雌激素类药物的高效液相色谱分析方法概况1

雌激素类药物的高效液相色谱分析方法概况李 燕1,韩 海21 重庆南川市人民医院药剂科,重庆4084002 暨南大学药学院,广东广州510632雌激素(estrogen)类药物是以18个碳原子雌烃为基本结构的类固醇激素,其作用除了性激素方面外,还能促进骨中钙的沉积。

目前已有很多以雌激素为主要成分的制剂用于治疗妇女绝经期后由于雌激素缺乏而发生的骨质疏松症及其引起的其它疾病。

如美国市场上销售的倍美力(Premarin),主要成分为多种雌激素的硫酸单酯钠盐。

目前常用的测定雌激素类药物的方法有比色法和分光光度法[1]、薄层色谱法[2]、气相色谱法(GC)[3]、高效液相色谱法(HPLC)、放射免疫分析法(RIA)[4]及酶联(ELISA)技术[5]等。

RI A及ELISA具有很高的灵敏度,可检测到空气及受污染的水源中微量的雌激素,但均存在交叉响应的问题,测定值常高于真实值,不宜作为含量测定方法。

随着分析技术的提高和分析仪器的发展,HPLC被广泛使用,它具有样品用量少、灵敏度较高、分离效能好、快速等优点,因此被USP、JP、BP及中国药典等采用。

文中主要介绍HPLC在雌激素类药物分析测定中的概况。

1 用于雌激素原料药的含量测定中国药典2000年版雌激素测定方法见表1。

表1 中国药典 中雌激素原料药物的HPLC法分析化合物分析柱流动相检测方法己烯雌酚ODS甲醇-水(75 25)UV241nm 苯甲酸雌二醇ODS甲醇-水(80 20)UV230nm 炔雌醇ODS甲醇-水(70 30)UV281nm2 用于制剂中雌激素的分离和含量测定HPLC具有很好的分离效能,所以除了应用于雌作者简介:李燕,女,重庆,大专,主管药师,从事临床药学工作。

激素原料药的分析外,还广泛地应用于雌激素制剂的分离与分析。

文献[6]以RP-HPLC分离测定雌三醇栓剂中雌三醇的含量,采用WatersNora-ParkC18柱,用氯霉素作内标,甲醇-水(50 50)为流动相, 280nm检测。

此条件下,雌三醇与基质分离较好,方法准确、快速、简便。

文献[7]等用Sperisorb C18柱,甲醇-水(75 25)为流动相,280nm检测,用FDA法溶出装置测定了复方雌二醇控释贴片的含量及体外释放度。

此条件下,雌二醇能与杂质达到基线分离,方法准确、灵敏、线性范围宽、重复性好,雌二醇的最低检出量为5ng。

王俏[8]等建立了同时测定复方雌二醇控释贴片中的雌二醇和炔诺酮醋酸酯含量的RP-HPLC法,利用Shimadzu LC-10A高效液相色谱仪的系统控制器自动变换检测波长的功能及雌二醇和炔诺酮醋酸酯出峰时间不同,使其二者在同一次分析中均能准确地检出,完成一次分析只需15 min,具有快速的优点。

3 用于生物样品中雌激素的含量测定含有雌激素的生物样品由于其组成复杂,对测定的干扰较大,用其它分析方法很难获得良好的专属性。

近年来,HPLC在分离与分析组分复杂的生物样品中多种雌激素这方面发展迅速,梯度洗脱、变换波长检测、光电二极管阵列检测(DAD)及柱切换(column switc hing technique)等技术都被广泛应用。

刘子怡[9]用C18柱,甲醇-二氯甲烷-水-异丙醇(40 4 48 8)为流动相,220nm检测,证明了油菜花粉中含有雌二醇。

Jasmina[10]等用Nucleosil C18柱,以甲醇-二氯甲烷-水-异丙醇(45 5 42 5 7 5)为流动相,在线分离了马尿中的雌酚酮、马烯雌酚、马40 2 ,相对湿度在7% 2%的条件下放置6个月,分别于第0、1、2、3、6月取样,检测外观、溶出度、有关物质、含量等指标参数。

到第6月时供试品均变黄,含量较稳定,溶出度略有下降,有关物质含量增加。

2 讨论导致盐酸西替利嗪片发黄的主要原因是由于盐酸西替利嗪具有较高的化学活性,有多种辅料在高温、光照加速条件下或在长期存放过程中不能耐受盐酸西替利嗪的化学活性而发生化学变色现象,这并非由于盐酸西替利嗪原料本身不稳定而造成的现象。

曾有资料报道乳糖与伯胺类化合物发生相互作用而变色,它们直接影响了制剂的外观与内在质量,因此制剂处方的前期设计研究工作十分重要。

收稿日期:2002-06华西药学杂志W C J P S 2002,17(5):395~396萘雌酚及其对应的17- -二醇等多种雌激素化合物,并分别用电化学检测器和紫外检测器变换检测波长进行了检测。

王伟群[11]等用55%~65%的甲醇-1mmol L -1的醋酸铵水溶液为流动相进行梯度洗脱,分离出新鲜植物材料中的雌马酚(egnol)等多种游离的和结合的雌激素,并利用检测器根据时间程序自动变换波长的功能在一次分析中将其全部定量测定。

Anneke K [12]等用Hypersil ODS 柱,Lichro -spher 60RP-select B 为保护柱,43%~76%的乙腈-水溶液为流动相,在45min 内分5个时间段梯度洗脱,光电二极管阵列检测器检测,以调整保留时间和紫外光谱作定性依据,分离和鉴定了牛尿样品提取物中的雌激素、孕激素等二十多种激素类化合物及其代谢物,对雌激素的检测限可达5~10ng 。

生物样品中雌激素类药物的HPLC 测定方法还有较多文献报道。

但对样品进行前处理时,一般都要采用如沉淀除蛋白[13],液-液萃取[13,15]或液-固提取[15~17]等步骤,以及振荡混合、浓缩、挥干等操作,方法繁琐,易引入干扰物质,降低回收率。

为保证方法准确可靠,通常还需加入内标。

有文献以Brownee C 18小柱为保护柱,0 1mmol L -1十二烷基磺酸钠溶液为预处理流动相,Beckman ultrasphere C 18柱为分析柱,乙腈-水(33 67)为流动相,用HPLC 阀切换滤过技术直接进样测定狗血浆中的雌二醇、马烯雌酚和雌酚酮。

此法在预处理时,通过将样品直接注入有机沉淀剂(乙腈)的流路中,使其中的蛋白和多肽被在线沉淀并被溶剂滤器滤过,从而达到净化样品、保护分析柱的目的,该技术对色谱系统分离效能及定量分析均无显著影响。

有学者采用HPLC 柱前衍生化方法结合柱切换技术以氯甲酸芴甲酯(FMOC-C L)为衍生化试剂,Merck Lichropred RP2为预处理柱,60%甲醇预处理流动相,Phenomenex LunaODS 为分析柱,甲醇-0 1mol L -1醋酸钠(pH2 5)(92 8)为流动相,建立了哌嗪雌酚酮[18]体内血药浓度的分析方法,采用荧光检测( ex =262nm, em =313nm),提高了测定灵敏度,且方法简便准确,回收率高,无需内标,为进一步研究它的体内过程奠定了理论和实践基础。

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