结核菌快速测定

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执业护士考试基础护理：结核菌素试验（OT试验）

结核菌素试验（OT试验）是利⽤结核菌体蛋⽩来测定机体有⽆过敏反应，以确定是否受过结核菌感染，对诊断结核感染具有特异性，判断是否需要接种卡介苗或接种卡介苗是否成功。

受过结核菌感染者，此试验呈阳性反应，但不表明有活动性结核病灶。

未受感染或曾受感染但时间已久，反应消失者，试验呈阴性反应。

⼀般婴幼⼉⼤都未受过结核菌感染，多呈阴性反应。

若呈阳性反应，则表⽰有活动性结核灶，应做进⼀步检查。

在卡介苗预防接种前，应先做结核菌素试验，以确定接种对象。

只有未感染过结核，结核菌素试验阴性者，⽅可接种卡介苗。

凡结核菌素试验阳性者，表⽰已受过结核菌素感染，对结核菌具有免疫⼒，故不必再接种卡介苗。

⼀、试验液的配制⽤旧结核菌素原液（每ml原液含10万结核菌素单位），以⽣理盐⽔稀释成1：100、1：1000、1：10000三种不同浓度的溶液分别装于密封消毒瓶内保存在冰箱中备⽤。

在冰箱内放置6－8周仍有效。

但在常温下保存不超过⼀周。

试验液浓度由医⽣根据病情、年龄决定。

稀释⽅法。

1.取旧结核菌素0.1ml加⽣理盐⽔⾄10ml，为1：100稀释液。

2.取1：100稀释液0.1ml加⽣理盐⽔⾄1ml，为1：1000稀释液。

3.取1：1000稀释液0.1ml加⽣理盐⽔⾄1ml，为1：10000稀释液。

4.眼科应⽤时，可按上法继续稀释⾄所需浓度。

⼆、试验⽅法（⼀）原则先从低浓度⽪试液开始，若第⼀次试验结果为阴性，则可提⾼浓度再做第⼆次或第三次试验。

（⼆）⽅法⽪内注射0.1ml试验液。

开始宜⽤1：10000或1：2000溶液（可疑结核者⽤1：10000溶液，以免反应过强），注射后分别于24、48、72⼩时观察反应⼀次（以72⼩时的结果为准）。

如为阴性，则⽤⾼⼀级浓度再做试验，⾄1：100溶液为⽌。

如均为阴性，⽅能确定为阴性。

三、试验结果判断（⼀）阴性反应局部⽆反应，或只红⽽⽆硬结。

（⼆）阳性反应 1.局部稍红肿，硬结直径⼩于0.5cm者，为可疑阳性。

结核分枝杆菌快速检测中的新技术

维普资讯
结核分枝杆菌快速检测中的新技术
江苏省盐城市卫生防疫站厦门大学肿瘤和细胞工程国家专业实验室汤权夏宁邵综述审校
摘要
结撮分枝杆茵体外培养生长缓慢的特性和耐多药性给传统的实验室检测和薛物教瘩试验带来很
多麻烦，从而培结撮病的诊断和治疗增加困。随着现代实验技术的发展，难分子生物学技术、色谱技术以及计算机等技术在谊茵中的研究和应用已显示出极大的优势，不仅能够快速鍪定到算种和株的水平，还能够提供快速的药教试验的结果和考棱抗结棱治疗的效果，并可进行耐药基因的分析及分子流行病学调查，为人类最终控制并战胜培柱病提供了有效的手段。结核病是一古老的传染性疾病。据统计，结核病在过去２０中致使ｌ亿人死亡。据世界卫生０年Ｏ用，包括插人序列ＩＩ、Ｓ１直接重复序列Ｄ富古￣０Ｋ、Ｇ的多态性重复序列、Ｃ主要多态性前后排列的重复性序列以及（】Ｇ）与寡核苷酸序列… ，分子分型技
的水平【；２另外一种被广泛应用的方法是采用高教液相色谱（ＰＣ测定分枝杆菌细胞壁中具有种特ＨＬ）异性的分枝菌酸，根据峰高和峰相对保留时间鉴定
不同的种。
（）Ｎ－ＤＡ指纹技术
ＤＡＮ指纹技术是用来描述细菌基因组的一个
或多个独特性的技术。仅在结核杆菌染色体ＤＡＮ中发现插人序列Ｉ６１０以此为基础，Ｓ，０根据插人序
（）Ｌ－ｍ＇Ｃ
读数，ＢＣ￣Ｃ与ＡＩ系统的符合率达９％【９。Ｌｏｉｉｚ等将一段来源于非常保守的１．ｒＮｇｚ６ＡＳＲ基因区经惨饰过ＤＡ片段与野生型ＤＡ进行协同ＮＮ扩增，扩增后的产物通过凝胶电泳分析，光密度计用

结核菌素试验的方法

结核菌素试验的方法结核菌素试验又称PPD试验，是指通过对人接种旧结核菌素或接种纯结核杆菌蛋白衍生物来测定其对结核菌素有无迟发型变态反应的一种试验。

结核菌素试验主要有皮肤接种法和皮内注射法，其结果有以下几种情况：1.阴性（﹣）：局部无硬结或硬结平均直径<5mm。

2.阳性（﹢）：局部硬结平均直径为5～9mm。

3.中度阳性（﹢﹢）：局部硬结平均直径为10～19mm。

4.强阳性（﹢﹢﹢）：局部硬结平均直径为≧20mm，或硬结平均直径<20mm但局部出现水泡、破溃及淋巴管炎。

结核菌素试验也称为PPD试验，是用来辅助诊断结核病的检查项目之一。

结核菌素试验是需要先在皮内注射结核菌素纯蛋白衍生物，然后在48~72小时后观察注射部位皮肤是否出现硬结以及出现的硬结大小，来协助判断机体是否感染结核分枝杆菌的一种检验方法。

通过测量皮试处皮肤硬结直径大小、观察周围皮肤红晕等情况来进行结果判读，可分为以下几种情况。

阴性（-）：硬结直径＜5mm。

阳性（+）：硬结直径为5~9 mm。

中度阳性（++）：硬结直径为10~19mm。

强阳性（+++）：硬结直径≥20mm或虽不足20mm但局部皮肤出现双圈、水疱、坏死及淋巴管炎。

异常情况指标阳性提示机体可能既往感染过结核分枝杆菌或目前存在活动性结核病。

指标阴性多提示机体未感染过结核分枝杆菌。

但对于处于结核感染早期的患者，PPD试验也表现为阴性，有时需要结合其他检查进一步明确。

注意事项检查结果可能会受到患者病情、精神状态、检查操作等因素的影响。

检查期间应注意以下几方面。

检查前检查前注意保持前臂内侧皮肤的清洁，不要涂抹化妆品。

检查前不需要空腹。

如有任何已知的过敏症状（尤其对蛋白质），受过结核疫苗接种，或者曾经被诊断为结核病，都应该及时告诉医生。

检查中医生会在前臂内侧皮肤进行注射，注射时会有轻微的痛感，通常可以忍受。

晕针患者需要有家属陪同，并应提前告知医护人员。

检查后保持注射部位皮肤干燥，切勿挤压或刮擦试验部位。

YBS102结核分枝杆菌快速鉴定和药敏检测试剂盒(培养法)说明书

结核分枝杆菌快速鉴定和药敏检测试剂盒（培养法）说明书【产品名称】通用名称：结核分枝杆菌快速鉴定和药敏检测试剂盒（培养法）商品名称：结核分枝杆菌快速鉴定和药敏检测试剂盒（培养法）英文名称：Kit of identification and drug sensitiveity of Mycobacterium tuberculosis【包装规格】10人份/盒【预期用途】结核分枝杆菌鉴定和药敏测定。

【检验原理】采用24孔微孔板（本公司专用），分枝杆菌快速变色液体培养基营养丰富，含有多种促进分枝杆菌生长的营养素能促进分枝杆菌生长，抑制剂能抑制其他细菌和真菌生长的抗生素，但不影响分枝杆菌生长生长，当鉴定试剂或药物能抑制结核分枝杆菌生长时，变色剂不发生氧化还原反应，不发生颜色变化；反之，当鉴定试剂或药物不能抑制结核分枝杆菌生长时，变色剂发生氧化还原反应，产生颜色变化。

【主要组成成份】链霉素(Streptomyin,SM))、异烟肼(Isoniazid,INH)、利福平(Rifampicin,RFP)、乙胺丁醇(Ethambutol,EB)、氧氟沙星(Ofloxacin,OFL)等。

【储存条件及有效期】包装后结核分枝杆菌快速鉴定和药敏检测试剂盒应贮存在环境温度2℃-8℃,干燥处。

试剂盒有效期为12个月。

【样本要求】用接种环刮取3-4周生长于罗-琼培养基（或其他培养基）上的菌落，置无菌磨菌瓶（含1-2滴10%吐温80）中。

旋紧瓶盖后旋涡混匀），用试剂A调其浊度为MacFarland No1一致（相当于1mg/ml）。

【检验方法】对照孔（1A、7A号孔）加试剂A198μl和菌液2μl，再加入试剂B 1μl，试剂C 50μl，鉴定孔（1B、7B号孔）加入试剂D5μl，菌悬液200μl，再加入试剂C50μl。

测试孔（2-6、8-12号孔）每孔加入200μl菌悬液，再加入试剂C50μl ，37℃培养，每天观察结果1次，当对照孔变色后，加入试剂B 1μl 于鉴定孔和各测试孔底部，37℃培养3小时，观察结果。

结核菌快速检测技术进展

1.前言从目前来看，结核病的发病率在最近几年内呈现出较为明显的上升趋势。

据世界卫生组织的统计数据来看，全球有超过20亿人不同程度感染了结核，并且每年还会出现890万新发结核菌病例，还有160万结核菌患者死亡[1]。

我国也是结核病高发国，发病人数居于全球第二，仅次于印度，每年会出现145万新发结核菌病例，还有20万结核菌患者死亡[2]。

通常而言，结核菌都是利用传统涂片镜检方法来予以检测，存在着较大的问题：培养时间需要60~90d ，且检出率不到35%[3]，给结核菌的诊断与治疗带来了较大的困难。

国外内医学界已经越来越重视结核菌快速检测技术，希望能够通过结核菌快速检测技术来提高结核菌的诊断率，以此达到尽快治疗的效果。

本文就结核菌快速检测技术进行进展。

2.液体培养技术在液体培养基中，结核杆菌的生长速度较快，且液体培养仅需要简单的操作设备即可，方法原理简单，世界卫生组织大量鼓励全球中低收入国家采用液体培养方法。

（1）分枝杆菌快速手工培养技术将荧光指示器镶嵌在肉汤培养基试管底部，若指示器发出橙色荧光，那么就说明存在着结核菌，通过对比含抗结核药管与生长对照管的荧光情况就可获得细菌药敏情况与生长情况。

分枝杆菌快速手工培养技术检测精确（检出率高于90%），方法有效、简单，只需7~14d 就可得到检测结果[4]。

（2）The BACTEC MGIT960自动培养技术The BACTEC MGIT960自动培养技术的检测原理与分枝杆菌快速手工培养技术相似，但需要由仪器来自动控制荧光信号的读取，但是其最大的问题在于：一次性设备投入较大，应用面较窄[5]。

（3）The Bac T/Alert 3D 系统技术The Bac T/Alert 3D 系统技术采用改良7H9 Middlebrook 肉汤培养基，将比色传感器镶嵌在试管底部，试管对二氧化碳（由细菌代谢产生）的检测灵敏度较高，试管颜色的变化可通过The Bac T/Alert 3D 系统技术来予以24h 实时持续检测，待试管的颜色变为黄色之后，那么说明确实存在着结核菌。

结核菌素(PPD)试验验

结核菌素(PPD)试验简介
定义：
• 中文名称：结核菌素试验 • 英文名称： tuberculin test • 定义：用于诊断结核菌感染所致IV型超敏反应的皮肤试验。对诊断活动性结核病和测定机体细胞免疫功能有参考意义。 • 应用学科：免疫学（一级学科）；应用免疫（二级学科）；免疫学检测和诊断（二级学科）
阴性：
• 结素试验阴性反应除提示没有结核菌感染外，还见于以下情况：结核菌感染后需4－8周有变态反应充分建立；在这变态反应前期，结素试验可为阴性。在应用糖皮质激素等免疫抑制剂者，或营养不良及麻疹、百日咳等病人，结素反应也可暂时消失。严重结核病和各种危重病人对结素无反应，或仅为弱阳性，这都是由于人体免疫力连同变态反应暂时受到抑制的结果；
结果分类：
③15 mm或更大：
1、无危险的结核杆菌接触者
2、结核菌素测试转换：指在2年期间增加了10毫米或以上（不论其年龄） 3、卡介苗免疫接种后，PPD试验呈阳性，一般硬结大小：>5mm， <15mm。
试验目的：
（1）为接种卡介苗提供依据，如结核菌素试验阳性时，表明体内已感染过结核菌，无需再接种卡介苗。阴性者是卡介苗的接种对象。（2）为测定免疫效果提供依据：一般在接种卡介苗3个月以后，应做结核菌素试验，了解机体对卡介苗是否产生免疫力。假如结核菌素阳性，表示卡介苗接种成功，反之需重新再进行卡介苗接种。（3）用于诊断与鉴别诊断：结核菌素
结素：
• 1、旧结素（old tuberculin，OT）是从生长过结核菌的液体培养基中提炼出来的结核菌代谢产物，主要含有结核蛋白。在人群中作普查时，可用1：2000的OT稀释液0.1ml（5IU），在左前臂屈侧作皮内注射，经48－72h测量皮肤硬结直径，如小于5mm为阴性，5－ 9mm为弱阳性（提示结核菌感染或非结核性分支杆菌感染），10－ 19mm为阳性反应，20mm以上或局部发生水泡与坏死者为强阳性反应。 • 2、结素的纯蛋白衍化物（purified protein derivative，PPD）为纯结素，不产生非特异性反应。PPD-RT23是由丹麦制造供应世界许多国家使用，已经取代OT。我国从人型结核菌制成PPD（PPD-C），又从卡介苗制成BCG-PPD，0.1ml为5IU，用于临床诊断，硬结平均直径≥5mm为阳性反应。 • 3、结素试验除引起局部皮肤反应外，还可引起原有结核病灶和全身反应。临床诊断一般使用5IU，如无反应，可在一周后再用5IU皮试（产生结素增强效应），若仍为阴性，大多可除外结核感染。

肺结核应该做哪些检查

肺结核应该做哪些检查?一、结核菌检查是确诊肺结核最特异性的方法,痰中找到结核菌是确诊肺结核的主要依据。

涂片抗酸染色镜检快速简便,在我国非典型分枝杆菌尚属少见,故抗酸杆菌阳性,肺结核诊断基本即可成立。

直接厚涂片阳性率优于薄涂片,为目前普遍采用。

荧光显微镜检查适合于大量标本快速检查。

无痰或儿童不会咳嗽,可采用清晨的胃洗液找结核菌,成人亦可通过纤支镜检查,或从其涮洗液中查找结核菌。

痰菌阳性表明其病灶是开放性的,,具有传染性。

若排菌量多(每毫升10万个以上),直接涂片易呈阳性,为社会传染源。

痰菌量较少(每毫升1万个以下),可用集菌法。

培养法更为精确,除能了解结核菌有无生长繁殖能力外,且可作药物敏感试验与菌型鉴定。

结核菌生长缓慢,使用改良罗氏培养基,通常需4~8周才能报告。

培养虽较费时,但精确可靠,特异性高,若涂片阴性或诊断有疑问时,培养尤其重要,培养菌株进一步作药物敏感性测定,可为治疗特别是复治时提供参考。

将标本在体外用聚合酶链反应(PCR)法,使所含微量结核菌DNA得到扩增,用电泳法检出。

1个结核菌约含1fgDNA,40个结核菌即可有阳性结果。

该法不必体外预培养,特异性强,2天即可出报告,快速、简便,并可鉴定菌型,不足之处是可能出现假阳性或假阴性。

血清学检查近年来已开展酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测结核抗体,用PCR 法检测分枝杆菌。

二、影像学检查胸部X线检查可以发现肺内病变的部位、范围、有无空洞或空洞大小、洞壁厚薄等。

X线对各类结核病变的透过度不同,通过X线检查大致能估计结核病灶的病理性质,并能早期发现肺结核,以及判断病情发展及治疗效果,有助于决定治疗方案。

必须指出,不同病因引起的肺内病变,可能呈现相似的X线影像,故亦不能仅凭X线检查轻易确定肺结核的诊断。

X线摄片结合透视有助于提高诊断的准确性,可发现肋骨、纵隔、膈肌或被心脏遮盖的细小病灶,并能观察心、肺、膈肌的动态。

肺结核的常见X线表现包括:纤维钙化的硬结病灶,表现为密度较高、边缘清晰的斑点、条索或结节;浸润性病灶,表现为密度较淡,边缘模糊的云雾状阴影;干酪样病灶,表现为密度较高、浓淡不一,有环形边界透光区的空洞等。

结核分枝杆菌的微生物学检查程序

结核分枝杆菌的微生物学检查程序结核分枝杆菌是一种引起结核病的病原菌，它具有潜伏感染和活动性感染两种状态。

为了准确诊断结核病，需要进行微生物学检查。

以下将详细介绍结核分枝杆菌的微生物学检查程序。

第一步：标本采集结核分枝杆菌的标本可以采集自患者的呼吸道、淋巴结、组织等部位。

常见的标本包括痰、胸腔积液、脑脊液等。

标本采集应严格遵循无菌操作原则，避免污染和细菌的死亡。

第二步：标本处理采集到的标本需要进行适当的处理，以提高分枝杆菌的检出率。

对于痰标本，应先进行离心，将上清液（上清液中含有较高浓度的分枝杆菌）分装入多个收集器中。

对于其他标本，如胸腔积液、脑脊液等，可以进行直接涂片或离心浓缩处理。

第三步：分枝杆菌培养分枝杆菌培养是诊断结核病的关键步骤。

常用的培养基有Lowenstein-Jensen（LJ）固体培养基、麦康奈尔（Middlebrook）液体培养基等。

将经过标本处理的标本接种到培养基上，并在适宜的温度（通常为35-37摄氏度）下培养2-8周。

培养期间需要定期观察菌落的形态，并进行常规的结核分枝杆菌鉴定。

第四步：分枝杆菌鉴定通过观察分枝杆菌的形态特征，如形状、颜色等，可以初步鉴定分枝杆菌。

进一步的鉴定需要进行生化试验，如尼氏染色、热酸洗脱法、硝酸盐还原试验等。

这些试验可以确定菌株是否为结核分枝杆菌。

第五步：药敏试验药敏试验用于检测结核分枝杆菌对抗结核药物的敏感性。

常用的药敏试验包括比值法（MIC测定）、比例法、临界浓度法等。

通过药敏试验可以确定分枝杆菌对抗结核药物的敏感性，以指导临床治疗。

第六步：核酸检测核酸检测是近年来发展起来的一种快速、准确的检测方法。

常用的核酸检测技术有PCR（聚合酶链反应）、LAMP（环介导等温扩增法）等。

通过检测结核分枝杆菌特定的基因序列，可以快速准确地诊断结核病。

综上所述，结核分枝杆菌的微生物学检查程序包括标本采集、标本处理、分枝杆菌培养、分枝杆菌鉴定、药敏试验和核酸检测。

结核菌素(PPD)试验操作

结核菌素（PPD）试验操作-CAL-FENGHAI-(2020YEAR-YICAI) JINGBIAN
结核菌素（PPD）试验
【口的】测定人体是否感染过结核杆菌。

【用物准备】治疗盘内盛PPD、1ml注射器及4〜5号针头、安尔碘、无菌纱布、棉签、砂轮、弯盘、医嘱执行单、笔、手表。

【操作流程及评分标准】
1 •告知患者注射部位不可揉、擦、抓，以免局部感染，避免肥皂水刺激。

2.告知患者及家属皮试观察时间为48〜72小时。

如有不适，及时与医护人员联系。

【注意事项】
1•严格执行查对制度及无菌操作原则。

2.药液必须现配现用。

3.按时观察结果。

判断结果时必须在光线充足的地方，被试验者手臂肌肉要放松。

【相关知识】
1.结核菌素纯蛋口衍生物溶液皮试浓度;含有5IUo
2.注射部位：左/右前臂屈侧中部没有瘢痕处。

3.皮试观察时间：48〜72小时观察皮试结果。

4.结果判断
阴性反应无硬结或硬结直径W4mm。

阳性反应硬结直径5〜9mm为弱阳性；10〜19mm为中度阳性；±20mm或
局部有水泡、出血、坏死及淋巴管炎者为强阳性。

几种常见的结核分枝杆菌快速检测方法

肺结核属于肺部慢性传染疾病，临床发病率高，该病的主要致病菌为结核分枝杆菌，病程相对较长，会向全身多个脏器累及。

菌阴肺结核指的是通过一次结核杆菌培养以及三次痰涂片检查，结果均显示为阴性的肺结核患者，具有较低的传染性。

大多数患者不了解菌阴肺结核的相关性知识，如果没有采取及时有效的诊断、治疗，患者的病情就会延误，继而转变为阳性，对患者的预后造成不利影响。

目前，临床中对于菌阴肺结核的特异性诊断措施相对缺乏，最常用的方法就是痰或呼吸道采集标本中结核分枝杆菌的检验。

近年来，结核病的发病率及死亡率呈现逐年上升的趋势。

筛选出一种能有效确诊早期结核病的检验方法十分重要。

目前临床上应用于辅助结核病诊断的检验方法以结核分枝杆菌培养和抗酸染色涂片为主，其中培养法作为结核疾病诊断的金标准具有准确性高、特异性高的优势。

结核分枝杆菌痰的分离培养，消耗时间较长，如果利用固体改良罗氏培养基进行培养，一般会需要至少20d，最长可需要60d，如果使用先进的全自动分枝杆菌进行检测，至少需要7d，至多需要20d。

实验室一般会通过痰涂片法进行检测，该方法的操作相对简单，价格较低，但是，操作费时，在基层痰检实验室涂片量过大的时候，一天内无法得到实验结果，这种现象无法满足目前的结核病防治工作。

近些年来，随着染色技术的逐渐先进，荧光染色技术作为新型的实验手段，已经在医学科学领域中广泛应用。

目前，涂片染色法已经成为无菌体液的主要检查方法，但是，通过传统制片以及染色法的检出率相对较低，误诊率以及漏诊率较高。

主要是因为染色时制片以及标本固定环节容易出现误差，而细胞沉淀仪法、改良的抗酸染色法、萋-尼氏抗酸染色法、金胺O荧光染色法、PCR等技术的应用越来越多。

传统方法：获取痰标本后，排除口水痰，然后纳入研究范围，确认纳入的当天，需要在每份痰标本相同位置，取两份，制成痰涂片。

离心处理标本，再在洁净的玻片上涂抹沉渣，涂完一层之后，使其自然干燥，再次涂抹，形成厚涂片，先使用萋尼抗酸染色法进行染色，随后使用石炭酸复红溶液初染，再使用盐酸酒精脱色，然后用美兰复染，寻找红色区域，待涂片干燥后置于显微镜镜检，于蓝色背景中寻找红色的杆状、分枝状细菌。

如何用PCR技术检测结核杆菌

如何用PCR技术检测结核杆菌结核杆菌可以导致全身性疾病，特别是在发展中国家，其发病率较高，危害性极大.近几年结核杆菌的变异性较大，对抗痨药物的耐药性增加，从而使结核病的发病大幅度增高.虽然传统的涂片抗酸染色、细菌培养以及胸片检查对大部分结核能作出正确的诊断，但对某些病人亦可造成误诊或漏诊;动物接种虽特异性较高，但因时间较长，不能满足临床快速诊断的需要.近几年也出现了几种快速诊断方法，但也存在较大的缺陷，如短期培养后抗原免疫原性分析，即用放免方法或酶联免疫吸附试验(ELISA)检测BACTEC培养瓶中被培养标本所分泌的抗原，该方法可在BACTEC瓶本身鉴定出细菌之前，结合ELISA和涂片抗酸染色有效地鉴别典型和非典型分枝杆菌，敏感性较高，但存在培养时间长，重复性尚差的缺点.另一种是短期培养后核酸探针杂交法，即用特异性DNA探针与BACTEC瓶中培养的细菌染色体DNA杂交.该方法能有效地防止培养的假阴性结果，但却易发生假阳性结果，加之采用的方法较为复杂和繁琐，又有涉及同位素操作之嫌等，因而近来已较少应用.上面两种方法都要借助细菌培养来进行，虽然在时间上比传统培养大大缩短，但缺乏快速诊断的优势.近几年兴起的PCR 方法基本实现了快速、灵敏、准确地诊断结核的目的，并且该方法正趋于常规化地应用于临床一般实验室.应用PCR方法检测结核杆菌的首要条件是设计一对特异性DNA引物.该引物所引导的DNA扩增序列应是结核杆菌独有的，且是结核杆菌的保守序列，这样才能保证检测结果的特异性.PCR方法的另外几个关键因素是:①DNA提取，即对有限的结核杆菌应尽量地将其DNA完整、全部地提取;②TaqDNA聚合酶的活性;③PCR产物的检测方法，即将PCR产物进行快速、灵敏、安全、准确的检测.一、结核杆菌DNA的提取在该技术上，目前仍无一种统一常规化的方法.现有各方法都存在着提取DNA不足的缺点，因此，敏感性受到影响.现在主要的细菌裂解方法是:①蛋白酶K加表面活性剂法;②蛋白变性剂加表面活性剂煮沸法;③反复冻融法;④超声波法;⑤溶菌酶加表面活性剂法.提取DNA的方法主要有:①酚一氯仿提取法:即用酚一氯仿抽提含有裂解菌体的溶液，然后用乙醇从抽提后的溶液中沉淀DNA.有的学者将硅酮加入酚一氯仿中，使水相和有机相的界面更牢固，这样不但能减少抑制因子混入水相，而且使DNA提取量比未加硅酮方法高20%～30%;②Chaotrop-silica法:用二氧化硅(sio2)吸附裂解菌体释放出的DNA，该二氧化硅用70%乙醇洗涤，而后干燥，最后用双蒸水洗脱(55℃).有报道认为该方法可以消除痰中的某些抑制因子.有的学者发现未预裂解的结核杆菌直接煮沸进行PCR的效果与预先处理的相仿，提示结核杆菌不预裂解也可直接进PCR.但加入的菌数应约1000个，否则细菌蛋白会对PCR产生抑制作用.二、引物的设计根据不同型结核杆菌的序列，目前常在下列几种序列内进行引物设计.(一)编码结核杆菌抗原的基因序列1.编码65-KDa蛋白抗原的基因序列:结核杆菌65-KDa蛋白抗原为存在于所有分枝杆菌细胞壁中的热休克蛋白，也是一种交叉反应蛋白.所以依据该序列设计合成的引物，PCR能扩增出所有分枝杆菌的靶DNA片段，没有属内特异性.这种PCR较适用于结核病高发区大规模筛选和流行病普查.另外，对65-KDa蛋白基因的PCR扩增产物进行限制性酶切分析(RFLP)，也可以准确地检测出结核杆菌的属内归属.2.编码MPB64蛋白的基因序列：MPB64蛋白为结核杆菌复合群(MTBC，包括人型结核杆菌、牛型结核杆菌、BCG、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌)所特有.根据该蛋白的基因序列设计的引物进行PCR，对MTBC模板DNA显示出高的特异性.3.编码38-KDa蛋白抗原b(Pab)的DNA序列:该序列仅存在于人型和牛型结核杆菌.采用在此基因内设计合成的引物和探针进行PCR，只能扩增人型和牛型结杆菌的DNA序列，能检出少至10个结核杆菌的纯化DNA.4.编码32-KDa蛋白的基因序列:32-KDa是蛋白分枝杆菌的一种分泌蛋白，由它的基因序列设计的引物和探针进行PCR，可以特异地检测出分枝杆菌的DNA片段，能检测出50fg的纯化DNA，相当于10个结核杆菌.5.编码MPB70抗原的基因序列:MPB70为牛型结核杆菌所特有，由该基因序列设计的引物进行PCR，对牛型结核杆菌的检测具有高度的特异性和敏感性.(二)结核杆菌基因组重复序列1.克隆DNA序列:目前所应用的DNA序列都是MTBC所特有，拷贝数在10个以上，包括亚克隆重组质粒pPH7301和克隆质粒PMTb4，分别含KpnI-SmaI插入片段和EcoRI-BamHI插入片段.根据这些基因序列设计的引物，其检出限在20个结核杆菌以下.2.插入序列:结核杆菌的插入序列主要有IS6110和IS986，它们仅见于MTBC.这两种插入序列在基因组中的拷贝数为1--20个，选择插入序列作为扩增的靶序列，可以得到较高的敏感性和特异性.尤其是IS6110，是目前进行临床PCR检测的首选区段.(三)人型结核杆菌特异序列mtp40是人型结核杆菌特异性DNA片段，Portillo等选择mtp40作为靶序列，用PCR检测结核杆菌，结果只能扩增人型结核杆菌DNA，敏感性达到10fg纯化DNA量.(四)分枝杆菌dnaJ基因该基因为分枝杆菌共有，但种间又存在差别，在该基因序列内设计合成的引物和探针用于PCR检测，能检出50fg的纯化分枝杆菌DNA，相当于10个结核杆菌.并可用于区分结核杆菌和非典型结核杆菌的鉴别诊断.(五)rRNA序列用“通用”引物在逆转录酶作用下，将16SRNA逆转录合成cDNA，然后对cDNA进行PCR扩增，检出限达0.1fg化的结核杆菌rRNA.临床标本中少至10个结核杆菌亦可被检出，该方法由于加了一步反转录过程相对增加了难度，临床一般少用.三、PCR产物的检测方法通常PCR产物的检测方法是经琼脂糖电泳后，用溴化乙锭染色，然后在紫外灯下观察或进一步采用标记的DNA探针杂交.为了进一步提高检测的灵敏度，现多在引物和探针的标记上进行改进.由于放射性标记物的危害性，现多采用非放射性标记，如生物素、荧光素、酶及化学发光剂.Wilson等在巢式PCR的内侧引物上分别掺入生物素和地高辛配基，这样PCR产物两端就分别带有生物素和地高辛配基.PCR 产物上的生物素和附着在微型滴定板表面的生物素蛋白结合，使PCR 产物附着在滴定板上，另一端的地高辛配基和加入的抗地高辛配基碱性磷酸脂酶结合形成抗地高辛配基碱性磷酸脂酶偶合物，利用该偶合物405nm的吸收峰做光密度(OD)测定.另外，还可用吖啶酯标记探针进行杂交，用硼酸钠将未杂交的探针分解，然后加入H2O2溶液和NaOH 溶液使吖啶酯水解，最后测量吖啶的光通量.虽然这些方法安全、快速、但其敏感性还需进一步提高，操作还需进一步简化.四、PCR检测结核杆菌的敏感性和特异性(一)PCR的特异性PCR特异性的关键首先取决于所选靶序列的特异性.现在常用的靶序列有:①分枝杆菌共有的靶序列，如65-KDa蛋白基因序列;②MTBC特有的靶序列，如MpB64蛋白基因序列、IS6110序列.③人型结核杆菌特异的靶序列，如mpt40序列.引物设计对PCR的特异性也至关重要.引物序列在靶DNA上的专一性、以及引物的特异性和保守性，以及引物本身的许多特性，如G+C含量引物3'未端序列的特异性和保守性及引物长度等都影响PCR的特异性，另外在设计引物时也要防止出现引物间的过多配对，以免形成过多的引物聚合体，造成非特异性扩增.PCR扩增TB的特异性除上述先决条件外，也与PCR反应本身有极重要的关系.其中退火温度是一个重要因素，退火温度过低时，引物易发生非特异性结合，造成非特异性扩增.由于结核杆DNA中G+C含量高，因此可以适当提高退火温度，以获得更高的特异性.另外，PCR缓冲液的组成，尤其是Mg2+浓度对PCR的特异性也有较大影响，Mg2+浓度过高，会提高PCR产物的产量，但同时也会增加非特异性扩增.(二)PCR的敏感性PCR的敏感性很高，一般可以检测出1～100fg纯化的结核杆菌DNA，相当于1～20个结核杆菌，这种敏感性明显高于涂片法和培养法.PCR还可以检出培养法易发生失败的病例，从而大大提高菌阴结核病的诊断.另外PCR检测TBDNA不受抗痨治疗的影响，可以准确观察抗痨治疗的效果，防止血清学方法所带来的假阴性结果.PCR敏感性受下列因素影响:①扩增靶序列的拷贝数.一般认为，结核杆菌染色体中含靶序列拷贝数越多，PCR敏感性越高，如38-KDa蛋白的基因序列在结核杆菌染色体中只有一个，而IS6110序列的拷贝数却有10～12个，结果PCR敏感性后者比前者高100倍;②PCR的循环次数.在一定程度上，PCR循环次数越多，其敏感性就越高，但要合适.因为，循环次数过多会增加非特异性问题，造成结果判断上的失误，产生假阳性结果;③结核杆菌DNA的提取技术.处理标本时首先要富集(如离心)标本中的TB，使单位体积内TB含量变高，从而增加了起始模板数，有利于提高PCR的灵敏性.同时提取过程要尽可能减少抑制成份，并提高DNA的提取率.④PCR产物的检测方法.虽然DNA探针杂交要比直接电泳法敏感性高得多，但步骤繁琐，这也是影响PCR临床应用的原因之一.但一般情况下，直接电泳法的敏感性完全能够达到检测的需要.五.PCR在结核病临床诊断中的应用PCR检测结核杆菌的优点决定了它在临床上的应用价值和范围，PCR检测TB的优点主要表现如下:1.能早期诊断TB菌血症:在TB感染的早期，特别是在TB病灶通过血源性外传播时、及在外周血中存在极少量的TB时，PCR就能给于扩增并确诊.此外，由于外周血中TB的含量甚微，又没有新的病灶形成，因而血清学方法和物理方法均难以达到确诊的目的，而对这类病灶的早期诊断在临床治疗上具有指导意义，因为早期菌血症是较易控制的，并可以防止继发性TB病灶的形成.2.时间短;PCR检测TB仅需2-4h对于某些培养法难以实施的病例，PCR法则行之有效，同时提高了敏感性和特异性，可以检测到1个TB菌.3.有利于鉴别诊断:对于肺结核来说，其中的结核球和成人型原发性结核等，经常易于同肺癌的诊断相混淆.病灶中心部位经常出现既未见TB又未见癌细胞的坏死区.此时涂片检测常是阴性的.在这种情况下，PCR检测就显得特别有效.它不但可以扩增能着色的活菌，还可以扩增已死亡的，但DNA尚未降解的死菌，从而确定这样的病灶是恶性还是良性.在许多情况下，TB可以导致脑膜炎、胸膜炎、腹膜炎等.涂片法尽管在诊断上具有直接、简便的优点，但敏感性差就局限了它的诊断范围和实用价值.PCR检测这类标本，可以说极其有效.其极高的特异性和敏感性可以很容易地确定TB性脑膜炎及TB性胸腹水.另外，对于肾结核、泌尿生殖系统结核的诊断，PCR都可以予以完成.4.抗痨治疗的评价:对于抗痨治疗效果的评价，以前的方法显得软弱无力.而PCR法则可以通过定期检测，采用定量PCR法确切地评价抗痨药物的疗效及残存菌的数量和活性度.在体内一般情况下，细菌死后，其蛋白系统很快崩溃，而DNA则能相对较长时间地保存下来.这些DNA在某种情况下又会复活.所以，细胞的死亡最可靠的评价指标是其基因DNA的完全降解.特别是在许多问题未搞清楚以前，更应该以DNA的降解来判定病原体的死与活.从理论上讲，PCR扩增结果将是最可靠的疗效评价指标.5.修正以往所谓“正确”的观念:致病菌与机体的防御系统是一对激烈的矛盾，致病菌可以以任何方式和通路打击人体的防御系统，以便其生存和繁殖.在健康人群和周围环境中都携带或存在有大量的TB，但何时何地才会造成机体致病呢?以往认为TB很少存在于外周血，这主要是因为外周血中查不到TB，或TB已被局限在肺组织中.但很难让人相信的是，肺部血管极其丰富，淋巴组织和血管网共同构成人体的细胞外液贮存和交换的场所.所以，二者之间的交换是经常的.这种交换就包括能透过毛细血管壁的致病菌.当然，对于TB来讲，大多数细菌将被机体的免疫器官禁固起来.但仍有不少“漏网之鱼”，只是以前所用的方法敏感性及特异性均不够.但在某些情况下，如情绪低落、过度劳累、感冒等情况下，机体防御系统功能减弱，就会造成致病菌的攻击发生疾病.所以PCR技术对于评估临床疗效、疫情的检控、发病机理的探讨均有十分重要的意义.六、PCR在检测TB中的注意事项PCR如操作不严格会出现假阳性和假阴性结果.发生假阳性最常见的原因是:样品间的污染和扩增产物的污染.样品间的交叉污染最易发生在样品的处理过程之中.如大家共用一个加样器、剪刀、位置等，因此在处理活检标本时，用剪刀剪碎组织块，每个标本用后，剪刀应在火上烧数分钟，以彻底清除污染在剪刀上的DNA.对于液态标本的处理，尽可能在同一管子内处理.用具应为一次性的.要解决好扩增物的污染，最佳的方式是减少操作的时间，简化操作手续并使用一次性离心管及接头.因为扩增产物的量一般很高，易于污染实验室任何地方.所以减少打开反应管的次数会降低假阳性的发生率.。

结核病实验室快速诊断方法的研究

738
55. 5
25
75
100
75
荧光定量 PCR
358
380
738
48. 6
0
100
100
1 00
P P < 0. 01
3 讨论
分枝杆菌快速培养检测技术[2 ] :可早期报告结果。
59
2 结果
用 3 种方法检测对 738 例结核病患者及 100 例非结核呼吸系统疾病患者临床标本的结果见表 1。结果显示 ,738 例结核病患者的检测结果经χ2 检验 ,
结核抗体检测法阳性率明显高于荧光定量 PCR 检测法 ; 荧光定量 PCR 检测法阳性率明显高于 BACTEC TB 960 快速培养法。100 例非结核呼吸系统疾病患者的检测结果经χ2 检验 ,结核抗体检测法特异性明显低于荧光定量 PCR 检测法。
[ 关键词 ] 结核分枝杆菌 ;实验诊断 ;快速培养 ;结核抗体 ;荧光定量 PCR [ 中图分类号 ] R378. 91+ 1 [ 文献标识码 ] A [文章编号 ] 16732016x(2007) 0220058202
结核病 (tuberculosis ,TB) 主要是由结核分支杆菌感染引起的疾病 ,全球现有结核病人 2 000 万人 ,每年约有 900 万新增患者 ,而且有 300 万人死于这种疾病 ,是单一病因死亡最多的传染病。根据最近一次卫生部组织的结核病流行病学抽样调查结果显示 :日前我国有 4 亿人感染过结核杆菌 ,现有的传染性结核病人达到 200 万人。结核病人数居世界第 2 位。
长期以来 ,结核病的实验室诊断方法主要依赖 : 涂片抗酸染色镜检、结核菌培养法。结核菌培养法是病原体检测的“金标准”,精确可靠 ,特异性高 ,可同时做药敏试验和菌群鉴定。但所需时间长 ,一般为 4～8 周 ,且对早期感染者不易检出 ,失去了早发现早治疗的良机 ,严重的影响了结核病的及时诊断。因此. 结核的快速、准确诊断尤为重要[ 1] 。

结核杆菌试验结果判断方法

结核杆菌试验结果判断方法结核病是一种影响全球范围的慢性传染病，其主要致病菌为结核杆菌。

为了诊断结核病患者，临床医生常常会进行结核杆菌试验。

然而，正确判断结核杆菌试验结果对于准确诊断和治疗结核病患者至关重要。

本文将详细介绍结核杆菌试验结果判断的方法，以帮助医生准确解读患者的结核杆菌试验结果。

一、结核杆菌试验种类及原理结核杆菌试验包括常规结核菌素试验以及现代分子生物学技术所开发的分子检测试验。

常规结核菌素试验是通过皮肤注射结核菌素，观察注射部位皮肤变化情况来判断患者是否感染结核菌。

而分子检测试验则通过检测患者体液、组织等样本中的结核菌DNA或RNA来快速确认结核菌感染情况。

二、常规结核菌素试验结果判断方法1. 通过直接观察注射部位皮肤反应来判断常规结核菌素试验结果。

注射部位皮肤发生红斑或硬结反应通常表明患者免疫系统对结核菌素具有敏感性，可能已感染结核菌。

2. 量化测定注射部位皮肤反应的大小，一般采用厚度或直径测量方法。

常用的计量方式包括银规、牛规等，测量结果可根据相关参考值进行判断。

3. 结合患者的临床症状以及其他辅助检查结果来判断试验结果。

例如，患者有典型的结核病症状，并且CT、X光等影像学检查结果显示典型结核病表现，则可以初步判断为结核菌感染。

三、分子检测试验结果判断方法1. 分子检测试验结果通常通过荧光信号或者DNA条带的出现与否来判断。

设备会输出分子检测结果的荧光信号或者电子数据，医生根据设备手册或者相关技术标准进行解读。

2. 结合设备输出的数据进行定量判断。

通常，分子检测试验设备会提供一个参考范围，医生可根据患者的数据与参考范围进行比较，从而判断是否感染结核菌。

3. 结合患者的临床症状和其他实验结果进行综合判断。

例如，分子检测试验结果为阳性，患者有结核病典型症状，且在影像学检查中发现肺部结核病表现，则可以初步判断为结核杆菌感染。

结核杆菌试验结果判断方法对于准确诊断和治疗结核病患者至关重要。

结核菌快速测定专家讲座

TB形态
结核菌快速测定
第3页
全球感染情况
结核菌快速测定
第4页
试验诊疗检测方法

结核菌快速测定
常规检测方法
分子生物学检测方法
第5页
常规检测方法
一个月
二个月
PCR）方法
结核菌快速测定
第7页
回顾RNA与DNA
结核菌快速测定
第8页
RNA Vs DNA
G C
G C
A T
AT
A T
G C
G C
T A
G C
DNA
10 000 套
r-RNA
结核菌快速测定
(eg : E.coli)
第15页
样本前处理
细胞溶解
样本
目标 r-RNA释放
结核菌快速测定
第16页
杂交
rRNA
AE
AE
15分钟
AE
AE
AE
AE
60°C
AE
AE
探针
结核菌快速测定
杂交体
第17页
选择
AE
AC
TUB
结果解释
katG
RMP INH
++ - + - + - + +
+ - + - ++ - + +
+ +- +- - + + +
+ - + - +- + + +
+ - - - - +- + +
MTD试验与其它试验方法性能比较

结核分枝杆菌药敏快速测定试剂盒

指导治疗
根据试剂盒的检测结果，医生可以预测患者的病情发展趋势和治疗效果，有助于及时调整治疗方案。
预测病情
指导用药
通过对耐药性的监测，医生可以针对不同菌种的耐药性情况选择最合适的药物进行治疗。
监测耐药性
结核分枝杆菌药敏快速测定试剂盒可以监测结核病菌的耐药性情况，了解当地或全球的耐药性分布和演变趋势。
控制疫情
耐药性的监测对于控制结核病的疫情具有重要意义，可以为制定防控策略提供科学依据。
结核分枝杆菌药敏快速测定试剂盒在耐药性监测中的应用
疗效评价
结核分枝杆菌药敏快速测定试剂盒可以评价治疗方案的疗效，帮助医生及时调整治疗方案，确保患者得到最佳的治疗效果。
病情监测
通过定期使用结核分枝杆菌药敏快速测定试剂盒进行检测，可以了解患者的病情变化，及时发现复发和再感染的情况。
2023
结核分枝杆菌药敏快速测定试剂盒
CATALOGUE
目录
结核分枝杆菌药敏快速测定试剂盒简介结核分枝杆菌药敏快速测定试剂盒的用途结核分枝杆菌药敏快速测定试剂盒的检测原理和方法结核分枝杆菌药敏快速测定试剂盒与其他检测方法的比较结核分枝杆菌药敏快速测定试剂盒的应用前景和局限性
01
结核分枝杆菌药敏快速测定试剂盒简介
试剂盒内的特异性引物和探针能够针对结核分枝杆菌的特异基因序列进行多重PCR扩增，实现对结核分枝杆菌的高特异性检测。
结核分枝杆菌药敏快速测定试剂盒的检测原理
结核分枝杆菌药敏快速测定试剂盒的检测方法
收集患者可疑感染部位的标本，如痰液、支气管肺泡灌洗液、肺活检组织等。
加入试剂盒内的多重PCR反应液和特异性引物、探针，进行多重PCR扩增反应。
分子生物学检测方法
基因测序、质谱测序等，价格昂贵，技术要求高，一般不用于常规检测。

结核菌DNA荧光定量PCR测定

结核菌DNA荧光定量PCR测定1.样本采集、存放及运输1.1采集：嘱病人晨起用清水漱口清洁口腔，然后用力咳出气管深部的痰液，盛于蜡纸盒或广口瓶内。

取痰样本约1ml，加入等量1N NaOH溶液，充分摇匀室温10-20分钟，若痰液浓稠时，可以适当增加1N NaOH溶液用量并延长时间或37℃水浴20分钟，使痰液充分液化。

取中层液化良好的痰液置于1.5ML离心管内，待测。

存放：4℃保存不应超过72小时；-20℃保存不超过三个月；-70℃以下长期保存。

应避免反复冻溶。

1.2运输：采用冰壶加冰或泡漠箱加冰密封进行运输，48小时内送达。

2. 样本处理取上述待测样品振摇或吹打混悬，12000G离心5分钟，去上清，沉淀加入50ul标本处理液混悬，96℃加热10分钟，12000G离心5分钟，取上清10ul移入含10XPCR扩增系统管中，补加20ul稀释液，振摇混匀，5000G离心2秒钟，置入荧光PCR扩增仪内扩增。

3. 核酸扩增3.1PCR扩增（检测区）循环条件设置使用Genelight9800检测仪循环程序设置如下：95℃，2min;95℃，15sec；52℃，40sec；40个循环。

4结果分析条件设定4.1基线的确定：取6-10或6-15个循环的荧光信号。

阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线（无规则的噪音线）的最高点，且TB值=40.0为准。

4.2为避免漏检强阳性样本,应首先将基线定为6-10/3-10/2-10个循环的荧光信号观察分析TB值,如果没有TB值<16.0样本,则将基线改定为6-15/3-15/2-15个循环的荧光信号进行结果分析。

4.3 质控标准4.3.1定量检测线性范围为：1.0×101-1.0×109copies/ml.4.4 检测质控标准4.4.1 四个阳性参控品的TB值都应小于38.0。

将阳性参控品1-4的拷贝浓度输入,仪器将自动以阳性参控品拷贝浓度的对数值为横坐标,以其实际测得的TB值为纵坐标给出标准曲线,标准曲线的拟合度应小于等于-0.980,否则视为定量结果无效。

结核菌素试验操作

结核菌素(PPD试验
【目的】测定人体是否感染过结核杆菌。

【用物准备】治疗盘内盛PPD、1ml注射器及4〜5号针头、安尔碘、无菌纱布、棉签、砂轮、弯盘、医嘱执行单、笔、手表。

【操作流程及评分标准】
【指导内容】
1. 告知患者注射部位不可揉、擦、抓，以免局部感染，避免肥皂水刺激。

2. 告知患者及家届皮试观察时间为48〜72小时。

如有不适，及时与医护人员联系c 【注意事项】
1. 严格执行查对制度及无菌操作原则。

2. 药液必须现配现用。

3. 按时观察结果。

判断结果时必须在光线充足的地方，被试验者手臂肌肉要放松。

【相关知识】
1. 结核菌素纯蛋白衍生物溶液皮试浓度；0.1ml含有5IU。

2. 注射部位：左/右前臂屈侧中部没有瘢痕处。

3. 皮试观察时间：48〜72小时观察皮试结果。

4. 结果判断
阴性反应无硬结或硬结直径v 4mm。

阳性反应硬结直径5〜9mm为弱阳性；10〜19mm为中度阳性；＞20mm或局部有水泡、出血、坏死及淋巴管炎者为强阳性。