内毒素休克猕猴白细胞介素18mRNA变化规律的研究①

内毒素休克猕猴白细胞介素18mRNA变化规律的研究①孙可一　季晓辉　冯艳红　殷国庆②　(南京医科大学微生物学与免疫学系,南京210029) 中国图书分类号　R392.11 文献标识码　A 文章编号　10002484X(2004)0320158205[摘　要]　目的:研究猕猴实验性内毒素休克过程中,白细胞介素18(I L218)在外周血单个核细胞(P BMC)、肝脏及脾脏中mRNA表达水平的变化规律。

方法:静脉注射细菌内毒素(LPS)218mg/kg制成内毒素休克模型,利用源自人细胞因子基因序列的引物,建立荧光半定量reverse transcription(RT)2PCR方法,检测P BMCs、肝脏及脾脏中I L218mRNA表达水平的改变,并与T NF2α、I L21β相对照。

结果:LPS注射后120分钟P BMC中I L218的表达有显著增加,此时肝脏及脾脏中的mRNA表达水平也有增高;T NF2α在P BMCs中mRNA水平于LPS注射后60分钟即出现峰值,120分钟时肝脏和脾脏中的表达均显著增高;I L21β在P BMCs中mRNA表达峰值出现在60分钟,但120分钟时在肝脏和脾脏中mRNA表达水平增高不明显。

结论:在猕猴实验性内毒素休克过程中I L218的表达显著增高,但峰值晚于T NF2α、I L21β。

I L218可以由P BMCs和肝脏枯否细胞产生(也许还有脾脏巨噬细胞);T NF2α可能有广泛的细胞来源;I L21β主要由P BMCs在LPS刺激活化后产生并分泌至血浆。

[关键词]　内毒素休克;LPS;细胞因子;RT2PCRChanges of interleukin218mRNA in lipopolysaccharide induced monkey endotoxic shockSUN K e2Yi,JI Xiao2Hui,FENG Yan2Hong,YIN Guo2Qing.Department o f Microbiology and Immunology,Nanjing Med2 ical Univer sity,Nanjing210029,ChinaAbstract　Objective:T o evaluate the levels of interleukin18(I L218)mR N A in peripheral blood m on onuclear cells(P BM Cs),livers and s pleens in m onkey end otoxic sh ock m odels.M ethods:C yn om olgus m onkeys were injected i.v.w ith lipopolysaccharide(LPS)(218mg/kg)to prepare the end otoxic sh ock m odels.T he mR N A levels of I L218in P BM Cs,livers and s pleens were tested by flu orescence sem i2quantitative realtime reverse transcription(RT)2PCR and com pared w ith that of T NF2αand I L21β.R esu lts:I L218mR N A ex pression in P BM Cs remarkably increased at120m in a fter LPS adm inistration,s o did in livers and in s pleens at the same time.mR N A levels of T NF2αin P BM Cs peaked at60m in a fter LPS injection,and als o increased markedly at120m in in livers and s pleens.I L21βmR N A levels peaked at60m in in P BM Cs,and did n ot change s o much in livers and in s pleens.Conclusion:I L218mR N A ex pression in P BM Cs can be up2regulated by LPS,but changed latterly than T NF2αand I L21βin end otoxic sh ock cyn om olgus m onkeys.I t is presumed that I L218can be produced by P BM Cs and liver K upffer cells(maybe s plenic macrophages),and T NF2αis pro2 duced by a variety of cells,but I L21βin bloodstream mainly come from P BM Cs a fter LPS challenge.K ey w ords　Endotoxic shock;Lipopolysaccharide;Cytokine;RT2PCR 内毒素休克是一种以发热、低血压、弥漫性血管内凝血、多器官功能不全等为主的综合征,是临床上常见的危急病症,有较高的死亡率。

革兰阴性菌细胞壁的脂多糖———LPS(lipopolysaccharide)是引起毒性反应的主要原因。

LPS并不直接引起宿主的组织损伤,而是通过某些内源性炎症介质特别是细胞因子的过度分泌介导一系列病理生理反应。

内毒素休克过程中有一些因子可在炎症早期表达,被称为前炎症因子,如白细胞介素1β(I L21β)、肿瘤坏死因子α(T NF2α)、白细胞介素6(I L26)、白细胞介素8(I L2①南京市医学科技发展专项资金重点资助项目(CKG9809)②南京市第二医院内科,南京210003作者简介:孙可一(1971年-),女,免疫学硕士;指导教师:季晓辉(1955年-),男,从事细胞免疫学及免疫调节的研究。

8)、白细胞介素12(I L212)以及新近发现的I L218。

它们可以与细胞上的特异性受体结合,导致细胞内信号传导途径活化,调节基因转录1,并调节免疫细胞的活化、分化、增殖和存活,进而活化其他的细胞因子,或者放大前炎症反应。

在炎症反应中,前炎症因子的持续增加可导致血管功能状态的改变,末端器官损伤,多器官功能不全,甚至死亡。

其中,I L21β和T NF2α是研究较多的因子。

I L218发现较晚,内毒素休克循环系统及脏器的免疫细胞中表达的变化规律报道不多。

最新的研究表明,在LPS诱导的肝损伤中,I L218可能是各种前炎症因子中最上游的因子,在肝损伤中有重要意义2。

而I L218在猴内毒素休克中的变化规律尚未见报道。

本文研究了I L218 mRNA在猴内毒素休克中的变化规律,并与T NF2α、I L21β相对照,现报道如下。

1　材料与方法111　试剂　LPS源于大肠杆菌0127:B4,Sigma公司产品。

淋巴细胞分离液购自中国科学院天津血液研究所;Trizol RNA提取试剂盒购自GI BC O公司;M2 M LV、RNase Inhibitor购自Promega公司;PCR试剂: T aq酶、dNTP购自Promega公司;PCR纯化试剂盒购自Boehringer Mannheim公司;其他试剂均为实验用分析纯试剂。

112　引物　Olig odT,I L218:G CTTG AATCT AAAT2 T ATC AG TCG AAG ATTC AAATTG C ATCTT AT3;T NF2α: ATG AG C ACTG AAAG C ATG ATCTC AC AGGG C AATG ATC2 C C AAAG T AG ACCTG C4;I L21β:ATGG C AG AAG T ACC2 TG AG CTCTT AGG AAG AC AAC AAATTG C ATGG TG AA4;β2actin:TTCC AG CCTTCCTTCCTGG TTG CG CTC AGG AG2 G AG C AAT4均由上海生工生物技术服务公司合成,并达测序级纯度。

113　动物模型的建立及标本采集与处理　猕猴购自中科院上海实验动物中心,普通级,合格证书号为中科沪动管9920010号,共23只,平均(6117±111) kg,静脉插管,监控动脉压,按本实验室建立的方法制备内毒素休克模型。

将猕猴随机分成两组:①对照组5只,雌性2只,雄性3只,静脉注射生理盐水;②实验组18只,雌雄各半,静脉注射LPS,制内毒素休克模型,当动物平均动脉压下降30%时认为模型制成。

此时距LPS注射时间为60分钟,剂量为218 mg/kg。

分别于LPS注射的0,60,120分钟取静脉血10ml于无菌离心管中,E DT A2Na2抗凝,用淋巴细胞分离液分离P BMCs,分装于无RNA酶的离心管中(每管约106细胞),-70℃冻存,以提取RNA。

动物在120分钟时处死,取肝脏、脾脏各5g,迅速投入液氮中,以后再于-70℃冻存,以提取RNA。

114　细胞内细胞因子mRNA表达水平的测定　用Trizol试剂提取冻存的P BMCs(每管106个细胞)及肝脏、脾脏(011g)的总RNA,1μg RNA加入10μl反应混合液(包括50mm ol/L Tris2HCl pH810,75mm ol/ L K Cl,3mm ol/L MgCl2,10mm ol/L DDT,012μg引物Olig odT,250μm ol dNTPs,200U M2M LV,15U RNase Inhibitor),37℃水浴1小时,反转录合成cDNA第一链,加入荧光染料SY BR2G reenⅠ(终浓度为1∶10 000),在荧光定量PCR仪上进行realtime2PCR扩增。

在PCR扩增的指数期,于延伸期末将特异性片段与β2actin的荧光强度相比,得到mRNA的相对表达量。

115　RT2PCR产物测序　将PCR产物连接PGE M2T 载体,送宝生物工程有限公司测序。

116　数据统计　组间差异的评价采用t检验,以P<0105为显著性检验水准。

2　结果211　I L218mRNA在P BMCs、肝脏、脾脏中的表达　见表1、表2。

P BMCs中I L218mRNA于LPS刺激后60分钟有所增加,在120分钟时显著高于对照组(P<0105);肝脏中I L218的表达被LPS显著上调(P<0105);脾脏中I L218mRNA水平比对照组高。