实验二 凝胶层析法
凝胶层析实验报告结论
一、实验目的本次实验旨在通过凝胶层析技术，对混合溶液中的不同组分进行分离，验证凝胶层析法的原理，并探讨影响分离效果的因素。
二、实验原理凝胶层析是一种基于分子筛效应的分离技术。
凝胶作为一种具有多孔结构的材料，其孔径大小可以调节，从而实现对不同分子量物质的分离。
实验中，混合溶液中的组分通过凝胶层析柱时，分子量较大的物质由于无法进入凝胶孔道，只能沿着凝胶颗粒之间的缝隙流出，而分子量较小的物质则可以进入凝胶孔道内部，从而在凝胶层析柱中停留更长时间，最终实现分离。
三、实验结果与分析1. 实验现象（1）观察实验过程中，不同组分在凝胶层析柱中的洗脱顺序。
根据实验结果，分子量较大的组分先流出，而分子量较小的组分后流出。
（2）观察凝胶层析柱中凝胶颗粒的吸附情况。
实验过程中，凝胶颗粒对分子量较大的组分吸附作用较弱，而对分子量较小的组分吸附作用较强。
2. 实验数据分析（1）通过计算不同组分的洗脱时间，可以得出其分子量大小。
实验结果表明，分子量较大的组分先流出，而分子量较小的组分后流出，与理论预期相符。
（2）分析凝胶层析柱中凝胶颗粒的吸附情况，可以发现分子量较小的组分在凝胶层析柱中停留时间较长，说明凝胶颗粒对其吸附作用较强。
四、实验结论1. 凝胶层析法可以有效地对混合溶液中的不同组分进行分离，实现不同分子量物质的分离。
2. 凝胶层析法的分离效果受分子量大小、凝胶孔径、洗脱液等因素的影响。
在本实验中，分子量较大的组分先流出，而分子量较小的组分后流出，与理论预期相符。
3. 凝胶层析柱中凝胶颗粒对分子量较小的组分吸附作用较强，导致其在凝胶层析柱中停留时间较长。
4. 实验过程中，凝胶层析柱的装填、洗脱液的选择、流速的控制等操作对实验结果有较大影响。
在实际操作中，应严格控制实验条件，以提高分离效果。
五、实验展望1. 在今后的实验中，可以尝试改变凝胶孔径、洗脱液等因素，进一步优化实验条件，提高分离效果。
2. 探索凝胶层析技术在生物、医药、化工等领域的应用，为相关领域的研究提供技术支持。
凝胶层析_实验报告
一、实验目的1. 了解凝胶层析的原理和操作方法。
2. 掌握凝胶层析分离混合物中不同组分的基本技能。
3. 分析实验结果，验证实验原理。
二、实验原理凝胶层析是一种基于分子筛效应的分离技术。
该技术利用凝胶的孔隙结构，使不同分子量的物质在凝胶柱中受到不同的阻滞作用，从而实现分离。
凝胶是一种具有多孔、网状结构的分子筛，分子量不同的物质通过凝胶柱的速度也不同。
在凝胶层析实验中，样品被注入凝胶柱，随着洗脱液的流动，不同分子量的物质会以不同的速度通过凝胶柱，从而实现分离。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：混合样品、葡聚糖凝胶、洗脱液（如蒸馏水、乙醇等）。
2. 实验仪器：凝胶层析柱、注射器、恒流泵、收集器、滤纸、烧杯等。
四、实验步骤1. 准备凝胶层析柱：将葡聚糖凝胶倒入层析柱，轻轻敲打柱底，使凝胶均匀分布。
2. 洗脱液平衡：将凝胶层析柱放入盛有洗脱液的烧杯中，使凝胶充分浸泡。
3. 样品制备：将混合样品与洗脱液按一定比例混合，制成样品溶液。
4. 注射样品：将样品溶液注入凝胶层析柱。
5. 收集分离组分：随着洗脱液的流动，不同分子量的物质会以不同的速度通过凝胶柱。
将收集器放置在凝胶柱下方，收集分离组分。
6. 分析实验结果：观察收集到的组分，分析实验结果。
五、实验结果与分析1. 分离效果：通过凝胶层析实验，成功分离出混合样品中的不同组分。
2. 分组情况：根据收集到的组分，分析其分子量大小，确定分离效果。
3. 实验原理验证：实验结果表明，凝胶层析能够有效分离混合物中的不同组分，验证了实验原理。
六、实验讨论1. 凝胶层析的原理：凝胶层析的原理是基于分子筛效应，通过凝胶的孔隙结构，使不同分子量的物质在凝胶柱中受到不同的阻滞作用，从而实现分离。
2. 影响分离效果的因素：实验过程中，洗脱液的种类、流速、凝胶的孔径等因素会影响分离效果。
在实验中，应严格控制这些因素，以确保分离效果。
3. 实验结果分析：通过分析实验结果，可以了解不同组分在混合样品中的含量和分子量大小，为后续研究提供数据支持。
《凝胶层析法》课件
改进方向
提高分离速度
通过改进凝胶介质或优化操作条件，提高凝 胶层析法的分离速度。
减少小分子物质的损失
研究新型的凝胶介质和操作条件，减少小分 子物质的损失。
增强对大分子的分离效果
开发新型凝胶介质，提高对大分子物质的分 辨率。
提高温度稳定性
通过改进凝胶介质或优化操作条件，提高凝 胶层析法对温度变化的稳定性。
装柱
将凝胶颗粒装入层析柱中，确 保填充均匀。
上样
将待分离样品加入层析柱的顶 部，确保样品与凝胶颗粒充分 接触。
检测
对洗脱液进行检测，观察分离 效果。
结果分析
对收集到的洗脱液进行定性和定量分 析，确定各组分的含量和纯度。
比较实验结果与预期结果，分析实验 误差和影响因素，总结实验结论。
03
CATALOGUE
告撰写非常重要。
采用适当的统计方法处理数据
对于实验数据，应采用适当的统计方法进行处理和分析， 以得出可靠的结论。
备份实验数据
为了防止数据丢失，应将实验数据备份并保存在安全的地 方。
04
CATALOGUE
凝胶层析法实验案例
实验一：分离蛋白质
总结词
通过凝胶层析法分离蛋白质，可以获得高纯度的蛋白质样品，为后续的生化分析提供高 质量的原料。
原理
基于分子大小和形状差异，利用凝胶孔径对不同大小分子进行选择性分离，大 分子不能进入凝胶孔洞，而小分子可以进入凝胶孔洞，从而实现大小分子的分 离。
发展历程
起源
现状
凝胶层析法起源于20世纪40年代，最 初用于蛋白质的分离。
目前，凝胶层析法已成为一种广泛应 用于分离纯化技术领域的进和分离技术 的提高，凝胶层析法逐渐应用于更多 领域，如生物技术、制药、环境科学 等。
凝胶层析实验报告
凝胶层析实验报告一.实验目的:将血红蛋白与鱼精蛋白混合物进行分离二.实验原理:凝胶是一种具有多孔,网状结构的分子筛. 分子量不同通过凝胶柱的速度也不同,利用这种凝胶分子筛对大小不同的分子进行层析分离.当样品溶液通过凝胶柱时,相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔而只能沿着凝胶颗粒间的孔隙,随着溶剂流动,因此流程较短,向前移动速度快而首先流出层析柱;反之,相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网孔,可自由地进出凝胶颗粒的网孔,在向下移动过程中,它们从凝胶内扩散到胶粒孔隙后再进入另一凝胶颗粒,如此不断地进入与逸出,使流量增长,移动速率慢而最后流出层析柱.从而在大分子物质与小分子物质之间被洗脱.这样,经过层析柱,使混合物中的各物质按其分子大小不同而被分离.三.主要仪器和试剂:铁架台层析柱胶管交联葡聚糖凝胶G-50血红蛋白鱼精蛋白混合物(aq)四.操作步骤:1 连接装置:将层析柱固定在铁架台上,保持与水平面垂直,底部与胶管连接.胶管下端置于烧杯中.2 装柱:将尼龙网放入层析柱底部, 使其水平固定;夹住胶管向柱中注水,松手放水,使水流到剩一厘米,让气泡流出,夹住胶管.3 灌胶:将凝胶搅拌均匀,用玻璃棒引流将凝胶溶液一次性倒入层析柱约20ml;夹住胶管片刻,然后打开夹子,让凝胶沉淀约20分钟(凝胶与水分层),当水流至离凝胶约5mm处时,夹住胶管.用玻璃棒取滤纸一片伸入层析柱,放置于凝胶表面之上水面之下,打开夹子,当露出滤纸,关闭夹子.4 加样:用胶头滴管取血红蛋白’鱼精蛋白混合液,滴入层析柱,约两滴.5 洗脱:当待分离混合液渗入滤纸后,加少量水,开夹放水,(水面始终位于滤纸之上),反复两三次;关闭止水夹到入大量水,再开夹.等待分离6 回收:将洗净的凝胶回收以便再次利用五.实验现象:观察看到红色的液体先被分离,流至烧杯中;黄色液体流速很慢,最终流入烧杯.六.结论与分析:结论:血红蛋白分子量比鱼精蛋白分子量大的多,利用分子筛效应先分离出血红蛋白; 使其混合物分离. 分析:。
凝胶层析试验报告
摘要凝胶色谱技术是六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离分技术，由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果。
凝胶色谱法又称分子排阻色谱法。
根据分离的对象是水溶性的化合物还是有机溶剂可溶物，又可分为凝胶过滤色谱（GFC）和凝胶渗透色谱（GPC）。
GFC一般用于分离水溶性的大分子，如多糖类化合物。
本实验用凝胶色谱法对食用油中的甘油三酯进行了分离提取。
关键词：凝胶色谱甘油三酯食用油第一章简介凝胶层析法凝胶层析又称分子筛过滤、排阻层析等。
它的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性质的保持有独到之处。
对于高分子物质有很好的分离效果。
一、凝胶的选择根据实验目的不同选择不同型号的凝胶。
如果实验目的是将样品中的大分子物质和小分子物质分开，由于它们在分配系数上有显著差异，这种分离又称组别分离，一般可选用Sephadex G-25和G-50，对于小肽和低分子量的物质（1000-5000）的脱盐可使用Sephadex G-10，G-15及Bio-Gel-p-2或4。
如果实验目的是将样品中一些分子量比较近似的物质进行分离，这种分离又叫分级分离。
一般选用排阻限度略大于样品中最高分子量物质的凝胶，层析过程中这些物质都能不同程度地深入到凝胶内部，由于Kd不同，最后得到分离。
二、柱的直径与长度根据经验，组别分离时，大多采用2-30cm长的层析柱，分级分离时，一般需要100cm左右长的层析柱，其直径在1-5cm范围内，小于1cm产生管壁效应，大于5cm则稀释现象严重。
长度L与直径D的比值L/D一般宜在7-10之间，但对移动慢的物质宜在30-40之间。
三、凝胶柱的制备凝胶型号选定后，将干胶颗粒悬浮于5-10倍量的蒸馏水或洗脱液中充分溶胀，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去。
自然溶胀费时较长，加热可使溶胀加速，即在沸水浴中将湿凝胶浆逐渐升温至近沸，1-2小时即可达到凝胶的充分胀溶。
凝胶层析法分离蛋白质实验报告
凝胶层析法分离蛋白质实验报告凝胶层析法分离蛋白质实验报告一、实验目的本实验旨在通过凝胶层析法分离蛋白质，掌握凝胶层析法的基本原理和方法，了解凝胶层析在蛋白质分离中的应用。
二、实验原理凝胶层析法是一种基于分子大小不同的分离技术。
它利用凝胶颗粒的孔径大小，将不同大小的分子进行分离。
当蛋白质溶液通过装有凝胶颗粒的层析柱时，不同大小的蛋白质分子会根据其大小分别进入凝胶颗粒的不同孔径，从而实现在一个连续的流洗过程中将不同大小的蛋白质分离开来。
三、实验步骤1.准备实验材料：凝胶颗粒（如Sephadex G-25或G-75）、层析柱、蛋白质样品（如牛血清白蛋白）、缓冲液等。
2.将凝胶颗粒装入层析柱中，注意不要压实，保持颗粒松散。
3.加入缓冲液，使凝胶颗粒充分膨胀。
4.将蛋白质样品加入到层析柱中，注意不要加太多，以免影响分离效果。
5.打开流出口，使缓冲液缓慢流过层析柱，收集流出的溶液。
6.记录每管收集的溶液体积和蛋白质含量，绘制洗脱曲线。
7.收集分离后的蛋白质。
四、实验结果与分析1.洗脱曲线的绘制与分析实验中，随着缓冲液的流过，不同大小的蛋白质分子会依次被洗脱出来。
通过观察每管收集的溶液体积和蛋白质含量，我们可以绘制出洗脱曲线。
洗脱曲线显示了不同大小的蛋白质分子被洗脱出来的时间和顺序。
通过洗脱曲线，我们可以分析不同蛋白质分子的性质和大小。
2.分离效果评估通过比较实验前后的蛋白质样品，我们可以评估凝胶层析法的分离效果。
在凝胶层析法中，不同大小的蛋白质分子被分离出来，从而可以得到多个不同的蛋白质组分。
通过观察每个组分的蛋白质含量和性质，我们可以评估凝胶层析法的分离效果。
五、结论本实验通过凝胶层析法成功地分离了蛋白质样品中的不同组分。
实验结果表明，凝胶层析法是一种有效的蛋白质分离方法。
通过调整凝胶颗粒的孔径大小和缓冲液的成分，可以进一步优化分离效果。
在生物化学、生物工程和生物医药等领域，凝胶层析法被广泛应用于蛋白质和其他生物分子的分离和纯化。
凝胶层析法测定蛋白质分子量
凝胶层析法测定蛋白质的分子质量【实验原理】凝胶层析法（即凝胶过滤法，gel filtration）是利用凝胶的分子筛作用把分子大小不同的物质分离开的一种方法，又称为分子筛层析法（molecular sieve chromatography），排阻层析法（exclusion chromatography）。
凝胶本身是一种分子筛，可以把分子按不同大小进行分离，好象过筛可以把大颗粒与小颗粒分开一样。
但这种“过筛”与普通的过筛不一样。
将凝胶颗粒在适宜的溶剂中浸泡，使充分吸液膨胀，然后装入层析柱中，加入欲分离的混合物，再以同一溶剂洗脱。
在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外，而小分子可以进入凝胶内部，流速缓慢，以致最后流出柱外，从而使样品中分子大小不同的物质得到分离。
凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质，不论是天然凝胶还是人工合成凝胶，它们的内部都具有很微细的多孔网状结构。
凝胶层析法常用的天然凝胶是琼脂糖凝胶（agarose gel，商品名Sepharose）；人工合成的凝胶是聚丙烯酰胺凝胶（商品名为Bio-gel-P）和葡聚糖（dextran）凝胶（商品名称为Sephadex）的各种交联凝胶，它们是具有不同孔隙度的立体网状结构的凝胶，不溶于水。
这种聚合物的立体网状结构，其孔隙大小与分离物质分子的大小有相应的数量级。
在凝胶充分溶胀后，交联度高的，孔隙小，只有相应的小分子可以通过，适于分离小分子物质。
相反，交联度低的孔隙大，适于分离大分子物质。
利用这种性质可分离不同M r的物质。
为了说明凝胶层析的原理，将凝胶装柱后，柱床体积称为“总体积”，以V t(total volume)表示。
实际上V t是由V O，V t与V g三部分组成，：V t=V O+V t+V gV o称为“孔隙体积”或“外体积”（outer volume）又称“外水体积”，即存在于柱床内凝胶颗粒外面空隙之间的水相体积，相当于一般层析法中柱内流动相的体积；V i为内体积（inner volume），又称“内水体积”，即凝胶颗粒内部所含水相的体积，相当于一般层析法中的固定相的体积，它可从干凝胶颗粒重量和吸水后的重量求得；V g为凝胶本身的体积，因此V t-V o.等于V i+V g。
生物化学实验 层析法实验
实验二（1）凝胶层析分离血红蛋白与鱼精蛋白【实验目的】掌握凝胶层析分离蛋白质的基本原理，掌握柱层析的基本操作方法【实验原理】交联葡聚糖凝胶具有多糖网状结构，血红蛋白较鱼精蛋白大：血红蛋白分子量为64500，鱼精蛋白分子量为2000-12000，因此在交联葡聚糖凝胶中鱼精蛋白从胶体分子内部网状结构孔隙中通过，血红蛋白从胶体分子间隙中通过。
血红蛋白走过的路径短且速度快，鱼精蛋白走过的路径长且速度慢。
因此可以在层析柱中观察到红色的血红蛋白先被洗脱出来，而经二硝基氯苯预染呈黄色的鱼精蛋白则在其后被洗脱出来【实验步骤】检查层析装置是否完好→装填层析柱（蒸馏水面应高凝胶面1cm左右）→滴加0.2ml的血红蛋白和鱼精蛋白混合样品→放出一些蒸馏水使样品沉降到凝胶表面→滴加蒸馏水至液面高凝胶2cm→开始洗脱，过程中应不断滴加蒸馏水使液面高度尽量保持不变【实验结果】如图所示：【讨论与分析】1.凝胶层析柱装填时应避免出现气泡，因为气泡会导致血红蛋白的洗脱路径变窄，以至于血红蛋白洗脱速率减慢，从而导致血红蛋白和鱼精蛋白分离不充分；2.为避免凝胶柱装填时出现分层现象，可在再次加入凝胶前轻轻吹打沉淀好的凝胶表面，然后再慢慢补加凝胶。
实验二（2）离子交换层析分离混合氨基酸【实验目的】掌握离子交换层析的基本原理，了解分离混合氨基酸的基本方法【实验原理】天冬氨酸的等电点是2.97，赖氨酸等电点为9.74。
所以先用pH4.2的柠檬酸洗脱时天冬氨酸带负电被洗脱出来，而赖氨酸带正电吸附在阳离子交换树脂上；然后用pH13的NaOH洗脱时赖氨酸带负电，此时之前被吸附在阳离子交换树脂上的赖氨酸就会脱落而被洗脱出来了。
【实验步骤】检查层析装置是否完好→装填层析柱并用柠檬酸洗涤几次阳离子交换凝胶（流动相面始终应高出凝胶面1cm左右）→滴加0.2ml的混合氨基酸样品→放出一些液体使样品沉降到凝胶表面（使流动相液面高出凝胶面0.5cm即可）→滴加柠檬酸至液面高凝胶2cm→开始洗脱并用标记好的试管依次采集7管洗脱液各2ml（过程中不断滴加柠檬酸使液面高度尽量保持不变）→换用NaOH洗脱，同样也采集7管洗脱液各2ml→往洗脱液收集管中分别加入pH为5的乙酸缓冲液和茚三酮溶液各0.5ml→沸水浴10min→570nm测吸光值→绘制层析图并计算分离度【实验结果】时间（试管编号） 1 2 3 4 5 6 7 吸光度A 0.000 0.004 0.695 0.295 0.044 0.014 0.030 时间（试管编号）8 9 10 11 12 13 14 吸光度A -0.003 0.008 0.037 3.010 0.222 0.020 0.039【讨论与分析】由层析图可得Rs=98.4%【讨论与分析】天冬氨酸与赖氨酸洗脱液的吸光度差距较大的原因可能有哪些？答：1.样品取自上清液，氨基酸没有混合均匀，导致洗脱液中氨基酸含量差异较大；2.茚三酮与氨基酸的呈色反应的结果与氨基酸的种类及pH值有关，洗脱液pH值不同，导致茚三酮呈色反应出现了不同的染色结果因而导致了吸光度的差异。
凝胶过滤层析实验报告
一、实验目的1. 了解凝胶过滤层析的原理及操作步骤。
2. 掌握利用凝胶过滤层析法分离混合物中不同分子量蛋白质的方法。
3. 通过实验验证凝胶过滤层析法在蛋白质分离中的应用。
二、实验原理凝胶过滤层析法，又称分子筛层析法或凝胶过滤法，是一种根据分子大小进行分离的层析技术。
该技术利用凝胶的分子筛特性，将混合物中的不同分子量的物质分离。
凝胶是一种具有多孔结构的物质，孔径大小不一，当混合物通过凝胶层析柱时，大分子物质由于无法进入凝胶孔径，将直接通过层析柱；而小分子物质则可以进入凝胶孔径，从而在层析柱中停留较长时间，实现分离。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 蛋白质混合物（含有已知分子量的标准蛋白质和未知分子量的蛋白质）- 凝胶层析柱（Sephadex G-75）- 洗脱液（磷酸盐缓冲液，pH 7.4）- 标准蛋白质（如牛血清白蛋白、卵清蛋白等）- 未知蛋白质样品2. 实验仪器：- 凝胶层析柱架- 凝胶层析柱- 量筒- 离心机- 分光光度计四、实验步骤1. 准备凝胶层析柱：将凝胶层析柱垂直放置于凝胶层析柱架上，用洗脱液平衡凝胶层析柱，直至洗脱液颜色清澈。
2. 加样：取一定量的蛋白质混合物，加入凝胶层析柱的顶部，用洗脱液冲洗，直至混合物完全进入层析柱。
3. 洗脱：用洗脱液缓慢冲洗层析柱，收集各部分洗脱液，分别测定其蛋白质含量。
4. 分离：根据洗脱液的蛋白质含量，绘制洗脱曲线，分析不同分子量蛋白质的分离情况。
5. 结果分析：根据标准蛋白质的分子量和洗脱曲线，推测未知蛋白质样品的分子量。
五、实验结果与分析1. 凝胶过滤层析柱平衡后，洗脱液颜色清澈，说明凝胶层析柱已准备就绪。
2. 洗脱过程中，标准蛋白质和未知蛋白质样品的洗脱曲线如下：- 标准蛋白质洗脱曲线：在洗脱曲线中，标准蛋白质的洗脱峰呈对称状，峰面积较大，说明分离效果较好。
- 未知蛋白质样品洗脱曲线：在洗脱曲线中，未知蛋白质样品的洗脱峰位置与标准蛋白质的洗脱峰位置不同，峰面积较小，说明分离效果较差。
凝胶层析
1 凝胶层析的基本原理
凝胶层析的分离过程是在装有 多孔物质填料的柱中进行的。 柱的总体积为VA，它包括填料 的骨架体积Vg，填料的孔体积 Vi(内水体积)以及填料颗粒之 间的体积V0（外水体积）。
4
流动相体积
固定相体积
总体积
则：
Vt=Vo+Vi+Vg
原理
当具有一定分子量分布的高聚 物溶液从柱中通过时，较小的 分子在柱中停留时间比大分子 停留的时间要长，于是样品各 组分即按分子大小顺序而分开， 最先淋出的是最大的分子。
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3 凝胶层析的实验条件和操作
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凝胶层析的实验条件和操作
3.1 3.2 3.3 3.4 凝胶的选择和处理 凝胶层析柱的设计和制备 凝胶层析操作 主要参数测算
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3.1 凝胶的选择和处理
3.1.1 凝胶的选择
选择适宜的凝胶是取得良好分离效果的最根 本的保证。选取何种凝胶及其型号、粒度，一方 面要考虑凝胶的性质，包括凝胶的分离范围（渗 入限与排阻限）还有它的理化稳定性、强度、非 特异吸附性质等；另一方面还要注意到分离目的 和样品的性质。
对含羟基与羧基的化合物却有吸附作用 。
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2.2.2 葡聚糖凝胶离子交换剂
在G类凝胶上引入一些酸性或碱性基团后，则制 得各种葡聚糖凝胶离子交换剂 。
如引入磺乙基（SE-Sephadex）、羧甲基（CM-Sephadex） 及二乙胺基乙基（DEAE-Sephadex A）等。葡聚糖凝胶离子交 换剂具有离子交换和分子筛双重作用。其结构多孔、疏松、非 特异性吸附很少，层析时流速易控制，特别适用于蛋白质、酶、 激素、多核苷酸等的分离纯化，以及生化制剂的除热原。
Ve=V0+Vi Kd
层析凝胶法实验报告
1. 了解层析凝胶法的原理及其应用。
2. 掌握层析凝胶法的基本操作步骤。
3. 学习利用层析凝胶法分离混合物中的不同组分。
二、实验原理层析凝胶法，又称分子筛层析法，是一种利用凝胶作为固定相，根据分子大小不同进行分离的技术。
凝胶是一种具有多孔结构的物质，其孔径大小可以调节，从而实现对不同分子大小的分离。
在层析过程中，分子量较大的物质无法进入凝胶内部，只能沿凝胶颗粒间的缝隙流出；而分子量较小的物质可以进入凝胶内部，流速较慢，最后流出柱外。
通过这种差异，样品中的不同组分可以得到有效分离。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：混合物样品、葡聚糖凝胶、洗脱液、收集瓶等。
2. 实验仪器：层析柱、紫外-可见分光光度计、电子天平等。
四、实验步骤1. 准备凝胶：将葡聚糖凝胶用洗脱液浸泡，使其充分膨胀，然后装入层析柱中。
2. 样品制备：将混合物样品溶解于适量的洗脱液中，调整其浓度为1mg/mL。
3. 上样：将样品溶液缓慢加入层析柱中，使其均匀分布在凝胶表面。
4. 洗脱：用洗脱液冲洗层析柱，收集不同洗脱体积的洗脱液。
5. 分析：使用紫外-可见分光光度计测定不同洗脱体积的洗脱液吸光度，确定各组分的洗脱时间。
6. 收集：将不同洗脱时间的洗脱液收集于不同试管中，进行后续分析。
五、实验结果与分析1. 通过紫外-可见分光光度计测定不同洗脱体积的洗脱液吸光度，绘制洗脱曲线。
2. 根据洗脱曲线，确定各组分的洗脱时间。
3. 对收集的洗脱液进行后续分析，如质谱、核磁共振等，确定各组分的成分。
1. 层析凝胶法是一种有效分离混合物中不同组分的技术。
2. 通过调节凝胶的孔径大小，可以实现不同分子大小的分离。
3. 本实验成功分离了混合物中的不同组分，为后续分析提供了基础。
七、实验讨论1. 层析凝胶法的分离效果受多种因素影响，如凝胶的孔径大小、洗脱液的流速等。
在实际操作中，需要根据样品特性和实验目的选择合适的实验条件。
2. 层析凝胶法适用于分离分子量较大的物质，对于分子量较小的物质，可能需要采用其他分离方法。
生化凝胶层析实验报告
一、实验目的本实验旨在通过凝胶层析技术，对混合物中的不同分子量物质进行分离和纯化。
具体目标包括：1. 掌握凝胶层析的原理和操作步骤。
2. 学习如何根据分子量差异对蛋白质等生物大分子进行分离。
3. 观察和分析实验结果，验证凝胶层析技术的有效性和可行性。
二、实验原理凝胶层析（Gel Filtration）又称分子筛层析，是一种基于分子量差异进行物质分离的方法。
该技术利用凝胶作为固定相，凝胶具有多孔结构，分子量不同的物质在凝胶中的移动速度不同，从而实现分离。
实验中常用的凝胶材料包括葡聚糖凝胶（Sephadex）和琼脂糖凝胶（Sepharose）。
凝胶颗粒的大小可通过调节葡聚糖和交联剂的比例来控制。
交联度越大，网孔结构越紧密；交联度越小，网孔结构就越疏松。
因此，不同型号的凝胶具有不同的分子量分级范围。
实验过程中，将待分离物质加入凝胶柱中，在溶剂的作用下，各组分因分子量差异在凝胶柱中以不同的速度移动。
分子量大的物质在凝胶柱中的移动速度较慢，先流出柱子；而分子量小的物质则可以进入凝胶颗粒的网孔内，移动速度较快，后流出柱子。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 待分离的混合物- 葡聚糖凝胶（Sephadex G-100）- 洗脱液（例如磷酸盐缓冲液）- 标准蛋白质溶液（例如牛血清白蛋白、肌红蛋白等）- 紫外分光光度计- 凝胶层析柱- 量筒- 移液器- 离心机2. 实验仪器：- 凝胶层析柱- 紫外分光光度计- 移液器- 量筒- 离心机四、实验步骤1. 准备凝胶柱：将葡聚糖凝胶（Sephadex G-100）用洗脱液充分溶胀，装入凝胶层析柱中。
2. 准备样品：将待分离的混合物用洗脱液稀释，调整蛋白质浓度至适当水平。
3. 加样：将样品加入凝胶柱中，待样品完全进入凝胶柱后，用洗脱液冲洗柱子，直至流出液为无色。
4. 收集洗脱液：用紫外分光光度计检测洗脱液中的蛋白质浓度，收集不同分子量范围的蛋白质组分。
5. 分析结果：将收集到的蛋白质组分进行SDS-PAGE电泳或Western blot分析，观察蛋白质的分子量和纯度。
凝胶层析试验报告
凝胶层析试验报告首先，我们制备了一定浓度的SDS-凝胶。
制备过程中，我们按照实验要求将甘油胺修饰的蛋白样品加入到SDS-样品缓冲液中，然后将混合物加载到凝胶槽中。
同时，我们还将分子量标准品加载到凝胶的一侧，作为分子量标尺。
之后，我们通过电泳的方式让样品在凝胶中迁移。
首先我们设定电泳系统的电压和时间，并保持电流稳定运行。
期间，我们注意观察凝胶是否存在异常现象，如温度升高、电解液溢出等。
电泳结束后，我们将凝胶从电泳槽中取出，并放置在染色盒中。
接下来，我们进行染色和显影步骤。
首先，我们将染色剂溶液倒入染色盒中，然后将凝胶小心地放入盒中，确保凝胶完全浸泡在染色剂中。
染色时间一般为30分钟至1小时，根据染色剂的要求进行调整。
染色结束后，我们将染色剂排出，并用去离子水反复洗涤凝胶，使染色剂完全被洗去。
最后，我们在凝胶上观察和记录蛋白质的迁移和染色情况。
根据实验结果，我们发现样品中蛋白质分子量分布范围较广，主要集中在50kDa至200kDa之间。
具体来说，我们观察到了几个特定的蛋白质带。
首先，我们观察到了一个明显的带位于分子量标尺上的150kDa位置，这表明样品中存在一个分子量为150kDa的蛋白质。
其次，我们还观察到了一些较暗的带，它们位于分子量标尺上的100kDa左右和200kDa左右位置，分别代表样品中分子量约为100kDa和200kDa的蛋白质。
此外，我们还对样品中特定蛋白质的含量进行了定量分析。
通过将实验结果与标准曲线比对，我们可以计算出样品中该蛋白质的含量。
例如，我们发现样品中的蛋白质在凝胶上表现为一个较浓的带位于分子量标尺上的75kDa位置。
通过对标准曲线的分析，我们确定该带所代表的蛋白质浓度为200μg/mL。
综上所述，凝胶层析试验是一种简单有效的蛋白质分析方法。
通过该方法，我们可以确定蛋白质的分子量范围以及特定蛋白质的含量。
然而，需要注意的是，凝胶层析试验在蛋白质的分离和检测中存在一定的局限性，例如对于超大分子量的蛋白质会出现迁移受限的情况。
凝胶层析法
型号 G10 G15 G25 G50 G75 G100 ＜700
分离范围 （分子量）
吸水量 （ml/g） 1.0±0.1 1.5±0.2 2.5±0.2 8.0±0.3 7.5±0.5 10.0±1.0
床体积/干凝胶 （ml/mg） 2~3 2.5~3.5 4~6 9~11 12~15 15~20
三．凝胶层析分离的过程
5 ． Ve (elution volume) 洗 脱 容 积 ： Ve=Vo+KdVi 。 自加入样品时算起，到组分最大浓度（峰） 出现时所流出的容积。 6．Kd：样品组分在两相间的分配系数。 7．Kd: 通过实验可求得。 Ve=V0+Kd•Vi Kd=(Ve-Vo)/Vi
二．样品 积 为 柱 床 体 积 的 1~4%； 制备分离时，样品体积为柱床体积的 25~30%。 2. 分离体积（Vsep=Ve1-Ve2） 当样品体积≥Vsep时，两个相邻组分不能 完全分离。
三．操作压的影响
1．洗脱时维持流速的恒定。 2．用恒流泵维持恒压，从而维持恒流。
分子量的测定和计算
一般都采用标准曲线法。只要测得几种标 准蛋白质相对分子质量的Ve，并以它们的 相对分子质量的对数(logMr)对Ve作图得一 直线，再测出待测样品的Ve，即可从图中 确定它的相对分子质量。
凝胶层析法
第一节：引言
一．凝胶层析(Gel chromatography)
凝胶层析也称： 排阻层析(ellusion chromatography)、 凝胶过滤(gel filtration)、 分子筛层析(moleculer chromatography)。
凝胶层析中常用凝胶的类型 （4种主要类型）
二．凝胶的类型
第四节：凝胶层析的实验技术
不同分子量蛋白质的分离-凝胶柱层析法
不同分子量蛋白质的分离——凝胶柱层析法目的要求（1）了解凝胶柱层析的原理及应用。
（2）掌握凝胶柱层析的基本操作技术。
实验原理凝胶层析又称凝胶过滤，是一种按分子量大小分离物质的层析方法。
该方法是把样品加到充满着凝胶颗粒的层析柱中，然后用缓冲液洗脱。
大分子不能进入凝胶颗粒中的静止相中，只留在凝胶颗粒之间的流动相中，因此以较快的速度首先流出层析柱，而小分子则能自由出入凝胶颗粒中，并很快在流动相和静止相之间形成动态平衡，因此就要花费较长的时间流经柱床，从而使不同大小的分子得以分离。
凝胶过滤柱层析所用的基质是具有立体网状结构、筛孔直径一致，且呈珠状颗粒的物质。
这种物质可以完全或部分排阻某些大分子化合物于筛孔之外，而对某些小分子化合物则不能排阻，但可让其在筛孔中自由扩散、渗透。
任何一种被分离的化合物被凝胶筛孔排阻的程度可用分配系数Kav（被分离化合物在内水和外水体积中的比例关系）表示。
Kav值的大小与凝胶床的总体积（Vt）、外水体积（V o）及分离物本身的洗脱体积（Ve）有关，即：Kav= (Ve-V o)/(Vt-V o)在限定的层析条件下，Vt和V o都是恒定值，而Ve值却是随着分离物分子量的变化而变化的。
分离物分子量大，Kav值小；反之，则Kav值增大。
通常选用蓝色葡聚糖2000作为测定外水体积的物质。
该物质分子量大（为200万），呈蓝色，它在各种型号的葡聚糖凝胶中都被完全排阻，并可借助其本身颜色，采用肉眼或分光光度仪检测（210nm或260nm或620nm）洗脱体积（即V o）。
但是，在测定激酶等蛋白质的分子量时，宜用蓝色葡聚糖2000测定外水体积，因为它对激酶有吸附作用，所以有时用巨球蛋白代替。
测定内水体积（Vi）的物质，可选用硫酸铵、N-乙酰酪氨酸乙酯，或者其它与凝胶无吸附力的小分子物质。
本实验使用血红蛋白（分子量64,500左右）和二硝基氟苯－鱼精蛋白（DNP－鱼精蛋白分子量12,000左右）的混合物，通过Sephadex G－25层析后达到分离。
凝胶层析实验报告
凝胶层析实验报告一、实验目的1.学习凝胶层析的原理和操作方法。
2.熟悉常用的层析缓冲液配制方法。
3.掌握凝胶层析实验结果的分析和判断。
二、实验原理凝胶层析是利用凝胶介质对溶液中的离子或分子进行分离和纯化的方法。
其原理基于不同溶质在凝胶介质中的扩散速率差异，从而实现分离和纯化。
在本实验中，我们使用的是凝胶过滤层析。
凝胶过滤层析是一种分子量分离的方法，适用于分离高分子量溶质和低分子量溶质。
其原理是通过选择性的孔径大小和分子量将目标蛋白分离出来。
三、实验步骤1.准备工作：配制层析缓冲液。
2.准备凝胶柱：取一个洁净的层析柱，将其连接到固定底座上。
3.预处理凝胶柱：在凝胶柱上加入适量的层析缓冲液，振荡平衡一段时间。
4.样品处理：将样品加入层析缓冲液中，轻轻混合，使样品均匀分布。
5.等体积加载：将样品缓慢地加入凝胶柱顶部，等体积加载约1.5倍。
6.等待分离：样品逐渐从凝胶柱中过滤，高分子量溶质滞留在凝胶中，而低分子量的溶质通过凝胶柱流出。
7.收集分离物：根据实验需求，收集分离物进行后续的分析或操作。
四、结果分析实验结果以图表形式呈现，其中包括吸光度曲线、蛋白的分离和纯化效果等。
通过分析结果可以得出以下结论：1.凝胶层析可以有效地分离高分子量蛋白和低分子量蛋白。
2.凝胶层析的纯化效果与样品的初始浓度、孔径大小等因素有关。
3.层析缓冲液的pH值和离子强度对层析效果有重要影响。
4.凝胶层析可以用于富集和纯化特定蛋白，为后续实验提供高纯度的样品。
五、实验总结凝胶层析是一种常用的分离和纯化生物大分子的方法，具有操作简便、高效、可扩展性强等优点。
通过本次实验，我对凝胶层析的原理和操作方法有了更深入的了解，并且熟悉了层析缓冲液的配制和实验结果的分析方法。
然而，在实验中还存在一些问题和改进的方向。
首先，凝胶层析的选择需要根据样品特性和实验目的来确定，不同的凝胶介质适用于不同的分离和纯化需求。
其次，凝胶柱的装配和操作要求严格，需要保证凝胶柱平衡和预处理的稳定性。
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【目的】
学习和掌握凝胶层析的基本原理和操作技术
学习使用Sephadex G-75分离核黄素与酪蛋白
【原理】
凝胶层析也称分子筛层析、排阻层析。 是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用， 根据被分离物质的分子大小不同来进行分 离的技术。
四、核黄素与酪蛋白的分离
打开层析柱出口，使柱面溶液流出，直至床面
与液面刚好齐平，关闭出口，将10滴样品沿层析 柱管壁小心加入，加完后打开底端出口，流出液
分别收集。
流速大约10滴/分钟，每管收集30滴。
从无黄色的各收集管中每管取1滴溶液加于白
瓷板上，分别滴加1滴双缩脲试剂，找到颜色最深 的2管样品，转移至Eppendorf管，标记后冻存于20℃冰箱。
凝胶过滤层析
凝胶层析是按照蛋
白质分子量大小进行分 离的技术，又称之凝胶 过滤、分子筛层析或排 阻层析。 单个凝胶珠本身象 “筛子”。不同类型凝
胶的筛孔的大小不同。
带网孔的 葡聚糖珠 小分子进入 葡聚糖珠内
大分子不 能进入珠 内，经珠 之间缝隙 流出
凝胶过滤层析过程示意图
凝胶 珠
凝胶颗粒内外部分渗透，渗透的
程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介于二 者之间，这样分子大的组分先流出，分子小的组分后流出。
这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的
顺序依次流出，从而达到了分离的目的。
【实验器材】
层析柱:1.2×20cm, 1支
100ml烧杯，1只
样品的准备
0.1g酪蛋白样品置离心管中，加入 0.1mol/L NaOH溶液3ml,蒸馏水2ml,60℃水 浴使其溶解，至室温后调PH至8.0 加入少量核黄素粉末使饱和，3000rpm 离心5min，取上清液备用
二、装柱
取1.2×20cm的洁净层析柱，先于底部 填放少许脱脂棉，加入5ml洗脱液(硼酸缓冲 液),关闭出口.
凝胶过滤层析过程示意图
总结：
相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔被完全排
阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间向下流动，因此流程
较短，移动速度快；所以首先流出。 相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网孔，可完全 渗透进入凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中，因此流程 较长，移动速率慢；所以最后流出。
乳胶管，1根
再字夹，1支
滴管1支，玻棒1支
1.5×10cm小试管20-30支 5ml吸量管1支，0.5ml吸量管1支 试管架1只
【实验试剂】 待分离样品：核黄素，酪蛋白 葡聚糖凝胶 Sephadex G-75
双缩脲试剂
洗脱液：0.1mol/L pH8.0硼酸缓冲液
【操作方法】
一、凝胶的处理
Sephadex G-75干粉经蒸馏水室温充 分溶胀48h，或沸水浴中煮沸2h，冷却至 室温后抽真空脱去颗粒空隙中的空气。
五、绘制洗脱曲线
以与酪蛋白络合形成的紫红色为纵坐标， 以毫升数（或管数）为横坐标，绘出洗脱曲 线。
六、凝胶柱的处理
凝胶用过后，反复用蒸馏水通过柱 （2~3倍床体积）即可。
注意事项
• 各接头不能漏气，连续用的小乳胶管不要有破损， 否则造成漏气、漏液。注意恒压瓶内的排气管应 无液体，并随着柱下口溶液的流出不断有气泡产 生，则表示恒压瓶不漏气。操作过程中，层析柱 内液面不断下降，则表示整个系统有漏气之处， 应仔细检查并加以纠正。 • 始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分挥发， 凝胶变干。也要防止液体流干，使凝胶混入大量 气泡，影响液体在柱内的流动，导致分离效果变 坏，不得不重新装柱。
• 1. 处理凝胶时，应使之充分吸收溶胀，并避免剧 烈搅拌。 • 2. 装柱时，凝胶不可太稀或太干。
• 3. 为了取得较好分离效果，起始区带必须尽量狭
窄，因此加样量要少，不能超过床体积的25-40%。
• 4. 严格控制洗脱速度，不宜过快，否则可导致分
离不完全。
糖溶液，切勿搅动柱床表面。 打开出口，使蓝色葡聚糖溶液进入柱床，直至柱面与液面齐
平，关闭出口。
同上法加入20滴洗脱液，完全进柱后，再加入多量的洗脱液 进行洗脱。
蓝色葡聚糖进柱后，立即开始收集，同时观察蓝色葡聚糖在
柱中的移动行为（蓝色谱带集中，则装柱效果好） 待色带流至柱底时，按每管30滴收集。 待蓝色液全部流出后，将从蓝色葡聚糖进柱后开始所收集的 流出液，直至颜色最深的一管的总体积相加，量出体积，即为外 水体积。
将浓浆状的凝胶缓慢地倾入柱中，使之 自然沉降，凝胶沉降约2㎝高度后打开出水 口，继续加入凝胶浆，直到凝胶沉积至 18cm。装柱要求连续，均与，无气泡，无 “纹路”。
三、装柱效果检查及外水体积测定
打开层析柱出口，将柱中多余的液体放掉出，使液面刚好盖过
凝胶，关闭出口，用滴管于床面中心轻轻滴加 10滴0.5%蓝色葡聚