动物肠道益生菌地衣芽孢杆菌的筛选及培养基的优化
鸡源益生菌的分离、筛选、鉴定与特性研究
华南理工大学硕士学位论文鸡源益生菌的分离、筛选、鉴定与特性研究姓名：陈琼申请学位级别：硕士专业：生物化工指导教师：杨汝德20040501摘要摘要本研究课题来源于广东省农业攻关项目“安全高效无残留的新型畜禽用微生态制剂的研制与应用”，文件编号为粤科技字［２００２］１４１号。
本实验内容是该项目的一部分，主要研究了从鸡的肠道中分离筛选出五种肠道菌，初步鉴定为肠道益生菌，在此基础上对各菌株的发酵特性进行探讨，并对各菌株拮抗致病菌和抗生素进行了探讨。
同时也探讨了筛选出的菌株间的拮抗性及相容性。
选用Ｂｓ培养基，从１５天龄小鸡的盲肠中分离筛选出双歧杆菌。
选用ｓＬ培养基，从ｌＯ天龄小鸡的小肠中分离筛选出乳酸杆菌。
选用Ｅｃ培养基，从３０天龄小鸡的盲肠中分离筛选出屎肠球菌。
选用ＢＬＩ培养基，从３０天龄小鸡的盲肠中分离筛选出地衣芽孢杆菌。
选用麦芽汁培养基，从成年鸡的盲肠中分离筛选出酵母菌。
对分离筛选获得的五种菌株进行初步鉴定：菌株Ｂ１７ｌ是双歧杆菌，菌株Ｍ１６是嗜酸乳杆菌，菌株ｗ０１９是屎肠球菌，菌株ＹＢ０２是地衣芽孢杆菌，菌株Ｂ１２ｌ是酵母菌。
双歧杆菌ＢＬ７１为革兰氏阳性严格厌氧菌，最佳培养条件是初始ｐＨ值７．０，最适培养温度为４０℃。
采用正交实验方法，确定最佳培养基配方为酵母膏０．９％．胰蛋白胨０．６％，大豆蛋白胨０．６％，葡萄糖２．５％，双歧因子０．２％，生氏因子ｌＯ％。
发酵培养时间１８ｈ。
在最佳培养条件下，Ｂ１７１的增殖菌数可达６．２×１０８个／ｍＬ。
嗜酸乳杆菌Ｍ１６为革兰氏阳性兼性厌氧菌，发酵培养时间１６ｈ，增殖菌数可达７。
ｌ×１０８个／ｍＬ。
屎肠球菌ｗＯｌ９为革兰氏阳性兼性厌氧菌，发酵培养时间１６ｈ，增殖菌数可达８．３×１０ｓ／ｍｌ。
地衣芽孢杆菌ＹＢ０２为革兰氏阳性好氧菌，其最佳培养条件为初始ｐＨ值６．５，最适培养温度３０～３２℃。
采用正交实验方法，确定最优培养基为酵母膏１．５％，玉米淀粉２．０％，Ｎａｉｌ２Ｐ０４＋Ｎａ２ＨＰＯ４０．２％＋Ｏ．２％，玉米浆２．０％。
地衣芽孢杆菌LNPU_1发酵条件研究及培养基优化
过 程 ， 通过改变摇床转速来调节通气量 ， 转速 太小 ， 通气量小 ， 不利于菌体生长 ； 但摇床转速太大时 ， 可 能会引起菌 体 自 溶 ， 使 得 生 物 量 减 少 ［５］ 。 选 取 １２０ｒ ／
２．１．４
生长曲线的测定
取培养好的斜面 ， 用接种环
１ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ ９ Ｋ１ Ｋ２ Ｋ３ Ｋ
２ １
挑 ３ 环接种于盛有 ３０ｍＬ无菌种子培养基的 ２５０ｍＬ三角 瓶中， 按单因素确定的最佳发酵条件， 摇床培养温 度 ３５℃， 振荡培养 ２４ｈ， 转速为 １８０ｒ／ｍｉｎ， 自接种后每
原发酵培养基结果 ５．１０× １０９ｃｆｕ／ｍＬ。
:;<： 地衣芽孢杆菌 ； 发酵 ； 培养基优化 ； 正交实验 =>?@A： ＴＳ２０１．３ BCDEF： Ａ BGHA： １００５－ ９９８９（２００６）０８－ ００２８－ ０３
Ｓ ｔｕｄｙ ａ ｎｄ ｏｐｔｉｍｉｚａ ｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｎ ｓ ｕｂｍｅ ｒｇｅ ｄ ｆｅ ｒｍｅ ｎｔａ ｔｉｏｎ ｏｆ ｂａ ｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅ ｎｉｆｏｒｍｉｓ ＬＮＰ Ｕ－ １
ＬＩＵ Ｙｉｎｇ１， ＳＵＮ Ｒｏｎｇ－ ｄａｎ １， ＹＡＮＧ Ｘｉａｎｇ－ ｈｕａ １＊， ＴＯＮＧ Ｍｉｎｇ－ ｙｏｕ ２， ＷＡＮＧ Ｌｉ１
（１．Ｃｏｌｌｅ ｇｅ ｏｆ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅ ｎｔ Ｅｎｇｉｎｅ ｅ ｒｉｎｇ， Ｌｉａ ｏｎｉｎｇ Ｕｎｉｖｅ ｒｓ ｉｔｙ ｏｆ Ｐ ｅ ｔｒｏｌｅ ｕｍ ａ ｎｄ Ｃｈｅ ｍｉｃａ ｌ Ｔｅ ｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｆｕｓ ｈｕｎ １１３００１； ２．Ｆｕｓ ｈｕｎ Ｒｅ ｓ ｅ ａ ｒｃｈ Ｉｎｓ ｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｐ ｅ ｔｒｏｌｅ ｕｍ ＆ Ｐ ｅ ｔｒｏｃｈｅ ｍｉｃａ ｌ， Ｆｕｓ ｈｕｎ １１３００１）
地衣芽孢杆菌W10菌株发酵培养基优化
ｅ ｆ ｆ ｅ ｃ ｔ ｏ ｆ ｔ ｈｅ Ｗ ｌ ０ ｓ ｔ ｒ ａ ｉ ｎ ｕｓ ｉ ｎ ｇ ｔ ｈ ｅ ｏｐｔ ｉ ｍｉ ｚ ｅ ｄ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕｒ ｅ ｍｅ ｄｉ ｕｍ ｏｎ Ｂ．ｃ ｉ ｎｅ ｒ ｅ ａ ｒ ｅ ａ ｃ ｈｅ ｄ ９ ０．３ ７ ，ｓ ｈｏ ｗｉ ｎｇ ａ ２２ ．３ ｃ ｏ ｍ ｐａ ｒ ｅ ｄ ｔ Ｏ ７ ３ ．９ ０ ｂ ｅ ｆ ｏｒ ｅ ｍｅ ｄｉ ｕｍ ｏｐｔ ｉ ｍｉ ｚ ａ ｔ ｉ ｏｎ．
ｃ ｏ ｓ ｅ ，７ ． ９ ６ ｇ ・Ｌ （ ＮＨ４ ） ２ Ｓ Ｏ４ ，０ ． ４ ５ ｇ ・Ｌ
Ｍｇ Ｓ Ｏ４ ，０ ． ４ ５ ｇ・Ｌ Ｋ２ ＨＰ Ｏ４ ，ａ ｎ ｄ ４ ． ５ ０ ｇ ・Ｌ— Ｎａ Ｃ １ ． Ｔｈ ｅ ｉ ｎ ｈ ｉ ｂ ｉ ｔ ｏ ｒ ｙ
镁 ０ ． ４ ５ 、 磷酸氢二钾 ０ ． ４ ５ 、 氯化 钠 ４ ． ５ Ｏ 。用优 化 培养 基 对 Ｗｌ ０菌 株 进 行 发 酵 培 养 ， 发 酵 液 对 灰 葡 萄 孢 的 抑 菌 率 为 ９ Ｏ ． ３ ７ ，比优 化 前 抑 菌 率 （ ７ ３ ． ９ ０ ） 提高 ２ ２ ． ３ 。
第 ３ ６ 卷第 １ 期
２ ０ １ ５年 ３月
扬 州大学学报（ 农 业 与生 命 科 学 版 ）
Ｊ ｏ ｕ ｒ ｎ ａ ｌ ｏ ｆ Ｙａ ｎ ｇ ｚ ｈ ｏ ｕ Ｕｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ（ Ａｇ ｒ ｉ ｃ ｕ ｈｕ ｒ ａ ｉ ａ ｎｄ Ｌｉ ｆ ｅ Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ Ｅｄ ｉ ｔ ｉ ｏ ｎ ）
ＡＢ Ｓ ＴＲＡＣＴ：Ｂａ ｃ ｉ ｌ ｌ ｕ ｓ ｌ ｉ ｃ ｈ ｅ ｎ ｉ ｆ ｏ ｒ ｍｉ ｓ Ｗｌ ０，ａ ｎ ａ ｎ ｔ ｉ ｆ ｕ ｎ ｇ ａ ｌ ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ｕ ｍ ｓ ｔ ｒ ａ ｉ ｎ，ｐ ｏ ｓ ｓ ｅ ｓ ｓ ｅ ｄ ｓ ｔ ｒ ｏ ｎ ｇ ｉ ｎ ｈ ｉ ｂ ｉ ｔ ｉ ｎ ｇ ｅ ｆ ｆ ｅ ｃ ｔ ｏ ｎ Ｂｏ ｔ ｒ ｙ ｔ ｉ ｓ
一株水产地衣芽孢杆菌的鉴定及培养基优化
１１１ 样 品来源 供试样品采 自湖北省武汉市多个养殖池塘的底泥． ．．
１１ 培养基 液体种子培养基 ： ５ｇ ．． ２ 含 牛肉膏、 蛋 白胨、 ａ １ １ｇ ０ ５ｇ Ｃ， Ｎ 定容至 １ ，Ｈ７０ 于 ０１ Ｐ 灭 ｐ ．， ． Ｍ ａ Ｌ
菌 ２ ｉ． ０ｍｎ 固体种子培养基则在上述培养基 中添加 ２ ％琼脂． 初始发酵培养基 ： ３ 葡萄糖 、 Ｎ ４ ２Ｏ 、． ｇ ｇＯ 、 ｇＮ Ｈ Ｐ ４定容至 １Ｌ ｐ ．， 含 Ｏｇ ２ ｇ（ Ｈ ）Ｓ ４ ５ Ｓ ４１ ａ ２Ｏ ， ０ ０ Ｍ ，Ｈ ７０ 于 ０１Ｍ ａ ． Ｐ 灭菌 ５ ｉ 培养基优化时按试验设计方案调整各组成成分． ０ｒｎ ａ ．
ｐ ｏｏｉ 。ｐ ｙｉｌｇ ・ｉｃ ｅ ｓｒ ｈ ｒｃｅ ｓｉｓａ ｄ １ Ｓ ｒ Ａ ｅ ｕ ｎ ｅ ａ ａｙ ｉ，ｓｒｉ Ｊ ０ ｈ ｌｇｃ ｈ ｓｏｏ ｙｂｏ ｈ ｍｉｔ ｃ ａａ ｔｒ ｔ ｎ ６ ＤＮ ｓｑ ｅ ｃ ｎ ｌｓ ｙ ｉ ｃ ｓ ｔ ｎ ｃ ０ １惴 ａ ｉｅ ｔ ｅ ８Ｂ ｃｌ ｓｌ ｈ ｎ－ ｄ ｎｉ ｄ ａ ａ ｉｕ ｃ ｅ１ ｉ ｆ ｌ ｉ
ｂａ ％ ， ａｂｍｄ ０２ ％ ａ ｄＮ ｉ Ｐ ４ ．５ ， ｅｐｃｉ ｌ．Ｕ ｄｒ ｅｃｎｉｏ １．５Ｘｌ ， ｂｃｅ ａｐｒ ｌｌｅ ｗ ｒ ｅｎ３ ｃｒａ ｉｅ ．５ ｎ ａ ２ Ｏ ０ １ ％ ｒ８ｅｔ ｅ ｌ ｖ ｙ ｎ ｅ ｔ ｏｄｔ ｎ １１ ｏ ｃ ａｔ ｅ ｍ ｌｉ ｒ ｅｅ ｈ ｉ ｉ ｒ ｉ ｉｔ
Ｙ Ａ ｅ ｉ ， Ｏ ｈ ｐ ｇ， Ｉ ｕ ， ＥＬ ， Ｈ Ｕ Ｑ ｎ１ Ｕ Ｎ Ｋ ． ｎ ・ Ｚ Ｕ Ｓｉ ｉ Ｌ Ｈ ｉ Ｚ Ｏ ｕ ． ｎ ｐ ｇ ．ｎ Ｇ ａ
（ ． ｅ ａｏａ ｒ ｆ ｒｓｗ ｔｒ ｉ ｉ ｒ ｔ Ｃ ｎｅｖｔ ｎａｄＵｉｚｔ ｎ １Ｋ ｙＬ ｂｒｔ ｙｏ ｅｈ ａｅ ｏ ｖ ｓｙ ｏｓｒａ ｏ ｎ ｔｉ ｉ ，Ｍｉｉｒ ０ ｇｉ ｔ Ｙ ｎ ｔ ｉ ｒ ｉ ｅ ｅ ｏ Ｆ Ｂ ｄ ｅ ｉ ｉ ｌａ ｏ ｎｓ ｙ ｆ ｒ ｕ ｕ ｔ Ａ ｃ ￣ ａｓ ｅＲｖ ｓ ｒ ｓ ｌ ｚ ｅ Ｆ ｈｉ
地衣芽孢杆菌饲料添加剂的研究开发现状与展望
地衣芽孢杆菌饲料添加剂的研究开发现状与展望田广斌刘自诚李国（安徽金农生物技术有限公司230088）摘要：地衣芽孢杆菌是芽孢杆菌中较具应用潜力的菌种之一。
近年来，国内外对于地衣芽孢杆菌各方面应用的报道日益增多。
本文主要对地衣芽孢杆菌作为饲料添加剂的作用与机理、应用效果、生产工艺、存在的问题及发展前景作了概述。
关键词：地衣芽孢杆菌；饲料添加剂；现状与前景地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)是芽孢杆菌中较具应用潜力的菌种之一。
近年来，国内外对于地衣芽孢杆菌各方面应用的报道日益增多，在医药、饲料加工、农药等行业，取得了较好的研究成果[1]。
1989年，美国FDA和美国饲料控制官员协会公布了可以直接饲喂且一般认为是安全的微生物物种，其中就包括地衣芽孢杆菌。
中华人民共和国农业部318号公告也把地衣芽孢杆菌列入饲料添加剂目录，但一直作为新饲料添加剂。
2010年，全国饲料评审委员会办公室在汇总行业意见的基础上，编制了2010版《饲料添加剂品种目录》。
征求意见通过后，地衣芽孢杆菌将由新饲料添加剂变为饲料添加剂，地衣芽孢杆菌也由“试用期”成功“转正”，这说明其安全性已经得到业内人士的肯定[2]。
目前我国地衣芽孢杆菌作为饲料添加剂应用于养殖业还处于起步阶段，还没有产业化的报道。
本文就地衣芽孢杆菌作为饲料添加剂的研究开发现状与发展前景作一概述，以期为地衣芽孢杆菌饲料添加剂的产业化提供参考。
1地衣芽孢杆菌饲料添加剂概述近年来，抗生素的残留和耐药性等问题日益引起人们的重视，世界各国正逐步限制或禁止在饲料中使用抗生素。
益生菌作为一种无毒、无残留、无抗药性的饲料添加剂，成为抗生素有效的替代产品之一。
目前常用的益生菌主要有乳酸菌、芽孢杆菌、光合细菌和真菌四大类，而芽孢杆菌因其抗逆性强、耐高湿高压、易贮存等优良特性，且具有调节肠道菌群平衡、增强动物免疫力、提高生产性能等诸多功能，被认为是最理想的微生物添加剂[3]。
地衣芽孢杆菌发酵条件优化和抑菌活性测定
中国畜牧兽医 2022,49(7):2812-2819C h i n aA n i m a lH u s b a n d r y &V e t e r i n a r y Med i c i ne 地衣芽孢杆菌发酵条件优化和抑菌活性测定张 钰1,马 曦2,赵金标2,鲁 琳1(1.北京农学院动物科学技术学院,北京102206;2.中国农业大学动物科学技术学院,北京100193)摘 要:ʌ目的ɔ探究不同培养及发酵条件对地衣芽孢杆菌19148抑菌作用的影响及地衣芽孢杆菌19148的耐药性㊂ʌ方法ɔ设计单因素试验,分别在不同温度㊁酸碱度㊁金属离子㊁摇床转速㊁发酵时间和接种量的条件下培养地衣芽孢杆菌19148菌液,将培养后的菌液离心㊁过滤制成无菌滤液,并通过牛津杯抑菌试验探究无菌滤液对大肠杆菌K 88㊁鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌1882的抑制能力㊂通过药敏纸片法探究地衣芽孢杆菌19148对27种抗菌药的耐药性㊂ʌ结果ɔ地衣芽孢杆菌19148在4和75ħ下生长受到抑制,25㊁37和45ħ能正常生长,其中在37ħ抑菌活性最好㊂在p H5.0~9.0的条件下能正常生长,在p H 为6.0条件下抑菌活性最好,对铜离子不耐受,但对镁离子表现出了良好的耐受性,且不同浓度镁离子处理组间抑菌活性无显著差异(P >0.05)㊂体外发酵试验中,地衣芽孢杆菌19148在3%种子液接种量㊁150r /m i n 发酵28h 时,体外发酵的抑菌活性最好㊂耐药性评价试验结果显示,地衣芽孢杆菌19148对青霉素㊁四环素㊁头孢他啶㊁呋喃唑酮和多黏菌素B5种抗菌药中介,对头孢哌酮和红霉素等其他22种抗菌药敏感㊂ʌ结论ɔ地衣芽孢杆菌19148具有较好的稳定性,能应用于工业发酵饲料生产,对抗菌药不具有耐药性㊂关键词:地衣芽孢杆菌;发酵条件;抑菌活性;耐药性;益生菌制剂中图分类号:S 852.61+5文献标识码:AD o i :10.16431/j.c n k i .1671-7236.2022.07.040 开放科学(资源服务)标识码(O S I D ):收稿日期:2022-01-17基金项目:博士后创新人才支持计划(B X 20200365);中国农业大学横向项目 高效I G F -1和生物酵母技术开发 (201905410411435)联系方式:张钰,E -m a i l :z y 155********@163.c o m ㊂通信作者赵金标,E -m a i l :ji n b i a o z h a o @c a u .e d u .c n ;鲁琳,E -m a i l :l u l i n @b u a .e d u .c n O pt i m i z a t i o no f F e r m e n t a t i o nC o n d i t i o n s a n dD e t e r m i n a t i o no f A n t i b a c t e r i a l A c t i v i t y of B a c i l l u s l i c h e n i f o r m i s Z H A NG Y u 1,MA X i2,Z H A OJ i n b i a o 2,L U L i n1(1.C o l l e g e o f A n i m a lS c i e n c e a n dT e c h n o l o g y ,B e i j i n g U n i v e r s i t y o f A gr i c u l t u r e ,B e i j i n g 102206,C h i n a ;2.C o l l e g e o f A n i m a lS c i e n c e a n dT e c h n o l o g y ,C h i n aA g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y ,B e i j i n g 100193,C h i n a )A b s t r a c t :ʌO b j e c t i v e ɔT h e o b j e c t i v e o f t h i s s t u d y w a s t o i n v e s t i ga t e t h e e f f e c t s o f d i f f e r e n t c u l t u r e a n d f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so nt h ea n t ib ac t e r i a l a b i l i t y o f B a c i l l u s l i c h e n i fo r m i s 19148a n dt h e r e s i s t a n c e o f B a c i l l u s l i c h e n i f o r m i s 19148.ʌM e t h o d ɔB a c i l l u s l i c h e n i fo r m i s 19148w a s c u l t u r e d u n d e r d i f f e r e n t c o n d i t i o n so f t e m p e r a t u r e ,p H ,m e t a l i o n s ,s h a k i n g s pe e d ,f e r m e n t a t i o nt i m ea n d i n o c u l a t i o na m o u n t i nas i ng l e f a c t o r e x p e r i m e n t a l d e s i g n ,r e s p e c t i v e l y ,th e nc e n t ri f u g ea n df i l t e r t h e c u l t u r e dl i q u i di n t os t e r i l ef i l t r a t et os t u d y i n h i b i t i o na b i l i t y a ga i n s t E s c h e r i c h i ac o l i K 88,S a l m o n e l l a T y p h i m u r i u ma n d S t a p h yl o c o c c u s a u r e u s 1882u s i n g o x f o r dc u p b a c t e r i o s t a t i c t e s t .T h e d r u g r e s i s t a n c eo f B a c i l l u sl i c h e n i fo r m i s 19148t o27a n t i b i o t i c s w a ss t u d i e d b y d r u g s e n s i t i v e p a p e rm e t h o d .ʌR e s u l t ɔB a c i l l u s l i c h e n i f o r m i s 19148c o u l d g r o wn o r m a l l y a t 25,37a n d 45ħ,a n dw a s i n h i b i t e da t 4a n d75ħ,a n dh a d t h eb e s t a n t i b a c t e r i a l a c t i v i t y at 37ħ.B a c i l l u s l i c h e n i fo r m i s 19148c o u l d g r o w n o r m a l l y i nt h e p H r a n g e df r o m 5.0t o9.0a n dh a dt h eb e s t a n t i b a c t e r i a l a c t i v i t y a t p H 6.0.B a c i l l u s l i c h e n i fo r m i s 19148w a s i n t o l e r a n t t oc o p p e r i o n s ,b u t7期张钰等:地衣芽孢杆菌发酵条件优化和抑菌活性测定c o u ld t o le r a t em a g n e s i u mi o n s,a n dt h e r ew a sn os i g n if i c a n td i f f e r e n c ea m o ng t r e a t m e n t g r o u p s w i t hd i f f e r e n t m a g n e s i u mi o nc o n c e n t r a t i o n s.I n i nv i t r o f e r m e n t a t i o n,B a c i l l u s l i ch e ni f o r m i s 19148s h o w e d t h eb e s t a n t i b a c t e r i a l a c t i v i t y u n d e r t h ec o n d i t i o n so f3%s e e d l i q u i d i n o c u l a t i o n, a n d150r/m i n f e r m e t a t i o n f o r28h.I n t h e d r u g r e s i s t a n c e e v a l u a t i o n t e s t,B a c i l l u s l i c h e n i f o r m i s 19148s h o w e d m o d e r a t e s e n s i t i v i t y t o p e n i c i l l i n,t e t r a c y c l i n e s,c e f t a z i d i n e,f u r a z o l i d o n e a n d p o l y m y x i nB,a n ds h o w e dh i g hs e n s i t i v i t y t ot h eo t h e r22a n t i b i o t i c ss u c ha sc e f o p e r a z o n ea n d e r y t h r o m y c i n.ʌC o n c l u s i o nɔB a c i l l u s l i c h e n i f o r m i s19148h a d g r e a t s t a b i l i t y a n d c o u l db e u s e d i n t h e p r o d u c t i o no f i n d u s t r i a l f e r m e n t e d f e e dw i t h o u t a n t i b i o t i c r e s i s t a n c e.K e y w o r d s:B a c i l l u s l i c h e n i f o r m i s;f e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n s;a n t i b a c t e r i a l a c t i v i t y;d r u g r e s i s t a n c e; p r o b i o t i c s抗生素能通过其分子结构识别靶细菌膜表面的结合位点[1],抑制细菌生长甚至灭杀细菌㊂畜牧业中使用抗生素虽能提高畜禽的生长性能,但同时也带来许多危害[2-3]㊂目前,全球畜牧业禁抗已成为趋势,欧盟畜牧业在20世纪末陆续禁用维吉尼亚霉素㊁螺旋霉素等多种抗生素[4]㊂但各国畜牧业禁抗后陆续出现畜禽生产性能下降,疾病发生率上升等问题[5-6]㊂中国农业农村部第194号公告规定自2020年1月1日起,退出除中药外的所有促生长类药物饲料添加剂品种,自2020年7月1日起,饲料生产企业停止生产含有促生长类药物饲料添加剂(中药类除外)的商品饲料㊂寻找合适的替抗产品对中国畜牧业今后的发展极为重要㊂地衣芽孢杆菌作为替代抗生素的饲用益生菌,能分泌纤维素酶㊁几丁质酶等多种外源酶[7],可帮助畜禽消化饲料[8],改善肠道组织结构[9-10]㊂地衣芽孢杆菌具有广泛的抑菌谱,能抑制致病菌黏附在肠黏膜表面,并通过分泌多种脂肽类抑菌物质来抑制致病菌的生长[11-13],且对部分真菌及霉菌具有良好的抑制作用[14]㊂此外,有研究显示,亲缘个体间的肠道菌群存在相似性[15],地衣芽孢杆菌改变畜禽亲代肠道菌群可能对子代肠道微生物区系造成影响㊂目前,地衣芽孢杆菌已被欧美多国批准用于畜牧业生产[16-17]㊂地衣芽孢杆菌在畜牧业中应用还需探究发酵过程中的各项参数,且不同地衣芽孢杆菌菌株可能携带有不同抗生素抗性基因[18],需探究其生物安全问题㊂本研究基于前期筛选得到的1株地衣芽孢杆菌19148,测定其在体外发酵的抑菌活性及适宜的发酵条件,分析其对多种抗菌药的耐药性,以期为下一步利用地衣芽孢杆菌生产畜禽发酵饲料,探究其发挥益生功能的机理机制提供研究依据㊂1材料与方法1.1供试菌株地衣芽孢杆菌19148(B a c i l l u s l i c h e n i f o r m i s 19148)由中国农业大学农业农村部饲料工业中心分离和保存[19];供试致病菌大肠杆菌(E s c h e r i c h i a c o l i K88)㊁鼠伤寒沙门氏菌(S a l m o n e l l a T y p h i m u r i u m)和金黄色葡萄球菌(S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s1882)均由中国农业大学农业农村部饲料工业中心动物营养国家重点实验室保存㊂1.2培养基L B培养基㊁MH A培养基(北京奥博星生物技术有限公司);药敏纸片(杭州微生物试剂有限公司)㊂1.3地衣芽孢杆菌19148抑菌条件分析1.3.1 不同p H对地衣芽孢杆菌19148抑菌效果的影响设置p H2.0~12.0共11个处理,每个处理3个重复㊂用1m m o l/L的N a O H和0.5m m o l/L的H C l调整L B液体培养基p H㊂制备好的培养基用高压灭菌锅灭菌,冷却后用无菌接种环挑取地衣芽孢杆菌19148单菌落接种到100m L液体培养基中,37ħ㊁200r/m i n培养24h㊂将培养得到的菌液7500r/m i n离心15m i n,取上清液,用0.2μm滤膜过滤制成无菌滤液㊂另用无菌生理盐水分别将大肠杆菌K88㊁鼠伤寒沙门氏菌㊁金黄色葡萄球菌1882菌液稀释至D600n m值为0.05,按照1ʒ50的比例与L B固体培养基混合后,取20m L倒入培养皿,牛津杯打孔后向孔中加入200μL无菌滤液,37ħ恒温培养箱中培养24h,观察并记录抑菌圈直径㊂1.3.2不同温度对地衣芽孢杆菌19148抑菌效果的影响设置4㊁25㊁37㊁45和75ħ共5个处理,每个处理3个重复㊂将接种后的培养基置于相对应的温度条件下,200r/m i n培养24h㊂取菌液制3182中国畜牧兽医49卷备成无菌滤液,以牛津杯抑菌试验检测其抑菌活性㊂1.3.3不同浓度金属离子对地衣芽孢杆菌19148抑菌效果的影响设置0㊁1㊁2㊁4m m o l/L的铜离子组和镁离子组共8个处理,每个处理3个重复㊂用硫酸铜和硫酸镁调整L B液体培养基中铜离子和镁离子的浓度,无菌接种环挑取单菌落进行接种, 37ħ㊁200r/m i n培养24h㊂取菌液制备成无菌滤液,以牛津杯抑菌试验检测其抑菌活性㊂1.4地衣芽孢杆菌19148体外发酵最适条件探究用接种环挑取L B固体培养基表面的地衣芽孢杆菌19148单菌落,接种到盛有50m LL B液体培养基的三角瓶中(100m L规格),放入摇床37ħ㊁200r/m i n培养24h后作为种子液,后续试验用种子液进行液体接种,并以无菌发酵液的抑菌圈直径为指标,探究地衣芽孢杆菌19148的最适发酵条件㊂1.4.1不同种子液接种量对地衣芽孢杆菌19148体外发酵的影响设置1%㊁3%㊁5%和7%接种量共4个处理,每个处理3个重复㊂向灭菌后的L B 液体培养基中按照种子液体积百分比进行接种, 37ħ㊁200r/m i n发酵24h,发酵液经离心过滤后制成无菌发酵滤液,以牛津杯抑菌试验检测其抑菌活性㊂1.4.2不同发酵时间对地衣芽孢杆菌19148体外发酵的影响设置16㊁20㊁24㊁28和32h共5个处理,每个处理3个重复㊂将种子液按照1%体积百分比接至L B液体培养基,37ħ㊁200r/m i n发酵,并在相应的时间点取样,制备成无菌发酵滤液,以牛津杯试验检测其抑菌活性㊂1.4.3不同摇床转速对地衣芽孢杆菌19148体外发酵的影响设置100㊁150㊁200㊁250和300r/m i n共5个处理,每个处理3个重复㊂L B液体培养基中接种1%种子液,37ħ发酵24h后以牛津杯试验检测无菌发酵滤液的抑菌活性㊂1.5地衣芽孢杆菌19148耐药性评价以麦氏比浊管作为参考标准,用无菌生理盐水将地衣芽孢杆菌19148菌液稀释至0.5麦氏浊度单位(M C F),菌液浓度约为1.5ˑ108C F U/m L,并用L B培养基作为比对,排除培养基本身颜色对的菌液浊度的干扰㊂用无菌棉拭子蘸取少量稀释后的菌液涂布于MH A培养基表面,待干燥后将含有不同抗菌药的滤纸片贴附在MH A培养基表面,37ħ培养24h,测量并记录抑菌圈直径㊂无抑菌圈或抑菌圈直径<10m m为耐药,抑菌圈直径在10~15m m之间为中介,抑菌圈直径>15m m为敏感㊂1.6数据统计分析采用E x c e l2010和S P S S23.0软件对试验数据进行统计分析,对不同处理组间的差异进行单因素方差分析,应用D u n c a n s法进行差异显著性检验㊂P<0.05表示差异显著,0.05<P<0.10表示具有差异趋势㊂2结果2.1地衣芽孢杆菌19148抑菌条件分析2.1.1不同p H对地衣芽孢杆菌19148抑菌作用的影响p H为2.0㊁3.0㊁4.0㊁10.0㊁11.0㊁12.0处理组地衣芽孢杆菌19148生长受到抑制,菌液较为澄清㊂p H为5.0㊁6.0㊁7.0㊁8.0㊁9.0处理组地衣芽孢杆菌19148有明显的生长迹象,其无菌滤液对金黄色葡萄球菌1882没有抑制效果,对大肠杆菌K88和鼠伤寒沙门氏菌有明显的抑制作用,其中p H5.0㊁6.0和7.0处理组的抑菌效果显著高于p H 8.0和9.0处理组(P<0.05),且3组间无显著差异(P>0.05)(图1)㊂大肠杆菌K88组间,不同大写字母表示差异显著(P< 0.05),相同大写字母表示差异不显著(P>0.05);鼠伤寒沙门氏菌组间,不同小写字母表示差异显著(P<0.05),相同小写字母表示差异不显著(P>0.05)㊂下同A m o n g E s c h e r i c h i a c o l i K88g r o u p s,d i f f e r e n t c a p i t a l l e t t e r s i n d i c a t e d s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e(P<0.05),w h i l et h es a m e c a p i t a l l e t t e r s i n d i c a t e d n o s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e(P>0.05);A m o n g S a l m o n e l l a T y p h i m u r i u m g r o u p s,d i f f e r e n t l o w e r c a s e l e t t e r s i n d i c a t e d s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e(P<0.05), w h i l et h es a m el o w e r c a s el e t t e r si n d i c a t e d n o s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e(P>0.05).T h e s a m e a sb e l o w图1不同p H对地衣芽孢杆菌19148抑菌作用的影响F i g.1E f f e c t o f d i f f e r e n t p Ho n t h e b a c t e r i o s t a s i s o f B a c i l l u s l i c h e n i f o r m i s1914841827期张 钰等:地衣芽孢杆菌发酵条件优化和抑菌活性测定2.1.2 不同温度对地衣芽孢杆菌19148抑菌作用的影响 4和75ħ处理组地衣芽孢杆菌19148生长明显受到抑制,菌液较为澄清;25㊁37和45ħ处理组正常生长㊂37ħ处理组无菌滤液对沙门氏菌和大肠杆菌K 88有抑菌活性(P <0.05),不抑制金黄色葡萄球菌1882;4㊁25㊁45和75ħ处理组无菌滤液对3种致病菌均无抑菌活性(图2)㊂图2 不同温度对地衣芽孢杆菌19148抑菌作用的影响F i g .2 E f f e c t o fd i f f e r e n t t e m p e r a t u r e so nt h eb a c t e r i o s t a s i s o f B a c i l l u s l i c h e n i fo r m i s 191482.1.3 不同浓度金属离子对地衣芽孢杆菌19148抑菌作用的影响 不同浓度硫酸铜处理组无菌滤液对大肠杆菌K 88㊁沙门氏菌和金黄葡萄球菌1882均没有抑制作用㊂1㊁2和4m m o l /L 镁离子处理组无菌滤液对大肠杆菌K 88的抑菌活性没有显著性差异(P >0.05),且3组均显著高于0m m o l /L 镁离子处理组(P <0.05)㊂0㊁1和2m m o l /L 镁离子处理组对鼠伤寒沙门氏菌的抑菌活性没有显著性差异(P >0.05),且3组均显著高于4m m o l /L 镁离子处理组(P <0.05)(图3)㊂图3 不同浓度镁离子对地衣芽孢杆菌19148抑菌作用的影响F i g .3 E f f e c t o fd i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n so fm a g n e s i u mi o n s o n t h e b a c t e r i o s t a s i s o f B a c i l l u s l i c h e n i fo r m i s 191482.2 地衣芽孢杆菌19148体外发酵最适条件探究2.2.1 不同种子液接种量对地衣芽孢杆菌19148体外发酵的影响 3%和5%接种量处理组无菌滤液对大肠杆菌K 88的抑菌活性显著高于1%组和7%组(P <0.05),且3%和5%组之间无显著差异(P >0.05),1%㊁3%和5%接种量处理组无菌滤液对鼠伤寒沙门氏菌的抑菌活性显著性高于7%组(P <0.05),且3组间没有显著性差异(图4)㊂图4 不同种子液接种量对发酵液抑菌作用的影响F i g .4 E f f e c t o f d i f f e r e n t i n o c u l u ma m o u n t o f s e e d l i q u i do n t h e b a c t e r i o s t a s i s o f f e r m e n t a t i o n l i qu i d 2.2.2 不同发酵时间对地衣芽孢杆菌19148体外发酵的影响 28h 处理组无菌滤液对大肠杆菌K 88和鼠伤寒沙门氏菌的抑菌效果显著高于20㊁24和32h 处理组(P >0.05)(图5)㊂图5 不同发酵时间对发酵液抑菌作用的影响F i g.5 I n f l u e n c e o f d i f f e r e n tf e r m e n t a t i o n t i m e o n t h e b a c t e r i o s t a s i s o f f e r m e n t a t i o nb r o t h2.2.3 不同摇床转速对地衣芽孢杆菌19148体外发酵的影响 150和200r /m i n 处理组无菌滤液的抑菌效果显著高于100㊁250和300r /m i n 处理组(P <0.05),且两组之间无显著性差异(P >0.05)(图6)㊂5182中 国 畜 牧 兽 医49卷图6 不同摇床转速对发酵液抑菌作用的影响F i g .6 E f f e c t o f d i f f e r e n t r o t a t i n g s pe e dof s h a k e r o n t h e b a c t e r i o s t a s i s o f f e r m e n t a t i o nb r o t h 2.3 耐药性评价地衣芽孢杆菌19148对27种抗菌药耐药性检测结果显示,地衣芽孢杆菌19148对青霉素㊁四环素㊁头孢他啶㊁呋喃唑酮和多黏菌素B5种抗菌药表现出中介,对诺氟沙星㊁氨苄西林㊁氯霉素等其他22种抗菌药表现出敏感(表1)㊂表1 地衣芽孢杆菌19148对27种抗菌药的耐药性T a b l e 1 D r u g r e s i s t a n c e o f B a c i l l u s l i c h e n i f o r m i s 19148t o 27k i n d s o f a n t i b i o t i c s m m抗菌药A n t i b i o t i c s抑菌圈直径I n h i b i t i o n z o n e d i a m e t e r /m m耐药性R e s i s t a n c e 喹诺酮类Q u i n o l o n e s诺氟沙星N o r f l o x a c i n 22.11敏感环丙沙星C i pr o f l o x a c i n 25.03敏感氧氟沙星O f l o x a c i n 23.74敏感青霉素类P e n i c i l l i n s青霉素P e n i c i l l i n15.56中介氨苄西林A m p i c i l l i n 16.38敏感苯唑西林O x a c i l l i n 15.72敏感酰胺醇类A m ph e n i c o l s 氯霉素C h l o r o a m p h e n i c o l 25.52敏感四环素类T e t r a c yc l i n e s 多西环素D o x y c y c l i n e 20.76敏感米诺环素M i n o c y c l i n e 20.34敏感四环素T e t r a c y c l i n e s 12.65中介大环内酯类M a c r o l ide s新霉素N e o m y c i n 25.52敏感麦迪霉素A b o r e n23.61敏感红霉素E r y t h r o m y c i n 27.71敏感氨基糖苷A m i n o g l yc o s ide s 丁胺卡那A m i k a c i n 22.43敏感庆大霉素G e n t a m i c i n 22.31敏感卡那霉素K a n a m y c i n 21.64敏感头孢菌素类C e p h a l o s po r i n s 头孢他啶C e f t a z i d i m e 11.83中介头孢曲松C e f t r i a x o n e26.65敏感头孢哌酮C e f o p e r a z o n e 18.52敏感头孢唑林C e f a z o l i n 35.53敏感头孢呋辛C e f u r o x i m e21.36敏感头孢拉定C e f r a d i n e43.41敏感糖肽类G l y c o p e pt i d e s 万古霉素V a n c o m yc i n 18.52敏感林可霉素类L i n c o m yc i n 克林霉素C l i nd a m yc i n 22.14敏感61827期张钰等:地衣芽孢杆菌发酵条件优化和抑菌活性测定续表抗菌药A n t i b i o t i c s抑菌圈直径I n h i b i t i o n z o n e d i a m e t e r/m m耐药性R e s i s t a n c e硝基呋喃类N i t r o f u r a n s呋喃唑酮F u r a z o l i d o n e13.81中介磺胺类S u l f o n a m i d e s复方新诺明C o m p o u n d s u l f a m e t h o x a z o l e29.05敏感多肽类P o l y p e p t i d e s多黏菌素BP o l y m y x i nB12.31中介3讨论3.1地衣芽孢杆菌19148抑菌条件分析饲用益生菌应用于发酵饲料的生产,首先要具备较强的抗逆性㊂饲用益生菌需要在高温加工㊁低温冷藏等饲料加工工艺过程中保持益生功能㊂王芬等[20]利用枯草芽孢杆菌发酵花生粕,发现在36ħ枯草芽孢杆菌的生物活性最高,且随温度升高或降低,其活性逐渐下降㊂苗永美等[21]通过单因素试验探究p H对枯草芽孢杆菌抑菌活性的影响,结果显示,当初始p H为5.0时,菌株发酵物的抑菌率最高㊂王晓洁等[22]探究镁离子浓度对侧孢短芽孢杆菌分泌抗菌脂肽的影响发现,在13.01g/L镁离子发酵液中抗菌脂肽含量最多㊂本试验中,地衣芽孢杆菌19148表现出了对外界培养条件良好的耐受性,且菌株抑菌活性的最适培养条件与前人研究一致㊂3.2地衣芽孢杆菌19148体外发酵最适条件探究饲用益生菌在不同的发酵条件下会产生不同的发酵产物,为降低益生菌发酵饲料的生产成本,需对其发酵培养条件进行优化,从而提高发酵效果和益生能力㊂李光月等[23]利用响应面试验对枯草芽孢杆菌的发酵工艺进行优化,结果显示,枯草芽孢杆菌在200r/m i n的转速下,表面活性素的产量最大㊂秦楠等[24]探究了1株解淀粉枯草芽孢杆菌的发酵特性,结果表明在接种量3%㊁发酵13h时,其无菌发酵滤液的抑菌活性最好㊂但也有研究指出,枯草芽孢杆菌的最适接种量为1.46%[25]㊂导致这种差异的主要原因可能是发酵液营养水平及不同芽孢杆菌菌株生长速率的不同㊂本试验结果显示,在3%接种量㊁150r/m i n发酵28h时,地衣芽孢杆菌19148抑菌活性最好㊂3.3地衣芽孢杆菌19148耐药性评价长久以来,细菌间获取和发展一系列抗生素耐药机制一直是益生菌应用于畜禽饲料生产的重要阻碍㊂益生菌产品想要真正替代畜牧业中促生长类抗生素的使用,不仅自身不能对抗生素表现出耐药性,且不能使肠道病原菌对益生菌发挥抑菌活性的途径产生新的耐药机制㊂由于地衣芽孢杆菌属细菌的遗传相似度很高,很难用遗传标记物进行鉴定和分类,而这就需要在菌株水平对地衣芽孢杆菌的耐药性进行检测㊂本研究采用27种不同种类的抗菌药对地衣芽孢杆菌19148的耐药性进行检测,结果显示除了对多黏菌素B㊁呋喃唑酮㊁头孢他啶㊁四环素和青霉素表现为中介外,其余22种抗菌药均为敏感,因此地衣芽孢杆菌19148不具有抗菌药耐药性问题㊂4结论地衣芽孢杆菌191418对外界环境具有良好的稳定性,在p H6.0㊁温度37ħ㊁镁离子浓度为1m m o l/L的培养条件下,其抑菌活性最强㊂体外发酵过程中,3%种子液接种量㊁150r/m i n发酵28h是其抑菌活性最适发酵条件㊂药敏试验结果显示地衣芽孢杆菌对27种不同类型的抗菌药表现为中介或敏感性,不具有耐药性㊂参考文献(R e f e r e n c e s):[1] B A Q U E R O F,L E 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地衣芽孢杆菌发酵培养基的优化
地衣芽孢杆菌发酵培养基的优化丰贵鹏,杨丽云 (新乡学院化学与化工学院,河南新乡453003)摘要 [目的]对地衣芽孢杆菌发酵培养基进行优化,并在此基础上确定最佳培养条件,为实现其工业化生产提供参考。
[方法]借鉴谷春涛等关于地衣芽孢杆菌T S 21液体培养发酵条件的研究成果,对培养基进行澄清,并运用单因素试验和4因素3水平正交试验对其培养基进行改进,对地衣芽孢杆菌发酵条件进行优化以得到其最佳温度、pH 值和接种龄。
[结果]4种因素对地衣芽孢杆菌发酵影响的显著性次序为:玉米浆>豆饼粉浸汁>蛋白胨>葡萄糖。
培养基的最佳配比为:玉米浆0.45g ,蛋白胨1.50g ,豆饼粉浸汁为1∶15,葡萄糖1.50g 。
最适宜种龄为18h ,接种量8%,起始pH 值7.5,最佳温度37.5℃,此条件下地衣芽孢杆菌对数生长期在14～20h ,发酵周期为22～24h 。
活菌数每单位提高近1亿个,发酵周期比经验周期缩短10h 。
[结论]试验得出了地衣芽胞杆菌发酵培养基的最佳配比及最佳培养条件,在此条件下培养,收获菌体量大大提高,降低了生产成本,更有利于其大规模工业化生产。
关键词 地衣芽孢杆菌;发酵;培养基优化;正交试验中图分类号 S182 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2009)15-06862-03R esearch on the Optimization of the M edium for Bacillus licheniformis F erm entationFENG G ui 2peng et al (Institute of Chem istry and Chem ical Engineering ,X inxiang C ollege ,X inxiang ,H enan 453003)Abstract [Objective]On the basis of the optim ization of the Bacillus licheniformis ferm entation m edium ,the best culture condition was determ ined for the reference for the im plem entation of its industrial production.[M eth od]On the basis of the results from G u Chuntao in the liquid culture ferm entation condition of Bacillus licheniformis 2T S 21,the further test of the culture m edium was conducted ,and the ex perim ent in the m edium im provem ent for bacillus licheniform is was d one w ith the single 2factor orth og onal test w ith 4factors and 3levels for the optimum tem perature ,pH value and age of in oculation.[Results]T he order of four kinds of factors significantly im pacting the ferm entation of Bacillus licheniformis was as follows :corn juice >steep liqu or from bean cake powder >peptone >glucose ,and the best contain in the m edium was 0.45g corn steep liqu or ,1.50g peptone ,the ratio of steep liqu or from bean cake powder in the m edium of 1∶15and 1.50g glucose.T he m ost appropriate in oculation age was 18h ours ;in oculation am ount ,8%;the initial pH value ,7.5and the best tem perature ,37.5℃;under the condition ,the logarithm ic grow th tim e of bacillus licheniform is appeared from the 14th to 20th h our ,and the ferm entation period was 22-24h ours.T he number of viable cells per unit was raised to near 100m illion cells and the cycle of the ferm en 2tation was sh ortened for m ore than 10h ours.[C onclusion]T he best Bacillus licheniformis ferm entation m edium and culture condition were obtained ,under the condition ,the harvested biom ass was greatly im proved and the production cost was reduced ,which was m ore conducive to its large 2scale industrial pro 2duction.K ey w ords Bacillus licheniformis ;Ferm entation ;M edium O ptim ization ;Orth og onal test作者简介 丰贵鹏(1982-),男,河南新乡人,助教,从事生物化工方面的教学与研究。
地衣芽孢杆菌培养基及培养条件优化
地衣芽孢杆菌培养基及培养条件优化作者：贾铁岭吴振江建梅王宁宁杨文娇来源：《中国科技博览》2014年第14期【摘要】：微生态制剂以其无毒副作用、无耐药性、无残留，能有效克服抗生素滥用等优点而为广大消费者所青睐。
本文以一株地衣芽孢杆菌为研究对象，通过单因素及正交实验确定最佳培养基配比：葡萄糖1.5%，酵母抽提物1.0%，硫酸镁0.3%。
最佳培养温度为35℃，最适接种量为5%，最佳初始pH 6.5。
【关键词】：地衣芽孢杆菌正交实验酵母抽提物【分类号】：S968.4在过去的50年，抗生素曾经为畜牧业做出了很大的贡献，但相继出现的耐药性问题和抗生素残留问题，使科学家们将动物药物添加剂的研究方向投向具有生长促进作用和保健效果的饲用微生态制剂。
微生态制剂具有无毒副作用、无耐药性、无残留以及效果显著、成本低等诸多优点，作为抗生素替代品是包括酸制剂在内的其他产品无法比拟的[1]，因饲用微生态制剂可做为饲料添加剂直接使用，美国FDA和我国农业部对可做为微生态制剂的微生物种类都有严格的规定[2.3]。
目前国外微生态制剂的研究多是围绕乳酸杆菌属、枯草杆菌属以及一些链球菌类进行的；我国则以芽孢杆菌、乳酸杆菌研制为主。
如谷春涛等通过大量的数据论证了地衣芽孢杆菌TS-1的廉价培养基，并使其生物量达到前所未有的水平[4]，丰贵鹏等在其研究的基础上对培养基进行了进一步的优化使培养基更为澄清[5]，为规模化生产提高产品品质提供了重要参考依据；邓菊云、吴振强、张锦亮等优化了地衣芽孢杆菌固体发酵[6.7.8] 。
本文以一株地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）为研究对象，用单因素变量和正交实验对其摇瓶发酵培养基及发酵条件进行优化。
一材料与方法㈠实验材料⒈菌种地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis ）由唐山师范学院微生物教研室提供⒉培养基种子培养基：蛋白胨1%；酵母抽提物（膏）0.5%；氯化钠 1%；自然pH发酵培养基：蔗糖1%；蛋白胨1%；氯化钠 0.5%； pH7.0⒊主要试剂蔗糖、葡萄糖、玉米淀粉、麦芽糖、玉米浆粉、胰蛋白胨、酵母抽提物（膏）、牛肉膏、黄豆饼粉、尿素⒋仪器设备控温摇床、高压灭菌锅、电子天平、pH-3C pH测定仪、无菌操作台、紫外分光光度计㈡方法⒈培养方法⑴菌种活化将保藏的菌种转接到斜面培养基，37℃培养24h备用。
地衣芽孢杆菌在营养肉汤中生长条件优化
地衣芽孢杆菌在营养肉汤中生长条件优化作者：丁康宁张梦洁张艾伽张旭来源：《畜牧兽医科学》2019年第18期摘要：地衣芽孢杆菌有调节动物肠道内微生态平衡、增强机体的抵抗力、保护动物健康等重要的作用。
试验研究了NaC1质量分数、pH值和温度对营养肉汤培养基中地衣芽孢杆菌生长状态的影响。
结果表明：地衣芽孢杆菌在营养肉汤中的最佳生长条件为，NaC1质量分数范围为1%，pH值为8.0，最适生长温度为37℃。
关键词：地衣芽孢杆菌;营养肉汤;生长条件中图分类号：TQ464 文献标识码：B doi：10.3969/j.issn.2096-3637.2019.18.0060 引言地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）是一种常见的革兰氏阳性菌。
该菌能产生多种生物活性物质，包括多糖、蛋白质、非肽类物质等，它们能促进饲料中营养素降解，提高饲料利用率[1]。
此外地衣芽孢杆菌还能产生多种活性酶，这些酶可以促使细胞营养物质的释放，消除饲料中的抗营养物质[2]。
在不良环境中，地衣芽孢杆菌可以形成芽孢，经受颗粒饲料加工和储存中一系列恶劣环境。
因此，地衣芽孢杆菌被我国农业部2003年318号公告《饲料添加剂品种目录》批准使用为饲料级菌株[3]。
试验研究了地衣芽孢杆菌在营养肉汤培养基中不同温度、不同NaC1质量分数以及不同pH值条件下的生长特性，探索地衣芽孢杆菌的最优生长条件，可以为更好的筛选地衣芽孢杆菌益生菌，研发益生菌制剂提供依据。
1 材料1.1 试剂营养肉汤培养基、营养琼脂培养基为杭州百思生物科技有限公司产品。
蛋白胨、牛肉浸膏、NaC1、HC1、NaOH、琼脂等为国药集团化学试剂有限公司产品。
1.2 试验菌株地衣芽孢杆菌菌种为本实验室保存，分离于60日龄樱桃谷鸭的小肠。
2 方法2.1 制备种子液从保存菌种的斜面培养基上挑取菌落，接种于营养琼脂培养基，37℃培养24h。
挑取扁平、边缘整齐、表面光滑、粘稠，呈乳白色的菌落，接种于营养肉汤培养基中，37℃培养24h。
牛场常见的益生菌类型及科学使用方法
２０２２年第８期（总第３９９期）畜禽业生产指导牛场常见的益生菌类型及科学使用方法张 雷（陕西省蓝田县动物疾病预防控制中心，陕西蓝田７１０５００）摘 要：益生菌是一类对动物机体生长发育有益的微生物。
对于牛场来讲，饲料类益生菌、药物类益生菌和添加剂类益生菌是生产过程中常见的３种类型。
益生菌具有促进消化、防控疾病、调节局部微生态、改善饲料口味以及保护环境等功能。
从发酵饲料、青贮饲料、发酵中药、饲料添加剂等角度详述了牛场常用的益生菌，并结合临床实践阐述了不同益生菌的科学使用方法及注意事项。
关键词：牛场；益生菌；类型；科学使用ｄｏｉ：１０．１９５６７／ｊ．ｃｎｋｉ．１００８－０４１４．２０２２．０８．０１３ 引言益生菌是指对动物机体生长发育有益的一类微生物，其对动物的有益作用主要体现在促进消化、防控疾病、调节局部微生态、改善饲料口味以及保护环境等方面。
我国畜牧业发展虽然起步晚，但很多基层养殖场早就通过经验摸索出将益生菌应用到青贮饲料、发酵原料中。
益生菌简介益生菌的本质是微生物，临床饲喂时通常需要载体，而载体种类较多，其中大致可分为饲料、药物和添加剂３种类型。
饲料最为常见的为发酵饲料、青贮饲料等。
发酵饲料临床以发酵的饼粕类或糟渣类饲料为主，如发酵豆粕、发酵苹果渣、发酵辣椒粕、发酵甘蔗渣等。
青贮饲料以青贮玉米秸秆、青贮苜蓿等为主。
目前药物最为流行的为发酵中药，通过益生菌和中药相结合，益生菌分泌纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶等将植物的细胞壁进一步分解，促使细胞浆中的有效中药成分更充分地溢出，从而提升药物的疗效。
而益生菌也可以中药为载体进行有氧或无氧发酵，有助于提高菌数量，增加代谢产物种类，发酵中药能发挥菌体和药物的双重作用。
添加剂则是饲料添加剂，即直接添加于饲料中进行投喂的一类以保健功能为主的添加物，根据性状不同分为液体饲料添加剂和固体饲料添加剂２种。
临床上都称之为微生态类饲料添加剂，目前载入饲料添加剂目录的益生菌种类较多，如植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、布氏乳杆菌、粪肠球菌、丁酸梭菌、屎肠球菌、酿酒酵母菌、双歧杆菌等。
地衣芽孢杆菌XY-2的筛选及其培养基的优化
地衣芽孢杆菌XY-2的筛选及其培养基的优化谢银堂;马学良;杨翔华【期刊名称】《辽宁石油化工大学学报》【年(卷),期】2010(030)001【摘要】从土壤中筛选出3株具有较强抑菌活性的菌株,其中XY-2菌株对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、灰霉葡萄孢菌、变形链球菌和大肠杆菌的抑制作用最强.根据对XY-2菌株形态特征、培养特征、生理生化特征的分析,初步鉴定为地衣芽孢杆菌.最后通过正交实验对地衣芽孢杆菌XY-2的发酵培养基成分配比进行了选择和优化,为以后工业化生产提供依据.结果表明,当培养基质量浓度配比为:ρ(玉米淀粉)20 g/L、ρ(豆饼粉)90 g/L、ρ(玉米浆)7 g/L时菌体的培养效果最好.在最佳配比下培养基中活菌浓度可以达到9.67×108 c fu/mL.【总页数】4页(P8-10,14)【作者】谢银堂;马学良;杨翔华【作者单位】辽宁石油化工大学环境与生物工程学院,辽宁抚顺,113001;辽宁石油化工大学环境与生物工程学院,辽宁抚顺,113001;辽宁石油化工大学环境与生物工程学院,辽宁抚顺,113001【正文语种】中文【中图分类】TS201.3【相关文献】1.水产养殖用地衣芽孢杆菌的分离鉴定与其扩增培养基筛选 [J], 周冬仁;罗毅志;施伟达;叶雪平;沈振伟;汤美锋2.动物肠道益生菌地衣芽孢杆菌的筛选及培养基的优化 [J], 江敏;梁金钟3.动物肠道益生菌地衣芽孢杆菌的筛选及培养基的优化 [J], 江敏;胡小军4.具群体感应淬灭作用地衣芽孢杆菌T-1株培养基及发酵条件的优化 [J], 童文涛; 陈彪; 彭孟凡; 赵祯; 肖翎; 宋增福; 张庆华5.具群体感应淬灭作用地衣芽孢杆菌T-1株培养基及发酵条件的优化 [J], 童文涛; 陈彪; 彭孟凡; 赵祯; 肖翎; 宋增福; 张庆华因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
动物益生芽孢杆菌菌株的筛选及发酵条件优化研究的开题报告
动物益生芽孢杆菌菌株的筛选及发酵条件优化研究的开题报告一、研究背景及意义益生菌指一类有益于宿主生理健康的微生物，其对人体健康具有明显的促进作用。
目前已知许多益生菌可用于改善宿主的肠道微生态环境、调节人体免疫功能、预防疾病等方面。
其中，动物益生芽孢杆菌（Animal probiotic Bacillus spp.）在畜牧业中的应用得到了广泛关注和研究。
据报道，动物益生芽孢杆菌可增强动物的消化吸收能力、抵御疾病、提高肉、蛋、奶等产品的质量等方面具有重要作用。
然而，目前市场上能够应用于畜牧业的益生芽孢杆菌产品品种较为单一，且质量参差不齐。
因此对于动物益生芽孢杆菌的筛选及发酵条件优化等方面的研究具有一定的实际意义和经济价值。
二、研究内容本研究旨在筛选出具有良好益生活性的动物益生芽孢杆菌菌株，并通过发酵条件优化提高其产酸数量和活菌数，进一步提高其应用价值。
具体研究内容如下：1. 通过文献调查和实验室试验等方法筛选出具有良好益生活性的动物益生芽孢杆菌菌株。
2. 利用单因素试验和正交试验等方法对所筛选出来的菌株在不同发酵条件下的产酸数量和活菌数进行优化。
3. 对比分析不同发酵条件下所得的发酵液中菌体、菌液等生物活性物质的含量、理化性质、成分等特征。
4. 通过动物实验等方法评价所筛选出的益生菌菌株在畜牧业中的应用效果。
三、研究方法1. 文献调查：通过检索相关文献，了解现有的动物益生芽孢杆菌菌株和发酵条件，为后续实验提供依据。
2. 菌株筛选：采用不同培养基和培养条件，筛选出具有良好益生活性的动物益生芽孢杆菌菌株。
3. 发酵条件优化：采用单因素试验和正交试验的方法，对所筛选菌株在不同发酵条件下的产酸数量和活菌数进行优化。
4. 生物活性物质含量及成分分析：采用化学分析方法，分析不同发酵条件下发酵液中的生物活性物质含量及成分特征。
5. 动物实验评价：采用以饲料为载体喂养动物的方法，评价所筛选出的益生菌菌株在畜牧业中的应用效果。
芽孢杆菌分离筛选与培养
芽孢杆菌分离筛选与培养枯草芽饱杆菌是芽饱杆菌属的模式种，很少成链，通常为0.7~0.8μm×2.0~3.0μm，营养细胞杆状，杆端钝圆，单生或成短链，能运动，革兰氏染色一致呈阳性，芽孢中生或偏生，芽孢呈椭圆或长简形。
无荚膜，周生或侧生鞭毛，游离孢子表面着色弱，菌落形态变化较大，粗糙，表面干燥，不透明，灰白色或微带黄色，扩散（蔓延）生长。
斜面丰厚粗糙，不透明，蜡质蔓延，奶油色至微褐色。
在液体培养基表面形成银白色较厚的具皱纹的菌膜。
可利用蛋白质、多种糖及淀粉，广泛分布在土壤、水体及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖。
琼脂培养基上的菌落圆或不规则形，表面色暗，变厚和不透明，可起皱，可呈奶油色或褐色，菌落的形状随培养基成分不同而有很大变化。
当琼脂培养基表面潮湿时，菌落易于扩散。
在琼脂培养基上生长的菌苔在液体中不易扩散。
在培养液中生成色暗、皱褶、完整的膜，培养液轻度混浊或不混浊。
有氧时生长旺盛，在含有葡萄糖的复杂培养基中可进行厌氧代谢，但其生长和发育都较弱，生长温度最高为45~55℃，最适为37℃。
枯草芽孢杆菌生理生化特性：液化明胶冻化牛乳还原硝酸盐不产生吲哚，硫化氢 V-P反应阳性，水解淀粉。
葡萄糖发酵产酸不产气，需氧。
地衣芽孢杆菌孢囊不膨大，无伴孢晶体，中生卵圆型芽孢，周围鞭毛，无荚膜。
革兰氏液染色呈紫色阳性菌。
细胞大小一般在0.9~1.2×2.2~3.8微米。
菌落呈灰白色、边缘不整齐的扁平菌落。
1.样品：外购菌种商品微生物制剂（固体或液体）土壤水体或枯枝烂叶，腐烂稻草（记录取样位置 PH 植被情况等）。
2.菌种分离与纯化2.1．培养基2.1.1可溶性淀粉3g/L 蛋白胨10g/L 酵母膏3g/L KH2PO41.5g/L K2HPO42g/LMgSO40.1g/L PH 7.4—7.6 （富集用）2.1.2肉汤（NA）培养基（营养琼脂）：蛋白胨10g/L 牛肉膏3-5g/L NaCl5g/L PH7.2—7.4（保存计数或分离纯化用）营养琼脂：麦芽汁培养基=1：1混合使用，菌落不易扩散，形态特征典型2.1.3蛋白胨 10g/L 酵母膏 5g/L 葡萄糖3.5g/L NaCl5g/L K2HPO40.5g/LMgSO43g/L MnSO4 25mg/L PH 7.2—7.4（分离纯化用）2.1.4产淀粉酶菌株筛选培养基：可溶性淀粉3-5g/L 蛋白胨10g/L 牛肉膏3-5g/L NaCl 5g/L PH7.2—7.4（用于淀粉酶产生菌分离筛选）2.1.5产蛋白酶菌株筛选培养基2.1.5.1酪素培养基：★★2.1.5.1.1葡萄糖1g/L，酵母膏1g/L，酪素4-5g/L，K2HPO4 1g/L，KH2PO4 0.5g/L，MgSO4 0.1g/L蒸馏水1000ml，pH7.0-7.2。
2010 益生芽孢杆菌的筛选与鉴定
地衣芽孢杆菌产芽孢培养基和培养条件的优化
地衣芽孢杆菌产芽孢培养基和培养条件的优化
董雪;刘晓露;李丽蓓;刘妩妍;雷浩;樊霞
【期刊名称】《中国饲料》
【年(卷),期】2024()1
【摘要】本研究以地衣芽孢杆菌CICC 20514为对象,芽孢数和芽孢率为目标参数,采用单因素、正交试验方法对培养基配方进行筛选,并在此配方基础上对培养条件进一步优化。
结果表明:最终产芽孢发酵培养基的最佳组合为20 g/L果糖、20 g/L 豆粕、5 g/L K2HPO_(4)、7 g/L NaCl、0.8 g/L CaCO_(3)和0.8 g/L MgSO_(4);产芽孢最佳培养条件为37℃,220 r/min,接种量5%,装样量20%,初始pH 6.5~7.5,发酵培养时间48 h。
优化后的地衣芽孢杆菌CICC 20514培养基芽孢数及芽孢率均具有良好的稳定性,发酵液芽孢数达5.8×109 CFU/mL,比优化前提高了58倍。
【总页数】9页(P36-43)
【作者】董雪;刘晓露;李丽蓓;刘妩妍;雷浩;樊霞
【作者单位】中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所;陕西秦云农产品检验检测股份有限公司
【正文语种】中文
【中图分类】S816.7
【相关文献】
1.具群体感应淬灭作用地衣芽孢杆菌T-1株培养基及发酵条件的优化
2.一株α-高温淀粉酶的地衣芽孢杆菌产酶培养基的优化
3.凝结芽孢杆菌产芽孢培养基及培养
条件优化4.响应面优化贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)菌株YH-18产芽孢培养基和培养条件
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鸡源益生芽孢杆菌的筛选、发酵工艺优化及益生特性的开题报告
鸡源益生芽孢杆菌的筛选、发酵工艺优化及益生特性的开题报告一、研究背景和目的随着人们对健康的关注不断提高，益生菌的市场需求也不断增加。
其中，益生芽孢杆菌作为一种强效的益生菌，在肠道健康、免疫调节等方面具有显著的作用。
因此，对于益生芽孢杆菌的筛选、发酵工艺优化及益生特性研究具有重要的实际应用价值。
本研究的目的是通过对益生芽孢杆菌的筛选和发酵工艺优化，探索获得高品质、高产量的益生菌。
同时，通过分析益生芽孢杆菌的生存能力和对肠道菌群的影响，研究其益生特性，为益生菌的研发和应用提供科学依据。
二、研究内容和方法1. 益生芽孢杆菌的筛选本研究将采用物理、化学和生物三种方法，对多种菌株中的益生菌进行筛选。
首先采用高温和低温等物理方法对菌株进行筛选，然后通过酸、碱、高盐等化学方法进行进一步筛选，最后通过实验室的体外条件下养殖肠道菌群来鉴定益生菌的功效。
最终通过对筛选出的菌株进行DNA测序，确认其是否为益生芽孢杆菌，并采用经济的代步优化方法来提高其益生活性。
2. 益生芽孢杆菌的发酵工艺优化本研究将通过响应表面法，对益生芽孢杆菌的发酵工艺参数进行优化。
首先确定影响菌株产量和生长速度的主要因素，然后通过设计实验矩阵和响应参数，对菌株的生产效率和质量进行优化。
在此过程中，应确保益生菌的生产过程不会对菌株的生存能力和活性产生负面影响，并且能够保证产品的质量稳定和安全。
3. 益生芽孢杆菌的益生特性研究本研究将采用宿主动物实验和体外模拟实验，研究益生芽孢杆菌对肠道菌群的影响和其生存能力。
具体包括饲喂实验动物，观察其肠道菌群的组成变化；通过模拟肠道内环境，评估益生菌的生存率和对肠道微生态平衡的影响。
同时，还将通过分析体内的免疫指标，评估益生菌对免疫系统的调节作用。
三、研究意义和预期结果本研究将针对益生芽孢杆菌的筛选、发酵工艺优化和益生特性进行综合研究，具有以下意义：1. 筛选出高品质、高产量的益生芽孢杆菌，为益生菌的研发和应用提供优质的菌株资源。
鸡源抗腹泻芽孢益生菌J-4菌株的筛选、鉴定、发酵条件优化及动物饲喂试验的开题报告
鸡源抗腹泻芽孢益生菌J-4菌株的筛选、鉴定、发酵条件优化及动物饲喂试验的开题报告一、研究背景随着养殖业的发展和规模化生产的推广，鸡腹泻等肠道疾病已成为养殖业的主要问题之一。
腹泻病原微生物通过排泄物的方式在鸡舍环境中传播，而鸡舍环境又是肠道微生物群落的主要来源，因此，合理调控环境微生物群落结构是防治鸡腹泻等肠道疾病的关键。
芽孢益生菌是一类能够在厌氧环境下生长并形成孢子的益生菌，能够在鸡的肠道内生存，产生有益的代谢产物，发挥多种功能，如降低肠道pH值、抑制致病菌和提高饲料利用率等。
因此，向鸡饲料中添加芽孢益生菌已成为改善肠道微生物群落结构、预防和治疗鸡腹泻等肠道疾病的有效途径。
本研究旨在筛选、鉴定一株适合应用于鸡饲料中的芽孢益生菌，优化其发酵条件并进行动物饲喂试验，为鸡腹泻等肠道疾病的防治提供理论依据和实验基础。
二、研究内容和方案1. 菌株的筛选和鉴定挑选常见的芽孢益生菌进行初始筛选，通过筛选后选取菌落形态规整、色泽浅黄、大小和形态相同、孢子产率高的菌株进行鉴定。
使用分子生物学技术重测鉴定菌株种属、确定菌株是否有其他致病菌。
2. 发酵条件的优化对选出的菌株进行发酵条件的优化试验，确定最适合菌株生长的pH、温度、碳源、氮源等发酵条件，并考虑工程应用的可行性。
3. 动物饲喂试验将优化后的菌株添加到鸡的饲料中，进行在实验室和实地等条件下的动物饲喂试验，研究菌株对鸡体生长、免疫功能和肠道微生物群落结构的影响。
三、预期结果本研究预计筛选出适合鸡饲料添加的芽孢益生菌，确定最佳的发酵条件，并通过动物饲喂试验探索其对鸡体生长、免疫功能和肠道微生物群落结构的影响。
为鸡腹泻等肠道疾病的防治提供理论依据和实验基础。
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关键词 ：地衣芽孢杆 菌 ；益生菌 ；筛选 ；培养基优化
中图分 类号 ：Ｔ ２ １３ Ｓ ０ ．
文献标识码 ：Ａ
文章编 号 ：１０ ２ １ （０ ７ ３— ０ ７一ｏ ０ ６— ５ ３ ２０ ）ｏ ０ ５ ４
Ｓｅｌｃ ｉ ｆｂ ｉｕ ｉｈ ｎｆ ｒ ｎ ｏｒｐ ｏ ｉｔ ｓ ｅｔ ｏｎ ｏ ａｃｌ ｓ ｌ ｅ ｉ ｍｉ ｓ ｆ ｒ ｂｏ ｉ ｌ ｃ ｏ ｃ ａｎ ｈ ｆ ｍｅ ｔ ｔ ｎ ｃ ｎ ｔ ｓ ｏ ｔ ｚ ｄ ｄ ｔ ｅｉ ｅｒ ｎａ ｉ ｏ ｄｉｏｎ ｐ ｉ ｅ ｒ ｏ ｉ ｍｉ
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动物肠道益生菌地衣 芽孢杆 菌的 筛选 及培养基的优化
江敏 胡 小 军
５４４ ） ２０ ８
（ 江师 范学 院化学 科 学与技 术 学 院 ，广 东湛 江 湛
摘 要 ：为 了研制新 型微 生态制剂 ，以常用益生菌株——地衣芽孢 杆菌 （ ａｉｕ ｂｃｌｓ比ｋｎ ｍｓ ｌ ｒ ｉ）为试 验菌 株 ，在测定 了初发 菌株 的极 限耐受 性后 ，运用紫外诱变技 术筛选 到了一株 耐酸性较强 、耐胆汁 、耐 高温 的地 衣芽孢杆菌 Ｄ一１ 。其极 限耐受条 件为 ：ｐ ４ １ ，胆盐浓度 ０４ ／ ，温度 ５ ￣ １ Ｈ ．８ ． ｇＬ ８Ｃ。并通过试验对该 菌株进行 了 形态和生理生化特征 的鉴定 。最后 通过 单因素和正交试验对地衣芽孢 杆菌 Ｄ一１ １的发酵培养基 成分配 比进 行 了选择和优化 ，为以后 的工业 化生产提供依 据 。结果 显示 当培养基 的配 比浓度 为 ：玉米 淀粉 １ｇ ／ ｇ Ｌ时菌体 的培养效果 最好 － ０
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