液相色谱法
经典液相色谱法
第一节 吸附色谱法
硅醇基有两种形式，一种是游离羟基(Ⅰ)，另一
种是键合羟基(Ⅱ)，当硅胶加热到200℃以上时，失
去水分，使表面羟基变为硅醚结构(Ⅲ)，后者为非
极性，不再对极性化合物有选择性保留作用而失去
色谱活性。
H O
Si (Ⅰ)
HH OO
Si Si (Ⅱ)
O Si Si
(Ⅲ)
由于硅胶具有弱酸性，所以选择性地保留胺类
第一节 吸附色谱法
制备含粘合剂的硬板，要先制备固定相的匀浆，调 制固定相的匀浆时可将一定量的固定相按上表比例加入 适量水或粘合剂，在研钵中或在匀浆器中调匀，倒入手 动或自动涂布器中涂布。室温下阴干后，活化后备用。
定性定量分析时薄层厚度为0.3～0.5mm，制备薄 层厚度为0.5～2mm。 （2）预制板
第一节 吸附色谱法
2. 首先将被分离样品溶于一定体积的溶剂中，选用的溶
剂极性应低，体积要小。 上样前，应将柱上端的溶剂放出至近吸附剂表面。沿
管壁加入样品溶液，溶液加完后，打开活塞使液体慢慢放
在洗脱时，用分液漏斗连续不断地加入洗脱剂，并保 持一定高度的液面。在收集洗脱液时，应采用等份集。 3
可以通过分段收集流出液，采用相应的物理和化学方 法进行检出。常用的检出方法很多，如化学反应法、TLC 及其它方法。
和其它碱性化合物。
第一节 吸附色谱法
2. 氧化铝
碱性氧化铝(pH9～10)适用于碱性和中性化合物
中性氧化铝(pH7.5)适用范围广，凡是酸性、碱 性氧化铝可以使用的，中性氧化铝也都适用。
酸性氧化铝(pH5～4)适用于分离酸性化合物。
第一节 吸附色谱法
(二) 吸附剂的活性和含水量有一定的关系。含水量
高效液相色谱法(精细化学品分离提纯技术)
• 在RPC中，有机水溶液作流动相，溶质在非 极性的配基（烷基、苯基等）上的保留， 就是由于溶质中的疏水基团倾向于与配基 结合而造成的。
• 溶质中的疏水性越强，与配基的结合地越 牢。所以有机同系物中随着烷基链长的增 加，其保留值也增大。
（2）计量置换模型
• 样品分子和固定相上的配基在流动相中都是溶剂化的。当 样品分子保留在柱子上时，样品分子与配基接触，两者之 间结合面上的溶剂化分子被“挤”走，进入流动相。被 “挤”走的溶剂分子有Z个。当样品分子被洗脱下来时，样 品分子进入了流动相，样品分子与配基的接触面重新被溶 剂化，重新溶剂化所需的溶剂分子是Z个，与保留时被“挤” 走的溶剂分子相等。
2.与GC相比 (1)样品受限制少，对易分解、不容易气化、 分子量大、高极性的有机物（70~80%的有机 物）可用HPLC分析。 (2)不用制备衍生物，减少了误差。 (3)进样量大（500~800μL），易制备。 (4)分离效率降低。
二、一般分离流程
高效液相色谱仪及一般分离流程见图7-1。 三、色谱原理 1、概念 HPLC：以溶剂或某种溶液为流动相，
§7-1 一般流程及分离原理
一、简介 1.与经典的液相柱色谱法相比 (1)柱内径↓，填充剂粒度↓、均匀性↑， 新型固定相的问世 → 分离效率↑。 (2)柱长↓，填充剂机械强度↑，供液压力 和进样压力↑，流动相流速↑（1~5ml/min） →分离速度↑（7~8个峰/10min）。 (3)采用光学原理的检测器→灵敏度↑。
• 另外，对照（a）和（d）可以 发现刚上样后，溶质分子形成的 色带（又叫谱带）较窄，而到了 （d）中，各组分的谱带明显变 宽，这说明同一组分沿柱子移动 时，存在着扩散问题，即谱带的 扩散。
图7-2 三组分样品 分离过程示意图
液相色谱法
色谱法的分类
4. 利用大小不同的分子在多孔固定相中的选 择渗透而达到分离的方法，称为凝胶色谱法或分 子排阻色谱法。
最近，又有一种新分离技术，利用不同组分 与固定相（固定化分子）的高专属性亲和力进行 分离的技术称为亲和色谱法，常用于蛋白质的分 离。
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色谱法的分类
吸附色谱：不同组份在固定相的吸附作用不同； 分配色谱：不同组份在固定相上的溶解能力不同； 离子交换色谱：不同组份在固定相（离子交换剂）上的 亲和力不同； 凝胶色谱（尺寸排阻色谱）:不同尺寸分子在固定相上 的渗透作用。
需 需
R≤ 1
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第二节 柱色谱法
一、液－固吸附柱色谱法 二、液－液分配柱色谱法 三、离子交换柱色谱法 四、凝胶柱色谱法 五、柱色谱法的应用
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第二节 柱色谱法
将固定相均匀填在金属或玻璃制成的管中做 成层析柱，并以此进行分离的方法叫柱色谱法。 根据作用原理，可分为： 吸附柱色谱法 分配柱色谱法 离子交换柱色谱法 凝胶柱色谱法
对吸附剂的要求： 1. 具有较大的表面积与适宜的活性。 2. 与流动相极其样品中各组分不发生化学反
应，在流动相中不溶解。 3. 吸附剂颗粒应有一定的细度，并且颗粒要
均匀。
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第二节 柱色谱法
常用的吸附剂有： 氧化铝、硅胶、聚酰胺
硅胶： 呈微酸性 适用于分离酸性和中性物质，如：有机酸、
氨基酸、萜类、甾类等的分离。
流动相) 中分布的差异，使固定相对各组分的保 留作用不同产生差速迁移而得到分离的一种物理 化学分离分析方法。
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色谱法基本原理
分配系数与保留行为的关系
溶质在色谱柱中被保留的程度常用保留比 （retention ratio）R 表示。
比较气相色谱法与液相色谱法
比较气相色谱法与液相色谱法气相色谱法和液相色谱法是常见的分析化学技术，它们在化学、医药、食品等领域有着广泛的应用。
两种方法在分子分离、分析品质、检验安全方面各有优势。
本文将比较气相色谱法和液相色谱法的优劣，并介绍它们的原理、应用和限制。
1、基本原理气相色谱法和液相色谱法的基本原理不同。
气相色谱法是利用样品分子在气相中的分配行为来分离分子，而液相色谱法是利用样品分子在流体中的分配行为来分离分子。
具体来说，气相色谱法利用气态流动相推动目标化合物与固定相之间的相互作用不断地进行蒸汽化、冷凝和挥发，以期获得特定的化合物。
液相色谱法则是利用与运动液体固定相交互作用的物质差异导致样品成分分离。
2、优缺点的比较气相色谱法和液相色谱法的优势和劣势各有不同。
气相色谱法适用于挥发性的有机和无机化合物的分析，具有高分辨率（分辨率可达0.001）和高选择性，可以通过调整程序来改变分离能力，适用于定量和定性分析，是分离不稳定结构易挥发的化合物的理想方法。
不过，气相色谱法对高沸点化合物的灵敏度较低，需要现场制备标准物质、气体流动控制和导致机械或电子零件失灵等因素限制了其应用。
液相色谱法的分离能力比气相色谱法更强，更具可靠性，适用于多种物质的分析，比如药品、天然化合物、大分子物质等等。
液相色谱法还可以通过选择特定的填充物、增加溶剂流速并进行检测来灵敏度相应地进行调整。
但是，与气相色谱法相比，液相色谱法需要耗费更多的检测时间和耗材，并且分析结果可能会受到残留溶剂的影响。
3、应用实例的比较气相色谱法和液相色谱法在不同领域有广泛的应用。
举例来说，气相色谱法常用于环境、食品和医药行业中的残留物检测。
例如，通过分离挥发出后的有机物质，气相色谱法可以检测农药残留、有害金属离子或气体等有毒物质。
而液相色谱法则用于分离和鉴定蛋白质、多肽、药物、香料等分子复杂的大分子。
4、结论总之，对于新手，要根据具体分析对象的需求选择正确的工具，根据所要分析的化合物的特性、分子结构来选择合适的分析法。
经典液相色谱法
色谱柱一定，Ka大，即极性越强的组分吸附力越强→→→
柱色谱：tR越长→洗脱慢；反之Ka小，极性越弱组分先被洗脱。 平面色谱：Rf越小→展开慢；反之Ka小，极性越弱组分展开快。
❖ 附：常见化合物极性
❖ ①见登山图1
❖
②双键↑，吸附力↑
羧酸 酚
❖
③分子内氢键，吸附力↓
醇 酰胺
胺类
酮 酯 二甲胺
1. 被测组分性质（极性大小）： 烃＜ - - - - - - - - ＜羧酸
2. 吸附剂的活性： 吸附剂的活性↑大，对组分的吸附能力↑强，K ↑大 强极性物质——选择弱吸附剂 弱极性物质——选择强吸附剂
3. 流动相的极性： 流动相极性↑大，对组分的展开能力↑大 , K ↑小 “相似相溶”原则 ：根据组分性质、吸附剂的活性， 选择适当极性的流动相
✓ 分离对象：大分子量（＞2000）的化合物 有机聚合物（如 聚烯烃、聚苯乙烯和聚酰胺等） 生物大分子（如蛋白质、核酸、低聚糖、肽类等）
局限： ✓ 不能分离大小相近的化合物 ✓ 为得到良好的分离，组分的分子量应相差10%以上。
应用
✓ Kp∝尺寸∝相对分子质量——
可应用于高分子分子量的测定
➢ 结论：
分 类：
平面色谱
薄层色谱 (TLC) 纸色谱 （PC）
吸附薄层色谱 分配薄层色谱 分子排阻薄层色谱
薄层电泳法
一、平面色谱参数
（一）定性参数
1、比移值（Rf）
Rf 原点 原到 点组 到分 溶斑 剂点 前 心质 沿 的量 的 距中 距 离 LL0离
Rf=0: 组分在原点，完全被固定相保留
L
0
Rf=1: 组分在前沿，完全不被固定相保留
适用：分析酸性或中性物质 ，如有机酸、氨基酸、甾体等 选择性保留碱性物质,如胺类
简述常见色谱分离法的类型及基本原理
简述常见色谱分离法的类型及基本原理色谱分离法是一种常用的分离分析方法，其基本原理是利用不同物质在固定相和流动相之间的分配平衡，实现物质的分离。
根据分离原理的不同，色谱分离法可以分为以下几种类型：
1. 液相色谱法（LC）：该方法是最常用的色谱分离法之一，其基本原理是利用不同物质在固定相和流动相之间的分配平衡，实现物质的分离。
液相色谱法具有高分离效能、高灵敏度、高选择性等优点，被广泛应用于生物、医药、环保、化工等领域。
2. 气相色谱法（GC）：该方法利用不同物质在气相状态下的吸附和解吸特性，实现物质的分离。
气相色谱法具有高分离效能、高灵敏度、分析速度快等优点，被广泛应用于环保、化工、食品、医药等领域。
3. 高效液相色谱法（HPLC）：该方法是一种改进的液相色谱法，通过提高固定相的粒径和流动相的速度，提高分离效率和速度。
高效液相色谱法具有高分离效能、高灵敏度、分析速度快等优点，被广泛应用于生物、医药、环保、化工等领域。
4. 薄层色谱法（TLC）：该方法是一种简便的色谱分离法，通过在薄层板上分离样品，实现物质的分离。
薄层色谱法具有操作简单、分析速度快、灵敏度高等优点，被广泛应用于食品、环保、化工等领域。
5. 离子交换色谱法（IEC）：该方法利用不同物质在离子交换剂
上的吸附和解吸特性，实现物质的分离。
离子交换色谱法具有高分离效能、高灵敏度、分析速度快等优点，被广泛应用于生物、环境等领域。
不同的色谱分离法具有不同的原理和特点，应根据具体的分析需求选择合适的色谱方法。
液相色谱法实验报告
液相色谱法实验报告【前言】液相色谱法是分离化合物的常用实验方法之一，其对分子结构的识别和定性分析有着重要的应用。
本文将介绍制作液相色谱法实验的具体步骤，并从实验原理、仪器设置、实验实施、结果分析等方面展开详细描述和分析。
【实验原理】液相色谱法是基于样品分子在流动相中与分离柱填料相互作用的不同程度而实现分离的方法。
该方法主要包括样品预处理、流动相的制备、色谱分离柱的选择和样品的检测等环节。
在液相色谱法中，流动相的选择与样品性质有很大的关系。
常用的流动相包括水、甲醇、乙酸、氯化钠等，不同种类的液体通过组合可以达到不同效果，从而实现对目标化合物的分离和检测。
【仪器设置】本实验中涉及的仪器主要包括高效液相色谱仪、工作站、电脑等设备。
在操作过程中首先需开启设备电源，然后从试剂柜中取出需要的试剂瓶和色谱柱，并按照设备说明书上的步骤将色谱柱连接到工作站上。
接着根据试剂瓶标签上的说明用注射器将液体加入装有流动相的移液瓶中，并将移液瓶接到高效液相色谱仪上。
取出预处理好的样品到注射器中，并连接到工作站上，调整好仪器的参数，即可开始实验。
【实验实施】接下来将展开对制作液相色谱法实验步骤的详细描述。
一、制备流动相液相色谱法实验中，常用的流动相包括水、甲醇、乙酸等。
制备流动相的具体步骤如下：1. 在流动相瓶上标明液体组分，比如乙酸-水混合物。
2. 在流动相瓶中向对应体积的乙酸加入适量的水，调节pH值。
3. 振荡混合，待混合均匀后，过滤。
特别是水不纯净的时候，要过滤掉残留物。
4. 将制备好的流动相装满移液瓶，并取一定量样品注入注射器中。
二、选择液相色谱柱和调整参数1. 根据实际需要选择合适的色谱柱。
2. 将液相色谱柱连接到仪器工作站上。
3. 根据样品的特性和分子量等参数，调整仪器的各项参数。
4. 进行样品柱前处理。
三、实验操作1. 打开实验软件，选择所使用的操作方法，设置相关参数。
2. 当仪器达到稳定状态时，输入注射体积和流速等参数，然后将样品注入移液瓶中。
液相色谱法
（2）平面色谱法（Planar Chromatography）
按平面色谱材料不同可分为: 薄 层 色 谱 法 （ Thin Layer
相之间发生反复多次的分配过程。 色谱分离过程是不同物质分子在相对运动的两相之间，多次
分配平衡而得到分离的过程。
2.分配系数（distribution coefficient）K
在一定的温度和压力下，某个组分在固定相（S）与流 动相（m）中达到分配平衡时的浓度之比，称为该组分 的分配系数，即，K = Cs/Cm 。
按流动相分
按机理分
气相色谱（GC） 液相色谱（LC） 超临界流体色谱（SFC） 吸附色谱 分配色谱 离子交换色谱 排阻色谱 亲和色谱
三、色谱分离过程
（一）、色谱法的基本步骤
1、制备成色谱床：根据试样分析目的选择固定相，按操作 形式的要求制备成色谱床（装填成色谱柱，或涂铺到薄层 板上等）。 2、进样（或点样）。将处理好的样品以一定方式加到固定 相的一端。 3、洗脱或展开。将流动相以一定速率载运样品连续通过固 定相，使样品各组分在两相相对运动中彼此分离。 4、收集从色谱床上分离的各组分，进行检测（定性、定量 分析）。
气相色谱仪
气相色谱仪结构示意图
薄层色谱法
1956年出现薄层色谱法。
薄层色谱法
凝胶过滤色谱法
1959年出现凝胶过滤色谱法。
高效液相色谱法
1968年前后产生高效液相色谱法。
高效液相色谱仪
超临界流体色谱法(Supercritical Fluid，SCF)
气相色谱法与液相色谱法的比较及应用
气相色谱法与液相色谱法的比较及应
用
气相色谱法（GC）和液相色谱法（LC）是化学分析领域中常用的两种分离技术，它们分别利用气体相和液相作为分离介质，通过样品分子在这些相中的分配和相互作用来实现分离。
气相色谱法和液相色谱法的比较：
1. 分离机理不同：气相色谱法基于分子在气相中的相互作用，而液相色谱法基于分子在液相中的相互作用。
2. 适用范围不同：气相色谱法适用于挥发性和半挥发性有机化合物的分离和分析，而液相色谱法适用于水溶性和非挥发性有机化合物的分离和分析。
3. 分离效果不同：气相色谱法对于具有较小极性差异的化合物分离效果较好，而液相色谱法对于具有较大极性差异的化合物分离效果较好。
4. 检测灵敏度不同：气相色谱法通常比液相色谱法具有更高的检测灵敏度，可以检测到更小的化合物浓度。
气相色谱法和液相色谱法的应用：
1. 气相色谱法广泛应用于环境监测、食品检测、医药分析等领域，如挥发性有机物的分析、药物代谢产物的分析等。
2. 液相色谱法广泛应用于生物医学分析、药物分析、环境分析等领域，如氨基酸的分析、核苷酸的分析等。
综合而言，气相色谱法和液相色谱法具有各自的优缺点和适用范围，需要根据实际应用需求进行选择。
在某些情况下，两种技术可以结合使用，以获得更好的分析结果。
1/ 1。
液相色谱-串联质谱法
液相色谱-串联质谱法
液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）是一种新型的色谱
分析技术，它可以用于分析多种类型的样品中的有机物，包括药物、肽和其他生物分子。
LC-MS/MS的原理是，样品被首先通过液相色谱仪（LC）进行分离，然后采用串联质谱仪（MS）对分离出的组分进行鉴定。
液相色谱法（LC）是一种以溶剂为溶剂的色谱分析技术，它可以把混合物分别成不同的组分。
在LC-MS/MS中，溶剂
通常是一种有机溶剂，比如乙腈或甲醇，用来溶解样品中的有机物。
通过高压活性柱（HPLC），溶剂带动样品在柱中运动，不同的有机物会以不同的速度经过柱，这样就可以把样品中的有机物分离出来。
串联质谱仪（MS）则可以用来鉴定分离出来的组分，这
是因为不同的有机物会有不同的质量数或质量分数。
MS是通
过将样品中的原子或分子电离，然后再用电压梯度将离子排列出不同的质量，从而可以确定样品中的有机物种类和含量。
LC-MS/MS的优势在于分析灵敏度高，可以检测微量样品中的有机物，而且分析时间短，减少了分析时间。
此外，LC-MS/MS也可以用于复杂的样品，因为它可以把复杂的样品中
的有机物分开，这样就可以从复杂的样品中提取关键信息。
总之，LC-MS/MS是一种非常有用的分析技术，可以用来分析复杂的样品，并能快速准确地测定样品中有机物的种类和含量。
液相色谱法的分离原理
液相色谱法的分离原理
液相色谱法（Liquid Chromatography，LC）的分离原理是基于混合物中各组分在固定相和流动相之间的分配系数、吸附能力、离子交换能力、分子大
小等物理化学性质的差异，从而实现各组分的分离。
主要的液相色谱分离模式包括：
1. 液液分配色谱：利用混合物中各组分在两种互不相溶的液体之间的分配
系数的差异来实现分离。
2. 液固吸附色谱：基于各组分在固定相上的吸附能力的不同而分离。
3. 离子交换色谱：依据混合物中各离子组分与离子交换剂之间的离子交换
能力的差别进行分离。
4. 凝胶色谱（空间排阻色谱）：按照分子大小进行分离，大分子不能进入
凝胶颗粒内部，先被洗脱出来；小分子能进入凝胶颗粒内部，后被洗脱出来。
在液相色谱中，流动相携带样品通过装有固定相的色谱柱，由于不同组分
与固定相和流动相之间的相互作用不同，导致它们在色谱柱中的迁移速度不同，从而实现分离。
分离后的组分依次进入检测器，产生相应的信号，最终得到色
谱图，用于定性和定量分析。
有机酸的测定液相色谱法
有机酸的测定液相色谱法是一种常用的化学分析方法，其基本原理是利用高效液相色谱仪将有机酸分离，然后通过检测器检测各有机酸的含量。
以下是测定有机酸液相色谱法的基本步骤：
1. 样品处理：将待测样品进行处理，如粉碎、溶解、过滤等，以便于后续的提取和分离。
2. 提取有机酸：将处理后的样品用适量的溶剂进行提取，常用的溶剂有酸性和碱性溶液。
提取时可以根据有机酸的性质选择合适的溶剂，如甲酸、乙酸、乳酸等。
3. 分离有机酸：将提取液通过高效液相色谱仪进行分离，色谱柱是关键的分离介质。
可以根据有机酸的极性、酸碱性质等选择合适的色谱柱，如C18、硅胶等。
流动相的选择也很重要，常用的流动相有甲醇、乙腈等。
4. 检测有机酸：分离后的有机酸可以通过紫外可见光检测器、荧光检测器等进行检测。
检测器的选择应根据有机酸的性质和实验要求进行选择。
5. 定量分析：根据色谱峰的面积或峰高进行定量分析，通过标准曲线法或内标法计算各有机酸的含量。
6. 数据处理和报告：将实验数据进行处理和分析，并撰写实验报告，包括实验目的、原理、操作过程、结果分析和结论等。
需要注意的是，在测定有机酸液相色谱法的过程中，应注意实验的安全性，避免使用有毒有害的试剂和溶剂。
同时，为了获得准确的结果，需要进行严格的实验操作和控制，如样品处理、提取和
分离等步骤都需要严格按照实验要求进行。
高效液相色谱法基本原理
高效液相色谱法基本原理高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是一种基于溶液相的色谱分析技术，其基本原理如下：1. 溶液相选择：在HPLC中，溶液相通常为无机盐溶液、有机溶剂或水。
选择合适的溶液相可以使被分析物在色谱柱中发生有效的分离和保持稳定。
2. 色谱柱选择：色谱柱是HPLC中最关键的组成部分。
根据被分离物的性质和所需分析的目的，选择合适的色谱柱类型，如反相色谱柱、离子交换色谱柱、凝胶过滤色谱柱等。
3. 样品进样：将待测样品通过自动进样器或手动进样器引入色谱系统。
进样总量应在仪器所能承受范围之内，且样品需提前进行前处理，如过滤、稀释等。
4. 色谱分离：进样后，溶液会通过色谱柱，其中的被分析物会在色谱柱中发生吸附、分配、离子交换等物理和化学作用，从而实现分离。
此过程依赖于被分析物和色谱柱固相之间的相互作用。
5. 流动相控制：为了保证色谱柱中样品的分离效果，需要采用恒定的流动相速度。
流动相的选择与被分析物的性质及分离要求有关，可通过梯度洗脱来实现更好的分离效果。
6. 检测器检测：色谱柱出口的物质会进入检测器进行检测。
常用的检测器有紫外-可见吸收光谱仪、荧光光谱仪、电导检测器等。
检测信号会被放大、处理和记录。
7. 数据分析：将检测到的信号转化为图谱，通过波峰的面积、保留时间等数据进行定性和定量分析。
常见的数据处理方法有峰面积法、内标法、标准曲线法等。
通过以上步骤，高效液相色谱法可以实现对复杂混合物的定性和定量分析，具有灵敏度高、分离效果好、样品处理简单等优点，广泛应用于化学、生物、药学等领域。
经典液相色谱法
经典液相色谱法
经典液相色谱法（Classical Liquid Chromatography，简称CLC）是一种分离和分析化合物的常用技术，它应用在生物、药物、环境中。
它基于不同分子间的相互作用，能够快速地将混合物中的个体分离出来，并且可以高灵敏度地测量分离物的组成和平衡。
CLC 是一种基于定性分离的技术，它是将混合物中的分子分离成单独的组分的过程，然后使用检测器来测定每个组分的含量。
它包括三个步骤：分离步骤、测量步骤和识别步骤。
1. 分离步骤：分离步骤包括样品的预处理，它要求将混合物中的分子溶解在一定的溶剂中，以便与柱中的溶剂形成稳定的溶液，并通过柱的内部空间平稳地传输，实现分子的分离。
2. 测量步骤：测量步骤是检测器的作用，它是根据样品中所含物质的特征，使用检测器对每个组分进行测量。
检测器可以是光学检测器（如分光光度计、紫外可见分光光度计），也可以是电子检测器（如电感耦合等离子体质谱仪）等。
3. 识别步骤：识别步骤是根据检测器的数据，通过特定的算法或者软件，将所测量的数据与已知的物质的特征进行比较来识别分离出来的物质，从而获得准确的信息。
CLC 技术的优势在于可以快速准确地将混合物中的各个组分分离出来，并且可以高灵敏度地测量它们的组成和平衡。
然而，该技术也存在一定的局限性，首先是它只能处理体积较小的样品，而且需要大量的时间和精力，容易受到环境变化的影响，因此不能满足大规模样品的处理要求。
总之，经典液相色谱法是一种非常有用的分离技术，它的优势在于可以快速准确地将混合物中的各个组分分离出来，并且可以高灵敏度地测量它们的组成和平衡。
但是，它也存在一定的局限性，因此在大规模样品处理中受到一定限制。
液相色谱法基本原理
液相色谱法基本原理
液相色谱法（Liquid Chromatography，简称LC）是一种用于分离、鉴定和定量混合物中各个组分的实验室技术。
其基本原理可以概括如下：
1.移动相和固定相：液相色谱法涉及两种相：移动相
（通常是液体）和固定相（固体或液体固定在固体
表面）。
移动相流过固定相。
2.样品注入：样品溶解在移动相中并被注入色谱系
统。
3.组分分离：样品中的不同组分在移动相和固定相之
间的互相作用差异导致它们以不同的速率移动。
这
种互相作用可能基于极性、分子大小、形状或其他
化学性质。
4.极性和非极性相互作用：在正相液相色谱中，固定
相是极性的，而移动相是非极性或中等极性的。
组
分根据其极性被分离。
反相液相色谱则相反，固定
相是非极性的，而移动相是极性的。
5.检测和定量：随着组分从柱子出来，它们通过一个
或多个检测器。
检测器可以基于不同的物理或化学
性质，如紫外-可见光谱、荧光或质谱。
6.洗脱曲线：每个组分产生洗脱曲线（或峰），其位置
（保留时间）和大小（面积或高度）可用于鉴定和
定量分析。
液相色谱法的关键在于选择合适的移动相和固定相组合，以实现最佳的分离效果。
它广泛应用于生物化学、环境分析、药物检测等领域。
化学实验知识：液相色谱法测定有机化合物的实验操作
化学实验知识：“液相色谱法测定有机化合物的实验操作”液相色谱法（LC）是目前广泛应用于有机化合物分析的一种方法。
它基于化合物在移动相和固定相之间的分配和吸附作用，通过不同的特性差异来分离和检测有机化合物。
本次实验旨在掌握液相色谱法的实验操作和测定有机化合物的方法。
一、实验器材和试剂1、液相色谱仪（HPLC）：用以分离和检测有机化合物。
2、色谱柱：涂有色谱填料的柱子，常见有C18、C8、C4以及Phenomenex和Zorbax等供应商的色谱柱。
3、样品瓶：用于保存待测样品。
4、移动相：液相色谱法中移动相是指用于将化合物从样品移至色谱柱的液体溶液，常见的有甲醇、乙腈、水等溶剂。
5、内标物：用于定量，通常为稳定的异构体或同分异构体。
二、实验操作1、样品的准备a)将待测样品溶于合适的溶剂中，通常使用纯度达到HPLC级别的甲醇或异丙醇/H2O（80：20）混合溶液作为溶剂。
b)将样品通过0.22μm滤膜过滤后放入HPLC瓶中待用。
c)加入内标物，内标物的浓度为待测溶液中溶质的1/10至1/1000，常用的内标物有咖啡因和左旋多巴。
2、移动相的选取移动相是溶质被洗脱的介质，也是色谱柱的“氧气”，选择合适的移动相可以使得溶质充分分离和纯化。
不同的溶质具有不同的物化性质，在选择移动相时，需要根据样品的特性来确定移动相的种类和体积分数。
一般情况下，甲醇、乙醇可以与水混合使用，它们的混合比例可以根据样品的极性、亲水性等特性加以调整。
3、色谱柱的选择色谱柱是色谱仪中最重要的组成部分之一，不同的色谱柱可以对应不同的分离特性。
在实验前需要根据样品的特性和所需的分离效果，选用不同类型的色谱柱。
例如：C18柱适用于极性中等的化合物，而C4柱适用于较极性的化合物；Phenomenex和Zorbax等柱子则具备更好的分离效果和较长的使用寿命。
4、色谱条件设置在实验前需要设置色谱条件，包括流速、温度、波长等参数的设置。
a)流速：流速是指液相在柱内流动的速度，一般情况下可以根据分离效果的要求调整流速。
液相色谱法的原理
液相色谱法的原理
液相色谱法是一种以液相为移动相、以固相为固定相的色谱分析方法。
其原理基于样品中的化合物在液体流动的移动相中与固定相相互作用，从而导致化合物在固定相上的分离。
液相色谱法的分离是通过样品分子与固定相之间的吸附和解吸过程实现的。
固定相通常是通过将活性吸附剂固定在固体载体上来实现的。
在液相色谱柱中，移动相以一定的流速通过柱填充物，样品分子将与固定相表面发生相互作用。
具有较强相互作用的分子将与固定相结合得更紧密，在柱中滞留时间较长，而相互作用较弱的分子则滞留时间较短。
这样，不同组分的样品将在柱中分离出来。
移动相在柱填充物中的流动速度是液相色谱法分离的关键因素之一。
当流速较快时，样品分子会迅速通过柱填充物，导致分离效果较差；而当流速较慢时，分离效果较好。
此外，选择合适的固定相和移动相也是实现分离的重要因素。
可根据样品的性质和分离目的选择合适的柱填充物，并调整移动相的pH值、溶解度、流速和温度等参数来优化分离效果。
液相色谱法可以根据不同的原理进行分类，如吸附色谱、离子交换色谱、分配色谱和排阻色谱等。
不同的类型适用于不同的样品和分析目的。
液相色谱法具有分离效率高、选择性好、灵敏度高、重现性好等优点，因此在生化、医学、环境和食品等领域广泛应用。
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现代高效液相色谱仪一般都具备贮液器、高压 泵、梯度洗脱装置（用双泵）、进样器、色谱柱、 检测器、恒温器、记录仪等主要部件。其结构框 图如图9—1所示。 图9——1高效液相色谱仪的结构
9. 1.1 贮液器(流动相贮罐)
分析用高效液相色谱仪的流动相贮罐，常使用1L 的锥形瓶加一个电磁搅拌器，在连接到泵入口处的管 线上时要加一个过滤器（例如2μm的过滤芯），以防 止溶剂中 的固体颗粒进人泵内。为了使贮罐中的溶剂 便于脱气，溶剂罐中常需要配备加热器、搅拌器和抽 真空及吹入惰性气体的装置。在进行分析工作前，必 须脱去流动相中的溶解气体，尤其是用水和其它极性 溶剂做流动相时，脱气更为重要（特别是在梯度洗脱 时）。为了防止在检测器中产生气泡，可在装流动相 贮罐中于强烈搅拌下抽真空几分钟，加热可提高抽气 效率。不管用什么方法脱气，以不使流动相混合物浓 度发生变化为原则。为了减少流动相和固定相可能发 生的反应，还必须除去流动相中的氧。用氦气吹扫流 动相是除去其中痕量氧气的有效手段。脱气后的流动 相液面上应保持有惰性气体，这样可以防止氧再次溶 解到流动相中，还可以避免易燃溶剂蒸气着火。
该检测器作为紫外 -可见光检测器的发展, 在液相色谱峰纯度检验和色谱峰定性方面有 很广泛的应用，它是以光电二极管阵列（或 CCD阵列，硅靶摄像管等）作为检测元件的 UV-VIS检测器。但在检测器结构与光路安排 上与紫外-可见光检测器有很大区别,光电二极 管阵列 检测器是由光源发出光线通过样品池, 然后由一系列分光技术,使所有波长的光在检 测端同时被检测,得到时间、光强度和波长的 三维谱图。而紫外-可见光检测器 是由光源发 出光线经过滤光片、棱镜或光栅分光,使单色 光进入样品池,再由光电倍增管检测。两检测 器结构中样品池与分光原件位置相反。
如果手柄处于Load和Inject之间，由于 暂时堵住了流路，流路中压力骤增，再转 到进样位，过高的压力在柱头上会引起损 坏，所以应尽快转动阀，不能停留在中途。 在HPLC系统中使用的注射器针头有别于气 相色谱，是平头注射器，不能用尖头注射 器。一方面，针头外侧紧贴进样器密封管 内侧，密封性能好，不漏液，不引入空气； 另一方面，也防止了针头刺坏密封组件及 定子。
泵入口和出口处的逆止阀（单向阀）是靠 泵头的液体压力控制的。在活塞泵出流动 相时，泵头压力增加，使泵入口逆止 阀关 闭，同时泵出口逆止阀打开。在吸入流动 相时，泵头减压，使出口逆止阀关闭，入 口逆止阀打开。由于只有在活塞泵出流动 相时才有液流进入色谱系统，在泵吸 入流 动相时，无液流输出，所以成脉冲式供液。 为了解决这一问题，人们设计了双柱塞和 三柱塞泵，即所谓累积型往复泵，使液流 脉动减小。
梯度洗脱可以分为两种——低压梯度和 高压梯度。低压梯度（也叫外梯度）是在 常压下，预先按一定程序将两种或多种不 同极性的溶剂混合后，再用一台高压泵输 入色谱柱。高压梯度 ( 或称内梯度系统 ) 是利用两台高压输液泵，将两种不同极性 的溶剂按设定的比例送入梯度混合室，混 合后，进入色谱柱。
9.1.3 进样装置
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紫外-可见光检测器（紫外检测器）
紫外检测器是液相色谱中应用最广泛的检测器。 一般市售仪器中的检测器可测量190nm—900nm范围 的紫外及可见光的吸收变化，通过测定样品在检测池 中吸收紫外-可见光的大小来确定样品含量。为了定 量计量方便,通常检测器中采用对数放 大器,将透过率 转换成吸光度,仪器输出的信号与样品浓度成正比。 所以,紫外-可见光检测器属于浓度敏感型检测器,具有 灵敏度高、受操作条件和外界环境影响小、适于进行 梯度洗脱、结构相对简单、使用维修成本低等特点。 其灵敏度可达到0.001AU,噪声小于1.0×10-5AU,对 紫外光吸收不强的最低检测 浓度为1.0×10-10g/ml的 样品也有一定检出能力。
六通阀进样器的进样方式有部分装液法和 完全装液法两种。使用部分装液法进样时，进 样量最多为定量环体积的75％，如20μl的定量 环最多进样15μl的样品，并且要求每次进样体 积准确、相同；使用完全装液法进样时，进样 量最少为定量环体积的3至5倍，即20μl的定量 环最少进样60至100μl的样品，这样才能完全 置换样品定量环内残留的溶液。一般为了操作 简单和保证足够的精密度及重现性，都采用完 全装液法进样，这就要求根据需要，加工制作 各种规格的定量环。
紫外吸收检测器按光路系统可分为单光路和双光 路。单光路没有光路补偿，稳定性较差，作梯度洗 脱时洗脱液组成变化将会引起基线漂移。双光路以 洗脱液做光路补偿，稳定性好，梯度洗脱时，由于 光路补偿基线很稳定，一般高档仪器都采用双光路。 紫外吸收检测器又分二维检测器和三维检测器。 三维检测器有扫描型和二极管阵列式。紫外吸收检 测器样品池结构基本有三种类型：Z型、H型和圆锥 型。标准池体积为5～8μl，光程5～10mm。池体积 越小，检测器死体积也越小，对柱效影响也越小； 光程越长，检测器灵敏度越高。最新型的圆锥式样 品池可为检测器提供更大的稳定性和和灵敏度。
9.1 高效液相色谱仪的结构
自俄国植物学家Tsweet提出经典液相色谱法后， 由于各种原因，在几十年的时间里，在色谱分析领域， 气相色谱分析一直占着主导地位。 20世纪60年代末，伴随着色谱理论的不断完善与 发展，色谱工作者经过大量的科学实验发现：采用 “微粒固定相”是提高液相柱色谱柱效的重要途径之 一。因此，随着“高效微粒固定相”的研制成功，液 相色谱仪制造商在借鉴气相色谱仪研制经验的基础上, 成功地制造出了“高压输液泵”和“高灵敏度检测器” 等组成部件，使液相色谱成为以“三高”(高效微粒 固定相、高压输液泵和高灵敏度检测器)为特征的色 谱分析方法，因此称为高效（或高压）液相色谱分析 法（HPLC）。
9.1.2高压泵
HPLC使用的色谱柱内径只有1~6 mm，所用固 定相的粒度也非常小（几μm到几十μm），所以流 动相在柱中流动受到的阻力很大，在常压下，流动 相几乎不能流动，因而就不能进行分析工作。为了 达到快速、高效分离，必须给流动相施加很大的压 力，以加快其在柱中的流动速度。为此，须用高压 泵进行高压输液。高压、高速是高效液相色谱的特 点之一。现代液相色谱对泵的要求如下： ①泵的结构材料要能抗化学腐蚀； ②输出压力要能达到40～50MPa； ③无脉冲或加一个脉冲抑制器； ④流量可变，流量稳定，重现性大大优于1％； ⑤为了可以快速更换溶剂，泵腔的体积要小。
用于高效液相色谱的溶剂要满足以下几点 要求，即易得、适用于所用的检测器、使 用安全、纯净以及有相对大的情性。所用 的溶剂应当能够溶解样品，当流动相的强 度适当时，在分析型分离中很少出现样品 不能被溶解的情况。一般来说选用低沸点 低粘滞性溶剂比较有利。此外，最好能够 选择具有足够纯度的且价格低廉的溶剂。 能够最大程度地满足这些要求并广泛用于 波相色谱的溶剂列于表6—1中。表中的溶 剂按极性增大的次序排列。
进样样品要求无微粒，不能阻死针头及 进样阀。样品溶液均要用0．45μm的滤膜 过滤，防止微粒阻塞进样阀和减少对进样 阀的磨损。为防止缓冲盐和其它残留物质 留在进样系统中，每次结束后应冲洗进样 器，通常用不含盐的稀释剂、水或不含盐 的流动相冲洗，在进样阀的Load和Inject位 置反复冲洗，再用无纤维纸擦净注射器针 头的外侧。
梯度洗脱装置是一种极重要的附属装置， 已成为现代高效液相色谱中部缺少的部分。 这种洗脱方式是将两种或两种以上不同性 质但可以互溶的溶剂，随时间改变而按一 定比例混合，以连续改变色谱柱中冲洗液 的极性，离子强度或pH等，从而改变被测 组分的相对保留值，提高分离效率，加快 分离速度。很明显，液相色谱中的梯度洗 脱和气相色谱中的程序升温相 似。这种洗 脱方式主要应用于分离分配比k相差很大的 复杂混合物。
高效液相色谱所用色谱柱的发展趋势是减小填料 粒度和柱径以提高柱效。
9.1.5 检测器
理想的HPLC检测器应具有如下特性：具有高灵 敏度和可预测的响应，对样品所有组分都有响应，或 具有可预测的特异性，适用范围广；温度和洗脱液流 速的变化对响应没有影响，响应与洗脱液组成无关， 可作梯度洗脱；死体积小，不造成柱外谱带扩展，使 用方便、可靠、易清洗和检修；响应值随样品组分量 的增加而线性增加，线性范围宽，响应时间快；不破 坏样品组分，并能对被检测的峰提供定性和定量信息。 能满足以上要求的高效液相色谱仪常见的选择性 检测器有：紫外-可见光检测器、示差折光检测器、 光电二极管阵列检测器、荧光检测器和电化学检测器。
9.1.4 色谱柱
色谱柱是色谱仪最重要的部件,通常用内壁抛光 的不锈钢管制作，对于一些有特殊腐蚀性的样品且 要求耐高压时，可用铜管、铝管或聚四氟乙烯管。 柱子内径一般为1～6 mm。常用的标准柱型是内 径为 4.6 或 3.9mm ，长度为 15 ～ 30cm 的直形不 锈钢柱。填料颗粒度 5 ～ 10μm ，必须注意的是， 色谱柱在装填好以后，入口和出口不同，是有方向 的，色谱柱的管外都以箭头显著地标示了该柱的使 用方向，安装和更换色谱柱时一定要使流动相能按 箭头所指方向流动。柱效以理论塔板数计大约为 7000 ～ 10000 。
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示差折光检测器
示差折光检测器也称折光指数（RI）检测器，是 一种通用型检测器，只要被测组分与洗脱液的折光 指数有差别就可使用。生命科学中常遇到各类糖类 化合物，没有紫外吸收，一般要用示差折光检测器。 它的通用性比紫外—可见吸收检测器广，但灵敏度 低（低两个数量级),价格高。 当一束光从一种介质进入另一种介质时都会发生 折射现象。折射率大小与溶质浓度成正比，因此示 差折光检测器属浓度检测器。由于折射率受温度影 响很大．故示差折光检测器要求较高的恒温条件， 最好控制在±0.001℃内，在使用时预热时间要充足， 否则基线漂移十分严重。
使用示差折光检测器要注意以下几点: （1）洗脱液的组成一定要恒定，不能使 用梯度洗脱。 （2）不能使检测池带压工作，在与其它 检测器串联使用时应放在最后。 （3）流速要恒定，泵的流速波动要小于 0.5％，使用往复泵时要用阻尼装置。 （4）温度要恒定，恒温控制要达±104℃。