禽腺病毒家禽分离株的生物学特性_张明明
核心期刊《中国动物传染病学报》
期刊名称：中国动物传染病学报英文名称：Chinese Journal of Animal Infectious Diseases 期刊级别：核心期刊CA曾用刊名：中国兽医寄生虫病主办单位：中国农业科学院上海兽医研究所出版周期：双月ISSN：1674-6422CN：31-2031/S出版地：上海市语种：中文开本：大16开创刊时间：1993专辑名称：农业科技专题名称：畜牧与动物医学出版文献量：2711 篇评价信息（2017版）复合影响因子：0.590（2017版）综合影响因子：0.380该刊被以下数据库收录：CA 化学文摘(美)(2014)北京大学《中文核心期刊要目总览》来源期刊：2014年版;期刊荣誉：Caj-cd规范获奖期刊;目录∙•《中国动物传染病学报》杂志简介∙•《中国动物传染病学报》收录情况∙•《中国动物传染病学报》主要栏目设置∙•论文快速发表绿色通道—期刊之家网《中国动物传染病学报》杂志简介是由中华人民共和国新闻出版总署、正式批准公开发行的优秀期刊。
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《中国兽医寄生虫病》本刊坚持普及与提高，理论与实践相结合，重在促进动物传染病学的基础理论研究，促进国内外学术交流，提高我国动物传染病防控、诊断与治疗水平。
主要报道我国病原微生物学、传染病学、病原诊断学、动物疫苗学、病原流行病学等方面的基础理论研究，动物传染病预防、诊断等方面的新技术、新成果，以及国内外在该领域的研究进展。
B亚群禽白血病病毒分离株的生物学特性的开题报告
B亚群禽白血病病毒分离株的生物学特性的开题报告标题：B亚群禽白血病病毒分离株的生物学特性摘要：禽白血病是一种常见的家禽疾病，由白血病病毒引起。
本研究旨在分离一株B亚群禽白血病病毒，探究其生物学特性。
首先采用禽白血病病毒特异性引物，进行PCR扩增，确认病毒感染样本。
然后进行病毒的分离和纯化，利用电镜观察病毒形态。
最后进行生物学特性分析，包括病毒的致病性、抗原性等。
本研究结果可为进一步了解B亚群禽白血病病毒的基础研究提供理论基础。
关键词：禽白血病；B亚群；病毒分离；生物学特性分析引言：禽白血病是由白血病病毒引起的一种常见疾病，严重影响了家禽的生产。
目前已知的禽白血病病毒分为A、B、C、D四个亚群，其中B亚群是最为严重的病毒亚群之一。
近年来，随着禽类养殖业的发展和市场需求的增加，B亚群禽白血病病毒感染已经成为禽类健康的重要问题。
因此，对于B亚群禽白血病病毒的研究显得尤为重要。
材料和方法：本研究收集了B亚群禽白血病病毒感染的样本，并进行了病毒特异性PCR检测。
接着，通过病毒分离和纯化，利用电镜观察病毒形态。
最后，进行病毒生物学特性的分析，包括病毒的致病性、抗原性等方面。
预期结果：本研究能够成功分离出B亚群禽白血病病毒分离株，并对其进行生物学特性分析。
预计研究结果能够揭示B亚群禽白血病病毒的结构和生物学特性，为进一步了解该病毒的基础研究提供理论基础。
结论：本研究将有助于加深对B亚群禽白血病病毒的认识，为疾病防控提供依据。
同时，本研究结果也有望为制定新的病毒疫苗和药物治疗方案提供有力支持。
Ⅰ群禽腺病毒的分离鉴定和生物学特性研究及重组禽腺病毒的构建
Ⅰ群禽腺病毒的分离鉴定和生物学特性研究及重组禽腺病毒的构建腺病毒最早发现于1953年,由于它们倾向于感染上皮细胞而被命名为腺病毒。
腺病毒属腺病毒科(Adenoviridae),共分为四个属即哺乳动物腺病毒属(Mastadenovirus)、禽腺病毒属(Aviadenovirus)、腺胸腺病毒属(Atadenovirus)和唾液腺病毒属(Siadenovirus)。
禽腺病毒是禽类常见的病毒之一,大部分在禽体内复制却不致病,少数引起轻微的病症。
对禽腺病毒的流行和变异国外有很多研究工作,国内的报道较少。
腺病毒作为载体,宿主范围广,致病性低,在机体内复制不发生整合,安全性高;能在增殖和非增殖细胞中感染和表达基因;能有效进行增殖,病毒滴度高;腺病毒载体应用方便,载体疫苗可经口服途径接种。
因此以腺病毒作为病毒载体具有独特的优势。
许多学者在禽类腺病毒载体方面做了很多研究工作,国内研究较晚,但是所研制的基因工程疫苗离临床应用还有一定距离。
目前,对禽腺病毒载体研究主要使用CMV启动子,获得了较好的表达效果,也有使用病毒自身的晚期启动子/先导序列(MLP/LS)的报道,但是尚未见到对两个启动子的重组病毒的免疫效果进行比较的报道。
本研究从外表健康禽群中随机采取泄殖腔拭子,根据禽腺病毒CELOV的全序列设计引物,PCR扩增了病毒基因组右末端 1.5Kbp的ITR片段。
结果表明:禽腺病毒在禽群中的流行比较广泛,鸡群的阳性率为23.8%(30/126),鸭群的阳性率为51.7%(15/29),鹅群的阳性率为17.3%(10/58)。
从鸡源、鸭源、鹅源ITR扩增阳性的样品中各选取3株,将ITR片段的PCR扩增产物克隆测序,并与CELOV、FAV-9、EDSV以及FAV-JS株的相应序列进行了比较。
结果表明:本次分离的9株禽腺病毒与血清1型的代表株CELOV和我们实验室早期分离株FAV-JS株在ITR片段上的同源性最高可达99.9%,最低也为94.7%;而与D亚群的FAV-9和禽腺病毒Ⅲ群的EDSV相比较,同源性较低。
1株3型禽腺病毒的分离鉴定
中国动物传染病学报2020,28(5):17-22Chinese Journal of A nimal Infectious Diseases •研究论文•1株3型禽腺病毒的分离鉴定牛登云，徐兆强，陈卓，马利芳，段宝敏，张小敏，冯敬敬(天津渤海农牧产业联合研究院有限公司，天津300308)摘要：本研究旨在利用鸡肝癌(LMH)细胞从FAdV感染鸡的肝脏中进行病毒分离，利用PCR扩增与序列测定、TCID5。
测定以及鸡胚接种等方法对分离获得的1株3型禽腺病毒进行鉴定与分析。
结果显示：LMH细胞接毒96h左右会出现明显的细胞病变，细胞体积变大，形态边圆，折光度增强，贴壁性减弱，呈半悬浮状态；将分离毒株在LMH细胞上连续传代2〜3次会稳定出现明显的细胞病变；接种LMH细胞进行TCID50测定，病毒滴度达到10-7.67/0.1mL；将分离株接种鸡胚，96h后死亡，胚体发红萎缩，肝脏出血有坏死灶；PCR扩增分离株的Hexon基因，并进行其同源性和基因进化树分析显示，分离株目的基因与参考毒株SR-49位于同一分支上，同源性在99.4%，同时将分离株命名为SX180203。
本研究结果为禽腺病毒3型毒株疫苗的研发奠定了坚实的物质基础。
关键词：3型禽腺病毒；分离鉴定；Hexon基因中图分类号：S852.659.1文献标志码：A文章编号：1674-6422(2020)05-0017-06 ISOLATION AND CHARACTERIZATION OF A SEROTYPE3FOWLADENOVIRUS ISOLATENIU Deng-yun,XU Zhao-qiang,CHEN Zhuo,MA Li-fang,DUAN Bao-min,ZHANG Xiao-min,FENG Jing-jing(Tianjin Bohai Joint Institute of A griculture and Animal Husbandry Industry Co.,Ltd.,Tianjin30030&China)Abstract:Liver samples of infected chickens were inoculated onto LMH cells to isolate serotype3Fowl adenovirus(FAdV-3).The obtained isolate was designated as the strain SX180203and then characterized by PCR,sequencing,determination of TCID50and chicken embryo inoculation.The infected LMH cells showed obvious cytopathic effect at about96h post infection.The cells became larger,round and detached and cell monolayers peeled off in a semi-suspended state at the late stage of infection.Continuous2to3passages of the isolated viruses on LMH cells resulted in significant cytopathic effect.The determination of titer(log10TCID50/mL)were performed on LMH cells and the virus titer reached to log10107.67/0.1mL.The isolate was also inoculated into chicken embryos.The inoculated embryos died at96hours post inoculation.The embryos looked red in color and livers showed hemorrhage and necrotic foci.The PCR testing of Hexon gene revealed that this isolate was on the same branch as the reference strain SR-49,and their nucleotide homology was99.4%. Key words:Serotype3fowl adenovirus;isolation and identification;Hexon gene收稿日期：2019-02-12作者简介：牛登云，女，硕士研究生，预防兽医学专业通信作者：冯敬敬，E-mail：****************・18・中国动物传染病学扌艮2020年10月I群禽腺病毒属于禽腺病毒科禽腺病毒属，为双链DNA病毒，无囊膜，直径为70~90nm,呈20面体对称结构。
禽腺病毒家禽分离株的生物学特性
Ｂｉ ｌ ｇ ｃ ｌｃ ｒ ｃ ｅ ｉ ｔｃ ｆ ｆ ｗｌａ ｎｏ ｉ ｕ ｔ ａ ｎ ｓ ｌ ｔ ｄ ｆ ｏ ｕ ｔ ｙ ｏ ｏ ｉ ａ ｈａ ａ ｔ ｒ ｓ ｉ ｓｏ ｏ ｄｅ ｖ ｒ ｓ ｓ ｒ ｉ ｓ ｉｏ ａ ｅ ｒ ｍ ｐｏ ｌｒ
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ｔ ｄ ｆ ｏ ｕｌｒ ｅ ｒ ｍ ｐｏ ｔ ｙ，ｓ ｍ ｅ ｂ ｏｌ ｇ ｃ ｌｃ ｒ ｃ ｅ ｉ ｔｃ ｅ ｅ ｅ ｏ ｉ ｏ ｉ ａ ｈａ ａ ｔ ｒｓ ｉｓ ｗ ｒ ｘｐｌ ｒ ｄ ｂ ｍ ａ ｇｌ ｔｎ ｔｏ ｅ ｔ ｌ ｃ ｒ ｉｒ ｓ ｏ ｅ ｙ ｈｅ ｇ ｕ ｉ ａ ｉ ｎ ｔ ｓ ，ｅ ｅ ｔ ｏｎ ｍ ｃ ｏ — ｃ ｐｙ，ｃ ｔ ｐ ｔ ｃ ｔ ｓ ｎｄ ｉ ｃ ａ ｉ ｎ ｉ ｈｉ ｋ ｎ ｅ ｂ ｙ ｓ ｏ ｈ ｃ ｅ ． Ｔ ｈｅ ｅ ｉ ｏ ａ ｅ ａ ｙｐ ｃ ｌｓ ａ ｆ ｏ ｙ ｏ ａ ｈｉ ｅ ｔａ ｎｏ ｕｌｔｏ ｎ ｃ ｃ ｅ ｍ ｒ ｏ ｒ ｃ ｉ ｋ ｎｓ ｓ ｓ ｌ ｔ ｓ ｈ ｄ ｔ ｉａ ｈ ｐｅ ｏ ａ ｅ ｏ ｒ ｓ ａ ｏｕ ｄ ｎｏ ｇ ｕｔｎａ ｅ ｃ ｃ ｎ ｒ ｄ ｂｌ ｏ ｅ ｌ ． Ｔ ｈ ｙ ｄ ｄ ｎｏ ａ ｅ ｐａ ｈｏ ｏ ｉ ａ ｃ ｎｇ ｓ ｉ ｄ ｎ ｖｉｕ ｎｄ ｃ ｌ ｔ ａ ｇｌ ｉ ｔ ｈｉｋｅ ｅ ｏ ｄ ｃ ｉｓ ｅ ｉ ｔ ｃ ｕｓ ｔ ｌ ｇ ｃ ｌ ｈａ ｅ ｎ ｃ ｃ ｍ ｂ ｙｏ ｆｂｒ ｂｌ ｓ ｓ， ｂ ｈｅ ｈｉｋｅ ｅ ｂ ｙｏ ｋｉ ｎｅ ｃ ｌｓ ｅ ａ ｅ ｒ ｎｄ ｗ ｉｈ ｅ ａ ｅ ｅ ｒ ｃ ｉ ｉｙ． ｈｉｋ ｅ ｒ ｉ ｏ ａ ｔ ｕｔ ｔ ｃ ｃ ｎ ｍ ｒ ｄ ｙ ｅ ｌ ｂ ｃ ｍ ｏｕ ｔ ｎｈ ｎｃ ｄ ｒ ｆ ａ ｔｖ ｔ Ａ ｎ ＰＦ ｃ ｃ ｎ ｅ ｂｒ ｏｓｗ ｅ ｅ ａ ｓ ｏｔａ ｆ ｃ ｅ ｄ Ｓ ｈｉｋｅ ｍ ｙ ｒ ｌｏ ｎ ｆｅ ｔ ｄ． Ａ ｆｅ ｈｅ － ａ — ｌ ｔ ｒ ｔ １ ｄ ｙ ｏ ｄ ＳＰＦ ｈｉｋｅ ｓ ｗ ｅ ｅ ｓ ｃ ｃ ｎ ｒ ｕｂｃ ａ ｏｕ １ ｕｔ ｎｅ ｓ ｙ
禽传染性支气管炎病毒分离株理化特性的研究
ｔ ｎｃｅ ｚｍ ．Ｉ Ｖ－ ０ ａ ｉｅ ｙ２ ％ ａｔｅ ｆｒ ４ｈ ｕｓ ５ ｃ ｌｒｆｒ ａ ｄ１ ｆｒ ｌｅ ｙ ｅｆｒ ０ｍｉｕｅ． Ｃ ｎ ｌｓ ｎ ｈ ８ ｅ ｉ ｎｙ ｅ Ｂ ＨＮ ５ｗ ｓ ｌ ｄｂ ０ ｉ ｋｌ ｅｈ ｒｏ ｏ ｒ， ％ ｈｏｏ ｍ ｎ ％ ｏ ｍａｄ ｈ ｄ ｎ ｔｓ ｆ ｏ ｃｕｉ ］Ｐ ｖｉ ２ ｏ ｏ ３ ｏ ．
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鸡腺病毒Ⅰ群血清4型的分离鉴定与防治
鸡出现发热、精神沉郁、嗜睡，羽毛脏乱无光泽症 状（图 1）。 食欲无明显降低，鸡群普遍腹泻，拉黄 绿色稀便、黄疸、冠髯苍白、衰弱等。 发病鸡常在 24~48h 内 死 亡 ，病 程 约 10d，死 亡 率 可 达 60%。
本病初期，基本无可见临床症状，仅见个别身 体 状 况 良 好 的 鸡 突 然 倒 地 死 亡 。 2~3d 后 可 见 有 些
收稿日期：2016-09-05
*基金项目：山东省科技发展计划项目资助：鸽瘟病毒的
流 行 病 学 与 防 控 技 术 研 究 （No.2013GNC11026）。
** 通 讯 作 者 ： 王 友 令 ， 博 士 ， 副 研 究 员 ， 主 要 从 事 家 禽 疫
鸡Ⅰ群 腺 病 毒 （FAV-Ⅰ ） 为 腺 病 毒 科 ， 禽 腺 病 毒属病毒，广泛存在于多种家禽的眼睛、上呼吸道 及消化道内， 大多数呈隐性感染或与其他疾病共 同 作 用 引 起 家 禽 发 病 或 死 亡 [1]。 2015 年 以 来 在 我 国北方鸡群内流行一种以心包积液、 肝脏肿大出 血为特征的疾病，发病率呈上升趋势，经研究证实 为腺病毒感染，俗称安卡拉病，也称心包积液综合 征。 本病毒属于禽腺病毒Ⅰ群血清 4 型，与包涵体 肝炎都属于Ⅰ亚群禽腺病毒。主要感染 1~3 周龄商 品 白 羽 肉 鸡 、817 肉 鸡 、麻 鸡 ，青 年 鸡 和 产 蛋 鸡 感 染 后症状较轻，给当前家禽养殖业带来巨大危害。
结果： 标准抗原孔与阳性血清孔之间出现 1 条清晰的乳白色沉淀线， 与阴性血清孔之间无沉 淀线出现， 待检孔与阳性血清孔之间出现 1 条清 晰的沉淀线， 且和标准抗原孔与对照阳性血清孔 之间的沉淀线相吻合者。 证实为禽Ⅰ群腺病毒血 清 4 型感染。 3 防治措施 3.1 加强饲养管理，严格卫生消毒 腺病毒广泛 存在于鸡群中，一般很少发病，但是在免疫抑制时 可能会出现临床症状。 因此，养殖者必须做好隔离 消毒工作，加强饲养管理，减少忽冷忽热、断喙、突 然 换 料 等 可 控 的 应 激 因 素[3]。 选 用 有 效 消 毒 药 搞 好 环境卫生的消毒，同时减少各种应激因素，使鸡群 在良好的饲养条件下处于最佳的生长发育和生产 状态，尽量降低损失，才能增加经济效益。 3.2 重视生物安全，控制种源选择 鸡场要重视 养殖场的生物安全， 控制种苗来源， 在引种过程 中，要避免从疫区引进种蛋和雏鸡，并加强检疫和
一种大肠杆菌中高效表达禽腺病毒Fiber-2蛋白的方法[发明专利]
![一种大肠杆菌中高效表达禽腺病毒Fiber-2蛋白的方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/c557ade081eb6294dd88d0d233d4b14e85243e28.png)
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011391371.9(22)申请日 2020.12.02(71)申请人 华农（肇庆）生物产业技术研究院有限公司地址 526238 广东省肇庆市高新区创业路5号肇庆大华农生物药品有限公司动物大楼（生产车间）一楼(72)发明人 方倪冉 郑航辉 叶俊贤 董楠 杨小云 (74)专利代理机构 广州市科丰知识产权代理事务所(普通合伙) 44467代理人 罗啸秋(51)Int.Cl.C12N 15/70(2006.01)C12N 15/67(2006.01)C12N 15/64(2006.01)C12R 1/19(2006.01) (54)发明名称一种大肠杆菌中高效表达禽腺病毒Fiber-2蛋白的方法(57)摘要本发明属于生物工程技术领域，公开了一种大肠杆菌中高效表达禽腺病毒Fiber ‑2蛋白的方法。
分别以PET ‑21a ‑GX ‑1‑fiber2质粒和PXMJ19‑C1786T ‑hexon(T7)质粒为模板，通过设计的引物进行扩增，得到Fiber ‑2目的片段和PXMJ19‑C1786T ‑T7载体片段；然后进行同源重组，得到重组质粒PXMJ19‑T7‑his ‑fiber2；最后转化至Shuffle T7‑B感受态细胞进行Fiber ‑2蛋白的表达。
本发明采用能提高外源基因拷贝数的质粒作为载体，构建PXMJ19‑T7‑his ‑fiber2重组质粒，来增强Fiber ‑2蛋白的可溶性表达。
权利要求书1页 说明书9页序列表16页 附图4页CN 112608932 A 2021.04.06C N 112608932A1.一种大肠杆菌中高效表达禽腺病毒Fiber ‑2蛋白的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)以PET ‑21a ‑GX ‑1‑fiber2质粒为模板，Fiber ‑2‑F，Fiber ‑2‑R为引物进行扩增，得到Fiber ‑2目的片段；(2)以PXMJ19‑C1786T ‑hexon(T7)质粒为模板，PXMJ19‑T7‑his ‑F，PXMJ19‑T7‑his ‑R为引物进行扩增，得到PXMJ19‑C1786T ‑T7载体片段；(3)将Fiber ‑2目的片段和PXMJ19‑C1786T ‑T7载体片段进行同源重组，得到重组质粒PXMJ19‑T7‑his ‑fiber2；(4)将重组质粒PXMJ19‑T7‑his ‑fiber2转化至Shuffle T7‑B感受态细胞进行Fiber ‑2蛋白的表达；所述引物序列分别如下：Fiber ‑2‑F：AAGAAGGAGATATAATGCTGCGTGCGC；Fiber ‑2‑R：AGCCGGATCTCATCAGTGGTGGTGG；PXMJ19‑T7‑his ‑F：CCACCACCACTGATGAGATCCGGCT；PXMJ19‑T7‑his ‑R：CACGCAGCATTATATCTCCTTCTTA；所述PET ‑21a ‑GX ‑1‑fiber2质粒的核苷酸序列为SEQ ID NO:6；所述PXMJ19‑C1786T ‑hexon(T7)质粒的核苷酸序列为SEQ ID NO:7。
禽腺病毒血清2_型分离鉴定及感染SPF_鸡发病模型建立
收稿日期：2023-03-29基金项目：国家重点研发计划项目（2022YFD1801000）；“十四五”广东省农业科技创新十大主攻方向“揭榜挂帅”项目（2022SDZG02）；广东省农业科学院创新基金-产业专项（202144）；云南省廖明专家工作站（202105AF150077）广东农业科学2023，50（7）：146-155Guangdong Agricultural SciencesDOI:10.16768/j.issn.1004-874X.2023.07.015胡鑫宇，孙敏华，曾庆航，谢梓民，袁朝霞，廖明.禽腺病毒血清2型分离鉴定及感染SPF 鸡发病模型建立［J］. 广东农业科学，2023，50（7）：146-155.禽腺病毒血清2型分离鉴定及感染SPF 鸡发病模型建立胡鑫宇1，2，孙敏华2，曾庆航1，2，谢梓民2，袁朝霞1，廖 明2（1.仲恺农业工程学院动物科技学院，广东 广州 510225； 2.广东省农业科学院动物卫生研究所/广东省畜禽疫病防治研究重点实验室/农业农村部禽流感等家禽重大疾病防控重点实验室，广东 广州 510640）摘 要：【目的】建立禽腺病毒血清2型（FAdV-2）的发病模型，为评价FAdV-2的免疫原性和疫苗有效性提供参考。
【方法】对疑似禽腺病毒感染的样品进行分离鉴定，对分离株Fiber 基因和Hexon 基因序列进行遗传演化分析，使用DNAStar 和MEGA7.0软件对分离株和其他FAdV 代表株进行核苷酸和氨基酸同源性比较。
在确定分离到的病毒为FAdV-2后，通过动物实验分析分离株在不同感染途径和不同感染剂量下对6周龄SPF 鸡的致病性，筛选出建立FAdV-2血清型发病模型的最佳感染方式和最佳感染剂量。
【结果】从发病鸡组织样品中成功分离得到1株FAdV-2血清型毒株，命名为KM 株。
遗传演化分析表明，KM 株和GX01株同属于禽腺病毒Ⅰ群D 种中的FAdV-2血清型；同源性分析结果显示，KM 株和GX01株的Fiber 基因和Hexon 基因核苷酸序列同源性分别为98.9%和99.3%，推导出氨基酸同源性分别为98.9%和98.8%。
一起来航鸡感染禽4_型腺病毒的诊断
4532023一起来航鸡感染禽4型腺病毒的诊断何晖福建省农业农村厅福州350003摘要2021年9月，福建省某鸡场存栏的2000羽来航鸡出现大批量死亡，患鸡于35日龄发病，发病率约50%，病死率达70%，结合流行病学特点、病死鸡的剖检病变和病原学检测确定该鸡群感染禽4型腺病毒（FADV-4）。
关键词来航鸡禽4型腺病毒诊断文献标识码：B文章编号：1003-4331（2023）03-0101-02禽腺病毒（FADV）是一种能够感染鸡、鸭、鹅等家禽以及火鸡、雉鸡、野鸭、麻雀等野生禽类较为常见的传染病病原之一，病毒粒子无囊膜，直径大小为60~90nm，属于腺病毒科禽腺病毒属[1]。
根据抗原性的不同，禽腺病毒可分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ共3个群[2]，不同群在致病性、抗原性、血凝特性、血清学特性方面差异较大。
目前我国鸡群流行的Ⅰ群FADV主要是禽4型腺病毒[1]，该病毒主要侵害肉用仔鸡[3]，是引起心包积液-肝炎综合征（HPS-IBH）的主要病原[4]。
2021年9月初，福建省某养殖场饲养的35日龄来航鸡出现突然死亡，患鸡翅膀下垂，羽毛蓬松，呼吸困难，剖检可见发病鸡主要表现为心包积液、肝脏肿大出血并伴有坏死点或出血点等。
无菌采集病死鸡的心脏、肝脏等脏器进行病原学检测，最终确定该场鸡群为禽4型腺病毒感染，现将该病的诊治总结报道如下。
1发病情况与临床症状2021年9月初，福建省某来航鸡养殖场的雏鸡饲养至35日龄时开始发病，患鸡主要表现为翅膀下垂，羽毛蓬松，呼吸困难，排黄绿色稀粪，发病3d后开始出现大量死亡，发病率近50%、病死率高达70%。
部分患鸡临死前表现角弓反张等神经症状。
2剖检病变剖检病死鸡，可见心肌肿大，有明显的淡黄色且澄清的心包积液；肝脏充血肿大，表面有坏死点或出血点；肺脏瘀血水肿；肾脏肿大，有尿酸盐沉积；气囊壁浑浊，气管内有黏性分泌物。
3病原检测无菌采集病死鸡的心脏、肝脏、肺脏、肾脏等组织，剪碎、加PBS研磨并反复冻融后，离心取上清，按照核酸提取试剂盒说明书提取核酸。
山西中部4_型禽腺病毒遗传进化及其分离毒株致病性分析
doidoi:10.3969/j.issn.1002-2481.2022.04.20山西农业科学2022，50（4）：591-597Journal of Shanxi Agricultural Sciences山西中部4型禽腺病毒遗传进化及其分离毒株致病性分析刘璐，王晨，张丹，高宇，程宇，谭世明，梁立滨，马海利（山西农业大学动物医学学院，山西太谷030801）摘要：为了解山西地区4型禽腺病毒（FAdV-4）的遗传进化情况及其致病性，为山西省FAdV-4的疫苗研发和防控策略制定提供理论依据，收集了山西中部地区太谷、祁县、介休、临汾、长治、交城、柳林等养鸡场11份疑似心包积水-肝炎综合征病鸡的肝脏组织样本，采用PCR方法进行FAdV-4检测，对阳性样品进行FAdV-4的Hexon 和Fiber-2蛋白的全基因序列扩增，将处理后的阳性病料接种于鸡肝癌细胞（LMH）进行病毒分离和PCR鉴定，测定分离毒株的TCID50，研究病毒对SPF鸡胚和SPF鸡的致病性。
结果表明，11份样品的FAdV-4检测均为阳性，经比对，11份样品中FAdV-4的Hexon和Fiber-2基因序列相同，与GenBank中不同FAdV分离株的同源性分别为67.7%~100%和43.2%~100%，其中，与GenBank中的基因C型FAdV-4毒株处于同一个分支，同源性分别为98.4%~100%和95.9%~100%，说明11份疑似样品均存在FAdV-4感染，且为同一毒株。
分离获得的1株FAdV-4（命名为SX2020）可在LMH细胞中良好复制并产生明显的细胞病变，对SPF鸡胚及SPF鸡均有致病性，感染后出现FAdV-4典型病变，并且病毒可以在感染鸡体内持续向外排毒达21~28d。
关键词：4型禽腺病毒；分离与鉴定；遗传进化；致病性中图分类号：S855.3文献标识码：A文章编号：1002-2481（2022）04-0591-07Analysis of Genetic Evolution of Avian Adenovirus Type4from Central Shanxi Province and Pathogenicity of Isolated Strain of the AdenovirusLIU Lu，WANG Chen，ZHANG Dan，GAO Yu，CHENG Yu，TAN Shiming，LIANG Libin，MA Haili（College of Veterinary Medicine，Shanxi Agricultural University，Taigu030801，China）Abstract：In order to understand genetic evolution and pathogenicity of avian adenovirus type4(FAdV-4)in Shanxi province,provide theoretical foundation for research and development of vaccines and prevention-control strategy of FAdV-4in Shanxi province,in this study,11liver samples of chicken suspected of hydropericardium hepatitis syndrome were collected from Taigu,Qixian,Jiexiu,Linfen,Changzhi,Jiaocheng and Liulin in central Shanxi province,and FAdV-4were detected by PCR method.The Hexon of FAdV-4and gene sequence amplification of Fiber-2protein of the positive samples were conducted.The positive samples treated were inoculated into chicken hepatoma cells(LMH)for virus isolation and PCR identification.The TCID50of the isolated strain was determined,and pathogenicity of the isolated virus to SPF chicken embryos and SPF chicken was studied.The results showed that all11samples were positive for FAdV-4,and the sequences of Hexon and Fiber-2genes of FAdV-4in11samples were the same.The homology of Hexon and Fiber-2gene with different FAdV isolates in GenBank was 67.7%-100%and43.2%-100%.They were in the same branch with FAdV-4C strain in GenBank,and the homology with FAdV-4was98.4%-100%and95.9%-100%,indicating that all the11suspected samples were infected by FAdV-4,and they were the same strain.One isolated FAdV-4virus(named SX2020)could replicate well in LMH cells and produce obvious cytopathic changes(CPE).The virus was pathogenic to SPF chicken embryos and SPF chicken,and the typical lesions of FAdV-4appeared after infection.The virus could continuously excrete outward in infected chicken for up to21-28d.Key words：Avian adenovirus type4（FAdv4）;isolation and identification;genetic evolution;pathogenicity禽心包积水-包涵体肝炎综合征（Hydroperica-rdium syndrome-inclusion body hepatitis，HPS-IBH）是一种主要由4型禽腺病毒（Fowl Adenovirus-4，FAdV-4）引起的高度传染性和高死亡率的新型家禽疾病[1]。
禽腺病毒4 型ZZ 株的分离鉴定及系统进化分析
E-mail:1956089861@ qq. com 通信作者:张改平(1960-) ,男,河南内黄人,研究员,中国工程院院士,博士,主要从事动物免疫学研究。
收 稿 日 期 :2020 - 06 - 04 基金项目:国家 重 点 研 发 计 划 重 点 专 项 ( 2016YFD0500800 ) ; 河 南 省 重 点 研 发 与 推 广 专 项 ( 科 技 攻 关 ) ( 202102110100,
202102110248) ;农业部动物疫病观测监测项目( ZX06S1701) 作者简介:金前跃(1982-) ,男,浙江建德人,助理研究员,博士,主要从事动物疫病的监测与防控。
Isolation and Phylogenetic Analysis of Fowl Adenovirus Serotype 4 Isolate ZZ
JIN Qianyue1,2,3 ,WANG Yinbiao4 ,CHAI Yongxiao1,2,5 ,LU Qingxia1,2,3 ,LI Peng6 , GUO Zhenhua1,2,3 ,XING Guangxu1,2,3 ,DENG Ruiguang1,2,3 ,ZHANG Gaiping1,2,3,7
蛋鸡腺病毒病的诊断及防控措施
收稿日期：2021-06-07作者简介：张春飞（1971-），男，湖北浠水人，副高级兽医师，主要从事畜牧兽医技术推广工作，（电话）189********。
腺病毒属腺病毒科腺病毒属，最早于1956年被正式命名，目前已经成为家禽常见传染病之一。
禽腺病毒属的血清型不同于其他属腺病毒，其不仅感染禽类，而且会引起禽类各种疾病。
根据禽腺病毒群特异性抗原的不同可将禽腺病毒分为3个类群：Ⅰ群禽腺病毒包括传统的禽腺病毒，其中从鸡群中分离的Ⅰ群禽腺病毒共有12个血清型，是鸡、鸭、鹅等禽类常见的传染性病原；Ⅱ群禽腺病毒与Ⅰ群禽腺病毒无抗原相关性，主要代表毒株有火鸡出血性肠炎病毒、大理石脾病毒及鸡大脾病毒等；Ⅲ群禽腺病毒主要是从具有产蛋下降综合征症状家禽体内分离得到的一群腺病毒，目前只有一个代表株成员，即蛋鸡产蛋下降综合征病毒［1］。
1流行现状及临床表现多数禽腺病毒可在健康家禽体内存在并复制，不表现临床症状或症状非常轻微。
但近几年来，蛋鸡腺病毒呈突变趋势，黄冈市及周边蛋鸡场时有该病发生，表现为产蛋率突然下降，急性感染且死亡率很高，临床解剖可见典型的心包积水和包涵体症状，临床上分离的病死鸡病原大多为血清4型腺病毒［2］。
鸡产蛋下降综合征是由Ⅲ群禽腺病毒引起的一种以产蛋母鸡产蛋率下降为典型特征的传染病。
随着疫苗的推广应用，该病的发病率有所下降。
病鸡一般无明显的病理变化，一般表现为卵巢发育不良和输卵管萎缩，少数病鸡出现子宫黏膜水肿，子宫腔内有灰白色的渗出物，卵泡变性或出血等现象。
Ⅲ群禽腺病毒的自然宿主有鸭、鹅和多种鸟类，但这些宿主感染后都不表现临床症状。
蛋鸡感染后会引起产蛋下降综合征，一般多发于24~26周龄。
雏鸡也可以感染，但不表现临床症状，生长发育也不受影响，血清抗体为阴性，直到开产前其血清抗体才转为阳性，进入产蛋期后产蛋率下降达20%~30%，甚至可达50%。
同时畸形蛋的数量增加，鸡蛋品质下降，种蛋的孵化率下降，减蛋的持续时间为4~10周，随后可逐渐恢复。
3株禽2型副黏病毒的分离鉴定与生物学特性初步分析开题报告
3株禽2型副黏病毒的分离鉴定与生物学特性初步分
析开题报告
一、研究背景
禽2型副黏病毒（Avian Adenovirus 2，AAv2）是一种禽类常见病原体，属于腺病毒科腺病毒属。
AAv2具有典型的腺病毒粒子形态，具有较强的传染性和致病性。
在禽类中引起多种疾病，如呼吸道疾病、消化系统疾病、神经系统疾病等。
近年来，随着养殖业的发展，AAv2病毒不断增强了对禽类的危害，对养殖业造成了很大的经济损失。
目前，研究表明AAv2存在着不同的血清型和病毒亚型，其传染性和致病性等生物学特性也存在差异。
因此，研究AAv2的分离鉴定和其生物学特性，对加深我们对该病毒的认识，制定出相应的防控和治疗措施具有重要意义。
二、研究内容
1.分离鉴定AAv2：通过分离方法和病毒学鉴定等技术，从不同的禽类样品中分离得到3株不同的AAv2病毒，并进行鉴定和检测。
2.基本生物学特性研究：对这3株AAv2病毒进行体外和体内实验，研究其生长特性、传染性和致病性等基本生物学特性。
3.毒株鉴定：通过PCR、RT-PCR等技术对这3株分离的AAv2病毒进行毒株鉴定，确定其基因组序列和分型，分析其毒力和免疫原性等特性。
三、研究意义
本研究将对于禽2型副黏病毒的分类、分型和病毒特性等问题进行一系列的研究，为加深我们对该病毒的认识，并制定出相应的防控和治疗措施提供了重要的科学依据。
同时，本研究还有助于提高我国禽类养殖业的健康水平，促进养殖业的可持续发展。
Ⅰ型禽腺病毒在我国鸡群中的流行情况和防控措施
2～3w。
解剖可见肝肿大，边缘钝厚，表面有大小不等出血点、条、斑，黄白色点状、斑状坏死灶，色泽变淡。
肾脏肿大，胸腺充血，也可见少量心包积液（图2）。
禽腺病毒可以垂直传播和水平传播。
腺病毒通过孵化的蛋垂直传播，雏鸡1日龄就可能分离到病毒，但正常情况下3周龄后开始排毒，4～6周龄排毒高峰。
蛋鸡转群时排毒量最大在5～9周龄，但在14周后仍可排泄70%，在一只鸡上经常可分离到2～3个血清型的病毒。
当腺病毒常在时，约在产蛋高峰前后有两次排毒期，大概由于高峰产蛋作为一种应激或高水平激素引起病毒活化，这可通过种蛋最大限度的传给下一代。
病毒还可在粪便、气管、鼻粘膜以及肾脏中存在，因此病毒可通过各种排泄物水平传播传播，其中粪便中病毒的滴度最高。
主要是通过接触带毒的粪便传播本病，水平传播速度比较缓慢。
图3 病毒分离接种鸡胚病变图A:心包积液肝炎综合征病料接种SPF鸡胚；B：包涵体肝炎病料接种SPF鸡胚（二）分子生物学检测1.目的基因的扩增。
从收集的样品中，采用试剂盒提取DNA，使用设计的针对禽腺病毒Hexon基因的特异性引物，进行PCR 检测，1%琼脂糖凝胶电泳，结果显示样品中均可以扩增出830bp左右的I型禽腺病毒Hexon基因目的性基因片段(图4)。
图4 禽腺病毒核酸电泳结果M：DNA marker； 泳道1-6：样品PCR结果； 泳道7：阳性对照； 泳道8：阴性对照。
2.目的基因测序分析。
对待检样品的PCR产物送金斯瑞生物技术有限公司进行基因测序分析，进化树显示，样本中分离的禽腺病毒属于两个基因型(图5)。
图1 心包积水肝炎综合征病鸡解剖症状图2 包涵体肝炎病鸡解剖症状31图5 各分离株Hexon基因序列与参考基因序列进化树分析（Neighbor-joining，1000 replicates）三、防治加强鸡场生物安全的控制是防治该病关键。
经调查发现，发病鸡群多数发生在养殖密度大的地区和饲养时间长的养殖场，这些鸡场无有效的生物安全措施，环境污染严重。
禽腺病毒的分离鉴定及LMH细胞适应毒的生物学特性研究
禽腺病毒的分离鉴定及LMH细胞适应毒的生物学特性研究陈玲;张兵;宋亚芬;刘月焕;蒋桃珍【摘要】To isolate and identify the virus from a case of sick chickens with hydropericardium syndrome. The suspected sample was inoculated on LMH for viral isolation and then passaged for 15 times, and the pathogenicity of C5 and C15 were performed on 3-week SPF Chickens. A serotype 4 fowl adenovirus was identified by cytopathology effect on LMH, serum neutralization, sequence analysis of Hexon and pathogenicity regression test. The virus could adapt to LMH after three blind passages, and LMH infected with isolate strain showed obvious cytopathology effects, the virus titer of the 10th passage was up to 107.4TCID50/0.1ml after 72 h inoculated. 3-week SPF Chickens inoculated with C5 and C15 had typical clinical symptoms and specific autopsy pathological changes with a morbidity of 100％ and 70％, respectively. The study demonstrated that the serotype 4 fowl adenovirus could cause high mortality to SPF chickens, but after continuous passage on LMH, the mortality rate was reduced.%为了对采集自北京平谷某养殖场发病鸡中出现心包积液综合征症状的病料进行病毒分离和鉴定,将病料接种LMH细胞进行病毒分离,并在LMH上连续传代,取C5和C15代细胞毒分别接种3周龄SPF鸡进行致病性试验.根据分离病毒在LMH上的CPE特征、病毒血清中和试验、Hexon基因序列比对分析、SPF鸡致病性回归试验,表明从发病鸡病料中分离的一株病毒为血清4型禽腺病毒;病毒在LMH细胞盲传3代后,就能很好地适应细胞培养,出现禽腺病毒典型的CPE;培养至第10代,病毒在接种后72 h,病毒含量即可达到107.4 TCID50/0.1mL的峰值滴度;接种细胞毒的SP F鸡出现4型禽腺病毒导致的典型临床症状和特异性剖检病理变化,两组接种鸡的死亡率分别为100％和70％.结果表明,研究分离到的4型禽腺病毒毒株对SP F鸡具有高致死率,但病毒经过细胞连续传代后对鸡的致死率降低.【期刊名称】《中国兽药杂志》【年(卷),期】2018(052)006【总页数】6页(P1-6)【关键词】禽腺病毒;鸡肝癌细胞;Hexon基因;致病性【作者】陈玲;张兵;宋亚芬;刘月焕;蒋桃珍【作者单位】中国兽医药品监察所,北京100081;中国兽医药品监察所,北京100081;中国兽医药品监察所,北京100081;北京市农林科学院,北京100097;中国兽医药品监察所,北京100081【正文语种】中文【中图分类】S852.65禽腺病毒属(Aviadenovirus)原称为I群禽腺病毒(Group I avian adenovirus)，主要宿主为鸡、火鸡和鹅。
禽腺病毒AH株的分离与鉴定
禽腺病毒AH株的分离与鉴定赵瑞宏;张丹俊;戴银;沈学怀;潘孝成;胡晓苗;侯宏艳;周学利【摘要】为获得禽腺病毒毒株,将临床疑似I群禽腺病毒感染病例的肝组织,通过接种SPF鸡胚进行病毒分离,用PCR方法对分离产物进行扩增,将PCR产物进行序列测定,对测定的序列在NCBI网上进行分析,结果显示,从病料可分离出病毒,用PCR 方法特异性地扩增出了与设计片段大小相一致的片段,序列分析表明,分离株序列与禽腺病毒SD1-15分离株序列同源性99％,说明分离株为I群禽腺病毒血清4型.【期刊名称】《中国兽医杂志》【年(卷),期】2017(053)010【总页数】4页(P45-47,中插3)【关键词】禽腺病毒;分离;鉴定【作者】赵瑞宏;张丹俊;戴银;沈学怀;潘孝成;胡晓苗;侯宏艳;周学利【作者单位】安徽省农业科学院畜牧兽医研究所,安徽合肥230031;安徽省农业科学院畜牧兽医研究所,安徽合肥230031;安徽省农业科学院畜牧兽医研究所,安徽合肥230031;安徽省农业科学院畜牧兽医研究所,安徽合肥230031;安徽省农业科学院畜牧兽医研究所,安徽合肥230031;安徽省农业科学院畜牧兽医研究所,安徽合肥230031;安徽省农业科学院畜牧兽医研究所,安徽合肥230031;安徽省农业科学院畜牧兽医研究所,安徽合肥230031【正文语种】中文【中图分类】S855.3Ⅰ群禽腺病毒病最早于1987年发生于临近巴基斯坦卡拉奇的安格拉地区，因此又称“安格拉病”。
在短短一年内，本病迅速传播到巴基斯坦地区的多数肉仔鸡群。
我国1988年山东即有Ⅰ群禽腺病毒的报道[1]，近两年病毒毒力增强，能引起3～6周龄鸡群发病，病死率超过30%，2015年，安徽淮北发现有鸡群感染Ⅰ群禽腺病毒，2016年蔓延至淮南、合肥等地区，现将该病实验室检验情况报告如下。
1.1 材料 UNlQ-10柱式病毒基因组DNA抽提试剂盒，购自上海生工生物工程技术服务有限公司；2×Taq Mastermix和MarkerⅦ,购自天根生化科技(北京)有限公司；0.22 μm一次性滤器，购自Millipore公司；其他化学试剂均为国产分析纯。
不同宿主源禽腺病毒分离株对雏鸡的致病性比较
不同宿主源禽腺病毒分离株对雏鸡的致病性比较孙锦; 黄兵; 李珍祖; 杨军; 王可洲; 李云龙【期刊名称】《《家禽科学》》【年(卷),期】2008(000)001【摘要】鸭腺病毒1型病毒可作为优良的重组疫苗载体。
为了筛选低毒力的鸭腺病毒1型病毒毒株,分别用病毒QU株和HS株对20日龄SPF鸡进行攻毒,4d后检测其血清生化指标的变化情况并与对照组进行比较,同时取其肝脏进行病理组织学观察。
发现QU组的各项生化指标均没有明显变化,肝组织形态与对照组相同;HS 组的谷草转氨酶、碱性磷酸酶、胆碱脂酶和血淀粉酶显著降低,总蛋白、白蛋白和球蛋白极显著降低,并且肝细胞大量坏死。
结果表明,HS株病毒主要引起鸡肝脏和胰腺的损伤,具有较强的致病性;QU株病毒对雏鸡的生理状况几乎没有影响,毒力很弱,适合作为重组疫苗载体。
【总页数】3页(P4-6)【作者】孙锦; 黄兵; 李珍祖; 杨军; 王可洲; 李云龙【作者单位】山东师范大学生命科学学院济南 250014; 山东省农业科学院家禽研究所济南 250023; 山东中医药大学第二附属医院济南 250100; 山东省医学科学院实验动物中心济南 250002【正文语种】中文【中图分类】S852.65【相关文献】1.不同禽源贝氏隐孢子虫分离株对鹌鹑致病性的比较研究 [J], 高庚渠;张龙现;齐萌;王岩;徐利纳;王荣军;黄磊;张素梅;菅复春;宁长申2.不同地区101个禽源性大肠杆菌分离株的致病性试验 [J], 高崧;吴长新3.2株胶东地区Ⅰ群禽腺病毒分离株的致病性试验 [J], 董振杰;刘东;魏建平;佘锐萍4.2株鸡源血清4型禽腺病毒的分离鉴定及致病性研究 [J], 祝常椿;钱焱;满成连;刘源;杜银平;秦涛;陈素娟;彭大新5.2株贝氏隐孢子虫鸡源分离株对雏鸡的致病性比较 [J], 高庚渠;齐萌;黄磊;张素梅;马磊磊;菅复春;宁长申;张龙现因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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禽腺病毒家禽分离株的生物学特性张明明,王小辉,秦爱建(扬州大学兽医学院,江苏扬州225009)摘要:为了解禽腺病毒(FA V)家禽分离株的致病性,通过病毒凝集试验、电镜观察、细胞病变试验以及接种鸡胚或鸡体,研究了3株A型F AV分离株的生物学特性。
结果表明,分离株具有腺病毒的典型形态,不能凝集鸡的红细胞;不引起鸡胚成纤维细胞的病变,可导致鸡胚肾细胞变圆、折光性增强;对SPF鸡胚无明显致病作用;以1.0×1010T CID50的剂量,经皮下注射和口服2种途径接种1日龄的SPF鸡,攻毒后未出现明显的临床症状,体重和免疫器官的重量基本不受影响,除肝脏出现一过性病变,大部分脏器基本无病变。
因此,FA V分离株致病性低,生物安全性高,可能是较好的FA V载体。
关键词:A型禽腺病毒;生物学特性;致病性中图分类号:S852.65+9.1 文献标识码:A 文章编号:0529-6005(2010)10-0007-03 Biological characteristics of fowl adenovirus strains isolated from poultryZH ANG Ming-ming,WANG Xiao-hui,QIN Ai-jian(Co llege of Veterinary M edicine,Yangzhou U niver sity,Yang zhou225009,China)A bstract:To understand the patho genicity of three strains of fo w l adeno virus(FAV)subtype A isola-ted from poultry,some biolog ical characteristics w ere explored by hem agglutination test,electron micros-copy,cy to pathic test and inocula tion in chicken embryo s o r chickens.These isolates had typical shape of adenovirus and could not ag glutinate chicken red bloo d cells.They did not cause patholog ical changes in chick embry o fibro blasts,but the chicken embryo kidney cells became ro und w ith enhanced refractivity. And SPF chicken embry os we re also no t affected.After the1-day-old S PF chickens w ere subcutaneously or orally challenged w ith the isolate at the do se of1.0×1010TCID50,no obvious clinical sym ptom s ap-peared.A nd their bo dy weig ht and imm une o rgan w eight w ere no t affected.No lesions appeared in mo st org ans except temporary changes in liver.T herefo re,these FAV isolates have low pathogenicity and larg er bio-safe ty,and they m ay be better candidates for FAV vector.Key words:fow l adeno virus subtype A;biological characteristics;pathog enicityC orresponding author:QIN Ai-jian收稿日期:2010-04-14基金项目:国家高技术研究发展计划(2006AA10A205);江苏省高校自然科学重大基础研究项目(07KJA23021);国家科技攻关计划(2005DKA21205-8)作者简介:张明明(1982-),女,博士,研究方向为动物微生物学与免疫学,E-mail:s tealth.wings@通讯作者:秦爱建,E-mail:aij ian@yz 禽腺病毒(fow l adeno virus,FAV)属腺病毒科(Adenoviridae),是鸡、鸭、鹅等禽类常见的传染性病原体之一。
近年来,从鹦鹉、长尾鸭、肉鸡等禽类体内分离到了多种新的血清型FA V,某些病毒株还发生了变异[1-3]。
陈溥言提出鸡胚致死孤儿病毒(chicken em bry o le thal o rphan virus,CELOV)已污染我国研究用和疫苗生产用非免疫鸡胚[4]。
最retroviral sequences in th e chicken genome clos ely related toHPRS-103(subg rou p J)avian leukosis virus[J].Gen Virol,1999,80:261-268.[6] Ruis B L,Benson S J,Conk lin K F.Genome s tru cture and ex-p ression of the ev/J family of avian endogenou s viru ses[J].Virol,1999,73:5345-5355.[7] S acco M,H ow es K,Venugopal K.In tact E AV-H P endoge-nou s retrovirus in Sonn eratís jun gle fow l[J].Virol,2001,75: 2029-2032.[8] 殷震,刘景华.动物病毒学[M].2版,北京:科学出版社,1997:274-275.[9] 秦爱建,崔治中.用亲和层析法分离马立克氏病毒pp38基因产物[J].生物工程学报,1994,10:239-243.[10]杨玉莹,秦爱建,顾玉芳,等.鸡内源性类J亚群禽白血病病毒gp85基因的克隆及分析[J].病毒学报,2005,25(1):54-59.[11]Sambrook J,Fritsch E F,M aniatis T.分子克隆实验指南[M].金冬雁,黎孟枫,等译.2版.北京:科学出版社,1996: 19-22,45-55,464-467.7 C hinese Journal of Veterinary M edicine 中国兽医杂志2010年(第46卷)第10期近,周斌等用随机引物PCR 方法从鸭肝炎病毒鸡胚尿囊液种毒中扩增出了污染的CE LOV DNA 片段,证实了这种污染的严重性[5]。
本试验通过血凝试验、电镜技术、细胞病变以及动物试验等方法,研究了3株不同禽源的FAV 分离株的病毒特性、形态特征和致病特点等,以期为了解其致病性和研制FAV 基因工程疫苗提供条件。
1 材料与方法1.1 材料 FAV 分离株FAV I -C4-YZ0605、FA -V I -D4-YZ0605和FAVI -G24-YZ0605分别采自江苏省扬州市活禽市场外表健康的鸡群、鸭群和鹅群,其分离、鉴定和鸡胚扩增由江苏省动物预防医学重点实验室完成。
SPF 鸡胚购自山东省无特定病原种鸡场,由江苏省动物预防医学重点实验室孵化至使用日龄。
1日龄SPF 鸡购自中牧集团南京药械厂。
鸡胚成纤维细胞(CEF )和鸡胚肾细胞(C EK )生长所需的基础培养基DM EM 购自Gibco 公司。
透射电镜由扬州大学测试中心提供。
1.2 病毒形态观察 FAV 鸡胚尿囊液中加入1/10体积的氯仿,充分混匀,3000r /min 离心5m in后,吸取上清,重复此步骤直至分层之间无白色沉淀。
然后将上清装入透析袋中,外层包裹PEG -6000浓缩至一定体积后,收集到指形管中,加入1/10体积的氯仿继续抽提直至分层之间无白色沉淀。
取少量上清,负染后,透射电镜观察病毒的形态结构。
1.3 细胞致病性试验 常规方法制备CEK 或C EF 单层细胞。
用DM EM 培养基1∶100稀释FAV 尿囊液,将0.2m L 病毒稀释液分别接种24孔细胞培养板上的CEK 或CEF 单层细胞,同时设未接种对照。
37℃5%CO 2培养箱吸附2h 后,弃去病毒吸附液,补加含1%新生牛血清的DM EM ,继续培养5d ,每天于倒置显微镜下观察细胞病变。
吸取接种C EF 的病毒上清,重新接种新鲜的CEF细胞,按上述方法连续传5代。
1.4 鸡胚致病性试验 分别将0.2mL FAV 尿囊液通过绒毛尿囊腔接种9日龄SPF 鸡胚,置37℃温箱孵育5～6d 后收获尿囊液。
通过此方法连续传代以提高病毒滴度,同时观察病毒对鸡胚生长的影响及其致病性。
1.5 鸡体致病性试验 FAVI -G24-0605株尿囊液TCID 50的测定参照文献[6]进行。
以每只鸡1.0×1010TCID 50的剂量,分别通过皮下和口服2种途径各接种于10只1日龄SPF 鸡,并设生理盐水阴性对照。
接种后,每天观察鸡只的表现,并分别于10日龄、20日龄和30日龄各取2只不同接种途径的小鸡,称量活体重,剖杀后取胸腺、腔上囊、脾等免疫器官称重,并取心、肝、肺、肾、腔上囊等器官制作病理切片,观察组织病变情况。
2 结果2.1 病毒形态 经透射电镜观察FAV 分离株,可以观察到球形、无囊膜、直径为70～80nm 的病毒粒子,具有腺病毒典型的二十面体结构,符合腺病毒的形态特征。
图1为FAVI -G24-0605分离株在电镜下的形态。
图1 禽腺病毒FAVI -G24-YZ0605分离株的电镜形态A :13000×;B :19000×2.2 FAV 分离株在CEK 和CEF 上的细胞病变 FAVI -C4-YZ0605、FAVI -D4-YZ0605和FAVI -G24-YZ0605均不能引起CEF 细胞的眼观病变,细胞生长良好;在接种24h 左右,CEK 细胞开始出现细胞病变,表现为细胞变圆、聚集、折光性增强等,对照CEK 细胞则看不到类似的细胞病变,只有少量因衰老或制备原因而死亡的细胞碎片(见前插彩版图2)。
2.3 FAV 分离株对鸡胚的致病性 鸡胚接种病毒后,未见出血等眼观病变,也未造成鸡胚生长发育迟缓。