LIM矿化蛋白1对牙周膜细胞生物学特性的影响

系统将木糖醇转运至细胞内，磷酸化形成5-木糖醇磷酸盐和5-木酮糖磷酸盐，抑制糖代谢所需酶的活性，进而使变异链球菌的产酸力下降［9］。

而赤藓糖醇和木糖醇同属于糖醇类，推测其抑菌产酸机制和木糖醇相似，在赤藓糖醇进入细菌体内后，被磷酸化，其产物抑制糖代谢所需酶的活性。

但在本体外实验中，这种抑制产酸的效能较相同浓度的木糖醇弱。

推测原因可能有两点：①菌体膜的主动转运机制，相对于赤藓糖醇，能转运更多的木糖醇；②赤藓糖醇在菌体内的转化效率未及木糖醇。

赤藓糖醇的防龋效应还有待进一步实验研究。

参考文献［1］杨海军．赤藓糖醇的发展及应用．中国食品添加剂，2004，13（1）：100-102．［2］Kawanabe J，Hirasawa M，Takeuchi T，et al．Noncariogenicity of e-rythritol as a substrate．Caries Res，1992，26（5）：358-362．［3］M kinen KK，Isotupa KP，Kivilompolo T，et al．The effect of polyol-conbinant saliva stimulants on S．mutans levels in plaque and saliva of patients with mental retardation．Spec Care Dentist，2002，22（5）：187-193．［4］李云帆，韦和春．赤藓糖醇VS木糖醇－怎样夺得天然甜味剂市场头筹．中国食品工业，2004，10（2）：16-17．［5］王成龙，刘洪臣，储冰峰．美蓝预防龋病的实验研究．牙体牙髓牙周病学杂志，2006，16（8）：430．［6］王成龙，刘洪臣，储冰峰，等．人工体外菌斑模型的建立及其在评价防龋制剂防龋效果中的应用．中华老年口腔医学杂志，2003，1（4）：193-196．［7］周学东．口腔生物化学．成都：四川大学出版社，2002：253-255．［8］刘天佳．口腔疾病的生物学基础．北京：人民卫生出版社，1999：48-49．［9］韩旭，刘鲁川．木糖醇防龋的研究进展．国外医学口腔医学分册，2004，31（5）：353-355．（收稿日期：2011-06-27）（编辑轩东英）·基础与应用研究·LIM矿化蛋白1对牙周膜细胞生物学特性的影响*俞少杰＊＊，付云，赵川江，李颖，邓雨泉中山大学附属口腔医院牙周科，广东广州（510055）【摘要】目的以LIM矿化蛋白1（LIM mineralization protein1，LMP-1）基因构建真核表达载体PET43．1a-LMP-1，转染人牙周膜细胞，观察对其生物学特性的影响。

方法采用基因工程技术构建真核表达载体pET43．1a-LMP-1，脂质体法转染人牙周膜细胞，四唑盐比色法和酶联免疫吸附测定法测定真核表达载体pET43．1a-LMP-1转染对牙周膜细胞活性以及碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）的影响。

结果与空质粒转染组和空白对照组相比，pET43．1a-LMP-1真核表达载体转染后牙周膜细胞中LMP-1mRNA和蛋白表达显著增强（P＜0．05）；细胞增殖明显增加；ALP表达明显增强，并随时间延长逐渐上升。

结论外源性LMP-1转染进入牙周膜细胞能够促进细胞的增殖和矿化能力。

【关键词】LIM矿化蛋白1；基因转染；人牙周膜细胞【主题词】牙周膜；基因转移技术；骨形态发生蛋白质类【中图分类号】R781．4【文献标识码】A【文章编号】1006－5245（2011）11－585－05【引用著录格式】俞少杰，付云，赵川江，等．LIM矿化蛋白1对牙周膜细胞生物学特性的影响．广东牙病防治，2011，19（11）：585-589．Effect of Recombinant Plasmid Pet43．1a-LMP-1on Human Periodontal Ligament Cells YU Shao-jie，FU Yun，ZHAO Chuan-jiang，et al．Guanghua School of Stomatology，Hospital of Stomatology，Sun Yat-sen University，Guangzhou510055，China*基金项目：广东省医学科学技术研究基金（A2009225）；广东省科技计划项目（2010B031100010）＊＊通讯作者：俞少杰E-mail：yu-shaojie@163．com【Abstract】Objective The aim of this study is to construct eukaryotic expression vector PET43．1a-LMP-1with LIM mineralization protein1（LMP-1）and investigate the effect of LMP-1by recombinant plasmids PET43．1a-LMP-1on hu-man periodontal ligament cells（PDLCs）．Methods The LMP-1cDNA was cloned into vector PET43．1a for construc-ting the vector PET43．1a-LMP-1．Periodontal ligament cells were cultured and then transfected with PET43．1a-LMP-1．Expression of LMP-1mRNA and protein in periodontal ligament cells were detected by RT-PCR and western blot，respec-tively；cell viabilities were detected by（3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2H-tetrazoliumbromide，MTT）and alkaline phosphatase（ALP）were detected by enzyme linked immunosorbent（ELISA）．Results The expression of LMP-1mRNA and ALP were detected in PDLCs tranfected with PET43．1a-LMP-1，ALP as well as PDLCs viability were significantly higer than that of the control．Conclusion The results provided a therapeutic strategy for periodontal regen-eration with PDLCs transfected PET43．1a-LMP-1．【Key words】LIM mineralization protein1；Transfection；Human periodontal ligament cell【MeSH】Gene transfer techniques；Periodontal ligament；Bone morphogenetic proteinsLIM矿化蛋白1（LIM mineralization protein1，LMP-1）是一种细胞内骨诱导蛋白，在硬组织矿化过程中发挥重要作用［1］。

LMP-1为非分泌型的胞内信号转导分子，研究表明由腺病毒转导进入胞内的LMP-1能促进细胞产生组织矿化的多种因子，具有比骨形成蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs）更强的骨诱导能力［2－3］。

牙周组织缺损的修复依赖于牙周膜细胞优先占据根面，并且需要多种细胞因子调控，促进牙周膜细胞增殖分化，达到牙周组织再生的目的。

本实验构建含LMP-1的真核表达载体PET43．1a-LMP-1，将外源性LMP-1有效导入牙周膜细胞内，检测其对牙周膜细胞生物学特性的影响，为探索有效的牙周组织再生治疗提供实验依据。

材料和方法1．材料质粒PET43．1a、DNA纯化试剂盒（Clontech，美国），大肠埃希菌E．coli BL21（DE3）、Lipofectamine 2000、反转录酶、Trizol（Invitrogen，美国），质粒提取和纯化试剂盒（Progema，美国），T4DNA连接酶、限制性内切酶、dNTP、Pyrobest DNA聚合酶（TaKaRa，日本），胎牛血清、高糖DMEM无血清培养基（Gibi-co，美国），四唑盐［3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2H-tetrazoliumbromide，MTT］试剂盒、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）检测试剂盒（上海研生生化试剂有限公司）。

2．方法（1）LMP-1基因的获取复苏MG63成骨肉瘤细胞，培养并传代，细胞总量达107个时，磷酸盐缓冲液洗涤，采用Trizol法提取细胞总RNA。

按照逆（re-verse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR），合成LMP-1cDNA第1链，以其为模板，进行PCR。

反应体系为逆转录产物1μL、dNTP混合物（2．5mmol/L）4μL，LMP-1上游引物和下游引物各1μL。

上游引物：5’-GCA GAA TTC GCC ACC ATG GAT TCC TTC AAG GTA GTG CTG G-3’，下游引物：5’-GA AGG GGA TCC CAC ATG AGA GAA GGC ATG GCT CTT GCA GA-3’，反应缓冲液5μL，Pyrobest DNA聚合酶（2U/μL）1μL，加dH2O至总体积50μL，94ħ预变性5min，94ħ30s，55ħ30s，72ħ2min，30个循环后72ħ延伸10min。

将PCR扩增产物于1%琼脂糖凝胶电泳，观察电泳结果。

按照胶回收试剂盒说明书回收目的片段。

PCR扩增片段经EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切，回收备用。

（2）真核表达质粒PET43．1a-LMP-1的构建LMP-1基因PCR扩增片段的酶切产物和PET43．1a 载体经T4DNA连接酶16ħ过夜进行连接反应，将连接产物转化处于感受态的E．coli BL21（DE3）细菌，选取单克隆扩大培养。