实验六 氨基酸的纸层析法

氨基酸的纸层析法

一．目的

了解并掌握氨基酸纸层析的原理和方法。

二、原理

以滤纸为支持物的层析法，称为纸层析法。纸层析所用展层剂大多由水和有机溶剂组成。展层时，水为静止相，他与滤纸纤维亲和力强；有机溶剂为流动相，它与滤纸纤维亲和力弱。有机溶剂在滤纸上又下向上移动的，称为上行法；有上向下移动的，称为下行法。

将样品在滤纸上确定的原点处展层，由于样品中各种氨基酸在两相中不断进行分配，且他们的分离系数各不相同，所以不同的氨基酸随流动相移动的速率也不相同，于是各种氨基酸在滤纸上就相互分离出来，形成距原点不等的层析点。

在一定条件下（室温、展层剂的组成、滤纸的质量、PH值等不变），不同的氨基酸有固定的移动速率（Rf值）Rf=原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离。用混合氨基酸做样品时，如果只用一种溶剂展层，由于某些氨基酸的移动速率相同或相近，就不能将它们分开，为此，当用一种溶剂展层后，可将滤纸旋转90度，以第一次所的层析点为原点，在用另一溶剂展层，从而达到分离的目的。这种方法称为双向层析法。

本试验主要介绍的是单向层析法。其中混合氨基酸有精氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸组成。

三、实验仪器

1、新华滤纸

2、层析缸

3、细线

4、点样管

5、橡皮筋

6、电吹风

7、喷雾器

四、实验试剂

1、混合氨基酸（精氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸）

2、展层剂：正丁醇：12%氨水：95%乙醇：蒸馏水=13：3：3：1（v:v）

3、0.5%茚三酮—无水丙酮溶液：0.5g茚三酮溶于100ml无水丙酮，贮于棕色瓶中

五、实验步骤

1、取滤纸剪成20×10厘米的滤纸条一张，在一端打孔，系一根细线，在另一端2~3cm处用铅笔画一横线，中间画一圆点（原点）。

2、取毛细管一支(回收)，吸取氨基酸混合液，在原点处点样，样点直径不宜超过5mm,每点一次用吹风机吹干，点2~3次为佳。

3、点样后将滤纸放入层析缸中展层，注意点样线要高于层析液面，滤纸不要贴在层析缸璧上，当展层至另一端1~2cm处时，停止展层（大约2~3小时）。

4、取出滤纸，用铅笔记下溶剂前沿，然后用热风吹干（或烘箱60℃）烘干。

5、均匀喷上茚三酮—无水丙酮液，注意使溶液不倒流，不间断。

6、用吹风机吹干，观察层析点，确定其几何中心。

7、量取数值，计算各自的Rf值，与表中标准氨基酸Rf值比较，确定样品氨基酸种类。（书上图谱横着看）

六．实验结果

从左到右依次为H、H1、H2、H3、H4。

H1=1.0cm H2=4.4cm H3=5.0cm H4=0.99cm H=11.7cm 由此可得

Rf1=0.08547

Rf2=0.37607

Rf3=0.42735

Rf4=0.08461

据此可知，混合氨基酸是由甘氨酸（Gly）和苯丙氨酸（Phy）组成。

七．实验分析

实验中出现了拖尾的现象。

拖尾现象是指展层，显色后在层析分配图上，所看到的某一种氨基酸的分子位移，不是如标准图谱所示的那样，完整地显示在某一位置上，而是形成象笤帚似的那样，前端粗圆而逐渐细小下来，宛如拖着一个尾巴。其图所呈颜色也是由浓渐淡。

图象的出现，是在实验中对影响Rf值的主要因素要求，掌握不够所致。诸如，物质结构与极性对Rf值的影响，层析溶剂对Rf值的影响，PH对Rf值的影响(溶剂、滤纸和样品的PH值)，温度对Rf值的影响，滤纸的质地是否均匀，薄厚是否适当，纤维的松紧度是否适中等对Rf值的影响，展层的方式(上行、下行)对Rf值的影响。然而在多次实验过程中无论怎佯严格遵循其影响Rf值的主要因素的要求，都仍不可避免地要出现拖尾现象。此时，这就需要从具体操作规范方面，诸如样品的处理，点样、展层、显色等几个操作程序去考虑思索，经仔细分析，样品的处理是为除去杂质纯化样品，达到层析分配某氨基酸的情晰显色图像；展层过程是在上述影响Rf值的主要因

素要求下进行，使样品达到一个适当的位移，便于在显色后从图象上，区分不同样品的氨基酸；显色是在用配制好的，与水不相混合，并挥发性较快喷雾后迅速吹干的。更何况显色剂又是含水量极低，不会影响洋品的斑点扩散，那么问题就集中在点样这个操作程序上了。点样是将被层析分配的几种氨基酸混合液，和为了对照实验结果，而分别配制的几种氨基酸的溶液，用微量点样管或毛细管，或血球计数器将5一j5微升的样品，点在以滤纸为惰性支持物的层析纸上设计好的多点位置中去。点样后要自然风干，或冷风吹干。最好不要用加热装置，如吹风机，灯泡之类的热源将其样品点加速干燥。因为加热装置在学生操作时，一但注意不够，掌握不好，则温度升高势必要使样品破坏，更会使佯品点干的太燥。正是由于这样，样品点太干燥，使其样品物的分子，牢固地吸牢在层析纸的纤维上。所以在展层过程中，样品点的每个物质分子，不能在层析纸上同时起步，而是形成了有先有后，鱼贯而上行或下行的状况，最终使洋品物质的分子，不能同时都集中到达一个位置。致使在显色后，实验结果的图象上，观察到的不是一个完整的斑点，而是一个拖着尾巴的斑点。这就是上述所说的拖尾现象。

纸上分配层析所出现的拖尾现象，究其原因很简单，就是在点样品后，样品点吹的太干燥所致。样品点不要吹的太干燥，否则，样品物质的分子，会牢吸在层析纸的纤维上，出现拖尾现象”。

影响 Rf值的主要因素

1.物质结构对于Rf值的影响：“物以类聚”，极性物质易溶于极性溶剂(水)中，非极性物质易溶于非极性溶剂(有机溶剂)中。所以物质的极性大小决定了物质在水和有机溶剂之间的分配情况。例如酸性和碱性氨基酸极性大于中性氨基酸。所以前者在水(固定相)中分配较多，因此Rf值低于后者。

2.溶质与溶剂间的相互作用对Rf值的影响：这种影响是由溶质与溶剂间的相互作用与分配系数的关系所决定的。溶质与溶剂之间若能形成氢键，对分配系数的影响就很大。例如酚、三甲基吡啶、氨等和水混合后都能很好地与溶质形成氢键。某些溶剂(例如酚，正丁醇等)是质子的供给体，而水既是质子的供给体又是质子的接受体。当溶质结构中增加能接受质子的基团(例如NH ２ )时，因酚与水都能给 NH ２基提供质子，所以酚和水两相对接受质子的基团的引力，基本上是一致的，因此当溶质结构中增加氨基时，该物质与酚和水的作用对其在酚和水两相间的分配影响不大，对Rf值影响较小。又例如当有机溶剂是质子的接受体(如三甲基吡啶，NH 3 等)，而溶质也是质子的接受体(如-NH ２基)，这时有机溶剂对-NH ２没有引力，而水却有引力，于是水的引力就大于有机溶剂，因此溶质就被水拉向水相，对Rf值的影响就大。

3.pH对Rf值的影响：这种影响主要是由pH与分配系数的关系所决定的。弱酸与弱碱的解离度受pH影响很大，解离度越大，极性越强，极性强的物质在两相溶剂中分配时，偏向于极性强的