分┆增│ │ ┆诱┆学┆技┆余┆生┆和┆复┆离┆加│ │ ┆人┆分┆术┆年┆产┆贮┆多┆，┆，│ │ ┆的┆析┆，┆发┆。┆存┆次┆且┆易│ │ ┆应┆和┆在┆展┆固┆，┆使┆易┆从│ │ ┆用┆医┆工┆起┆定┆有┆用┆于┆反│ │ ┆前┆药┆业┆来┆化┆利┆。┆控┆应│ └─┴─┴─┴─┴─┴─┴─┴─┴─┴─┘
简讯
我国自主开发成功固定化酶技术
“ 十五” 国家科技攻关计划’ 纳米材料 技术及应用开发 ’ 延续项目——纳米结构固 定化酶组装技术的开发，上 周在北京通过了 中国石油和化学工业协会、 中国钢协粉末冶 金协会共同组织的专家验收。这一成果可望 使我国 摆脱依赖进口载体生产固定化青霉素 酰化酶催化剂的被动局面，促进我国固定化 酶技术提升和抗生素产业可持续发 展。
不足：由于包埋 优点：酶不参加化
学反应，整体结 构保持不变，酶 的催化活性得到 很好保留。
物或半透膜具 有一定的空间 或立体阻碍作 用，因此对一 些反应不适用
• 形式较物理法少 • 过程较物理法复杂 • 与物理法比较可形成相对 分子质量更大、不溶性的 固定化酶
传统固定化技术的改进
• 基于传统载体材料的各自优点与不足，通 过改性充分发挥其优势并弥补不足，将会 显著提高所得固定化酶的性能，已成为固 定化酶载体材料研究的主要内容之一。 • 经过近几十年的不断发展，已经产生了很 多制备载体固定化酶的新方法。
水不溶性大分子载体结合或把酶包 埋在水不溶性凝胶或半透膜的微囊 体中制成的。
┌─┬─┬─┬─┬─┬─┬─┬─┬─┬─┐ │景┆等┆生┆的┆酶┆于┆便┆制┆系┆稳│ │。┆方┆产┆酶┆是┆自┆于┆，┆统┆定│ │ ┆面┆、┆应┆近┆动┆运┆能┆中┆性│ │ ┆有┆化┆用┆十┆化┆输┆反┆分┆增│ │ ┆诱┆学┆技┆余┆生┆和┆复┆离┆加│ │ ┆人┆分┆术┆年┆产┆贮┆多┆，┆，│ │ ┆的┆析┆，┆发┆。┆存┆次┆且┆易│ │ ┆应┆和┆在┆展┆固┆，┆使┆易┆从│ │ ┆用┆医┆工┆起┆定┆有┆用┆于┆反│ │ ┆前┆药┆业┆来┆化┆利┆。┆控┆应│ └─┴─┴─┴─┴─┴─┴─┴─┴─┴─┘
简讯
我国自主开发成功固定化酶技术
“ 十五” 国家科技攻关计划’ 纳米材料 技术及应用开发 ’ 延续项目——纳米结构固 定化酶组装技术的开发，上 周在北京通过了 中国石油和化学工业协会、 中国钢协粉末冶 金协会共同组织的专家验收。这一成果可望 使我国 摆脱依赖进口载体生产固定化青霉素 酰化酶催化剂的被动局面，促进我国固定化 酶技术提升和抗生素产业可持续发 展。
《酶的固定化》 说课稿
《酶的固定化》说课稿尊敬的各位评委老师：大家好！今天我说课的题目是《酶的固定化》。
下面我将从教材分析、学情分析、教学目标、教学重难点、教法与学法、教学过程以及教学反思这几个方面来展开我的说课。
一、教材分析《酶的固定化》是生物工程领域中的一个重要内容，通常在高中生物学选修教材或大学生物技术相关课程中出现。
本节课的内容是在学生已经学习了酶的相关知识，如酶的特性、作用机制等基础上进行的深入拓展。
教材通过介绍酶固定化的方法、优点以及应用实例，让学生了解酶固定化技术在现代生物技术产业中的重要地位和作用。
这不仅有助于学生完善对酶的认识，也为后续学习细胞工程、发酵工程等相关知识奠定了基础。
二、学情分析学生在之前的学习中已经对酶有了一定的了解，知道酶具有高效性、专一性和作用条件温和等特点。
但对于酶的固定化这一较为前沿的生物技术，学生可能较为陌生。
在认知能力方面，高中生或大学生已经具备了一定的逻辑思维和分析问题的能力，但对于复杂的生物技术原理的理解和应用可能还存在一定的困难。
三、教学目标1、知识目标（1）理解酶固定化的概念和常用方法。
（2）掌握酶固定化的优点和应用领域。
2、能力目标（1）通过对酶固定化方法的学习，培养学生的分析和比较能力。
（2）通过实验设计和操作，提高学生的动手实践能力和创新思维。
3、情感目标（1）激发学生对生物技术的兴趣，培养学生的科学探索精神。
（2）让学生认识到生物技术在生产生活中的重要应用，增强学生的社会责任感。
四、教学重难点1、教学重点（1）酶固定化的方法及原理。
（2）酶固定化的优点和应用。
2、教学难点（1）各种酶固定化方法的特点和适用范围。
（2）酶固定化实验的设计和操作。
五、教法与学法1、教法（1）讲授法：讲解酶固定化的基本概念、方法和原理，使学生对新知识有初步的了解。
（2）比较法：通过对不同酶固定化方法的比较，帮助学生加深理解和记忆。
（3）案例分析法：结合实际应用案例，让学生体会酶固定化技术的重要性和应用价值。
固定化酶
中等
活力回收率
载体再生 费用 底物专一性 适用性
较高
可能 低 不变 酶源多
低
不可能 高 可变 较广
高
可能 低 不变 广泛
中等
不可能 中等 可变 较广
高
不可能 低 不变 小分子底物、 药用酶
3 评价固定化酶指标
固定化后酶的考察项目
（1） （3）
测定固定化酶的活力，以
确定固定化过程的活力回收 率。
考察固定化酶最适反应 条件。
固定化后酶性质的变化
4
固定化酶和亲和色谱
• 亲和技术的基础：是生物活性化合物生物特异信 息的综合。 • 利用了生命现象中生物分子间特有的高亲和力、 高专一性，可逆结合而设计的纯化方法。 • 是唯一能够体现待分离物质间生物学功能差异的 分离方法。
THANK YOU
固定化后酶性质的变化
2
• 固定化青霉素酰化酶，只要改变pH值等条件，就可以生成不同的产物
固定化酶在医药治疗上的应用
青霉素酰化酶催化合成头孢类抗生素
H2N R1
O
R2
+
NH2 O N O
S
Penicillin G acylase H2O R
1
OH
NH2 H N S O N O O OH
1: D-(-)-PGA (R1 = H, R2 = NH2) 2: D-(-)-PGM (RI = H, R2 = OMe) 3. D-(-)-HPGA (R1 = OH, R2 = NH2) 4: D-(-)-HPGM (R1 = H, R2 = OMe
酶降低了酶的亲和力。
• （2） 载体与底物电荷相反，静电作用，Km'<Km
6 固定化酶的应用
第四章 固定化酶
第四章固定化酶固定化酶的是指是具有催化活性蛋白质的固定化，因此固定化酶一般为具有各种性状的颗粒，其反应过程必须在颗粒水平上进行描述和表达。
它的显著特征是：在描述其反应过程动力学时，必须包含有反应物系从液相主体扩散到颗粒内、外表面的传递速率的影响。
第一节固定化酶概论酶的催化作用具有高选择性、高催化活性、反应条件温和、环保无污染等特点，但游离状态的酶对热、强酸、强碱、高离子强度、有机溶剂等稳定性较差，易失活，并且反应后混入催化产物等物质，纯化困难，不能重复使用。
为了克服这些问题，20世纪60年代酶固定化技术应运而生。
它是模拟体内酶的作用方式（体内酶多与膜类物质相结合并进行特有的催化反应），通过化学或物理的手段，用载体将酶束缚或限制在一定的区域内，使酶分子在此区域进行特有和活跃的催化作用，并可回收及长时间重复使用的一种交叉学科技术。
固定化酶（immobilized enzyme）这个术语是在1971年酶工程会议上被推荐使用的。
Trevan在1980年给出了固定化酶的定义：酶的固定化就是通过某些方法将酶与载体相结合后使其不溶于含有底物的相中，从而使酶被集中或限制在一定的空间范围内进行酶解反应。
其实，固定化酶并不是新的物质，例如，胞内酶是在细胞内起作用的，类似于用包埋方法制成的固定化酶。
因此，固定化酶研究一定程度上可以认为是为了使酶在更接近其原始状态下进行的反应。
对各种酶的固定化技术进行积极的研究与开发始于20世纪50年代，通过重氮化共价结合法将羧肽酶、淀粉酶、胃蛋白酶等固定在聚氨基苯乙烯树脂上；1963年，利用聚丙烯酰胺包埋法固定了多种酶；1969年，日本的一家制药公司首次将固定化的酰化氨基酸水解酶用来从混合氨基酸中生产L-氨基酸，开辟了固定化酶工业化应用的新纪元。
通常的生物催化剂，如酶或细胞同其它溶质一样，分散在溶剂或溶液中，可以自由移动，称为游离酶或游离细胞。
若通过固定化技术将酶固定于载体表面或其内部，则与液相主体相分离，形成了固定化生物催化剂，即固定化酶。
固定化酶资料
8
共价键结合法制备固定化酶的“通式”
• 首先载体上引进活泼基团 • • 然后活化该活泼基团 • 最后此活泼基团再与酶分子上某一基团形成共价键
9
（4）载体活化的方法
• A．重氮法(需载体具有芳香族氨基) • B．叠氮法 • C．烷基化反应法 • D．硅烷化法 • E．溴化氰法
10
（三）交联法
• 交联法:借助双功能试剂使酶分子之间发生交 联作用，制成网状结构的固定化酶的方法。 也可用于含酶菌体或菌体碎片的固定化。
R3
H2O
R1
NH2NH
S
O O
N
R3
O OH
O OH
7-ACCA (R3 = Cl) 7-ADCA (R3 = Me)
Cefaclor (R1 = H, R3 = Cl) Cephalexin (R1 = H, R3 = Me) Cefadroxil ( R1 = OH, R3 = Me)
7-ACCA or 7-ADCA as nucleus
44
7．固定化酶在基础理论研究中应用
• 阐明酶反应机理 • 揭示酶原激活机理
45
酶亚基性质的研究
46
研究蛋白质-核酸分子结构
• 连续的固定化酶柱进行DNA序列分析； • 原理：是测定DNA聚合时，以掺入dNTP同时释
放的焦磷酸判断是否发生了聚合反应，进而确定 掺入的是哪种核苷酸从而推导出序列； • ——该系统由连续的6个固定化酶柱组成 • 焦磷酸酶、DNA聚合酶、甘油激酶、己糖激酶、 ATP磷酸化酶，荧光酶柱。
16
（四） 包埋法（entrapping method）
定义：将酶或含酶菌体包埋在各种多孔 载体中使酶固定化的方法。
分为：网格型和微囊型
共价键结合法制备固定化酶的“通式”
• 首先载体上引进活泼基团 • • 然后活化该活泼基团 • 最后此活泼基团再与酶分子上某一基团形成共价键
9
（4）载体活化的方法
• A．重氮法(需载体具有芳香族氨基) • B．叠氮法 • C．烷基化反应法 • D．硅烷化法 • E．溴化氰法
10
（三）交联法
• 交联法:借助双功能试剂使酶分子之间发生交 联作用，制成网状结构的固定化酶的方法。 也可用于含酶菌体或菌体碎片的固定化。
R3
H2O
R1
NH2NH
S
O O
N
R3
O OH
O OH
7-ACCA (R3 = Cl) 7-ADCA (R3 = Me)
Cefaclor (R1 = H, R3 = Cl) Cephalexin (R1 = H, R3 = Me) Cefadroxil ( R1 = OH, R3 = Me)
7-ACCA or 7-ADCA as nucleus
44
7．固定化酶在基础理论研究中应用
• 阐明酶反应机理 • 揭示酶原激活机理
45
酶亚基性质的研究
46
研究蛋白质-核酸分子结构
• 连续的固定化酶柱进行DNA序列分析； • 原理：是测定DNA聚合时，以掺入dNTP同时释
放的焦磷酸判断是否发生了聚合反应，进而确定 掺入的是哪种核苷酸从而推导出序列； • ——该系统由连续的6个固定化酶柱组成 • 焦磷酸酶、DNA聚合酶、甘油激酶、己糖激酶、 ATP磷酸化酶，荧光酶柱。
16
（四） 包埋法（entrapping method）
定义：将酶或含酶菌体包埋在各种多孔 载体中使酶固定化的方法。
分为：网格型和微囊型
理学食品酶学本固定化酶课件
（1）酶的底物为小分子化合物
一般来说，当酶的底物为小分子化合物时，固定化酶的底物特异性大多数情况下不发生变化。例如，氨基酰化酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖异构酶等，酶的底物为大分子化合物
当酶的底物为大分子化合物时，如蛋白酶、α-淀粉酶、磷酸二酯酶等，固定化酶的底物特异性往往会发生变化。这是由于载体引起的空间位阻作用，使大分子底物难以与酶分子接近而无法进行催化反应，酶的催化活力难以发挥出来，催化活性大大下降；而分子量较小的底物受到空间位阻作用的影响较小，与游离酶没有显著区别。 酶底物为大分子化合物时，底物分子量不同，对固定化酶底物特异性的影响也不同，一般随着底物分子量的增大，固定化酶的活力下降。例如，糖化酶用CMC叠氮衍生物固定化时，对分子量8000的直链淀粉的活性为游离酶的77％，而对分子量为50万的直链淀粉的活性只有15%～17％。
以上四种固定化酶方法各有其优缺点（见表4-1）。往往一种酶可以用不同方法固定化，但没有一种固定化方法可以普遍地适用于每一种酶。在实际应用时，常将两种或数种固定化方法并用，以取长补短。
各固定方法的特点与比较
四、 固定化酶的特性
（一）固定化酶的形状 （二）固定化酶的性质 （三）酶活力 （四）固定化酶的稳定性 （五）固定化酶的反应特性
酶经固定化后，其对蛋白酶的抵抗力提高。这可能是因为蛋白酶是大分子，由于受到空间位阻的影响，不能有效接触固定化酶。例如，千畑一郎发现，用尼龙或聚脲膜包埋，或用聚丙烯酰胺凝胶包埋的固定化天门冬酰胺酶，对蛋白酶极为稳定，而在同一条件下，游离酶几乎全部失活。另外固定化后酶对有机试剂和酶抑制剂的耐受性也得到了提高。
固定化可延长酶的贮藏有效期。但长期贮藏，活力也不免下降，最好能立即使用。如果贮藏条件比较好，亦可较长时间保持活力。例如，固定化胰蛋白酶，在0.0025mol/L磷酸缓冲液中，于20℃保存数月，活力尚不损失。
第九章 固定化酶
(2)整个系统各方同性。
在上述条件下，固定化对反应体系的影响，可以概括为三种类型：
1、构象改变和屏蔽效应
构象改变：酶在固定化的过程中，出于酶与载体相互作用使
酶的活性中心或变构中心的构象发生变化从而导致酶活性下 降。这种效应难以定量描写也难以预测。通常出现在吸附法 和共价键结合法。
立体屏蔽效应：由于载体对酶的活性中心或变构中心造成
3、偶联反应
酶和载体的连接反应取决于载体上的功能基团和酶分 子上的非必需侧链基团，必需在温和的pH、中等离子强度 和较低温的缓冲液中进行。
（三）交联法
定义：利用双功能或多功能试剂在酶分子间或酶与载体间， 或酶与惰性蛋白间进行交联反应，制备固定化酶的力法。 可用于含酶菌体或菌体碎片的固定化。 常用的交联试剂：戊二醛，其他如苯基二异硫氰、双重氮 联苯胺-2，2’二磺酸、 双重氮联苯胺等。
（四） 包埋法
定义：将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的 方法称为包埋法。 分类：根据载体与方法不同，分为： 网格型（凝胶包埋法） 微囊型（半透膜包埋法）
1、网格型： 将酶或含酶菌体包埋在凝胶细微网格中，制成一定 形状的固定化酶，称为网格型包埋法，也称为凝胶包埋法。
聚丙烯酰胺凝胶包埋法：
搅拌连续反应器
生物催化剂作用方式示意图
什么是固定化酶？ 水溶性酶
水不溶性载体 固定化技术
水不溶性酶 （固定化酶）
定义：通过物理的或化学的手段，将酶束缚于水不溶的载体上，或将酶束
缚在一定的空间内，限制酶分子的自由流动，但能使酶充分发挥催化作用； 曾称其为水不溶酶或固相酶。
第一节 概述
固定化酶的优点
3、pH的变化
PH对酶活性的影响：
（1）改变酶的空间构象 （2）影响酶的催化基团的解离
在上述条件下，固定化对反应体系的影响，可以概括为三种类型：
1、构象改变和屏蔽效应
构象改变：酶在固定化的过程中，出于酶与载体相互作用使
酶的活性中心或变构中心的构象发生变化从而导致酶活性下 降。这种效应难以定量描写也难以预测。通常出现在吸附法 和共价键结合法。
立体屏蔽效应：由于载体对酶的活性中心或变构中心造成
3、偶联反应
酶和载体的连接反应取决于载体上的功能基团和酶分 子上的非必需侧链基团，必需在温和的pH、中等离子强度 和较低温的缓冲液中进行。
（三）交联法
定义：利用双功能或多功能试剂在酶分子间或酶与载体间， 或酶与惰性蛋白间进行交联反应，制备固定化酶的力法。 可用于含酶菌体或菌体碎片的固定化。 常用的交联试剂：戊二醛，其他如苯基二异硫氰、双重氮 联苯胺-2，2’二磺酸、 双重氮联苯胺等。
（四） 包埋法
定义：将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的 方法称为包埋法。 分类：根据载体与方法不同，分为： 网格型（凝胶包埋法） 微囊型（半透膜包埋法）
1、网格型： 将酶或含酶菌体包埋在凝胶细微网格中，制成一定 形状的固定化酶，称为网格型包埋法，也称为凝胶包埋法。
聚丙烯酰胺凝胶包埋法：
搅拌连续反应器
生物催化剂作用方式示意图
什么是固定化酶？ 水溶性酶
水不溶性载体 固定化技术
水不溶性酶 （固定化酶）
定义：通过物理的或化学的手段，将酶束缚于水不溶的载体上，或将酶束
缚在一定的空间内，限制酶分子的自由流动，但能使酶充分发挥催化作用； 曾称其为水不溶酶或固相酶。
第一节 概述
固定化酶的优点
3、pH的变化
PH对酶活性的影响：
（1）改变酶的空间构象 （2）影响酶的催化基团的解离
固定化酶和细胞PPT课件
•优点：酶与载体结合牢固，不会轻易 脱落，可连续使用。 •缺点：反应条件较激烈，易影响酶的 空间构象而影响酶的催化活性。
第23页/共84页
3、交联法
借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固 定化酶的方法。
常用的双功能试剂有戊二醛、 己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶 氮苯等。其中应用最广泛的是 戊二醛。
优越性：
(1)降低成本，省去酶的分离纯化工作; (2)既可作为单一酶，也可作为复合酶系
完成部分代谢过程。 局限性： (1)细胞内多种酶的存在，会形成不需要的副 产物。 (2)细胞膜、细胞壁和载体都存在着扩散限制 作用。
第9页/共84页
3.固定化原生质体
意义： (1)固定化原生质体去除了细胞壁的扩散障 碍，有利于氧的传递，营养成分的吸收和 胞内产物的分泌。 (2)原生质体不稳定，容易破裂，固定化后， 由于载体的保护作用，稳定性提高。
第18页/共84页
第一个离子结合法固定化酶： DEAE-Cellulose 固定化过氧化氢酶
第一个工业化的固定化酶： DEAE-Sephadex A-50 固定化氨基酰化酶
第19页/共84页
共价结合法（covalent binding or covalent coupling）
借助共价键 将酶的活性非 必需侧链基团 和载体的功能 基团进行偶联。
第35页/共84页
各种固定化方法的优缺点比较
固定化方法 吸附法 包埋法
结合法 交联法
制备难易 易
结合程度 弱
活力回收 高，酶易流 失
再生
可能
费用
低
底物专一性 不变
较难 强 高
不能 低 不变
难 强 低
不能 高 可变
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中等 可变 较广
不可能
低 不变 小分子底 物、药用 酶
酶固定化方法选择依据：
（1） 酶的性质
（2） 载体的性质
（3） 制备方法的选择
四、辅酶固定化
原因
有机辅因子中具有某些特殊的化学基团，参与酶的催化 反应
有机辅因子在使用过程中要流失，并且不能自行再生
有机辅因子价格昂贵
——工业上应用全酶的关键是有机辅因子的保留和再生
固定化酶稳定性提高的原因：
a. 固定化后酶分子与载体多点连接。
b.抑制自降解，提高了酶稳定性。
c.酶活力的释放是缓慢的。
3． 最适pH的变化
pH对酶活性的影响：
（1）
改变酶的空间构象 （2）影响酶的催化基团的解离 （3）影响酶的结合基团的解离 （4）改变底物的解离状态，酶与底物 不能结合或结合后不能生成产物。
Aminoacylase
氨基酰化酶
A-L-Ala A-D-Ala
固定化酶 柱子 离心机
泵 储 罐 反应产物
L-Ala A-D-Ala
消 旋 反 应 器
晶体 L-Ala
2、固定化酶在医学上的应用（酶电极）
（1）葡萄糖电极 半透膜 酶胶层
感应电极
酶电极示意图
ß－D－葡萄糖＋O2
D－葡萄糖酸－1，5－内酯＋H2O
优点： 固定化时酶分子的构象很少
或基本不发生变化。
缺点： 结合力弱，易解吸附。 载体： 纤维素、琼脂糖、活性炭、
沸石及硅胶等。
II 离子结合法
酶分子与含有离子交换基团的固相载 体相结合
第一个离子结合法固定化酶：
DEAE — Cellulose
固定化过氧化氢酶 第一个工业化的固定化酶： DEAE-Sephadex A-50 固定化氨基酰化酶
⑴ 酯化 ⑵ 肼解
⑶ 叠氮化
(4) 偶联
B 叠氮法
对含有羧机基的载体，与肼基作用生成含有酰肼基团的载体，
再与亚硝酸活化，生成叠氮化合物。最后于酶偶联
C．烷基化反应法
含羟基的载体可用三氯三嗪等多卤代物进行活化， 形成含有卤素基团的活化载体。
D．硅烷化法
一般常用的载体：多孔玻璃，多孔陶瓷。
3、胶格包埋法
将酶或含酶菌体包埋在凝胶细微网格中，制成 一定形状的固定化酶，称为网格型包埋法。也 称为凝胶包埋法。
首先被采用的胶格包埋法是： • 固定化胰蛋白酶 • 木瓜蛋白酶 • －淀粉酶 Enzyme+N, N-甲叉双丙稀酰胺, 丙稀酰胺 引发剂－－inactiation
4、共价交联法 5、共价偶联法
转化为产物的酶量定义为1个酶活单位。 1Kat=1mol/s=60mol/min=60*106umol/min =6*106IU 2.酶比活定义（游离）：每毫克酶蛋白或酶RNA（DNA)所具有的 酶活力单位
固定化酶的指标：
1. 固定化酶的比活：每（克）干固定化酶所具有的
酶活力单位。 或：单位面积（cm2）的酶活力单位表示（酶膜、酶管、 酶板）。
•可以形成共价键的基团： 游离氨基， 游 离羧基， 巯基， 咪唑基， 酚基， 羟基， 甲硫基， 吲哚基，二硫键 •常用载体：天然高分子、人工合成的高聚 物、无机载体
共价键结合法制备固定化酶的“通式”
1. 2. 3.
载体上引进活泼基团 活化该活泼基团 此活泼基团再与酶分子上某一基团形 成共价键
载体活化的方法
什么是固定化酶？
水溶性酶 水不溶性载体 酶自身载体 固定化技术
水不溶性酶
（固定化酶）
酶的固定化技术和固定化酶
酶 可溶 间歇 固定化
吸附
包埋
间歇
交联
连续
化学偶联
固定化酶的优缺点 可重复使用 可以装塔连续反应 优点： 纯化简单，易与产物分离 提高产物质量 应用范围广 固定化过程中酶易失活 缺点： 首次投入成本高 大分子底物较困难
图 7－11 酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联
固定化酶方法研究热点
1 热处理法： 2 结晶法： 3 分散法：
固定化方法的另一种分类
关键在于选择适当的固定化方法和必要的载 体以及稳定性研究、改进。 四大类方法： 吸附法（包括电吸附法） 结合法（无机多孔材料） 交联法（双功能试剂） 包埋法（微胶囊法）
表7－3 固定化肌酸激酶及固定化亚基的蛋白质含量及比活力
酶的衍生物
蛋白质含量
（g/ml 凝胶）（％） 400 100
比活力
（单位/mg) 28.0
衍生物A
衍生物B
衍生物C
210
380
52.5
95.0
25.7
27.4
4、 固定化酶在药物上的应用
例1
固定化青霉素酰化酶，只要改变pH值等条件， 就可以生成不同的产物。
（2）交联包埋法
把酶液和双功能试剂（戊二醛）凝结成颗粒很细的集合 体，然后用高分子或多糖一类物质进行包埋成颗粒。
这样避免颗粒太细的缺点，同时制得的固定化酶稳定性
好。
5、共价偶联法
• 酶分子；（a）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不溶性
的固定化酶；（b）酶分子被偶联到水不溶性载体上形成水不溶性的固定化酶
固定化酶
深圳大学 吴海强
一、概述
固定化酶的发展史
生物催化剂 细胞 酶
非生长
悬浮 材料 固定化 膜固定 凝胶 吸附 化学连接物 分批 酶液 连续
生长
固定化 再循环系统 连续 间歇
可溶
吸附 包埋 间歇 交联
固定化
化学连续 间歇
半连续
凝胶
连续 活塞模式 搅拌连续反应器 活塞模式 搅拌连续反应器
连续
吸附
生物催化剂作用方式示意
第一篇报道是：戊二醛交联羧肽酶得到一种分子间 交联的固定化酶
常用于固定化酶的交联剂 交联剂 戊二醛 二重氮联苯胺－2，2‘－二磺酸
4，4‘－二氟－3，3’－二硝基二苯砜
二苯基－4，4‘－二硫氰酸－2，2’－二磺酸 1，5－二氟－2，4－二硝基苯
酚－2，4－二磺酰氯
3－甲氧基二苯基甲烷－4，4‘－二异氰酸盐
二、固定化酶的性质及其影响因素
（一）固定化酶的性质 （二）固定化酶性质改变的原因 （三）评价固定化酶的指标 （四）固定化酶的活力测定方法
（一）固定化酶的性质
1． 固定化对酶活性的影响： 酶活性下降，反应速度下降。 原因：酶结构的变化
空间位阻
2． 固定化对酶稳定性的影响
（1） 操作稳定性提高； （2） 贮存稳定性比游离酶大多数提高； （3） 对热稳定性，大多数升高，有些反 而降低； （4） 对分解酶的稳定性提高； （5） 对变性剂的耐受力升高。
辅酶固定化的方法：
固定化方法与酶相似，一般采用溴化氰法，碳二亚
胺法以及重氮偶联法等共价偶联，或将其进行适当 的化学修饰后固定在超滤器中。
辅酶固定化必须解决辅酶在多个酶之间传递的障碍。
辅酶的固定化
辅酶的固定化
辅酶固定化的形式：
五、固定化酶的应用
1、固定化酶在工业生产上的应用
乙酰 -DL — Ala L — Ala +乙酸 乙酰 -D — Ala
（二） 固定化酶性质改变的原因
1． 酶本身的变化，主要是由于活性中 心的氨基酸残基、高级结构和电荷状态 等发生了变化。
2． 载体的影响
（1）
分配效应 （2） 空间障碍效应 （3） 扩散限制效应
3.
固定化方法的影响
（三）评价固定化酶的指标：
游离酶
1.酶活定义（IU)：在特定条件下，每一分钟催化一个微摩尔底物
振荡测定法： 酶柱测定法： 连续测定法
利用连续分光光度法等测定方法可以对固 定化酶反应液进行连续测定，从而测定固定 化酶的酶活力。
三、酶固定化技术
1. 2. 3. 4. 5. 微型胶囊法 吸附法 胶格包埋法 共价交联法 共价偶联法
1、微型胶囊法
是将酶包埋在各种高分子聚合物制成的小球内， 制成固定化酶。由于固定化形成的酶小球直径一 般只有几微米至几百微米，所以也称为微囊化法。
载体对固定化酶体系pH的影响
载体带负电荷，pH向碱性方向移动。
微环境是指在固定化酶附近的局部环境，而把主 体溶液称为宏观环境。
载体带正电荷，pH向酸性方向移动。
产物性质对固定化酶体系pH的影响
催化反应的产物为酸性时，固定化酶的pH值比游离 酶的pH值高；反之则低
4． 最适温度变化
一般与游离酶差不多，但有些会有较明显的变化。
5． 底物特异性变化
作用于低分子底物的酶特异性没有明显变化
既可作用于低分子底物又可作用于大分子低物的酶 特异性往往会变化。
6．米氏常数Km的变化
Km值随载体性质的变化而变化
载体与底物带相同电荷，静电排斥，固定化酶降 低了酶的亲和力，Km’>Km 。
载体与底物电荷相反，静电吸引，固定化酶增加 了酶的亲和力，Km‘<Km。
白蛋白、明胶、血红蛋白等）来增加蛋白质浓度，使酶
与惰性蛋白质共交联。
酶共价交链法的操作方法： （1） 吸附交联法 （2） 交联包埋法
（1） 吸附交联法
先将酶吸附在硅胶、皂土、氧化铝、球状酚醛树脂或其 他大孔型离子交换树脂上，再用戊二醛等双功能试剂交
联。
用此法所得固定化酶也可称为壳状固定化酶。
各类固定化方法的特点比较:
不可能
低 不变 小分子底 物、药用 酶
酶固定化方法选择依据：
（1） 酶的性质
（2） 载体的性质
（3） 制备方法的选择
四、辅酶固定化
原因
有机辅因子中具有某些特殊的化学基团，参与酶的催化 反应
有机辅因子在使用过程中要流失，并且不能自行再生
有机辅因子价格昂贵
——工业上应用全酶的关键是有机辅因子的保留和再生
固定化酶稳定性提高的原因：
a. 固定化后酶分子与载体多点连接。
b.抑制自降解，提高了酶稳定性。
c.酶活力的释放是缓慢的。
3． 最适pH的变化
pH对酶活性的影响：
（1）
改变酶的空间构象 （2）影响酶的催化基团的解离 （3）影响酶的结合基团的解离 （4）改变底物的解离状态，酶与底物 不能结合或结合后不能生成产物。
Aminoacylase
氨基酰化酶
A-L-Ala A-D-Ala
固定化酶 柱子 离心机
泵 储 罐 反应产物
L-Ala A-D-Ala
消 旋 反 应 器
晶体 L-Ala
2、固定化酶在医学上的应用（酶电极）
（1）葡萄糖电极 半透膜 酶胶层
感应电极
酶电极示意图
ß－D－葡萄糖＋O2
D－葡萄糖酸－1，5－内酯＋H2O
优点： 固定化时酶分子的构象很少
或基本不发生变化。
缺点： 结合力弱，易解吸附。 载体： 纤维素、琼脂糖、活性炭、
沸石及硅胶等。
II 离子结合法
酶分子与含有离子交换基团的固相载 体相结合
第一个离子结合法固定化酶：
DEAE — Cellulose
固定化过氧化氢酶 第一个工业化的固定化酶： DEAE-Sephadex A-50 固定化氨基酰化酶
⑴ 酯化 ⑵ 肼解
⑶ 叠氮化
(4) 偶联
B 叠氮法
对含有羧机基的载体，与肼基作用生成含有酰肼基团的载体，
再与亚硝酸活化，生成叠氮化合物。最后于酶偶联
C．烷基化反应法
含羟基的载体可用三氯三嗪等多卤代物进行活化， 形成含有卤素基团的活化载体。
D．硅烷化法
一般常用的载体：多孔玻璃，多孔陶瓷。
3、胶格包埋法
将酶或含酶菌体包埋在凝胶细微网格中，制成 一定形状的固定化酶，称为网格型包埋法。也 称为凝胶包埋法。
首先被采用的胶格包埋法是： • 固定化胰蛋白酶 • 木瓜蛋白酶 • －淀粉酶 Enzyme+N, N-甲叉双丙稀酰胺, 丙稀酰胺 引发剂－－inactiation
4、共价交联法 5、共价偶联法
转化为产物的酶量定义为1个酶活单位。 1Kat=1mol/s=60mol/min=60*106umol/min =6*106IU 2.酶比活定义（游离）：每毫克酶蛋白或酶RNA（DNA)所具有的 酶活力单位
固定化酶的指标：
1. 固定化酶的比活：每（克）干固定化酶所具有的
酶活力单位。 或：单位面积（cm2）的酶活力单位表示（酶膜、酶管、 酶板）。
•可以形成共价键的基团： 游离氨基， 游 离羧基， 巯基， 咪唑基， 酚基， 羟基， 甲硫基， 吲哚基，二硫键 •常用载体：天然高分子、人工合成的高聚 物、无机载体
共价键结合法制备固定化酶的“通式”
1. 2. 3.
载体上引进活泼基团 活化该活泼基团 此活泼基团再与酶分子上某一基团形 成共价键
载体活化的方法
什么是固定化酶？
水溶性酶 水不溶性载体 酶自身载体 固定化技术
水不溶性酶
（固定化酶）
酶的固定化技术和固定化酶
酶 可溶 间歇 固定化
吸附
包埋
间歇
交联
连续
化学偶联
固定化酶的优缺点 可重复使用 可以装塔连续反应 优点： 纯化简单，易与产物分离 提高产物质量 应用范围广 固定化过程中酶易失活 缺点： 首次投入成本高 大分子底物较困难
图 7－11 酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联
固定化酶方法研究热点
1 热处理法： 2 结晶法： 3 分散法：
固定化方法的另一种分类
关键在于选择适当的固定化方法和必要的载 体以及稳定性研究、改进。 四大类方法： 吸附法（包括电吸附法） 结合法（无机多孔材料） 交联法（双功能试剂） 包埋法（微胶囊法）
表7－3 固定化肌酸激酶及固定化亚基的蛋白质含量及比活力
酶的衍生物
蛋白质含量
（g/ml 凝胶）（％） 400 100
比活力
（单位/mg) 28.0
衍生物A
衍生物B
衍生物C
210
380
52.5
95.0
25.7
27.4
4、 固定化酶在药物上的应用
例1
固定化青霉素酰化酶，只要改变pH值等条件， 就可以生成不同的产物。
（2）交联包埋法
把酶液和双功能试剂（戊二醛）凝结成颗粒很细的集合 体，然后用高分子或多糖一类物质进行包埋成颗粒。
这样避免颗粒太细的缺点，同时制得的固定化酶稳定性
好。
5、共价偶联法
• 酶分子；（a）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不溶性
的固定化酶；（b）酶分子被偶联到水不溶性载体上形成水不溶性的固定化酶
固定化酶
深圳大学 吴海强
一、概述
固定化酶的发展史
生物催化剂 细胞 酶
非生长
悬浮 材料 固定化 膜固定 凝胶 吸附 化学连接物 分批 酶液 连续
生长
固定化 再循环系统 连续 间歇
可溶
吸附 包埋 间歇 交联
固定化
化学连续 间歇
半连续
凝胶
连续 活塞模式 搅拌连续反应器 活塞模式 搅拌连续反应器
连续
吸附
生物催化剂作用方式示意
第一篇报道是：戊二醛交联羧肽酶得到一种分子间 交联的固定化酶
常用于固定化酶的交联剂 交联剂 戊二醛 二重氮联苯胺－2，2‘－二磺酸
4，4‘－二氟－3，3’－二硝基二苯砜
二苯基－4，4‘－二硫氰酸－2，2’－二磺酸 1，5－二氟－2，4－二硝基苯
酚－2，4－二磺酰氯
3－甲氧基二苯基甲烷－4，4‘－二异氰酸盐
二、固定化酶的性质及其影响因素
（一）固定化酶的性质 （二）固定化酶性质改变的原因 （三）评价固定化酶的指标 （四）固定化酶的活力测定方法
（一）固定化酶的性质
1． 固定化对酶活性的影响： 酶活性下降，反应速度下降。 原因：酶结构的变化
空间位阻
2． 固定化对酶稳定性的影响
（1） 操作稳定性提高； （2） 贮存稳定性比游离酶大多数提高； （3） 对热稳定性，大多数升高，有些反 而降低； （4） 对分解酶的稳定性提高； （5） 对变性剂的耐受力升高。
辅酶固定化的方法：
固定化方法与酶相似，一般采用溴化氰法，碳二亚
胺法以及重氮偶联法等共价偶联，或将其进行适当 的化学修饰后固定在超滤器中。
辅酶固定化必须解决辅酶在多个酶之间传递的障碍。
辅酶的固定化
辅酶的固定化
辅酶固定化的形式：
五、固定化酶的应用
1、固定化酶在工业生产上的应用
乙酰 -DL — Ala L — Ala +乙酸 乙酰 -D — Ala
（二） 固定化酶性质改变的原因
1． 酶本身的变化，主要是由于活性中 心的氨基酸残基、高级结构和电荷状态 等发生了变化。
2． 载体的影响
（1）
分配效应 （2） 空间障碍效应 （3） 扩散限制效应
3.
固定化方法的影响
（三）评价固定化酶的指标：
游离酶
1.酶活定义（IU)：在特定条件下，每一分钟催化一个微摩尔底物
振荡测定法： 酶柱测定法： 连续测定法
利用连续分光光度法等测定方法可以对固 定化酶反应液进行连续测定，从而测定固定 化酶的酶活力。
三、酶固定化技术
1. 2. 3. 4. 5. 微型胶囊法 吸附法 胶格包埋法 共价交联法 共价偶联法
1、微型胶囊法
是将酶包埋在各种高分子聚合物制成的小球内， 制成固定化酶。由于固定化形成的酶小球直径一 般只有几微米至几百微米，所以也称为微囊化法。
载体对固定化酶体系pH的影响
载体带负电荷，pH向碱性方向移动。
微环境是指在固定化酶附近的局部环境，而把主 体溶液称为宏观环境。
载体带正电荷，pH向酸性方向移动。
产物性质对固定化酶体系pH的影响
催化反应的产物为酸性时，固定化酶的pH值比游离 酶的pH值高；反之则低
4． 最适温度变化
一般与游离酶差不多，但有些会有较明显的变化。
5． 底物特异性变化
作用于低分子底物的酶特异性没有明显变化
既可作用于低分子底物又可作用于大分子低物的酶 特异性往往会变化。
6．米氏常数Km的变化
Km值随载体性质的变化而变化
载体与底物带相同电荷，静电排斥，固定化酶降 低了酶的亲和力，Km’>Km 。
载体与底物电荷相反，静电吸引，固定化酶增加 了酶的亲和力，Km‘<Km。
白蛋白、明胶、血红蛋白等）来增加蛋白质浓度，使酶
与惰性蛋白质共交联。
酶共价交链法的操作方法： （1） 吸附交联法 （2） 交联包埋法
（1） 吸附交联法
先将酶吸附在硅胶、皂土、氧化铝、球状酚醛树脂或其 他大孔型离子交换树脂上，再用戊二醛等双功能试剂交
联。
用此法所得固定化酶也可称为壳状固定化酶。
各类固定化方法的特点比较: