百合远缘杂交花粉萌发及花粉管生长过程观察

西北植物学报,2007,27(9):1790-1794Acta Bot.Boreal.2Occident.Sin. 文章编号:100024025(2007)09217902053百合远缘杂交花粉萌发及花粉管生长过程观察王文和,王树栋,赵祥云,李小英,于建军,陈之欢(北京农学院,北京102206)摘　要:利用荧光显微镜对百合远缘杂交组合‘Bernini’בPollyanna’花粉萌发及花粉管生长过程进行观察研究,结果显示,授粉后3～30h内花粉萌发形成花粉管,且花粉管生长速度由快到慢,48～51h内花粉管停止生长,花粉管最后深入到花柱的1/3处,并观察到一些异常的花粉管形态;花粉管生长过程中还伴随着一系列的胼胝质反应,出现的部位依次是乳突细胞、花粉管、花柱通道细胞、胚珠中的胚囊.结果表明该杂交组合不亲和.研究认为‘Berni2 ni’柱头乳突细胞是阻碍‘Pollyanna’花粉管生长的第一道屏障,花柱通道细胞是抑制花粉管在花柱内生长的第二道屏障.关键词:远缘杂交;花粉萌发;花粉管生长;百合中图分类号:Q944.58文献标识码:AProcess of Pollen Sprouting and Pollen TubeG row th on the Lily Distant H ybridizationWAN G Wen2he,WAN G Shu2dong,ZHAO Xiang2yun,L I Xiao2ying,YU Jian2jun,C H EN Zhi2huan(Beijing University of Agriculture,Beijing102206)Abstract:This article st udied t he process of pollen sprouting and pollen t ube growt h on t he lily distant hy2 bridization combination‘Bernini’בPollyanna’by t he fluorescence microscope.We observed t hat pollen sp routing formed t he pollen t ube after pollination in3～30h.The speed of pollen t ube growt h from quick to slow,t hen stopped growing between48～51h,finally penet rated into1/3of style.Besides,we also ob2 served some unusual pollen t ube shapes.During t he pollen t ube growt h,it was companied wit h a series of callose responses,which was happened in t he pollen t ube,papilla,canal cell,embryo sac in ovule.The re2 sult s indicated t hat t his hybrid combination was incompatible.We suggested t hat t he‘Bernini’papilla of stigma is t he first hindrance which preventing t he‘Pollyanna’pollen t ube f rom growing and t he canal cell is t he second barrier t hat p reventing t he pollen t ube from growing in stylar canal.K ey w ords:distant hybridization;pollen sprouting;pollen t ube growing;lily 远缘杂交是培育新品种的主要途径,但在百合杂交中存在远缘杂交不亲和现象,使得杂交的成功率非常低.因此,探讨百合远缘杂交不亲和的原因,寻求克服办法,提高杂交成功率,是培养百合品种中亟待解决的问题.杂交亲和性的障碍可能发生在生殖过程的不同阶段,如花粉粒不能萌发、花粉管不能进入柱头、不能到达子房、不能完成受精、胚发育不良及杂种死亡或不育等[1].早在1991年Amaki[2]就利用荧光显微镜技术观察百合花粉在柱头上萌发以及花粉管在花3收稿日期:2007204202;修改稿收到日期:2007207217基金项目:北京市教委基金资助项目(KM200610020006);北京市委组织部基金资助项目(20041D0502109);北京市属市管高校人才强教计划资助项目作者简介:王文和(1964-),男(汉族)、博士、副教授,主要从事植物生殖生物学和植物资源学研究.E2mail:wwhals@柱内生长过程.国内利用荧光显微镜对沙田柚自交和异交亲和性[3]、沙梨自花和异花授粉后花粉在柱头上的萌发及花粉管在花柱内的生长动态和形态变化[4]、甘蓝自交单株的不亲和性[5]、中国樱桃和甜樱桃自花和异花花粉在柱头上萌发的情况[6]、梨与远缘果树杂交不亲和研究[7]、梨不同品种自花授粉和异花授粉花粉管生长动态[8]等进行研究,均取得良好效果.刘春等[9]对麝香百合品种‘白狐’(Wite Fex )的花粉粒在铁亚杂种系品种‘达诺’(Ceb Daz 2zle )柱头上萌发及生长状况进行了观察.本研究运用荧光显微技术,对东方百合品种‘Bernini ’和亚洲百合品种‘Pollyanna ’杂交后,花粉粒的萌发和生长过程进行观察,以期确定百合远缘杂交不亲和发生的阶段及部位,为百合的远缘杂交提供理论依据.1　材料和方法1.1　材　料以东方百合品系‘Bernini ’(伯尼)为母本,亚洲百合品系‘Pollyanna ’(波利亚娜)为父本进行杂交.1.2　方　法将‘Pollyanna ’新鲜的花粉授在母本‘Bernini ’去雄的柱头上,套袋.于授粉后3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48、51h ,分别采集雌蕊用卡诺固定液固定,固定24h 后,将雌蕊转移到70%的酒精中,4℃冰箱中保存.用1mol !L -1NaO H 溶液进行透明和软化,之后,0.1%的苯胺蓝溶液染色,德国蔡氏Axioskop40荧光显微镜观察和测量,美国的CoolSNA P 摄像系统拍照.2　观察结果2.1　花粉管生长动态授粉3h 后大部分花粉粒萌发,而且花粉管长到了一定长度,表现正常(图版Ⅰ,1),但其均附着在柱头乳突细胞表面;授粉后6h ,多数花粉管仍缠结在柱头表面,花粉管中出现有胼胝质反应(图版Ⅰ,2);9h 后,花粉管深入到柱头单列的乳突细胞之间(图版Ⅰ,3);12h 后,乳突细胞有胼胝质反应(图版Ⅰ,4);15h 后,大量花粉管通过柱头缝隙伸入到花柱组织(图版Ⅰ,5),在距花粉管前端下面的一定距离的花柱道通道细胞开始有胼胝质反应;授粉18h 后,花粉管中多处出现胼胝质塞(图版Ⅰ,6),而且通道细胞胼胝质反应更加强烈(图版Ⅰ,7);30h 后,伸入到花柱组织中的花粉管深达1.45cm (图版Ⅰ,8);授粉后33～45h 内花粉管生长缓慢;授粉后48～51h 内花粉管停止生长,在柱头2.0cm 以下的花柱中没有观察到花粉管.经测量母本‘Bernini ’柱头和花柱总长度平均约为5.5cm ,即花粉管深入花柱的最深度达花柱的1/3.授粉后其花粉管的生长状况见图1.从图1可以看出,授粉后30h之前花粉管生长图1　授粉后花粉管生长过程Fig.1　The growth process of pollen tube after pollination速度较快,平均速度约10.1μm/min ,另外从图1中也可清楚地看出花粉管的长度比花粉管深入花柱的深度大,这是由于部分花粉管附着和缠结在柱头表面而不能伸入花柱的缘故.在观察花粉管生长的过程中,发现一些生长异常的花粉管,其中主要有3种类型:一是在花粉粒中出现较大的胼胝质块,导致花粉管生长和形态异常(图版Ⅰ,9);二是伸长的花粉管在顶部或近顶部出现异常膨大(图版Ⅰ,10);三是少量花粉管螺旋状缠绕在单列的乳突细胞上(图版Ⅰ,11).19719期 王文和,等:百合远缘杂交花粉萌发及花粉管生长过程观察2.2　胚珠内部的反应授粉48h后的胚珠中,胚囊的两端即卵器和反足细胞出现胼胝质反应(图版Ⅰ,12);授粉51h后,胚珠的珠孔处有明显的胼胝质反应(图版Ⅰ,13).3　结果与分析(1)绝大部分‘Pollyanna’的花粉粒都可在‘Bernini’柱头上萌发,花粉管开始生长速度较快,约10.1μm/min,但并没有按照正常的生长方向进入花柱道,而是缠结在柱头表面,与柱头的乳突细胞缠绕在一起.据报道在自交亲和的百合花柱中,花粉管的生长速率可以达到45μm/min[10],显然,本试验中花粉管生长速度和正常相比较慢.(2)柱头的胼胝质反应可以作为在一定亲缘范围内检验亲和性或不亲和性的结果[11].百合品种‘Pollyanna’的花粉管在品种‘Bernini’的柱头和花柱中生长过程还伴随着一系列的胼胝质反应,出现的部位依次是乳突细胞、花粉管、花柱通道细胞、胚珠中的胚囊、珠孔.可见‘Bernini’柱头乳突细胞是阻碍‘Pollyanna’花粉管生长的第一道屏障.随后,少量花粉管虽然进入了花柱道内,但向下生长速度缓慢,最后停止生长.花粉管最深达1.5～2.0cm.(3)在花粉管还未到达,大约上部1/3花柱中的花柱道通道细胞就开始有明显的胼胝质反应.这也许是花粉管刺激通道细胞产生了某种抑制花粉管生长物质的结果.本研究初步认为花柱道通道细胞是抑制花粉管在花柱道生长的第二道屏障.(4)远离花粉管的胚珠后期也出现排异性表现,是否可看作是抑制花粉管进入的第三道屏障,有待进一步证实.从试验结果看,‘Bernini’בPollyanna’杂交组合不亲和属于配子体不亲和.由于二者亲缘关系较远,杂交不易成功,但也有成功的报道[12].4　讨　论被子植物双受精的识别是多位点的[13],可分为花粉与柱头、花粉管与花柱及雌雄配子之间3个层次,任何一个部位不能识别都会导致生殖障碍.其中花粉与柱头之间,更确切地说是花粉壁与柱头表膜之间的作用是识别至关重要的第一步.前人研究证明,在传粉受精过程中,花粉壁蛋白与雌蕊组织间的识别反应决定花粉能否萌发以及二者亲和与否[14],在传粉过程中,高分辨率的透射电镜证实花粉壁蛋白在柱头表面的结合发生在乳突细胞的表膜[15].前人研究发现,花粉管尖端有大量钙离子通道分布,它们的开放会导致花粉管尖端的钙离子浓度增高,从而在花粉管前端形成钙离子的浓度梯度,这一梯度控制着花粉管伸长生长的速度和方向[16218].本试验中花粉粒能够萌发,‘Pollyanna’花粉壁蛋白和‘Bernini’柱头乳突细胞表膜能够顺利结合,并从柱头上吸水,在渗出液中开始萌发,但百合远缘杂交花粉管生长速度缓慢,且大量花粉管不能沿着正确的方向生长,是否和花粉管尖端内部原生质中自由钙离子浓度有关,有待研究.孢子体自交不亲和性中,花粉被抑制发生在柱头,而配子体自交不亲和性中,花粉管生长在花柱中被抑制[19].本试验中花粉可在母本柱头上萌发,花粉管生长的抑制发生在花柱中,属于配子体不亲和.在百合花柱中已经成功分离出引起花粉管和引导组织表皮(t ransmitting tissue epidermis,T TE)之间粘附的分子[20,21].这些分子包括一种果胶多聚糖和一种肽———SCA(柱头/花柱中的富含半胱氨酸的粘附分子).在一定的p H条件下,这两种分子连接在一起,并与T TE细胞表面相结合,花粉管细胞和T TE细胞表面即发生粘附作用[20].在本试验中,花粉管在引导组织表面生长速度慢,最后停止,而且在花粉管顶端下面一定距离的通道细胞出现明显的排异反应,最后这种排异反应可深达胚珠内部.那么这一杂交组合中花粉管停止生长是由于花粉管和母本引导组织表皮(即通道细胞)缺少SCA等物质,还是花粉管刺激了通道细胞产生某种抑制花粉管生长的物质,需进一步研究.参考文献:[1]　孟金陵.植物生殖遗传学[M].北京:科学出版社,1995:303.[2]　AMA KI2W,HIGUCHI2H.Effect s of stylar exudates collected from pollinated pistils on pollen tube growt h in L ili um longi f lorum[J].Scientia2Horticult urae,1991,46:1-2,147-154.[3]　XU E M N(薛妙男),CH EN T T(陈藤土),YAN G J H(杨继华).Observation on self and cross2compatibility in Shatinyu[J].A cta Horti2cult urae S inica(园艺学报),1995,22(2):127-132(in Chinese).[4]　CH EN D X(陈迪新),ZHAN G SH L(张绍铃),TAO SH T(陶书田).Characteristics of pollen germination and pollen tube growt h inin vivor sand pear styles[J].J ournal of N anj ing A g ricult ural Universit y(南京农业大学学报),2004,27(3):34-37(in Chinese).2971西　北　植　物　学　报 27卷[5]　WU N B (吴能表),XU G D (徐光德),TAN G Y T 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后大多数萌发的花粉粒,×520;2.6h 后花粉管仍在柱头表面,×350;3.花粉管深入到柱头单列的乳突细胞之间,×350;4.12h 后,乳突细胞有胼胝质反应,×600;5.15h 后大量花粉管通过柱头缝隙伸入到花柱组织,×220;6.授粉18h 后,花粉管中多处出现胼胝质塞,×400;7.通道细胞胼胝质反应,×350;8.30h 后,伸入到花柱组织中的花粉管,×350;9.花粉粒中较大的胼胝质块,×600;10.花粉管近顶部异常膨大,×520;11.花粉管螺旋状缠绕在单列的乳突细胞上,×520;12.48h 后胚囊中卵器和反足细胞出现胼胝质反应,×400;13.授粉51h 后,胚珠的珠孔处有明显的胼胝质反应,×180.Explanation of plates :Plate Ⅰ　Fig.1.After pollination in 3h ,most of pollen grains sprouting ,×520;Fig.2.After 6h ,pollen tube still exsist on surface of stig 2ma ,×350;Fig.3.Pollen tube stick in among t he single line papillas ,×350;Fig.4.After 12h ,callose responses was in papillose cells ,×600;Fig.5.After 15h ,t he large number of pollens stick in t he stylar cannal t hrough crevice of stigma ,×220;Fig.6.After pollination in 18h ,many part s of pollen tube have callose corks ,×400;Fig.7.Cannal cells have callose responses ,×350;Fig.8.After 30h ,pollen tubes stick in stylar cannal ,×350;Fig.9.Callose block in t he pollen ,×600;Fig.10.Near top of pollen tube abnormal expand ,×520;Fig.11.Pollen tube spiral wind round a papilla cell ,×520;Fig.12.After 48h ,egg apparatus and antipodes in t he embryo sac have arisen callose responses ,×400;Fig.13.After pollination in 51h ,micropyle in ovule clear has callose responses ,×180.39719期 王文和,等:百合远缘杂交花粉萌发及花粉管生长过程观察图版Ⅰ　PlateⅠ4971西　北　植　物　学　报 27卷。