实验二 凝胶层析法

五、绘制洗脱曲线
以与酪蛋白络合形成的紫红色为纵坐标， 以毫升数（或管数）为横坐标，绘出洗脱曲 线。
六、凝胶柱的处理
凝胶用过后，反复用蒸馏水通过柱 （2~3倍床体积）即可。
注意事项
• 各接头不能漏气，连续用的小乳胶管不要有破损， 否则造成漏气、漏液。注意恒压瓶内的排气管应 无液体，并随着柱下口溶液的流出不断有气泡产 生，则表示恒压瓶不漏气。操作过程中，层析柱 内液面不断下降，则表示整个系统有漏气之处， 应仔细检查并加以纠正。 • 始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分挥发， 凝胶变干。也要防止液体流干，使凝胶混入大量 气泡，影响液体在柱内的流动，导致分离效果变 坏，不得不重新装柱。
四、核黄素与酪蛋白的分离
打开层析柱出口，使柱面溶液流出，直至床面
与液面刚好齐平，关闭出口，将10滴样品沿层析 柱管壁小心加入，加完后打开底端出口，流出液
分别收集。
流速大约10滴/分钟，每管收集30滴。
从无黄色的各收集管中每管取1滴溶液加于白
瓷板上，分别滴加1滴双缩脲试剂，找到颜色最深 的2管样品，转移至Eppendorf管，标记后冻存于20℃冰箱。
糖溶液，切勿搅动柱床表面。 打开出口，使蓝色葡聚糖溶液进入柱床，直至柱面与液面齐
平，关闭出口。
同上法加入20滴洗脱液，完全进柱后，再加入多量的洗脱液 进行洗脱。
蓝色葡聚糖进柱后，立即开始收集，同时观察蓝色葡聚糖在
柱中的移动行为（蓝色谱带集中，则装柱效果好） 待色带流至柱底时，按每管30滴收集。 待蓝色液全部流出后，将从蓝色葡聚糖进柱后开始所收集的 流出液，直至颜色最深的一管的总体积相加，量出体积，即为外 水体积。
实验二 凝胶层析法分离酪蛋白与核黄素 Separating Riboflavin and Casein by Sephadex G-75
【目的】
学习和掌握凝胶层析的基本原理和操作技术
学习使用Sephadex G-75分离核黄素与酪蛋白
【原理】
凝胶层析也称分子筛层析、排阻层析。 是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用， 根据被分离物质的分子大小不同来进行分 离的技术。
• 1. 处理凝胶时，应使之充分吸收溶胀，并避免剧 烈搅拌。 • 2. 装柱时，凝胶不可太稀或太干。
• 3. 为了取得较好分离效果，起始区带必须尽量狭
窄，因此加样量要少，不能超过床体积的25-40%。
• 4. 严格控制洗脱速度，不宜过快，否则可导致分
离不完全。
样品的准备
0.1g酪蛋白样品置离心管中，加入 0.1mol/L NaOH溶液3ml,蒸馏水2ml,60℃水 浴使其溶解，至室温后调PH至8.0 加入少量核黄素粉末使饱和，3000rpm 离心5min，取上清液备用
二、装柱
取1.2×20cm的洁净层析柱，先于底部 填放少许脱脂棉，加入5ml洗脱液(硼酸缓冲 液),关闭出口.
凝胶过滤层析
凝胶层析是按照蛋
白质分子量大小进行分 离的技术，又称之凝胶 过滤、分子筛层析或排 阻层析。 单个凝胶珠本身象 “筛子”。不同类型凝
胶的筛孔的大小不同。
带网孔的 葡聚糖珠 小分子进入 葡聚糖珠内
大分子不 能进入珠 内，经珠 之间缝隙 流出
凝胶过滤层析过程示意图
凝胶 珠
凝胶基质
小分子 大分子
凝胶过滤层析过程示意图
总结：
相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔被完全排
阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间向下流动，因此流程
较短，移动速度快；所以首先流出。 相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网孔，可完全 渗透进入凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中，因此流程 较长，移动速率慢；所以最后流出。
中等大小的分子，它们在凝胶颗粒内外部分渗透，渗透的
程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介于二 者之间，这样分子大的组分先流出，分子小的组分后流出。
这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的
顺序依次流出，从而达到了分离的目的。
【实验器材】
层析柱:1.2×20cm, 1支
100ml烧杯，1只
乳胶管，1根
再字夹，1支
滴管1支，玻棒1支
1.5×10cm小试管20-30支 5ml吸量管1支，0.5ml吸量管1支 试管架1只
【实验试剂】 待分离样品：核黄素，酪蛋白 葡聚糖凝胶 Sephadex G-75
双缩脲试剂
洗脱液：0.1mol/L pH8.0硼酸缓冲液
【操作方法】
Baidu Nhomakorabea
一、凝胶的处理
Sephadex G-75干粉经蒸馏水室温充 分溶胀48h，或沸水浴中煮沸2h，冷却至 室温后抽真空脱去颗粒空隙中的空气。
将浓浆状的凝胶缓慢地倾入柱中，使之 自然沉降，凝胶沉降约2㎝高度后打开出水 口，继续加入凝胶浆，直到凝胶沉积至 18cm。装柱要求连续，均与，无气泡，无 “纹路”。
三、装柱效果检查及外水体积测定
打开层析柱出口，将柱中多余的液体放掉出，使液面刚好盖过
凝胶，关闭出口，用滴管于床面中心轻轻滴加 10滴0.5%蓝色葡聚