克雅病临床前诊断研究

克雅病临床前诊断研究靖冬来　高　冉　武力勇中图分类号：R741 文献标识码：A 文章编号：1006-351X（2019）05-目前认为克雅病（Creutzfeldt-Jakob disease，CJD）是一种罕见致命的神经退行性疾病，是由中枢系统内致病型朊蛋白（scrapie prion protein，PrP Sc ）异常沉积所致。

本文就CJD 的病理及分子生物学基础，从体液、外周免疫器官、神经影像学等方面临床前生物标志物的研究进展进行综述。

随着其分子生物学基础和病理生理学研究不断深入，目前其临床前生物学标志物成为研究热点，血浆、脑脊液、外周免疫器官临床前PrP Sc 检出以及神经影像学临床前研究，为未来CJD 临床前诊断体系的建立开辟了方向。

一、概述朊蛋白病发病率约百万分之一，其特征是将自然存在的正常细胞型PrP c 转变为一种异常折叠的蛋白质，称为PrP Sc 。

CJD 是人类朊蛋白病中最常见的类型，常常突然发作，整个病程通常在几个月内，其特征性的临床表现是快速进展的痴呆、肌阵挛。

按病因CJD 可分为四型: 散发型、遗传/家族型、医源型、变异型［2］。

散发性CJD（sporadic Creutzfeldt-Jakob disease，SCJD）最常见的，据推测，约占全世界报道朊蛋白病例的85%［3］。

CJD 临床表现存在异质性，特别是在其早期阶段，可能会模仿几种可逆性或可治疗的疾病，目前尚无根治方法，死亡率100%［4］。

不过依赖于临床症状的识别以及脑电图、磁共振以及脑脊液14-3-3蛋白的检测可以实现早期临床诊断，而确诊方法包括死后尸检和脑组织活检难于实现。

由于患者的典型临床症状直到疾病的末期才显现出来，一经诊断通常预示着疾病的迅速恶化和死亡，早期诊断对于更深入的了解朊蛋白神经病理学的机制以及实现早期的干预是至关重要的。

故目前的学者将研究的时间窗提前的临床前期，寻找早期诊断的的生物学标志物已成为当今CJD 研究的趋势和热点。

虽然在CJD 临床前的研究比较少，而Gigi 等［5］以家族性克雅病（familial Creutzfeldt-Jakob disease，FCJD）作为研究对象，结果提示E200K 突变健康携带者在临床症状出·综　述·现之前就出现神经心理学指标异常，提示CJD 的临床发病前已经有异常应激机制发生。

二、分子生物学基础及病理改变正常脑组织存在少量的朊蛋白（normal cellular isform of the prion protein，PrP c ），PrP c 是一种糖蛋白，相对分子质量约2700~3000，可存在于正常脑组织中，其基因位于20号染色体短臂上。

正常脑组织PrP c 为a 螺旋结构，具有水溶性、可被蛋白酶水解的特性，无致病性。

PrP Sc 为朊蛋白的异构体，PrP Sc 是PrP c 的一种变异型，呈β片状结构，不溶于水，不能被蛋白酶水解，也不能被核酸酶破坏，高压消毒及巴氏消毒不能灭活。

中枢神经系统的细胞内PrP Sc 积累是神经元功能障碍和变性的原因，这是朊蛋白疾病的主要特征，CJD 患者共同特点就是朊蛋白代谢异常，是PrP Sc 在脑内皮质及皮质下结构沉积所致。

不同的朊蛋白分离物具有特定的临床和生化特性，被称为朊蛋白菌株。

散发性CJD 病因不明，可由PrP c 自发转化为PrP Sc ；遗传CJD 病由于编码朊蛋白的基因突变，造成PrP c 转化成异常折叠成新生的PrP Sc 分子，它可以作为模板不断复制，为常染色体显性遗传；医源性CJD 是由于在医学或神经外科手术过程中暴露于感染性的人朊蛋白；变异的CJD 是非人类朊蛋白来源，大多数来自牛海绵状脑病的外源性PrP Sc 作为模板或启动子［6］。

CJD 的组织病理学变化大多局限于中枢神经系统，病理改变可见神经组织海绵样变性、神经元脱失、星形胶质细胞增生。

海绵样变性表现为在神经毡（纤维网）中出现小空泡，圆形或卵圆形，偶尔相互融合成片。

免疫染色可见PrP Sc 呈突触型沉积。

异常的朊蛋白可以从脑组织、外周组织及体液中被检测到，外周组织及体液含量较低，检出率不高，但是利用各种扩增技术可以提高检出率，如朊蛋白错误折叠循环扩增技术（protein misfolding cyclic amplification，PMCA）、实时震动诱导转化（real-time quaking—induced conversion，RT—QUIC）技术等，这些检测技术在临床阶段的检测已经得到了许多学者的验证。

目前的大量的动物实验已经证实在临床前阶段可以从外周组织（如肌肉）可以检测异常的PrP Sc ，而且在人类朊蛋白病患者外周组织中（如肌肉）检测到PrP Sc 的存在［7-10］。

异常朊蛋白的检测是诊断的朊蛋白病的必要条件，根据动物实验作者推测在人类朊蛋白病中观察到明显的临床症状之前即开始了病理生理改变，这使得临床前阶段诊断有病理依据。

随基金项目：国家自然科学基金（81470074）；北京市科学技术委员会临床特色课题（Z141107002514117）；北京市卫生系统高层次卫生技术人才培养项目（2014-3-051）；北京市科委重点研发计划（D171100008217005）作者单位：100053…北京，首都医科大学宣武医院神经内科通信作者：武力勇，…Email ：wmywly@着对朊蛋白的分子结构和朊蛋白疾病的病理生理学研究深入，在CJD的临床前诊断方面也有了有价值的依据。

三、生物学标志物临床前研究进展1.体液、组织液患者的体液或外周组织洗涮液（包括血液、尿液、唾液、脑脊液）容易获得，研究者使用各种方法在在CJD患者体液中检测到异常的朊蛋白，但临床前阶段的研究仍然处于探索阶段。

根据不同的朊病毒菌株、传播途径、宿主物种、朊蛋白基因及其可能的多态性，亚临床期可以在数周至几十年内变化。

变异型CJD（variant Creutzfeldt-Jakob disease，VCJD）朊病毒复制可以只在神经系统以外的组织中，比如脾脏或者外周淋巴结，可导致VCJD感染的无症状携带者［11］。

研究报道通过输入无症状VCJD捐献者的血液随后发展为VCJD的病例，强烈认为人类血液也可能具有传染性［12-14］。

文献中也有散发性CJD病患者的血浆具有传染性的报道［15］。

综上所述在临床前阶段血浆已有朊病毒存在。

目前动物实验或自然感染的动物物种已经证实了血浆朊蛋白的检测的可实施性。

已经有研究从啮齿动物、绵羊和仓鼠等各种无症状动物的血液成份中使用蛋白质错折叠循环扩增技术扩增出了异常的朊蛋白［16-17］。

Halliez等［18］同时使用不同的体内、体外多种方法对无症状羊瘙痒病绵羊动物模型的白细胞中的朊蛋白进行检测，证实了白细胞是临床前感染检测的合适靶点。

目前对临床前阶段血浆的研究主要集中在VCJD 动物模型中，在感染了VCJD动物模型中血浆样品中分离出异常的错误折叠朊病毒蛋白，而未感染的动物未检测到［19-20］。

CJD的诊断体系中研究中找到了众多可替代异常朊蛋白的脑蛋白标志物。

14-3-3蛋白是最早的也是研究最多的脑蛋白标志物，1998的世界卫生组织将l4-3-3蛋白列入诊断CJD 的标准，但其敏感性及特异性均有缺陷。

研究者发现Tau蛋白优于14-3-3蛋白［21-22］。

应用实时震动诱导的朊蛋白转换（RT-QUIC）分析直接检测脑脊液中的致病性朊蛋白具有更高的特异性（99%），并且不受CJD分型及病程的影响，可以更早、更准确的诊断疾病［23, 24］。

Lattanzio等［25］研究支持使用RT-QUIC技术作为CJD临床诊断的一线实验室检查。

还有一些其他的蛋白标志物的应用价值均不确定。

目前尚无将这些脑蛋白标志物应用临床前的研究。

不过前述研究已证实致病朊蛋白早于临床症状的而产生，应用RT—QUIC技术检测脑脊液中异常的朊蛋白有望成为临床前诊断的工具。

Maddison等［26］通过连续蛋白质错误折叠循环扩增技术进行扩增，从临床前期的绵羊口腔分泌物中检测到了异常的朊蛋白。

此外，研究者使用一种新的扩增方法在灵长类动物模型中疾病前期的唾液、尿液以及脑脊液中也可检测到异常的朊蛋白［27］。

2.外周免疫器官目前淋巴网状组织在海绵状脑病发病机制中的确切作用仍不清楚，但在自然发生的动物朊蛋白病和小鼠朊蛋白病模型的各种淋巴器官在临床前和亚临床期检测到朊蛋白病毒早已得到了确认。

动物模型证实感染了VCJD小鼠在整个观察期内均处于无症状状态，即使在生命结束阶段也没有在中枢系统中检测到的PrP Sc，然而，在这些小鼠的脾脏中，PrP Sc的积累在感染的早期达到最大值，并一直维持稳定直到死亡［28］。

3.神经影像学生物学标志物多模态磁共振成像，在早期的临床过程中，20%的CJD 患者的头颅磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）图像可能是正常的，随着病程的进展，SCJD最常见的MRI成像模式包括皮质和基底核区、岛叶和扣带回（边缘叶）的扩散加权成像（diffusion weighted imaging DWI）高强度异常信号［29］。

尽管如此，即使在脑电图（electroencephalography，EEG）和脑脊检查结果不明显或者不典型症状的病例中，MRI即可出现异常表现，尤其是DWI序列，甚至可先于临床表现出现。

Ukisu 等［30］分析了9例CJD患者不同阶段头颅MRI，发现DWI序列在CJD非常早期阶段甚至在特征性临床发现开始之前就具有诊断价值。

此外，在一些个例报道中也发现了在临床症状出现之前在头颅MRI中出现异常的高信号。

Alvarez等［31］报道了1例确诊CJD的患者，该患者在临床发作前2年进行的第一次MRI显像，与最后一次MRI检查中发现尾状核具有相同的高信号。

Terasawa等［32］报道1例家族性克雅病（familial Creutzfeldt-Jakob disease，fCJD）在临床症状出现前3个月DWI序列检测枕叶异常高信号。

Satoh等［33］报道1例SCJD病患者在先驱症状出现之前2个月接受了MRI检查，DWI序列发现颞叶异常高信号。

这表明CJD患者在临床症状出现之前头颅MRI就可以出现异常信号。

作者认为一方面这可能是一种常见的事件，由于该疾病的罕见性和大多数MRI研究是都是在确诊或者出现症状之后的CJD患者进行的，且不同基因型和外部因素的多样性可影响其结果，这意味着作者需要进行纵向研究，以阐明异常改变随时间和症状进展的演变过程；另一方面也不能排除可能是偶然的发现，因没有大样本的对照研究，证据强度很低。

动物模型中已经证实在临床前阶段，MRI显示组织水的表观扩散系数（apparent diffusion coefficient，ADC）明显减少，这些改变与小胶质细胞增生有关，与异常朊蛋白的沉积呈一致性改变［34］。