细胞外囊泡表征-ZetaView PPT-170809-YJL
细胞外囊泡介导药物传递机制解析
细胞外囊泡的定义和分类
定义
细胞外囊泡（Extracellular Vesicles ，EVs）是由细胞释放到胞外环境中 的膜性小囊泡，具有脂质双层膜结构 ，能够携带和传递生物信息。
分类
根据来源和大小，细胞外囊泡主要分 为外泌体（Exosomes）、微囊泡（ Microvesicles）和凋亡小体（ Apoptotic Bodies）等。
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研究内容
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2. 细胞外囊泡载药及释放行为研究；
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3. 细胞外囊泡与靶细胞的相互作用机制研究；
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4. 细胞外囊泡介导药物传递的体内外评价研究。
02
细胞外囊泡概述
细胞外囊泡的生物功能
物质传递
细胞外囊泡能够携带和传递多种生物分子，如蛋白质、脂 质、RNA和DNA等，实现细胞间的物质交换和信息传递 。
组织修复
在受损组织修复过程中，细胞外囊泡能够促进细胞增殖、 迁移和分化，加速组织再生和修复。
免疫调节
细胞外囊泡参与免疫应答的调节，既可以作为抗原呈递细 胞激活免疫反应，也可以作为免疫抑制因子抑制过度免疫 反应。
发展趋势
随着研究的深入，细胞外囊泡介导的药物传递将在肿瘤、神经性疾病、心血管疾病等多个领域展现出 广阔的应用前景。未来，研究将更加注重细胞外囊泡的规模化生产、质量控制以及临床转化等方面。
研究目的和内容
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研究目的：本研究旨在解析细胞外囊泡介导药物传递的机 制，为开发高效、安全的药物传递系统提供理论依据和技 术支持。
至细胞内。
药物传递的效率和影响因素
药物性质
细胞外囊泡 外泌体 表征的标准化
细胞外囊泡外泌体表征的标准化1. 引言1.1 细胞外囊泡及外泌体的定义外泌体是一种由细胞分泌的细胞外囊泡，其直径一般在30-1000纳米之间。
外泌体主要由脂质双层包裹着，内含有蛋白质、核酸和其他生物分子。
外泌体中的生物分子可以通过体内或体外的方式传递至其他细胞，从而发挥特定的生物学功能。
外泌体作为细胞间通讯的重要媒介，在调节细胞信号传导、免疫应答、代谢调节等生理过程中扮演着关键的角色。
细胞外囊泡是一个更广泛的术语，包括外泌体在内的各种细胞分泌的囊泡。
除外泌体外，细胞外囊泡还包括外泌体以外的其他细胞分泌的囊泡，例如外泌体以外的胞质小泡、外泌体样颗粒等。
这些细胞外囊泡可以从各种细胞类型中产生，包括免疫细胞、肿瘤细胞、神经细胞等。
这些细胞外囊泡也可以携带各种生物分子，对细胞间通讯和信号传导起到重要作用。
通过对细胞外囊泡和外泌体的定义，我们可以更深入地理解这些细胞分泌物的特性和功能，为研究其表征方法、生物学功能和疾病作用提供基础。
1.2 研究背景细胞外囊泡及外泌体是一种重要的细胞间通讯介质，其内含有丰富的蛋白质、核酸和脂质成分，可以在细胞之间传递信息并影响受体细胞的生理状态。
研究表明，细胞外囊泡及外泌体在多种生理和病理过程中发挥着重要作用，如细胞增殖、免疫应答调控、炎症传递以及肿瘤发生和转移等。
随着对细胞外囊泡及外泌体的研究不断深入，人们对其表征方法的标准化也越来越重视。
目前对细胞外囊泡及外泌体的表征方法存在较大的差异性，导致研究结果的准确性和可重复性受到影响。
一些研究中使用的分析技术不够准确、灵敏，导致无法准确检测细胞外囊泡及外泌体的组成和功能。
缺乏统一的标准化标志物和检测方法，也增加了对细胞外囊泡及外泌体研究结果的解读难度。
为了进一步推动细胞外囊泡及外泌体研究的发展，有必要对其表征方法进行标准化，并提出相应的改进建议。
通过建立统一的标准化指导方针和检测标准，可以有效提高细胞外囊泡及外泌体研究的可比性和可信度，为相关研究提供更加准确和可靠的数据支持。
由原核生物细胞和真核细胞分泌出来-细胞外囊泡（EV）介绍
由原核生物细胞和真核细胞分泌出来-细胞外囊泡（EV）介绍所有体液都含有细胞衍生的膜结构囊泡。
这种囊泡由原核生物和真核细胞分泌出来，并含有对环境反应的信息。
研究认为细胞衍生的囊泡有助于体内平衡、疾病发展和进展，可以提供新的生物标志物，并且可能适合用作治疗性药物载体。
由于这些胞外囊泡（EV）与生理和病理状况之间的关系，人们对EV的兴趣呈指数增长。
EVs对新型诊断和临床转化有很大希望。
阿姆斯特丹大学的研究人员提供了关于研究EVs方法的最新进展的专业更新，并总结了目前接受的注意事项和建议，从样本收集到EVs的分离、检测和表征。
突出了常见的误解和方法上的错误。
尽管在所有体液中都发现了EVs，但他们专注于人类血液中的EVs，不仅是最复杂的，也是心血管研究中最有趣的体液。
细胞外囊泡（EV）的样品收集和分离影响后续下游分析的结果（黑色大箭头）。
在设计样品采集和分离（灰色小箭头）时，必须考虑预期下游分析的要求。
该综述针对每一步都有详细的操作步骤和注意事项，大家可以好好研读一下这篇综述。
下面选取血液样本收集部分详解给大家。
产品：A549细胞来源外泌体肥大心肌细胞来源外泌体聚乙二醇(PEG)沉淀法提取关节液来源外泌体聚乙二醇沉淀剂有效分离尿外泌体巨噬细胞来源外泌体活细胞分泌的纳米级胞外囊泡-外泌体鳄鱼脂肪干细胞来源外泌体提取鳄鱼脂肪干细胞冻干粉大鼠肠淋巴液外泌体分离技术非小细胞肺癌A549细胞培养上清中外泌体(Exosomes)提取方法脂肪干细胞(ADSCs)中提取外泌体间充质干细胞外泌体提取物外泌体提取试剂盒骨肉瘤干细胞外泌体脑组织外泌体多发性骨髓瘤患者血清外泌体人毛囊毛乳头细胞来源的外泌体(DPCExos)提取方法喉鳞癌患者血清外泌体人脐带间充质干细胞外泌体提取液提取根尖牙乳头干细胞(SCAP)来源的外泌体大鼠骨髓来源树突状细胞外泌体肝星状细胞(HSC)来源外泌体-提取物单采血小板来源外泌体提取番茄外泌体提取工艺来源于RNA的外泌体来源microRNA的外泌体PEG6000富集精液来源外泌体大鼠脂肪间充质干细胞来源的外泌体(Exo)骨髓间充质干细胞来源外泌体肿瘤细胞来源的外泌体(TDEXs)口腔癌来源外泌体-miRNAs负载MSCs来源外泌体的口服微球人嗅黏膜间充质干细胞(OM-MSCs)来源外泌体内皮祖细胞来源外泌体脂肪干细胞来源外泌体携带miR-27抑制白色脂肪妊娠期糖尿病(GDM)患者外周血胎盘来源外泌体中miRNA携带miRNAs的MSCs来源外泌体携带微RNA(microRNA,miRNA,miR)-196b-5p骨髓间充质干细胞(BMSCs)来源的外泌体来源子宫内膜间质细胞(ESC)外泌体微小RNA(miRNA)脂肪干细胞来源外泌体(ADSC-Exos)间充质干细胞来源外泌体(MSCs-exo)小鼠脂肪间充质干细胞(mASCs)来源外泌体(Exo)牙髓干细胞(DPSC)来源的外泌体PSCs-MSCs来源的外泌体MCF7/ADM细胞来源外泌体黑色素瘤细胞来源外泌体PD-L1牛乳腺上皮细胞来源外泌体axc。
细胞外囊泡的功能与临床应用研究
细胞外囊泡的功能与临床应用研究细胞外囊泡是指由细胞分泌出来的，直径在50-1000纳米之间的细胞外小泡。
它们在流体动力学中的运动行为非常类似于血浆中的红细胞和白细胞。
囊泡可以通过穿过细胞膜与它们接触的各种细胞相互作用来影响它们。
此外，它们还可以在运输等方面支持自己或他人的生物过程。
囊泡能够将重要的信息和信号转移至其他细胞，并且能够刺激细胞间相互通讯。
这对于很多疾病治疗至关重要，因此细胞外囊泡的研究吸引了越来越多的关注。
细胞外囊泡的分类细胞外囊泡由两种不同的方式进一步细分：渗透性细胞外囊泡和外泌体。
渗透性细胞外囊泡是最小的细胞外囊泡，直径在30至100nm之间。
它们是通过有钙信号刺激的击打破碎形成的，并且从细胞膜上分离出来。
渗透性细胞外囊泡被认为对于自体免疫疾病，如类风湿关节炎和系统性红斑狼疮，有极大的影响。
一些研究表明，它们可能会激活免疫细胞并参与免疫炎症过程。
外泌体一般指直径在100-1000纳米之间的囊泡。
它们与细胞膜相连，并且能够与其他细胞互动。
外泌体通常分为多种类型，例如神经元遗传物质外泌体和输送来源细胞的细胞外囊泡等等。
细胞外囊泡的功能细胞外囊泡在生物体内具有广泛的应用和功能。
最显著的功能之一就是囊泡之间的信号传递。
其中一个细胞可以释放出一个囊泡，以便向其他细胞传递信息和信号。
另外，细胞外囊泡也可以将重要的信息和物质转移给周围的细胞。
例如，肿瘤细胞会释放出细胞外囊泡，这些囊泡能够向其他细胞提供信号和物质，以误导它们，使得它们缺乏足够的保护，并进一步预示了癌细胞的霸权。
除了这两个主要的功能外，囊泡还有许多其他有益的应用。
细胞外囊泡的临床应用研究细胞外囊泡不仅在基础研究中有很大的作用，而且在临床研究中也有很大的发展潜力。
关于细胞外囊泡的临床应用研究，涉及药物输送、动物模型、癌症治疗等方面。
药物输送方面，细胞外囊泡被看作是一种非常有效的药物输送手段。
治疗药物可以装载在囊泡内，以便于治疗药物直接送达到所需的细胞。
细胞外囊泡（细胞微粒、外泌体）检测新趋势
细胞外囊泡（细胞微粒、外泌体）检测新趋势胞外囊泡细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）是指从细胞膜上脱落或者由细胞分泌的双层膜结构的囊泡状小体，直径从40nm到1000nm不等。
胞外囊泡主要由微囊泡（Microvesicles, MVs）和外泌体（Exosomes, Exs）组成，微囊泡是细胞激活、损伤或凋亡后从细胞膜脱落的小囊泡，直径约为100nm – 1000nm。
外泌体由细胞内的多泡小体（multivesicular bodies）与细胞膜融合后以外分泌的形式释放到细胞外，直径约为40nm - 100nm。
细胞外囊泡广泛存在于细胞培养上清以及各种体液（血液、淋巴液、唾液、尿液、精液、乳汁）中，携带有细胞来源相关的多种蛋白质、脂类、DNA、mRNA、miRNA等，参与细胞间通讯、细胞迁移、血管新生和免疫调节等过程。
在糖尿病、心血管疾病、艾滋病、慢性炎症疾病以及癌症中都发现细胞外囊泡水平的升高，它们很有可能成为这类疾病的诊断标志物，因此，对细胞外囊泡进行准确的定性和定量研究显得尤为重要。
细胞外囊泡的检测方法目前细胞外囊泡（EVs）的检测方法主要有扫描电子显微镜、原子力显微镜、动态光散射技术、纳米微粒追踪分析术（NTA）、流式细胞仪和ELISA等，由于通量高、用时短、操作简单，ELISA和流式细胞仪是比较常用的方法。
ELISA方法容易受其他可溶性抗原的干扰，而且无法知道囊泡的大小、数量等信息；流式细胞仪不仅可以检测囊泡的大小、数量，而且通过细胞特异的标记物染色可以检测囊泡的来源，将囊泡进行分类，因此，流式细胞仪理论上是进行囊泡快速、高通量、多参数检测的最优选择。
然而，传统流式细胞仪针对的样本主要是细胞，散射光的检测极限通常是300-500nm，而大多数细胞外囊泡的直径都在300nm以下，由于无法与背景噪音区分，直径小于300nm的细胞外囊泡很难被检测到，因此，囊泡数量往往被低估，检测结果自然也不准确[1]。
细胞外囊泡的生物学特性与应用研究
细胞外囊泡的生物学特性与应用研究细胞外囊泡（Extracellular Vesicles，EVs）是一类含有生物活性分子的小型膜囊泡，其直径通常在30-1000纳米之间。
EVs广泛存在于细胞外液中，包括了血浆、尿液、唾液和胆汁等多种体液中，是一种重要的细胞间通讯的介质。
EVs的形成是由细胞膜内侧脂质双层的一部分向外翻转而形成，从而把细胞内的蛋白质、核酸等生物活性分子包裹在内，并在膜上表达自身的标志物。
EVs的生物学特性包括了来源的多样性、大小的差异、形成机制的复杂性等。
EVs已被证实在细胞间的信息交流、免疫调节、转移及植入等多个方面起着关键作用。
比如，它们能够通过转移膜蛋白、miRNA、mRNA等生物活性分子来调节目标细胞的生命活动，如生长、分化、凋亡等，从而影响相关疾病的发生和发展。
此外，由于EVs具有很好的穿过生物膜的能力，因此对于一些具有药物疗效的分子如siRNA或某些化疗药物等完成体内靶向输送也是很有前景的。
EVs的应用研究已成为细胞学、生物工程、药物研发等多个服务领域的热点。
首先，EVs在肿瘤诊断方面有着很好的应用潜力。
因为肿瘤细胞释放的EVs中含有丰富的蛋白质、核酸等生物标记物，这些标记物的种类和数量变化可作为肿瘤治疗效果的潜在指标。
此外，EVs中的miRNA等核酸类分子可以作为生物标志物，指导药物靶向输送和治疗策略的制定。
其次，EVs的应用在干细胞治疗中也受到了广泛关注。
因为EVs能够向目标细胞释放特定的生物活性分子，从而引导损伤组织的修复或更新。
通过构建EVs基因载体，将特定的功能基因导入EVs中，从而实现定向转运、放大和增强生物活性分子的效应，这在干细胞治疗领域具有广泛的应用前景。
此外，EVs的应用也可以用于治疗某些代谢性疾病。
EVs中同时包含有具有多种功能的蛋白质、核酸，它们在膜上的特异性表达可以加强它们与目标细胞的亲和性和选择性，从而实现更好的靶向和更低的副作用。
最后，EVs还可以作为一种新型的纳米药物载体，用于传递化学、基因和免疫治疗药物。
细胞外囊泡在肿瘤标志物检测中的应用
细胞外囊泡在肿瘤标志物检测中的应用在当今医学领域，肿瘤的早期诊断和精准治疗一直是研究的重点和难点。
肿瘤标志物的检测对于肿瘤的筛查、诊断、预后评估以及治疗监测具有重要意义。
近年来，细胞外囊泡（Extracellular Vesicles，EVs）作为一种新型的生物标志物载体，逐渐在肿瘤标志物检测中展现出巨大的应用潜力。
细胞外囊泡是由细胞分泌的脂质双层膜包裹的微小囊泡，其直径在30 1000 纳米之间。
根据其大小和生物发生机制，可分为外泌体、微囊泡和凋亡小体等。
细胞外囊泡中包含了多种生物分子，如蛋白质、脂质、核酸（DNA、RNA）等，这些分子反映了来源细胞的生理和病理状态。
为什么细胞外囊泡在肿瘤标志物检测中备受关注呢？首先，肿瘤细胞比正常细胞分泌更多的细胞外囊泡，这使得它们在肿瘤患者的体液中含量相对较高，易于检测。
其次，细胞外囊泡能够穿越生物屏障，如血脑屏障，从而可以在多种体液中被检测到，包括血液、尿液、脑脊液等，为肿瘤的无创检测提供了可能。
再者，细胞外囊泡中的生物分子具有较高的稳定性，能够在恶劣的环境条件下保持其结构和功能完整性，有利于样本的采集、储存和运输。
在肿瘤标志物检测中，细胞外囊泡中的蛋白质是重要的检测指标之一。
肿瘤细胞来源的细胞外囊泡表面常表达特异性的蛋白质标志物，如上皮细胞黏附分子（EpCAM）、癌胚抗原（CEA）等。
通过检测这些蛋白质标志物的表达水平，可以辅助诊断肿瘤的类型和分期。
此外，细胞外囊泡中的蛋白质还可以反映肿瘤细胞的耐药性和治疗反应，为临床治疗方案的调整提供依据。
除了蛋白质，细胞外囊泡中的核酸也具有重要的诊断价值。
细胞外囊泡中包含的核酸主要有 mRNA、miRNA 和 DNA 等。
其中，miRNA作为一种小非编码 RNA，在肿瘤的发生、发展中发挥着重要的调控作用。
肿瘤细胞来源的细胞外囊泡中 miRNA 的表达谱与正常细胞存在显著差异，通过检测特定 miRNA 的表达水平，可以为肿瘤的诊断和预后评估提供有价值的信息。
细胞外囊泡在生物学中的作用及应用
细胞外囊泡在生物学中的作用及应用细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）是由细胞分泌的包裹着生物分子的小囊泡，其大小和形态可以因演化和细胞隶属类型而异。
近年来，越来越多的研究表明细胞外囊泡在细胞间信息传递和生物功能调控中具有重要作用，并且在许多疾病诊断和治疗中也有广泛的应用前景。
一、细胞外囊泡在生物学中的作用1. 细胞间信息传递细胞外囊泡可以作为一种信息传递的载体，在细胞间传递包括蛋白质、核酸、脂质、代谢产物等在内的生物大分子。
例如，神经元释放的细胞外囊泡可以向神经元和非神经元细胞传递神经递质、神经调节物质、内源性抗炎分子等，从而调节相关细胞的生物学行为。
肿瘤细胞释放的细胞外囊泡含有多种信息分子，如DNA、RNA、膜蛋白等，在肿瘤转移中发挥重要作用。
2. 细胞间基质调控细胞外囊泡可以在细胞间传递基质分子，如纤维连接蛋白、透明质酸、胶原蛋白等，从而调节邻近细胞的基质构建和细胞-基质互作。
3. 免疫调节细胞外囊泡内含大量的生物大分子，如蛋白质、核酸和脂质，是一种复杂的免疫调节体系的组成部分。
它们可以向免疫细胞提供重要信号，如抗原和刺激信号，从而影响宿主免疫响应和疾病发生发展。
二、细胞外囊泡在疾病诊断和治疗中的应用1. 疾病的生物标志物细胞外囊泡内的生物大分子在许多疾病中呈现不同的组成和数量，因此可以作为疾病的生物标志物。
例如，肿瘤细胞释放的细胞外囊泡中含有特定的蛋白质和核酸，因此可以用作肿瘤诊断和疾病预后评估的标志物。
2. 药物输送细胞外囊泡可以作为一种新的药物输送系统，具有高效和低毒性的特点。
研究人员发现，可以通过改变细胞外囊泡的生物学特性和结构，使其具有特定的药物承载性能，并且可以通过选择性地瞄准病变部位的细胞进行选择性释放，从而提高治疗效果。
3. 生物体外检测利用生物体外检测技术，可以通过分析体外分泌的细胞外囊泡来了解宿主细胞的生物状态和功能。
例如，研究人员发现血液中的细胞外囊泡含有丰富的宿主生物信息，可以用作心血管疾病和自身免疫性疾病的早期诊断和生物标志物。
细胞外囊泡在疾病诊断中的应用前景
细胞外囊泡在疾病诊断中的应用前景一、细胞外囊泡的基本概念与特性细胞外囊泡（Extracellular Vesicles，EVs）是细胞释放到细胞外环境中的纳米级或微米级囊泡结构，它们在细胞间的通讯、物质运输和信号传递中起着重要作用。
细胞外囊泡的发现和研究为理解细胞间的相互作用提供了新的视角，并且逐渐被认为是疾病诊断和治疗的潜在生物标志物。
1.1 细胞外囊泡的分类细胞外囊泡可以根据其生物生成途径和大小被分为几种类型，包括外泌体（Exosomes）、微囊泡（Microvesicles）和凋亡小体（Apoptotic bodies）。
外泌体通常在50-150纳米大小，由多囊泡体（MVBs）与细胞膜融合后释放；微囊泡则在100-1000纳米大小，通过细胞膜直接出芽形成；凋亡小体则更大，通常在1-5微米，由细胞凋亡过程中形成。
1.2 细胞外囊泡的组成细胞外囊泡的组成复杂，包含多种蛋白质、脂质、核酸等生物分子。
这些分子不仅反映了释放它们的细胞的生理状态，而且可以在囊泡的表面和内部携带特定的标志物，为疾病的诊断提供了潜在的生物标志物。
1.3 细胞外囊泡的生物功能细胞外囊泡参与了多种生物学过程，包括细胞间通讯、免疫调节、组织修复、病原体传播等。
它们通过携带特定的分子，可以影响接收细胞的行为和功能，从而在生理和病理过程中发挥作用。
二、细胞外囊泡在疾病诊断中的应用细胞外囊泡因其独特的生物学特性和在疾病发展中的作用，逐渐成为疾病诊断的新兴领域。
它们可以在多种体液中被检测到，包括血液、尿液、脑脊液等，为非侵入性诊断提供了可能。
2.1 肿瘤诊断在肿瘤诊断中，细胞外囊泡携带的肿瘤特异性蛋白、miRNA和DNA等分子可以作为肿瘤标志物。
通过分析这些分子的表达模式，可以对肿瘤的存在、发展阶段和治疗反应进行评估。
此外，肿瘤细胞释放的外泌体还可以反映肿瘤微环境的变化，为肿瘤的早期诊断和预后判断提供重要信息。
2.2 神经退行性疾病神经退行性疾病如阿尔茨海默病和帕金森病，其特征是神经细胞的逐渐丧失。
细胞外囊泡的产生与功能研究及其在疾病诊断中的应用
细胞外囊泡的产生与功能研究及其在疾病诊断中的应用细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）是一类从细胞内部释放出来的，大小在30-1000nm之间的小囊泡。
起初被认为是由于细胞死亡过程中的随机释放，现在已被证实是一种重要的细胞间信号递送系统。
近年来，随着对细胞外囊泡的深入研究，人们对其功能及其在疾病诊断和治疗方面的应用有了进一步认识。
产生机制细胞外囊泡的产生机制包括其来源和放出过程两个方面。
来源有三种：外泌体来源的细胞外囊泡（exosomes）、泡状体来源的细胞外囊泡（microvesicles），以及质膜剪切所塑造的小囊泡（ectosomes）。
放出过程也可以分为三种：被动释放、病毒介导释放和活性释放。
其中被动释放是由于细胞死亡或者受到异常刺激而导致的，而其他两种是主动释放，存在明显的调控机制。
功能细胞外囊泡具有多种功能。
首先，细胞外囊泡可以通过携带的生物分子（如蛋白质、核酸和脂质）影响目标细胞的生理和病理状态。
其次，细胞外囊泡可以通过应答自身环境的变化和信号递送调整其自身状态，并影响目标细胞的行为反应。
最后，细胞外囊泡可以作为一种独立的细胞群体，参与到生理和病理状态的维持和调节中。
应用细胞外囊泡在疾病的诊断和治疗方面具有广泛的应用前景。
首先，细胞外囊泡中携带的生物分子可以作为一种生物标志物，应用于肿瘤和心血管疾病等多种疾病的早期诊断。
其次，细胞外囊泡可以作为一种药物载体，可以携带多种药物递送到特定细胞内部，实现精准治疗，并且避免药物的副作用。
最后，细胞外囊泡可以作为一种疫苗载体，可以携带多种抗原刺激免疫系统，诱导免疫反应，从而预防多种传染病。
总之，细胞外囊泡作为一种新兴的细胞间信号递送体系，具有广泛的研究价值和应用前景。
在未来的疾病诊断和治疗中，细胞外囊泡将会扮演着越来越重要的角色。
细胞外囊泡在疾病监测中的应用
细胞外囊泡在疾病监测中的应用在当今医学领域，对于疾病的监测和诊断，科研人员们一直在不断探索创新的方法和技术。
细胞外囊泡（Extracellular Vesicles，EVs）的发现和研究，为疾病监测开辟了新的途径。
细胞外囊泡是由细胞释放到细胞外环境中的膜性小囊泡，其直径通常在 30 1000 纳米之间。
根据它们的大小、来源和生物发生机制，可以分为外泌体（Exosomes）、微囊泡（Microvesicles）和凋亡小体（Apoptotic bodies）等类型。
这些小小的囊泡可不简单，它们携带着丰富的生物信息，包括蛋白质、脂质、核酸（如 DNA、mRNA、microRNA 等）。
当细胞受到各种刺激或发生病理变化时，细胞外囊泡的内容物也会相应地发生改变。
因此，通过对细胞外囊泡的分析，我们能够获取到关于细胞生理和病理状态的重要线索。
在肿瘤疾病的监测中，细胞外囊泡发挥着重要作用。
肿瘤细胞会释放大量的细胞外囊泡，这些囊泡中包含着肿瘤特异性的标志物，如肿瘤相关抗原、突变的癌基因和抑癌基因等。
通过检测血液、尿液或脑脊液等体液中的肿瘤来源细胞外囊泡，可以早期发现肿瘤的存在，评估肿瘤的进展和治疗效果。
例如，在乳腺癌中，研究人员发现肿瘤细胞来源的外泌体中富含特定的 microRNA，如 miR-21、miR-10b 等。
这些 microRNA 可以促进肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移。
通过检测血液中这些外泌体 microRNA的水平，可以辅助乳腺癌的早期诊断和预后判断。
在心血管疾病方面，细胞外囊泡也展现出了巨大的应用潜力。
心血管疾病如心肌梗死、心力衰竭等，会导致心肌细胞损伤和死亡。
受损的心肌细胞会释放细胞外囊泡，其内容物的变化可以反映心肌损伤的程度和修复情况。
例如，心肌梗死患者血液中的细胞外囊泡中，某些蛋白质（如肌钙蛋白、肌红蛋白等）的含量会显著升高。
通过检测这些蛋白质的水平，可以及时诊断心肌梗死，并评估病情的严重程度。
外泌体（胞外囊泡）入门必看经典综述
外泌体（胞外囊泡）入门必看经典综述今天我们来看一下外泌体的近期研究进展：1. Sheddinglight on the cell biology of extracellular vesicles.Nat. Rev. Mol.Cell Biol. 2018 Apr ;19(4)这篇最新的影响因子46.6的综述文章从外泌体的特征（比如包含的蛋白）、产生过程、来源等进行了综述，是外泌体研究入门的经典哦。
Main features of extracellular vesiclesBiogenesis of extracellular vesicles.Origin of exosome diversity in relation to sorting machineries推荐指数：入门必看，五颗星2. NewTechnologies for Analysis of Extracellular Vesicles.Chem. Rev. 2018Feb 28 ;118(4)这篇综述偏重于研究胞外囊泡的技术方法，包括了外泌体的分离鉴定、成分的分析检测方法以及临床应用等等，可以说是研究外泌体的“红宝书”了：推荐指数：入门必看，五颗星3. Manufacturing Exosomes: A Promising Therapeutic Platform.Trends Mol Med 2018 Mar ;24(3)这篇综述主要围绕外泌体的生产展开，其中干细胞作为生产的来源细胞是重点：Exosomes and Stem Cell TransplantationDownstream Processing of Stem Cells.推荐指数：外泌体的临床应用和干细胞研究相关，五颗星。
4. Isolation andcharacterization of urinary extracellularvesicles: implications for biomarker discovery.Nat Rev Nephrol 2017 Dec ;13(12)这篇文章的角度是尿液外泌体用于疾病（特别是肾病）分子标志物的发现相关的流程，比如下图给出的是肾病综合征和正常人尿液中外泌体分离方法的比较：Comparison of approaches to isolate extracellular vesicles from the urine of healthy individuals and from patients with nephrotic syndrome.推荐指数：外泌体用于分子标志物研究，五颗星。
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产率: 85%
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含膜颗粒
荧光模式
百分比
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带荧光染料的抗体蛋白特异性标记
特异性结合的百分比 1 : 1 ….. 10,000 : 1
来自HEK 293 细胞的囊泡， 细胞的囊泡， 带Alexa488®的抗体
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带表面涂层的量子点
激发光 488 nm, 激发的荧光 605 nm
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参数 粒径大小
相关物理性质 粒径范围和分布, 颗粒团聚现象 剂量, 动力学变化 代谢
举例 外泌体 : 30 – 170 nm 微泡的存在
颗粒浓度 Zeta电位
(表面电荷)
治疗前后细胞外囊泡浓度的 变化 纳米金颗粒在表面处理前后 电荷的变化 抗体结合荧光标记
荧光
生化鉴定
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NTA
from
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截止2017年6月在Pubmed上发表的Exosomes的文章数量统计
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截止2017年6月在Pubmed上发表extracellular vesicles的文章数量统计
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30 – 100 nm
100 nm – 1 µm
1 µm - 5 µm
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Applications of ZetaView®
生物纳米颗粒 脂质体+胶束 药物运输 蛋白质团聚 病毒样颗粒 (VLP) 病毒样品 细胞外囊泡 (EV)
乳液 聚合物 荧光标记生物纳米颗粒 纳米金属颗粒 纳米气泡 量子点 不规则纳米颗粒
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布朗运动分析样品颗粒大小
什么是特异性检测?
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荧光 NTA (F-NTA)
λex
λem
EVs from HEK 293 cell line, AB with Alexa488®
颗粒，微泡， 脂质体等 抗体 荧光物质
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荧光标样的粒径和颗粒浓度图
40 100 200 nm
表面带荧光 探针的401000nm的 颗粒
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激光波长和荧光标记物
染料
光稳定性 +++ +++ +++ +++ + ++
激光波长 405 nm 488 nm 520 nm 660 nm
滤光片 430 LP 500 LP 550 LP 680 LP
Alexa® Fluor Atto Fluoresbrite® YG Quantum dots (405 or 488) Rhodamine B DiO, DiL, CMO PKH67 GFP FITC
细胞外囊泡的表征
纳米颗粒追踪分析技术 (NTA) 德国 ZetaView®
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Intraluminal vesicles(ILVs) (Johnstone 1987) Exosomes
外泌体
Théry et al. 2009 Van der Pool 2012
Apoptotic bodies Microvesicles
Raghu Kalluri教授
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国际细胞外囊泡协会主席和PMX老板
Andrew Francis Hill 教授
澳大利亚墨尔本拉筹伯大学 分子科学学院生物化学与基 因组学系主任。国际细胞囊 泡大会(ISEV)现任主席。
PMX公司老板： Margret Boeck （右一） Dr. Hanno Wachernig（左一）
5 µm -15 µm
血小板 细菌 病毒
微泡 外泌体
凋亡小体 细胞
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差速离心
密度梯度离心
细胞外囊泡分离的常规方法
体积排除色谱法
超滤
沉降 免疫捕获
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差速超速离心被认为是外泌体纯化的金标准，但是得到的产率较低
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细胞上清/尿液/唾液中外泌体分离的标准流程 超速离心
冲洗和自动对光 冲洗和自动对光
第一天 第二天
偏差 < 5%
第1次测试
第2次测试
第3次测试
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通过颗粒计数计算样品浓度
相机
激光
单位点测量体积 ~5 nL
线性相关
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理论比值和粒径分布曲线
100:1
50:1
20:1
10:1
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100 nm和500 nm颗粒人工混合
颗粒直径（NTA）/nm
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多维分析
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Au 60 nm
NTA 图片
PS 60 nm
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60nm 金颗粒和聚苯乙烯混合物
Au
2D: 光强 & 粒径
PS
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复杂混合物
金 60 nm
Gold
脂质体
Liposomes
微泡 凋亡小体
Ectosomes, Oncosomes,Microparticles Extracellular
外泌体和微泡其他的名称
Vesicles (ISEV)
统称细胞外囊泡
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以各种含膜纳米颗粒名称发表的文章数量
Lotvall, Hill et al, JEV (2014)
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聚苯乙烯荧光标样
纯粹的聚苯乙烯荧光标样
荧光聚苯乙烯和 未标记聚苯乙烯 颗粒数 1:1
散射模式 荧光模式
对荧光标记和未标记的颗粒数量进行定量
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定量百分比
* *** * * * ** *** * * * **
荧光标记
*** *** * * * * * ** * ** * * * * * * ** * * * ** * **
卵磷脂脂质体的表征
6.2 ∙ 1013 cm-3
2.4 · 1013 cm-3
n > 500
用水稀释200,000倍
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果汁中的纳米颗粒
AuNP 30 nm in orange fruit juice 低浓度（ 低浓度（金属） 金属）纳米颗粒的检测
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细胞外囊泡分析鉴定方法
1#: Western Blotting 2#: NTA (纳米颗粒追踪分析) 3#: TEM (透射电镜)
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各种颗粒分析方法 – 颗粒浓度要求的范围
DLS NTA FC
粒径大小/nm
颗粒浓度，每毫升颗粒数
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细胞外囊泡目前的主要研究方向
PS
聚苯乙烯 500 nm
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粒径大小
颗粒浓度
ZetaView® NTA
• 快速测量(几分钟) • 独特的自动设计可靠 • 重现性好, 偏差 <±5% • 扫描NTA得到的数据更可靠 • 辨别力 （通过荧光标记和多参数分析）
Zeta 电位 荧光
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谢谢大家 !
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10000个未标记的颗粒中有一个带荧光标记的颗粒
散射模式 nS
动态比值超过 可以超过 10,000 : 1
荧光模式 nF
比率 nS/nF
1:1
100 : 1
1,000 : 1
10,000 : 1
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细胞外囊泡用CMO染料染色 (520|550)
*
散射模式
• Zeta电位分布而 不是Zeta电位平 均值
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纳米金颗粒团聚
粒径大小
电导率范围
Zeta电位
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卵磷脂脂质体
粒径
Zeta电位
同一个样品粒径和Zeta电位测试结果放到一起得到散点图
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卵磷脂脂质体pH 滴定
Zeta电位
等电点 ~ pH 3.4
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2016.12.-2017.8参加过的学术会议和研讨会
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纳米颗粒追踪分析技术
进样
可视化
测量
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粒径大小 颗粒数量
ZetaView内部结构示意图
激光器
悬浮的纳米颗粒
Zeta 电位 荧光
样品池横截面
自动聚焦 数字化相机
物镜
配套的滤光片
R 1…10
很一致 10 < R < 520
推荐 一个视频，一个SOP
10…500 两次稀释，两个SOPs > 500 相机参数优化 两个视频，两个SOPs
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光学结构比较
光学放大
测量体积
放大倍数 测量体积
20 x ~ 1 nL
10 x ~ 5 nL
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