PCR-SSCP实验操作详细步骤
PCR-SSCP实验操作详细步骤
PCR-SSCP 实验步骤一．样品制备1．PCR 扩增并检测。
根据不同的引物挑选适合的退火温度进行 PCR 扩增。
扩增产物用 2-2.5%的琼脂糖胶跑水平电泳检测，上样量 3-5ul。
PCR 产物为 10ng/nl 左右为最佳。
2．PCR 产物与变性 buffer 混合。
在干净的 PCR 管底部加入 5ul SSCP 上样缓冲液（变性缓冲液，同《分子克隆》中的测序缓冲液），然后在缓冲液中央加入 PCR 扩增产物。
按照经验，扩增效果在琼脂糖胶上能看出比较亮的带的样品加 1ul，效果很好加 0.5ul，如果不太好就适当增加1.5、2 或 3 不等，同时加大上样缓冲液的量，比如加 3ul 的 PCR 产物，缓冲液加到 8ul 变性效果更好。
3．PCR 产物变性。
加好的样品进行离心，使样品集中在管底。
PCR 仪上 95℃变性 10 分钟，立即取出 PCR 产物连同架子一同置于冰上静置 5min，以免变性的产物复性。
注：3 和 4 步可以在制 SSCP 胶第四步后，等胶凝的过程中进行。
二．制胶1．装板。
在所要进行实验的每一副玻璃板先用自来水冲洗，然后使用 ddH2O 冲洗，然后使用吸水纸将玻璃板擦拭干，然后再玻璃板上涂抹无水酒精，待 2-3min 酒精挥发。
将玻璃板组装好放入凝胶架子中，两边及底部固定好，两玻璃板保持水平，然后将发条拧紧。
（可用无水乙醇测试是否漏胶）。
2． 配胶。
甘油浓度 50%的几种浓度大板胶（10ml 下层胶，5ml 浓缩胶）配方（两块胶 1.0mm）：8%6%30%PAGE 2.7ml1ml10×TBE1ml0.5ml50%甘油1ml0.5mlddH2O5ml3mlAPS70ul70ulTEMED12ul8ulTotal10ml5ml甘油浓度 50%的几种浓度小板胶（15ml 下层胶，10ml 浓缩胶）配方（两块胶 1.5mm）8%6%4.05ml 2 ml30%PAGE（4℃）10×TBE 1.5ml1m50%甘油 1.5m1mddH2O7.5ml6mlAPS105ul70 ulTEMED12ul12ulTotal15ml10ml3．灌胶。
SSCP实验步骤
SSCP实验步骤一、泡菜液细菌总DNA提取1．样品中加入500µl裂解缓冲液（0.1mol/L Tris-HCl,0.1mol/L EDTA,1.5mol/L NaCl,1%CTAB;pH8.0）,20µl溶菌酶(25mg/mL),于37℃处理40min.2．加入5µl蛋白酶K(10mg/mL)于37℃处理40min.3．再加入120µl SDS(10%),65℃处理2h.4．粗提的DNA中加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)上下颠倒,混匀25min,离心(12000g,10min).5．取上清加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)上下颠倒,混匀5min,离心(12000g,30min).6．取上清加入0.6倍体积的异丙醇常温沉淀1h,离心(12000g,15min)后去上清液.7．用70%乙醇洗涤一次,1ml,2min,离心12000g,5min,将DNA溶于30µl无菌水.8．加入1µlRNase(20mg/mL)50℃10min.二、PCR扩增(25µl反应体系)H2O 15Buf 2.5Mg2+ 2dNTP 2引物1 1 (f341)引物2 1 (r533)Ex-Taq 0.25DNA 194℃预变性5min;94℃变性40s,50℃退火30s,72℃延伸35s,30个循环;72℃10min.三、λ核酸外切酶降解标记的反意义链反应体系中包括:λ核酶外切酶1µl,10×buffer 2µl,PCR产物20µl.37℃温浴过夜,处理完毕后,75℃10min灭活λ核酸外切酶.四、电泳清洗制胶用的玻璃板并用蒸馏水冲洗干净,用前用酒精擦试,烘干后,固定,倒入下层分离胶,加1ml水使液面平整,待分离胶凝固后把水倒出,倒入浓缩胶,插入梳子,随时观察凝胶聚合情况并补加丙烯酰胺.室温聚合1小时后,向电泳槽加入1×TBE,拨掉梳子,用注射器冲洗点样孔. 250V预电泳30分钟,同时准备点样.取4µlPCR产物置于PCR管中,加4µl变性buffer,离心混匀,98℃变10min,迅速冰浴10min,加入点样孔.250V电泳18小时.五、染色1.固定2.银染3.显色六、条带回收(PAGE胶回收试剂盒)1.切下凝胶,转移到1.5mlEP管中,用30μl无菌去离子水冲洗2次.2.加入30µl洗脱液(0.5M醋酸铵,10mM醋酸镁,1mM EDTA,0.1%十二烷基硫酸钠),用无菌的大枪头捣碎,再加入80μl 洗脱液,60℃培养2小时,4℃,5000g离心5min.3.吸取上清液到另一支EP管中.4.PAGE胶回收试剂盒回收,最后加入20µl双蒸水.七、回收产物PCR扩增H2O 18Buf 2.5Mg2+ 1.5dNTP 1引物1 0.5引物2 0.5Ex-Taq 0.2DNA 194℃预变性5min;94℃变性40s,56℃退火30s,72℃延伸35s,30个循环;72℃10min.八、λ核酸外切酶处理,产物再次跑胶,检测是否是单条带九、克隆1.PCR产物回收(琼脂糖凝胶回收试剂盒)2.PCR产物与T18载体连接T18vector 0.5µl , Solution 2.5µl , PCR回收产物7µl . 4℃过夜连接.3.连接产物的转化A.将连接产物吸到100µl感受态细胞中,温和混匀,置于冰上30min.B.42℃热休克90s,迅速放回冰中,将细胞冷却1-2min后,加入800µlLB培养基,37℃,125rpm,摇荡培养细菌45-90min.C.4000rpm离心1min,沉淀菌体,吸去上清液,留250µl左右转化混合物铺于LB琼脂平板上(Amp+),室温下放置20-30min,待溶液完全被琼脂吸收后,倒置平皿37℃培养12-16小时.D.随机挑取单菌落作PCR进行初步检测,并振荡培养.。
PCR-SSCP
PCR-SSCP分析的基本程序为：首先PCR扩增特定靶序列，然后将扩增产物变性为单链，进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。
在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，DNA单链的迁移率除与DNA链的长短有关外，更主要的是取决于DNA单链所形成的构象。
在非变性条件下，DNA单链可自身折叠形成具有一定空间结构的构象。
这种构象由DNA单链碱基决定，其稳定性靠分子内局部顺序的相互作用（主要为氢键）来维持。
相同长度的DNA单链其顺序不同，甚至单个碱基不同，所形成的构象不同，电泳迁移率也不同。
PCR产物变性后，单链产物经中性聚丙烯酰胺凝胶电泳，靶DNA中含单碱基置换，或数个碱基插入或缺失等改变时，因迁移率变化会出现泳动变位，从而可将变异DNA与正常DNA区分开。
由此可见，PCR-SSCP分析技术是一种DNA单链凝胶电泳技术，它根据形成不同构象的等长DNA单链在中性聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁移率变化来检测基因变异。
该技术已被广泛用于癌基因和抗癌基因变异的检测、遗传病的致病基因分析以及基因诊断、基因制图等领域。
为了高灵敏特异性地显示SSCP分析结果，现已发展多种PCR-SSCP技术，各有其优势及适用领域。
例如，可以在PCR扩增中用同位素或荧光素等标记引物或核苷，也可以在电泳后用银染或溴化乙锭染色以显示结果。
这里将重点介绍最常用的放射性同位素PCR-SSCP法。
在进行PCR扩增特定靶基因序列时，利用γ-32P-ATP标记引物或直接在PCR反应体系中加入α-32P-dCTP进行PCR扩增，使扩增产物带有同位素标记物，然后将扩增产物变性为单链进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，放射自显影显示结果。
利用引物标记或碱基掺入法使PCR扩增产物带有同位素标记物，均可使产物信号增强几个数量级。
二者相比较，前者经济、扩增特异性强，多用于大样本的检测和筛选；后者操作简便，适于一般实验室开展，可用于小样本或大样本的检测和筛查。
本节仅介绍同位素标记碱基掺入法。
PCRSSCP简介及应用解读
PCR-SSCP结果判定
单链DNA带迁移率与正常对照的相比发生改变，就可以
判定该链构象发生改变，存在碱基突变. 有时正常链与突变链的迁移率很接近，很难 看出两者之 间的差别,因此一般要求电泳长度在16--18cm以上. 以检测限为指标来判, 检测限是指突变DNA片段与正常
DNA 片段可分辨的电泳距离差的最小值 ,一般检测限定为
1)制备聚丙烯酰胺凝胶(PAG)
按上表制所需的胶液，将梳子插 入模子，从梳子一端加入胶，当胶液 快到梳齿时，使 模子向加胶端倾斜， 继续慢慢加胶，边加边放端模子以防 止气泡形成，室温放置1h使 之凝固.然 后拔掉梳子，顶部加入1×TbE封闭， 备用.
3)银染法 将PAG板用去离子水洗二次，浸 入10%乙醇和0.5%冰醋酸溶液固定 6min.用去离子水洗 二次，再浸入 0.2%AgNO3溶液中10min.用去离子水 洗3--5次，然后浸入1.5%NaOH和 0.4%甲醛溶液中显色7min.最后，用 0.75%NaCO3终止显色.
试剂与材料
1．样本DNA（100 ng/ml）、MTHFR上下游 引物（5 pmol/ml）、Taq DNA聚合酶（5 U/ml）、 10×PCR反应缓冲液、4×dNTPs（2.5 mmol/L）、 30% 丙烯酰胺（交联度 49:1 ）、 5 × TBE 缓冲液、 10%过硫酸铵（现用现配）、 TEMED、甲酰胺上 样缓冲液、固定液、银染液、显色液。
（二）PCR-SSCP的概念
P C R - S SCP 是 在完 成靶 D N A 的 PCR 扩增之后进行单链 DNA 多态性分 析的一种新方法。将单链的扩增DNA或 组织基因组DNA通过中性的聚丙烯酰胺 凝胶电泳，根据其电泳位置的改变可分 辨出单个碱基的改变。
pcr实验操作流程及注意事项
pcr实验操作流程及注意事项
哎呀呀，PCR 实验可真是个精细活儿！要想把这个实验做好，操作流程和注意事项可得牢记在心呀！
首先，准备工作得一丝不苟。
各种试剂、仪器都要准备齐全，就像战士上战场前要检查好装备一样。
然后，样品处理可不能马虎哟！得小心翼翼地提取样本中的核酸，这一步就如同在沙堆里寻找金子，需要耐心和细心。
接着，进行PCR 反应的设置，试剂的添加量要精准无误，温度和时间的设置更是关键。
嘿，这可不像随意做菜加盐，多一点少一点都不行呀！
反应过程中，要密切关注仪器的运行状态，稍有异常就得赶紧处理，千万别等到出了大问题才着急。
扩增完成后，产物的检测也不能掉以轻心哇！要确保检测方法准确可靠，不然前面的努力不都白费啦！
再说说注意事项。
实验环境得保持清洁无菌，不然杂菌会捣乱的呀！操作过程中要防止交叉污染，这就好比不能让不同的河流混在一起。
还有，试剂的保存要严格按照要求来，过期的试剂可不能用，就像过期的食品不能吃一样。
实验人员自身也要做好防护，保护自己的同时也是保证实验的准确性。
哇塞，PCR 实验可不简单，但只要严格按照流程，注意每一个细
节，就能取得成功，为科学研究贡献有价值的结果呀！
总之啊，PCR 实验操作流程和注意事项一定要牢记，这可不是闹着玩的，要以严谨的态度对待，才能得出可靠的实验结果哟！。
pcr的实验流程及注意事项
pcr的实验流程及注意事项嘿，搞科研的小伙伴们！今天咱们来唠唠pcr这个超重要的实验的流程及注意事项呀！这pcr实验啊，就像一场精密的魔法之旅呢！先说说实验流程吧。
第一步，那肯定是要准备好样本啦，这样本就像是pcr魔法的原材料，必须精心挑选，确保它的质量呀，啧，可不能随随便便拿个样本就开始呢。
然后呢，得把各种试剂都准备好，像什么引物啦，Taq酶啦，dNTP啦，这些可都是这场魔法的关键道具呢。
接着，就到了配置反应体系的时候啦。
这一步可得小心谨慎，就像在搭建一座精密的小城堡。
各种试剂的量都得按照比例来，多一点少一点都可能影响整个pcr的结果呢，这可不像做饭，调料多点少点可能只是味道有点差别。
把反应体系配置好后，就可以把它放到pcr 仪里面啦，这pcr仪就像是一个魔法小盒子，能让样本在里面发生神奇的变化。
然后咱们再来说说注意事项呀。
在准备样本的时候，一定要避免样本被污染哦，要是样本被污染了，那这pcr实验就像被施了坏魔法一样，结果肯定不对啦。
这就好比你在做蛋糕的时候，不小心把脏东西混进去了，那蛋糕能好吃吗？还有啊，配置反应体系的时候，加试剂一定要准确无误，可不能手抖。
而且呀，pcr仪的参数设置也很关键呢，温度、时间这些参数就像是魔法咒语，错了可不行。
再就是，在整个实验过程中，要保持实验室的清洁，这就像保持魔法场地的纯净一样。
如果实验室里乱糟糟的，到处都是灰尘或者其他杂质，那很可能就会干扰pcr实验的结果。
这就像在一个嘈杂的环境里想要安静地读书一样困难。
哎呀呀，pcr的实验流程和注意事项可真的要牢记于心呢。
咱们做实验的，只有严格按照流程走，注意每一个小细节，才能让pcr实验顺利进行，得到准确的结果呀。
这就像要登上山顶，每一步都要踩稳踩扎实一样。
千万不能马虎大意，不然之前的努力可就都白费啦。
咱们一定要像对待宝贝一样对待pcr实验，这样才能在科研的道路上不断前进，探索更多的奥秘呢！。
PCR-单链构型多态性分析
银染原理
根据核酸分子带有多个氨基和亚氨 基，一定条件下可以与银离子结合， 在甲醛等还原剂的作用下，形成黑 或褐色的银沉淀条带。
银染过程
凝胶
10%乙酸、30%乙醇固定10min
dH2O漂洗两次
0.1%AgNO3 染色10min
dH2O漂洗两次
2.5%碳酸钠-0.03%甲醛显色 1%乙酸终止 dH2O漂洗
PCR-SSห้องสมุดไป่ตู้P 的应用
1.基因点突变的监测 2.多态性检测 3. 外显子的筛查 4.cDNA筛查
2. 将提取的DNA在20l变性溶液（95% 甲酰胺、1mmol/L EDTA, 0.05%溴酚蓝、 0.05%二甲苯青），95℃ 10分钟，冰浴 3分钟。
3. 将混合液加到中性的聚丙烯酰胺凝胶 板孔中，在含1xTBE的电泳液中，电泳。
4. 将凝胶中DNA片段转移到硝酸纤维薄 膜上，烘干后以放射自显影拍摄记录。 或银染色
SSCP原理
在SSCP凝胶中电泳时，单链DNA的泳 动速率主要取决于二级空间结构，因此 若DNA片段中碱基发生突变，将会引起 单链DNA二级空间结构的改变，使 SSCP凝胶上出现异常移动的电泳带（即 SSCP 阳性）。
PCR-SSCP 操作步骤
1. 常规PCR扩增DNA片段或其他被标 DNA片段的提取。
影响PCR-SSCP的因素
1.DNA片段大小 2.复制错误发生 3.电泳条件 :（1）丙烯酰胺的浓度
（2）交联剂的浓度 （3）电泳的物理环境 （4）甘油浓度
PCR-SSCP与RFLP比较
无需特殊的限制性内切酶作用 可测出理论上任何一个碱基突变位点 操作简便，无需特殊的仪器设备及试剂 电泳条件的 改变容易影响SSCP
PCR-单链构型多态性分析
PCR-SSCP实验原理和操作步骤
PCR-SSCP实验原理和操作步骤(Polymerase Chain Reaction-Single Strand Conformation Polymorphism)【实验目的】1．了解PCR-SSCP技术的原理。
2．了解并熟悉PCR-SSCP技术的步骤。
【实验原理】PCR-SSCP是1989年日本Orita等创建的筛查突变的新技术。
它是一种简单、快速、经济的点突变筛查手段。
PCR-SSCP技术的基本原理是PCR扩增后的DNA片段经变性成单链DNA，单链DNA在中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时形成不同的立体构象，其构象直接影响泳动速率，相同长度的DNA单链其核苷酸顺序仅有单个碱基的差别，就可以产生立体构象的不同，造成泳动速率的不同，产生不同的泳动带。
PCR扩增后的DNA片段经变性成单链后在不含有变性剂的中性胶中电泳，与正常比较出现泳动带的变位即可推测存在碱基置换。
其碱基置换的性质必须经过DNA测序才能确定。
因此PCR-SSCP检测是测序之前突变筛查的常用手段。
为了便于观察分析结果，PCR扩增体系中常加入a-32P dNTP标记PCR产物，电泳后放射自显影观察泳动带的位置。
目前也常用银染法来染色聚丙烯酰胺凝胶上的DNA泳动带，此方法可避免同位素的污染及对操作者的辐射损伤，但其灵敏度不如用同位素标记。
单链DNA片段的立体构象主要与碱基序列相关，但也受到其他条件的影响。
因此，PCR-SSCP技术的关键在于电泳时的诸多条件，如凝胶的组成、电泳的温度、离子浓度以及影响分子内相互作用的其他溶质等。
PCR-SSCP的缺点是存在假阴性和假阳性，一般对长度不超过300bp的待测片段的检出率为70~80%。
【实验用品】1．PCR扩增仪；聚丙烯酰胺凝胶电泳装置；电泳仪；电泳槽。
2．6%非变性聚丙烯酰胺凝胶（49：1）、1´TBE、10%过硫酸铵、TEMED、甲酰胺上样缓冲液、固定液、银染液、显色液、琼脂糖3．微量加样器（200μl，20μl）；Tip头（200μl，20μl）。
pcr 操作规程
pcr 操作规程PCR（聚合酶链反应）是一种重要的分子生物学技术，被广泛应用于基础研究、医学诊断和法医学等领域。
它可以在体外迅速扩增目标DNA序列，并且可以在少量DNA 样本中检测到极低浓度的目标DNA。
为了确保PCR实验的准确性和重复性，制定一份操作规程是非常重要的。
下面是一份PCR操作规程：一、实验准备1. 检查PCR试剂盒的有效期，确保试剂的质量和纯度。
如果试剂过期或出现异常，应及时替换。
2. 温度设置：将实验室温度提前设定在室温（25℃），PCR仪预热至需要的温度。
3. 化学物品准备：准备好的试剂和物品包括PCR试剂盒、试剂所需的缩微管、用于装载PCR试剂的微量移液器和相应的移液器尖等。
4. 试剂检查：确认PCR试剂盒中的主要成分完好无损，并检查是否有任何已经发生的异常。
5. 设计引物：根据研究的目的和样本的特性，设计合适的引物序列。
确保引物能够与目标序列特异性结合，避免二次结构和自身互补性。
二、实验操作步骤1. DNA提取：根据需要选择合适的DNA提取方法，从样本中提取出所需的DNA。
2. DNA浓度测定：利用分光光度计检测DNA的浓度，确保DNA的浓度适合PCR扩增反应。
如果浓度过高或过低，可以进行适当的稀释或浓缩。
3. 反转录：如果是从RNA提取DNA，则首先需要进行反转录反应，将RNA转化为cDNA。
反转录反应的条件和步骤根据所用的反转录酶和试剂盒而有所不同，需按照相应的操作手册进行。
4. PCR试剂配置：按照PCR试剂盒说明书中所提供的配方准确称取PCR试剂，配置PCR反应体系。
确保试剂的质量和纯度，并且避免交叉污染。
5. PCR反应体系的装载：将PCR反应体系按照试剂盒说明书中的要求装入PCR管或反应板中。
确保每个反应管或反应孔中的体积均匀且准确。
6. PCR反应条件设定：根据所扩增的目标序列和引物的特性，设定合适的PCR反应条件，包括温度、时间和循环次数等。
一般情况下，PCR反应包括初始变性、循环变性、退火和延伸等步骤。
PCR-SSCP实验步骤(仅供参考)
PCR-SSCP实验步骤（仅供参考）1、PCR（例：15uL体系，n个样）A、取n个PCR管，做好标号。
B、配混合液（1.5mL离心管中）mix （n+1）×7.5uLDNApol （n+1）×0.15 uL引物（上）（n+1）×0.2 uL引物（下）（n+1）×0.2 uL无菌水（n+1）×5.95 uLC、分装：14uL/PCR管。
（注意枪头最好插到PCR管底部，打出混合液，待枪头离开PCR管再松手）D、加模板：1uL。
（注意加模板前一定要将模板DNA轻微振荡混匀，且枪头最好插到PCR管液面下打出模板，打出后待枪头离开液面后再松手）E、瞬时离心。
（长按short spin键，待转速升到10000r/min即可松手，使其自然停转）F、PCR仪中扩增。
G、琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。
（注意结果好时才可做SSCP）２、SSCP(1)制胶与电泳（此步要尽量统筹好时间）A、洗玻板、梳子，烘干，润湿胶条。
(注意玻板尽量洗净，千万不能留指纹或其他污物。
此步最好提前做好)B、润湿毛玻璃（注意蒸馏水不可弄的太多），放胶条，放另一块玻板，封好胶条（尤其毛玻璃最下端），用夹子在两侧夹好玻板（最好往两侧最下端夹，且夹在毛玻璃位置）。
C、制胶(例：20mL、8％。
注意不同片段长度所用胶浓度不同）30％Acr/Bis 5.334mL10×TBE 4mL10％Ap 250uLTEMED 25uL蒸馏水11.066mL添加顺序：蒸馏水→30% Acr/Bis→10×TBE→10% Ap→TEMEDD、混匀PAGE，迅速倒胶，注意不要产生气泡（最好从胶槽中间倒），插入梳子，切勿在齿下留有气泡。
E、室温聚合约10分钟后，取出梳子（用力要均衡），迅速用蒸馏水冲洗点样孔，用注射器吸净孔内的水，放置胶板，倒入电泳缓冲液(1×TBE)。
（注意胶板下端千万不要留有气泡，要仔细检查）F、电泳槽置冰水混合物中250V预电泳10分钟。
pcr的实验流程及注意事项
pcr的实验流程及注意事项嘿，小伙伴们！今天咱们来唠唠PCR这个超酷的实验呀！PCR 呢，就是聚合酶链式反应，在分子生物学里那可是相当重要的一个实验呢！**一、PCR的实验流程**1. 首先是样本准备呀！哎呀呀，这个步骤可不能马虎呢。
咱们得先获取到含有目标DNA的样本，这个样本来源可就多啦，可能是血液、组织或者细胞之类的哇。
在提取样本中的DNA时，一定要小心谨慎，要确保DNA的纯度和完整性呢！如果DNA提取得不好，后面的实验可就麻烦大啦！2. 接下来就是引物设计啦！哇，这可是个技术活呢。
引物就像是一把钥匙，要能够精准地结合到咱们想要扩增的DNA片段上才行呀。
引物的长度、GC含量这些参数都得好好考虑呢！一般来说，引物长度在18 - 25个碱基左右比较合适，GC含量在40% - 60%之间是比较理想的呢。
要是引物设计得不好，可能就扩增不出咱们想要的片段，那可就白忙活一场啦！3. 然后就是反应体系的配制喽！这一步需要把各种试剂按照一定的比例混合在一起呢。
像模板DNA、引物、dNTP（脱氧核糖核苷三磷酸）、Taq酶还有缓冲液这些都是必不可少的呀。
哎呀呀，在加试剂的时候一定要准确呢，哪怕是一点点的误差都可能影响实验结果哇！比如说Taq酶加多了或者加少了，反应的速度和效率就会发生变化呢。
4. 再然后就是把配制好的反应体系放到PCR仪里面进行反应啦！这个PCR仪就像是一个神奇的小盒子，它会按照咱们设定好的程序来进行加热、冷却的循环呢。
一般来说，PCR反应会经过变性、退火和延伸这三个步骤的循环。
变性的时候温度比较高，大概在90 - 95℃左右，这个时候DNA双链会解开变成单链呢；退火的时候温度会降低，这个温度要根据引物的Tm值 解链温度）来设定，一般在50 - 65℃之间，这时候引物就会和模板DNA结合上；延伸的时候温度大概在72℃左右，Taq酶会以引物为起点，把dNTP一个一个地连接到新合成的DNA链上呢。
循环的次数也很关键，通常是25 - 35次左右，循环次数太多或者太少都可能导致实验结果不理想呢！**二、PCR的注意事项**1. 哇，实验室的环境清洁可是相当重要的呢！如果实验室里有太多的杂质或者其他DNA的污染，很容易就混到咱们的实验样本里面去啦。
PCR原理及PCR-SSCP
一、聚合酶链反应（PCR）Polymerase Chain ReactionPCR技术诞生于1985年，美国Cetus公司人类遗传室的Kary Mullis—PCR技术发明者，因此获1993年诺贝尔化学奖。
1．基本原理：在反应温度为90-95℃时，DNA变性成为单链；反应温度降至45-65℃时，两种引物与两条单链DNA退火而配对结合；反应温度升至72℃左右时，在TaqDNA聚合酶作用下，引物以单链DNA为模板逐步延伸成新的单链。
“ 变性——退火——延伸”这一循环完成后，DNA复制了一次，由一个DNA分子成为两个DNA分子。
PCR两个重要特性：①能合成DNA的特定序列；②特定序列的大量扩增变性复性的过程：2．PCR 反应组成：Temple DNA、Primer、4 dNTPs、DNA Taq酶、PCR Buffer引物：是指两段与待扩增靶DNA序列侧翼片段互补的寡核苷酸。
长度一般在20-30mer设计引物的原则：A、与引物结合的靶DNA序列片段必须是已知的，B、尽可能选择碱基随机分布的序列，C、尽量避免多聚嘌呤，多聚嘧啶或其他异常序列，D、两引物中G+C碱基对的百分比（%GC）应尽量相似，E、若待扩增片段GC含量已知，则引物的GC含量则应与其类似，G+C碱基对含量以40-60%为佳，F、引物内部应避免具有二级结构，尤其是发夹结构，G、两引物之间不应有互补序列，以免形成“引物二聚体”。
设计引物的软件：olig06、Primer3、Real Time荧光定量PCR仪有设计引物软件。
2）4×dNTPs：提供靶DNA序列扩增的原料。
贮存液的pH应为7.0。
A．反应体系中，每种脱氧核苷三磷酸浓度以50-200μmol/L为宜，且dATP、dCTP、dGTP、dTTP浓度相同。
浓度过高，有可能造成非靶位置启动和延伸时核苷酸的错误掺入，当dNTP＞50mmol/L，会抑制Taq酶的活性；浓度过低，＜10-15μmol/L，影响扩增产量。
PCR原理及PCR-SSCP
一、聚合酶链反应（PCR）Polymerase Chain ReactionPCR技术诞生于1985年，美国Cetus公司人类遗传室的Kary Mullis—PCR技术发明者，因此获1993年诺贝尔化学奖。
1．基本原理：在反应温度为90-95℃时，DNA变性成为单链；反应温度降至45-65℃时，两种引物与两条单链DNA退火而配对结合；反应温度升至72℃左右时，在TaqDNA聚合酶作用下，引物以单链DNA为模板逐步延伸成新的单链。
“ 变性——退火——延伸”这一循环完成后，DNA复制了一次，由一个DNA分子成为两个DNA分子。
PCR两个重要特性：①能合成DNA的特定序列；②特定序列的大量扩增变性复性的过程：2．PCR 反应组成：Temple DNA、Primer、4 dNTPs、DNA Taq酶、PCR Buffer引物：是指两段与待扩增靶DNA序列侧翼片段互补的寡核苷酸。
长度一般在20-30mer设计引物的原则：A、与引物结合的靶DNA序列片段必须是已知的，B、尽可能选择碱基随机分布的序列，C、尽量避免多聚嘌呤，多聚嘧啶或其他异常序列，D、两引物中G+C碱基对的百分比（%GC）应尽量相似，E、若待扩增片段GC含量已知，则引物的GC含量则应与其类似，G+C碱基对含量以40-60%为佳，F、引物内部应避免具有二级结构，尤其是发夹结构，G、两引物之间不应有互补序列，以免形成“引物二聚体”。
设计引物的软件：olig06、Primer3、Real Time荧光定量PCR仪有设计引物软件。
2）4×dNTPs：提供靶DNA序列扩增的原料。
贮存液的pH应为7.0。
A．反应体系中，每种脱氧核苷三磷酸浓度以50-200μmol/L为宜，且dATP、dCTP、dGTP、dTTP浓度相同。
浓度过高，有可能造成非靶位置启动和延伸时核苷酸的错误掺入，当dNTP＞50mmol/L，会抑制Taq酶的活性；浓度过低，＜10-15μmol/L，影响扩增产量。
PCR-SSCP.课件
④ SSCP的结果断定:
• 检测限是指突变DNA片段与正常DNA片段可分辨 的电泳距离差的最小值。大于检测限则判定链的 迁移率有改变，说明该DNA序列有变化，小于检 测限则说明链之间无 变化。例如，一般检测限定 为3mm，那么当两带间距离在3mm以上，则说 明两链之间有改变。另外检测限不能定的太低， 否则主观因素太大，易造成假阳性结果。
dddH2O
5 2 1 1 3 1
12
25
3.聚丙烯酰胺的配置
⑴ 准备好用于灌胶的玻璃板和间隔条，按照说明 安装好制胶架，然后按照下表灌胶
试剂 30%丙烯酰胺 50×TAE 甘油 10%AP TEMED H2O total
非变性聚丙烯胺凝胶 4 ml 0.2 ml 0.6 ml 0.1 ml
单链构象多态性
(Single-Strand Conformation Polymorphism，SSCP)
单链DNA片段呈复杂的空间构象，这种立体结 构主要是由其内部碱基配对等分子内相互作用力来 维持的，当有一个碱基发生改变时，会使其构象发 生改变，空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯 酰胺凝胶中受排阻大小不同。因此通过非变性聚丙 烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，可以将构象上有差异的 分子分离开。称为单链构象多态性分析法。
④SSCP的结果断定:
由于SSCP中非变性PAGE不是根据单链DNA 分子大小和带电量 的多少来分离的，而是以单链 DNA片段空间构象的立体位阻大小来实现分离的 ，因 此，这种分离不能反映出分子量的大小。有 时正常链与突变链的迁移率很接近，很难 看出两 者之间的差别.因此一般要求电泳长度在16-18cm 以上。
③电泳电压和温度的影响
为了使单链DNA保持一定的稳定立体构象， SSCP应在较低温 度下进行(一般4℃-15℃之间)。 在电泳过程中除环境温度外，电压过高也是引起 温度升高的主要原因。因此，在没有冷却装置的 电泳槽上进行SSCP时，开始的5min应用较 高的电 压(250V)，以后用100V左右电压进行电泳。这主 要是由于开始的高电压可以使 不同立体构象的单 链DNA初步分离，而凝胶的温度不会升高。随后 的低电压电泳可以使 之进一步分离。
pcr-sscp检测
实验七PCR-SSCP检测一、实验目的1．了解PCR-SSCP技术的原理。
2．了解并熟悉PCR-SSCP技术的步骤。
二、实验原理SSCP(Single-Strand Conformation Polymorphism)：单链构象多态性检测，是1989年日本Orita等创建的筛查突变的新技术。
它是一种简单、快速、经济的基于DNA构象差别来检测点突变的方法。
相同长度的单链DNA，如果碱基序列不同，形成的构象就不同，这样就形成了单链构象多态性。
单链DNA片段呈复杂的空间折叠构象，这种立体结构主要是由其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的，当有一个碱基发生改变时，会或多或少地影响其空间构象，使构象发生改变。
空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰胺凝胶中受排阻大小不同。
因此，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳，可以非常敏锐地将构象上有差异的分子分离开。
该方法简便、快速、灵敏，但它也有不足之处。
例如，只能作为一种突变检测方法，要最后确定突变的位置和类型，还需进一步测序；电泳条件要求较严格；另外，由于SSCP是依据点突变引起单链DNA分子立体构象的改变来实现电泳分离的，这样就可能会出现当某些位置的点突变对单链DNA分子立体构象的改变不起作用或作用很小时，再加上其他条件的影响，使聚丙烯酰胺凝胶电泳无法分辨造成漏检。
三、实验用品1．聚丙烯酰胺凝胶电泳装置，电泳仪，电泳槽。
2．8%非变性聚丙烯酰胺凝胶（29：1）、1*TBE、5*TBE、10%过硫酸铵、TEMED、甲酰胺上样缓冲液、固定液、银染液、显色液。
四、实验步骤1．PCR产物经琼脂糖电泳确认特异性好的PCR产物才能用于PCR-SSCP检测，无条带或出现非特异性条带的产物都不能用于PCR-SSCP检测。
2．聚丙烯酰胺凝胶电泳2.1 装板在所要进行实验的每一副玻璃板（事先洗静、风干）的两边及底部装上垫片，尽量使底边及侧边紧密接触，夹子固定好，确保接头处都封上，以免漏胶。
PCR-SSCP简介及应用
内容
PCR及PCR-SSCP基本原理 PCR-SSCP基本过程
PCR-SSCP结果判定 PCR-SSCP的实验操作
SSCP的应用
(一)PCR的概念
聚Байду номын сангаас酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是一种体外扩增特异 DNA片断的技术,能在短时间内获得数 百万个特异DNA序列的拷贝。
人类白细胞抗原系统(HLA)，存在多
态性： 器官移植配型 疾病发生有关 个体鉴定 亲子鉴定
PCR-SSCP检测HLA-DRB用于亲子鉴定 (通用引物扩增HLA-DRB及其7个假性基因)
Thank you!
三、PCR-SSCP的实验操作 在小于1Kb长度的情况下，DNA片 段长度与丙烯酰胺的浓度选择如下: DNA片段长度(核苷酸数) (%) 1Kb～700b 3.5 700b～500b 5 500b～200b 8 200b 12 在进行SSCP前首先要通过PCR扩 增出特异性好的产物(琼脂糖电泳不能有 过强的拖尾).
（二）PCR-SSCP的概念
P C R - S SC P 是 在完 成靶 D N A 的 PCR 扩增之后进行单链 DNA 多态性分 析的一种新方法。将单链的扩增DNA或 组织基因组DNA通过中性的聚丙烯酰胺 凝胶电泳，根据其电泳位置的改变可分 辨出单个碱基的改变。
二、PCR-SSCP基本过程
1．PCR扩增靶DNA。 2．PCR产物的快速变性而后快速复性， 形成特定 空间结构的DNA单链分子。 3. 非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳 （PAGE） 4. PAGE胶的银染
试剂与材料
1．样本DNA（100 ng/ml）、MTHFR上下游 引物（5 pmol/ml）、Taq DNA聚合酶（5 U/ml）、 10×PCR反应缓冲液、4×dNTPs（2.5 mmol/L）、 30% 丙烯酰胺（交联度 49:1 ）、 5 × TBE 缓冲液、 10%过硫酸铵（现用现配）、 TEMED、甲酰胺上 样缓冲液、固定液、银染液、显色液。
pcr反应的实验操作流程
pcr反应的实验操作流程PCR（聚合酶链式反应）是一种用于扩增DNA片段的技术，它可以在短时间内大量复制目标DNA序列。
PCR反应通常包括三个步骤：变性、退火和延伸。
下面是一份关于PCR反应的实验操作流程：1. 准备PCR反应体系：首先准备PCR反应混合液，包括模板DNA、引物、dNTPs（四种脱氧核苷酸）、聚合酶和缓冲液。
确保所有试剂在冰上保存，避免受到污染。
2. 设计引物：根据目标DNA序列设计引物，引物是PCR反应的关键组成部分，它们会在变性和退火步骤中结合到目标DNA序列上。
3. 加入PCR反应混合液：将准备好的PCR反应混合液分配到反应管中，确保每个反应管中的混合液量相同。
4. 放入PCR仪：将反应管放入PCR仪中，设置好反应条件，包括温度、时间和循环次数等参数。
5. 进行PCR反应：启动PCR仪，让反应在设定的条件下进行。
在变性步骤中，DNA双链解旋；在退火步骤中，引物结合到目标DNA序列上；在延伸步骤中，聚合酶复制DNA序列。
6. 分析PCR产物：反应结束后，取出反应管，可以通过琼脂糖凝胶电泳等方法对PCR产物进行分析，确认目标DNA序列是否被扩增成功。
7. 结果解读：根据PCR产物的大小和数量，可以判断PCR反应的效果，进一步分析目标DNA序列的存在与否。
总结：PCR反应是一种快速、高效的DNA扩增技术，可以在短时间内扩增目标DNA序列。
正确的实验操作流程和条件设置对PCR 反应的成功至关重要，只有严格按照操作规程进行实验，才能获得准确可靠的结果。
PCR技术在分子生物学研究中有着广泛的应用，可以用于基因克隆、基因表达分析、疾病诊断等领域。
PCR反应的操作流程虽然简单，但需要实验人员具备一定的实验技能和经验，才能保证实验的顺利进行和结果的准确性。
PCR实验操作流程
1 PCR 实验操作流程（TB/LP/MPCP ）一、标本的核酸提取（痰标本）1、痰液液化：痰液加入四倍体积的4%NaOH ，摇匀静置30min ；（样本编号，离心管编号）2、将液化后的液体0.5ml 转至1.5ml 离心管中，再加入0.5ml 4%NaOH ，混匀静置10min 继续液化，13000rpm 离心5min ，去上清；3、加入1ml 生理盐水洗一次，振荡器震荡混匀，13000rpm 离心5min ，上清去除干净；4、沉淀直接加入100μl 核酸提取液（提取液使用之前混匀），混匀数秒，干热仪100℃加热10min ，然后13,000rpm 离心5min ，取上清4μl 作为PCR 反应模板。
二、试剂配制、加样三、PCR 扩增设置扩增循环参数设置：37℃×2min ，94℃×2min ，循环一次；93℃×15s ，60℃×60s ，循环40次，荧光检测在60℃×60s ，荧光通道FAM 和VIC 通道。
反应体系40μl 。
四、结果判断MPCP ：FAM 通道Ct ≤38，报告MP 为阳性；VIC 通道Ct ≤38， 报告CP 为阳性；如果Ct 值在38-40之间，复检一次，如果Ct 显示仍在38~40之间，则判断为低于检测线，判为阴性LP ：FAM 通道Ct ≤38，报告LP 为阳性；如果Ct 值在38-40之间，复检一次，如果Ct 显示仍在38~40之间，则判断为低于检测线，判为阴性TB ：FAM 通道Ct ≤38，报告TB 为阳性；如果Ct 值在38-40之间，复检一次，如果Ct 显示仍在38~40之间，且扩增曲线呈典型的S 型，则判断为阳性；若非典型S 型曲线，则判断为低于检测线，判为阴性。
SSCP实验步骤
SSCP实验步骤一．聚丙烯酰胺凝胶的制备一般情况下，用12%的聚丙烯酰胺凝胶分离待测片段。
根据玻璃板规格的不同（1.0、1.5两种），分别配制7ml、10ml的胶，配方如下表：二．样品的制备1、设计引物，样品片段长度一般因在150-300bp之间。
2、PCR扩增目的片段，琼脂糖凝胶检测。
3、样品稀释。
根据琼脂糖凝胶检测结果，如果PCR产物很浓（与marker一样亮），则将PCR产物稀释3倍；若PCR产物浓度较弱，则可以不稀释。
4、取1 μl 稀释好的PCR产物，加入9ul 变性缓冲液中，混匀。
变性缓冲液：溴酚蓝5mg，0.5M EDTA. Na2 (pH8.0 ) 400μl，甲酰胺9.6ml，混匀。
三．变性1、开启PCR仪，将程序设置为98 ℃ 11min2、将混有甲酰胺的样品放入PCR仪中，开始变性3、准备冰盒4、当变性10min时，打开PCR仪，迅速将样品插入冰中，保持10min四．上样电泳1、电泳前，所用的胶，电泳缓冲液（1×TBE）都要先预冷。
2、取样品3μl，依次点到事先制好并且制冷的聚丙烯酰胺凝胶中。
点样时注意标准品不要点到胶的最边上两个孔，以免由于制胶不均匀或其他原因造成的标准品分型不好，起不到指示作用。
3、将电泳槽放到4 ℃冰箱中，连上电泳仪，250V跑10min，50V 16h注：电泳条件因待分离片段的不同而不同，因此若以上条件不能够将不同的基因型分开，则可以尝试其他的条件。
五．染色1、固定。
把胶卸下，做好起始记号，放入约80ml固定液（50ml无水乙醇，2.5ml冰乙酸，定容到500ml，冷藏）中在摇床上固定10min。
2、染色。
60ml染色液（0.75gAgNO3，溶入500ml水中，避光保存）+60μl甲醛，染色6min。
蒸馏水洗涤一次。
3、显色。
60ml显色液（7.5g NaOH，溶于500ml水）+120μl甲醛，放到摇床上显色至条带清晰。
倒掉显色液，加蒸馏停止显色。
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PCR-SSCP实验步骤
一．样品制备
1．PCR扩增并检测。
根据不同的引物挑选适合的退火温度进行PCR扩增。
扩增产物用2-2.5%的琼脂糖胶跑水平电泳检测，上样量3-5ul。
PCR产物为10ng/nl左右为最佳。
2．PCR产物与变性buffer混合。
在干净的PCR管底部加入5ul SSCP上样缓冲液（变性缓冲液，同《分子克隆》中的测序缓冲液），然后在缓冲液中央加入PCR扩增产物。
按照经验，扩增效果在琼脂糖胶上能看出比较亮的带的样品加1ul，效果很好加0.5ul，如果不太好就适当增加1.5、2或3不等，同时加大上样缓冲液的量，比如加3ul的PCR产物，缓冲液加到8ul变性效果更好。
3．PCR产物变性。
加好的样品进行离心，使样品集中在管底。
PCR仪上95℃变性10分钟，立即取出PCR产物连同架子一同置于冰上静置5min，以免变性的产物复性。
注：3和4步可以在制SSCP胶第四步后，等胶凝的过程中进行。
二．制胶
1．装板。
在所要进行实验的每一副玻璃板先用自来水冲洗，然后使用ddH2O冲洗，然后使用吸水纸将玻璃板擦拭干，然后再玻璃板上涂抹无水酒精，待2-3min酒精挥发。
将玻璃板组装好放入凝胶架子中，两边及底部固定好，两玻璃板保持水平，然后将发条拧紧。
（可用无水乙醇测试是否漏胶）。
2．配胶。
甘油浓度50%的几种浓度大板胶（10ml下层胶，5ml 浓缩胶）配方（两块胶1.0mm）：
甘油浓度50%的几种浓度小板胶（15ml下层胶，10ml 浓缩胶）配方（两块胶1.5mm）
3．灌胶。
配好胶后搅匀，灌入装好的玻璃板中，注意不能产生气泡，如果产生气泡把板立起，轻轻敲打可使气泡升出胶面，胶面与凹板上沿大约差0.5cm时插上梳子，要保证梳子齿和液面接触处没有气泡，一旦产生要拔出重插。
4．静置。
灌好的胶平放或与水平成一比较小的角度（10o以下）静置水平桌面上30min左右使之充分聚合。
注：此时可以进行PCR样品变性，即第一部分的3、4步。
二．上样
1.安板。
PAGE聚合好后要及时拔出梳子（时间耽搁长后会使梳子很难拔出），拔梳子时要用力均匀以保持胶孔的整齐。
用夹子把胶板固定在电泳槽上，凹槽的一面朝里，安板时首先使板的底边一端先接触电泳液，再缓慢地过度到另一端，以免产生大气泡（产生大气泡会使电泳条带弯曲）。
2．预电泳。
从底槽把一些电泳液1×TBE吸到上槽，使液面高出玻璃板矮边1cm以上，并确保上槽不漏液。
打开电源，大槽电压调到140-150V，小槽110-120V，预电泳10min左右。
(0.1W/cm,10℃，1-3h)
3．点样。
用微量进样器把准备好的样品按顺序加到胶孔中。
由于边缘效应带型不整齐，每块板中最边上的两个孔最好不要点样。
4．电泳。
大槽电压140-150V，小槽110-120V，温度在10-15℃，恒温电泳10个小时以上。
三．染色
1．固定。
把胶卸下，做好起始记号，放入70%乙醇中在摇床上固定15min。
固定好后乙醇回收（可以重复使用5次左右），蒸馏水洗两遍，每遍3min左右。
若同时染两块胶固定和洗脱都要适当增加时间。
2．染色。
染色液（200ml染色液含3.6%的NaOH4.2ml、20%AgNO33.6ml、氨水2ml）染色30min，同时染两块胶要适当增加时间，需40min左右。
倒掉染色液，洗3遍，每遍3min，同时染两块胶要适当增加时间。
3．显色。
显色液（200ml显色液包含1%柠檬酸钠1ml，甲醛100ul）至清晰。
倒掉显色液，加蒸馏洗脱3次停显。
(也可将凝胶浸在含0.5ug/ml溴化锭的1×TBE缓冲液中染色10min，在紫外灯下观察)
附录
1.甘油浓度50%的几种浓度大板胶（10ml下层胶，5ml 浓缩胶）配方（两块胶1.0mm）：
2. 甘油浓度50%的几种浓度小板胶（15ml下层胶，10ml 浓缩胶）配方（两块胶1.5mm）
3．10×TBE的配方：
108g Tris碱、55g硼酸、40ml 0.5mol/lEDTA(pH8.0)定容1L
4.变性buffer的配方
98%去离子甲酰胺、10mmol/LEDTA(pH8.0)、0.025%二甲苯青FF、0.025%溴酚蓝
注意事项：
①重复性.影响SSCP重复性的主要因素为电泳的电压和温度.这两个条件保持不变，SSCP 图谱可保持良好的重复性.一般SSCP图谱是二条单链DNA带，但有时有的DNA片段可能只呈现一条SSDNA带，或者三条以上，这主要是由于两条单链DNA之间存在相似的立体构象.有时三条以上的SSCP图谱是由于野型DNA片段和突变型DNA片段共同存在的结果.
②靶DNA序列长度的影响在实验中发现SSCP对短链DNA或RNA的点突变检出率要比长链的高，这可能是由于长链DNA和RNA分子中单个碱基的改变在维持立体构象中起的作用较小的缘故.而有人认为在DNA链较短的(400bp以下)情况下，DNA的长度不会影响SSCP 的效果.
③电泳电压和温度的影响:为了使单链DNA保持一定的稳定立体构象，SSCP应在较低温度下进行(一般4℃-15℃之间).在电泳过程中除环境温度外，电压过高也是引起温度升高的主要原因，因此，在没有冷却装置的电泳槽上进行SSCP时，开始的5min应用较高的电压(250V)，以后用100V左右电压进行电泳.这主要是由于开始的高电压可以使不同立体构象的单链DNA初步分离，而凝胶的温度不会升高.随后的低电压电泳可以使之进一步分离.在实验中应根据具体实验
条件确定电泳电压.
④SSCP的结果断定:由于在SSCP分析中非变性PAG电泳不是根据单链DNA分子和带电量的大小来分离的，而是以单链DNA片段空间构象的立体位阻大小来实现分离的，因此，这种分离不能反映出分子量的大小.有时正常链与突变链的迁移率很接近，很难看出两者之间的差别.因此一般要求电泳长度在16--18cm以上，以检测限为指标来判定结果.检测限是指突变DNA片段与正常DNA片段可分辨的电泳距离差的最小值.大于检测限则判定链的迁移率有改变，说明该DNA 序列有变化，小于检测限则说明链之间无变化.例如，一般检测限定为3mm，那么当两带间距离在3mm以上，则说明两链之间有改变.另外检测限不能定的太低，否则主观因素太大，易造成假阳性结果.另外，SSCP 分析中其它条件，如PCR产物的上样量，PAG的交联度、以及胶的浓度等，都应根据具体实验进行选择确定.。