2015版中国药典无菌检验-中翎易

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2015版中国药典无菌检查概述merck

2015版药典无菌检查概述默克生命科学2016/04/28中国药典与国外药典的差别ChP2010USP38EP8.0ChP2015检验条件总体10000级、局部100级应在无菌条件下进行应在无菌条件下进行应在无菌条件下进行（B级背景下的A 级单向流洁净区域或隔离器）人员具备微生物专业知识，并经过无菌技术的培训经培训和认可经培训和认可具备微生物专业知识，并经过无菌技术的培训培养基培养条件与时间硫乙醇酸盐流体培养基30-35℃（20-25 ℃）改良马丁培养基23-28 ℃均培养14天接种后细菌培养2天、真菌培养3天硫乙醇酸盐流体培养基30-35℃胰酪大豆胨液体培养基20-25 ℃均培养不少于14天接种后培养均不少于4天硫乙醇酸盐流体培养基30-35℃胰酪大豆胨液体培养基20-25 ℃均培养不少于14天接种后培养均不少于7天硫乙醇酸盐流体培养基30-35℃胰酪大豆胨液体培养基20-25 ℃均培养不少于14天接种后培养均不少于7天培养基灵敏度检查与方法验证用菌株CMCC ATCC ATCC CMCC检验方法只要性状允许，应采用薄膜过滤法只要性状允许，应采用薄膜过滤法只要性状允许，应采用薄膜过滤法只要性状允许，应采用薄膜过滤法稀释剂与冲洗液1、0.1%蛋白胨水溶液2、pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液3、其他经验证过的溶液A. 0.1%蛋白胨水溶液D. A+1ml吐温80K.动物组织消化液+牛肉浸膏+吐温801、0.1%蛋白胨水溶液2、0.1%蛋白胨水溶液+0.1%（聚乙氧基乙醇、0.1%吐温80）3、十四烷酸异丙酯1、0.1%蛋白胨水溶液2、pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液3、其他经验证过的溶液结果判断与复试一次检出结果为准（设备及环境不符合要求、实验过程有可能引起污染的因素、阴性对照有菌生长、分离微生物可明确归因于无菌实验过程中所用的材料或技术错误造成的。

单倍量重试）2015版药典无菌检查法修订概况逐版发展提高的主要部分实验环境、设备的无菌保证；培养基品种及其适用性检查要求；检验数量、检验量的增加；检验方法和仪器发展；验证试验要求；培养时间保证受损微生物的生长；结果判断规定；取消复试、及重试的规定。

2015年版中国药典微生物限度检查法

2. 薄膜过滤法
– 除另有规定外，按计数方法适用性试验确认的方法进行供试液制备。取相当于1g、1ml 或10 cm²供试品的供试液，若供试品所含的菌数较多时，可取适宜稀释级的供试液，照方法适用性试验确认的方法加至适量稀释液中，立即过滤，冲洗，冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基或沙氏葡萄糖琼脂培养基上培养。 – 培养和计数培养条件和计数方法同平皿计数法，每张滤膜上的菌落数应不超过100cfu。
菌数报告规则
– 需氧菌总数测定宜选取平均菌落数小于 300cfu 的稀释级、霉菌和酵母菌总数测定宜选取平均菌落数小于100cfu 的稀释级，作为菌数报告（取两位有效数字）的依据。取最高的平均菌落数，计算1g、1ml 或10 cm² 供试品中所含的微生物数。 – 如各稀释级的平皿均无菌落生长，或仅最低稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小于1 时，以﹤1 乘以最低稀释倍数的值报告菌数。
1.1 总则：
• 如供试品有抗菌活性，应尽可能去除或中和。供
试品检查时, 若使用了中和剂或灭活剂，应确认
其有效性及对微生物无毒性。 • 供试液制备时如果使用了表面活性剂，应确认其
对微生物无毒性以及与所使用中和剂或灭活剂的
相容性。
1.2计数方法：
• 平皿法 • 薄膜过滤法 • 最可能数法（Most-Probable-Number Method，简称MPN 法）。
沙氏葡萄糖琼脂培养基或沙氏葡萄糖液体培养基，20～25℃，2～3 天【10版：改良马丁（琼脂）培养基，23~28 ℃ ，24~48h】沙氏葡萄糖琼脂培养基或马铃薯葡萄糖琼脂培养基，20～25℃，5～7天，或直接获得丰富孢子【10版：改良马丁琼脂斜面培养基，23~28 ℃ ，5~7天】

中国药典2015版无菌检查法与美、欧、日药典的差异分析与讨论_潘友文

中国药典2015版无菌检查法与美、欧、日药典的差异分析与讨论潘友文（罗氏/基因泰克，美国南旧金山，94080）2016年07月29日摘要目的：分析中国药典2015版无菌检查法与美、欧、日药典无菌检查法的之间的差异性，为评价不同药典中无菌检查法的等效性提供参考。

方法：对无菌检查法的主要实验步骤和参数进行一对一比较，对有差异的步骤和参数进行科学论证和评价。

结果：中国药典2015版无菌检查法与美、欧、日药典无菌检查法的主要参数和步骤是一致的，但中国药典无菌检查法还需要做阳性对照和厌氧需氧菌的额外培养。

并且，中国药典用大肠埃希菌代替美、欧、日药典中的铜绿假单胞菌参与无菌检查法的适用性试验。

结论：各药典的无菌检查法是等效的。

在不影响方法等效性的前提下，中国药典2015版无菌检查法在阳性对照和培养方法上还可以进一步简化。

关键词:无菌检查法；中国药典；美国药典；欧洲药典；日本药典Gap Assessment and Discussion on Sterility Tests in Chinese Pharmacopoeia 2015, United States Pharmacopoeia, European Pharmacopoeia, and Japanese PharmacopoeiaYouwen Pan (Genentech, a Member of Roche, South San Francisco, USA 94080)Abstract Objective：Gap assessment and discussion on the sterility test methods in Chinese Pharmacopoeia 2015 edition (CP2015), United States Pharmacopoeia (USP), European Pharmacopoeia (EP), and Japanese Pharmacopoeia (JP). Method：The test procedures and key parameters in the sterility test methods in different pharmacopoeia were compared step by step and the differences were identified. The identified differences are scientifically evaluated for their impact to the equivalence of the methods. Result：The sterility test method in CP2015 is largely harmonized with that in USP, EP and JP except for a few differences. Positive control and extra incubation bacteria are required in CP2015 only, and Escherichia coli is used in method suitability test in CP2015 while Pseudomonas aeruginosa is used in USP/EP/JP. Conclusion：The Sterility Test Methods in CP2015, USP, EP, and JP are equivalent. The method in CP2015 could be simplified more without compromising the validity, accuracy and reliability of the method.Key words：sterility test；Chinese Pharmacopoeia 2015；United States Pharmacopoeia；European Pharmacopoeia； Japanese Pharmacopoeia无菌检查法是用于检查药典规定的无菌物品是否被微生物污染的检测方法。

2015版中国药典检验操作规程

• • •
2.7.2预培养（增菌培养）：
• 取供试液10mL（相当于1g样品），加在定）中，30〜35℃培养24〜48小时。 ml增菌液体培养基（经方法适用性试验确
•
• •
耐胆盐革兰阴性菌肠道菌增菌液体培养基
大肠埃希氏菌沙门菌胰酪大豆胨液体培养基胰酪大豆胨液体培养基
2.7.3选择和分离培养
（3）物品取出,
• 随即检查包装的完整性,若有破坏或棉塞脱掉、包装有明显的水浸者,不可作为无菌物品使用。培养基或试剂等,应检查是否符合达到灭菌后的色泽或状态,未达到者应废弃。取出的物品掉落在地或误放不洁处,或沾有水液,均视为受到污染,不可作为无菌物品使用。取出的合格灭菌物品,应存放于贮藏室或防尘柜内,严禁与未灭菌物品混放。凡属合格物品,应标有灭菌日期及有效期限。
•
有毒有菌污物处理要求
• 1.4.5污染的工作服或进行强致病菌试验所穿的工作服、帽、口罩等，应放入专用消毒袋内，经高压灭菌后方能洗涤。
•
• •
1.5培养基制备要求
1.5.1根据培养基配方的成分按量称取（可根据产品说明书用量和方法进行），然后溶于蒸馏水中，在使用前对应用的试剂药品应进行质量检验。 1.5.2因高压灭菌可影响一些培养基的PH降低或升高，故不宜灭菌压力过高或次数太多，以免影响培养基的质量。
1.3.2装放
• （1）干热灭菌器：装放物品不可过挤，且不能接触箱的四壁。
•
（2）大型高压蒸气锅：放置灭菌物品分别包扎好，直接放入消毒筒内，物品之间不能过挤。
1.3.3设备检查
• • • （1）检查门的开关是否灵活，橡皮圈有无损坏，是否平整。（2）检查压力表蒸气排尽时是否停留在零位，关好门和盖，通蒸气或加热后，观察是否漏气，压力表与温度计所标示的状况是否吻合，管道有无堵塞。（3）对有自动电子程序控制装置的灭菌器，使用前应检查规定的程序，是否符合于进行灭菌处理的要求。

2015版中国药典无菌检查法课件

（二）、无菌检查的特点和意义由于抽样概率的限制，通过无菌检查发现产品微生物污染的可能性极低，而当前坚持无菌检查的意义在于：产品上市前发现重大污染事件的最后一道关口；通过无菌检查的执行情况可以窥视其无菌控制存在的问题。
三、无菌检查法的有关概念和新理念
(三)、无菌检查的新理念 1.全过程控制
（二）中国药典无菌检查法的发展 1953年版 1963年版
直接接种法直接接种法无阳性对照菌三种培养基培养基阳性对照－金葡
1977年版培养基质量检查－金葡、白念。阳性对照－金葡
培养基质量检查－藤黄、生孢、白念。 2支（瓶）或以上直接接种法 4管+2管+1管薄膜过滤法膜剪4片，2+1+1 1990版－金葡10－6
2015版《中国药典》无菌检查法
主要内容
一、药品无菌检查所面临的形势二、无菌检查法的发展历史三、无菌检查法的有关概念和新理念四、2015年版《中国药典》无菌检查法的重大修订五、2015年版《中国药典》无菌检查法六、医院制剂进行微生物控制的必要性
一.药品微生物检验所面临的形势
1.医药产品的发展 2.注射用药品的挑战 3.药品微生物污染的反思 4.2015版中国药典的修订
12Biblioteka 三、无菌检查法的有关概念和新理念
（一)、无菌检查法的有关概念
5、无菌技术是指在微生物试验工作中，控制或防止各类微生物的污染及其干扰的一系列操作方法和有关措施，其中包括无菌环境设施、无菌试验器材及无菌操作。 6、无菌检查法的局限性若供试品符合无菌检查法的
规定,仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。也就是无菌试验并不能用于保证整批产品的无菌性，但是它可用于确定批产品不符合无菌要求。

无菌检测方法

四川乐至贵均卫生材料有限公司医疗器械产品无菌检测方法1.目的建立无菌检测标准规程，对灭菌后的医疗器械产品进行无菌检测，以确定灭菌的有效性。

2.范围本规程适用于本公司对医疗器械产品的无菌检测。

3.依据《中国药典》2015版4.设备、器皿、药品的准备4.1 设备的准备电子天平、干热灭菌箱、高压灭菌箱、洁净工作台、放大镜、移液枪、电热培养箱、霉菌培养箱、冰箱、斜口钳、接种环、酒精灯4.2 器皿的准备锥心瓶（500ml）、烧杯（1000ml）、试剂瓶（60ml）、量筒（50ml、1000ml）、培养皿（Ф90mm ×15mm）、斜口钳、玻璃棒。

4.3 药品的准备硫乙醇酸盐流体培养基、胰酪大豆胨液体培养基、纯化水、pH7.0 无菌氯化钠溶液。

5.器皿的清洗将所需的锥形瓶、烧杯、试剂瓶、培养皿、玻璃棒放入超声波清洗机中用纯化水清洗两次，每次15分钟，将清洗完的器皿在180℃条件下进行干热灭菌2小时。

6.取样按灭菌批次或者生产批次进行取样，随机抽取同一型号的产品4件作无菌检测样品7.培养基的制备7.1 硫乙醇酸盐流体培养基的制备取15g硫乙醇酸盐流体培养基和1000ml纯化水于烧杯中混合，加热至微沸（注意加热过程中要不断地搅拌，使其混合均匀）用棉花塞塞紧复用无尘布和绳子绑好后转移至高压灭菌锅内灭菌，灭菌温度为121℃，灭菌时间30分钟。

灭菌后摇均，冷却至45℃待用。

7.2 胰酪大豆胨液体培养基的制备取15g胰酪大豆胨和1000ml纯化水于烧杯中混合，操作方法同6.1。

8. 培养基灵敏度检查8.1 菌种的要求培养基灵敏度检查所用的菌株（金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌）传代次数不得超过5代。

8.2 菌液的制备接种金黄色葡萄球菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基上，30-35℃培养24小时；接种枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基上，20-25℃培养24小时。

将上述经24小时培养后的培养物用0.9﹪无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100cfu(菌落形成单位)的菌悬液。

2015药典无菌、微限检验

方法适用性试验
• 当建立产品的无菌检查法时，应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的无菌检查。若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，应重新进行方法适用性试验。方法适用性试验按“供试品的无菌检查”的规定及下列要求进行操作。对每一试验菌应逐一进行方法确认。
方法适用性试验
光学显微镜
过滤装置（无油真空泵、滤杯、滤头、滤瓶、微孔滤膜、夹子）
环境及人员要求
无菌检查应在无菌条件下进行，试验环境必须达到无菌检验的要求，检验全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。单向流空气区、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度确认。隔离系统应定期按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求，日常检验还需对试验环境进行监控。无菌检查人员必须具备微生物专业知识，并经过无菌技术的培训。
促生长试验：用于证明生长培养基能够支持微生物生长的技术操作。假阴性：实际阳性的无菌试验结果被变成了阴性。假阳性：实际阴性的无菌试验结果被变成了阳性。需氧菌：在代谢中，有氧条件下才能生存的微生物。厌氧菌：在代谢中，没有氧的条件下才能生存的微生物。无菌保证水平（SAL）:灭菌后产品上存在单个活微生物的概率。“无菌医疗器械”表示为医疗器械中，有残存微生物的医疗器械的概率小于10 ，即一百万件中小于1件。
无菌检查法试验前准备
硫乙醇酸盐流体培养基:主要用于厌氧菌的培养
，也可用于需氧菌培养。
无菌检查法试验前准备
硫乙醇酸盐流体培养基:
在供试品接种前, 培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/5，否则 ,须经100℃水浴加热至粉红色消失（不超过20分钟）迅速冷却,只限加热一次，并应防止被污染。其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养基氧化层（粉红色）不超过培养基深度的 1/2。30℃ ~ 35℃培养14天。

2015版药典无菌检查法与微生物鉴定

• 无菌技术是指在微生物试验工作中，控制或防止各类微生物的污染及其干扰的一系列操作方法和有关措施，其中包括无菌环境设施、无菌试验器材及无菌操作。
• 无菌检查法的局限性由于无菌是一个相对的概念，因此，对无菌检查的结果应该有一个正确的认识－即产品通过无菌检查仅仅意味着在该检验条件下，供试品未发现有微生物污染，并不表示所有的产品都是无菌的。反之，当供试品中检出微生物污染，则可以认为批产品的微生物污染风险相当高。
豆木瓜蛋白酶消化物
浸出粉…….…2.0g
白酶水解物
………………………………….3.0g 葡萄糖…………....20.0g 磷 „„„„„„„„„3.0g
氯化钠 …..…………….…….…5.0g 酸氢二钾………..1.0g
氯化钠 „„„„„„5.0g
磷酸氢二钾 …………………....2.5g 硫酸镁一水葡萄糖……………….……2.5g (MgSO4.7H2O)….0.5g
Dextrose(葡萄糖)............................................5.0 g Sodium Chloride(氯化钠).....................................2.5 g L-Cystine( L-胱氨酸) .......................................0.5 g Sodium Thioglycollate (硫乙醇酸钠)..........................0.5 g Agar( 琼脂).................................................0.75 g Resazurin( 刃天青) .........................................1.0 mg Water（水）............................................. ...1000ml

中国药典(2015年版)无菌检查法

中国药典(2015年版)无菌检查法是用于检查药典要求无菌的药品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。

如果供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。

无菌检查法包括薄膜过滤法和直接接种法。

只要供试品性质允许，应采用薄膜过滤法。

薄膜过滤法一般应采用封闭式薄膜过滤器，无菌检查用的滤膜孔径应不大于0.45微米，直径约为50mm。

根据供试品及其溶剂的特性选择滤膜材质，使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。

直接接种法适用于无法用薄膜过滤法进行无菌检查的供试品，即取规定量供试品分别等量接种至硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基中。

1无菌试验操作规程-版中国药典资料讲解

1无菌试验操作规程-2015版中国药典1.目的：制定无菌检验标准操作规程，确保检验操作正确。

2.范围：本标准适用于本公司成品无菌检验操作。

3.职责：生产部负责提供待检验产品，质量部负责检验，出具检验报告。

4.内容：4.1.标准依据：《中国药典》2015年版通则（1101）无菌检查法。

4.2.简述：无菌检查方法系用于检查无菌医疗器械是否无菌的一种方法。

若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。

4.3.环境要求：该项检查应在无菌条件下进行。

其全过程必须严格遵守无菌操作。

防止微生物污染，但所采取的措施不得影响供试品中微生物的检出。

操作前环境洁净度应经验证。

日常检验需对试验环境进行监控。

4.4.方法验证：进行该项检查前应进行方法适用性试验。

4.5.人员要求：无菌检查人员必须具备微生物专业知识，并经过无菌技术培训。

4.6.检验数量及检验量：4.6.1.接种每种培养基所需的最少检验数量 (表1)供试品批产量N(个）接种每种培养基的最少检验数量医疗器具≤100100<N≤500>500 10%或4件（取较多者）10件2%或20件（取较少者）4.6.2.检验量（表3）供试品供试品装量每支供试品接入每种培养基的最少量医疗器具外科用敷料棉花及纱布缝合线、一次性医用材料带导管的一次性医疗器具其他医疗器具取100mg或1cm×3cm整个材料二分之一内表面整个器具（切碎或拆散开）4.7.仪器用具：垂直层流超净工作台、生化培养箱、电热恒温水浴箱、显微镜、手提灭菌器、离心机、双碟、试管、三角瓶、刻度离心管、注射器（针头）、剪刀、镊子、注射器盒、75％酒精棉球、紫外光灯365nm、真空泵、一次性使用集菌培养器。

4.8.消毒剂配制：75％乙醇溶液（配制酒精棉球用）。

0.2％新洁尔灭溶液（配制消毒棉球用）。

2％来苏尔溶液（配制消毒棉球用）。

4.9.试剂及培养基的配制：4.9.1.0.1％蛋白胨水溶液：取蛋白胨1.0g，加水1000ml,微温使溶解，滤清，调节PH值至7.1±0.2，分装，灭菌。

无菌检查法-2015版中国药典-电子版

无菌检查法-2015版中国药典无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、生物制品、医疗器具、原料、辅料、及其他品种是否无菌的一种方法。

若供试品符合无菌检查法的规定,仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。

无菌检查应在环境洁净度B 级背景下的局部A 级洁净度的单向流空气区域内或隔离系统中进行，其全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。

单向流空气区、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度确认。

隔离系统应定期按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。

日常检验还需对试验环境进行监控。

无菌检查人员必须具备微生物专业知识，并经过无菌技术的培训。

培养基硫乙醇酸盐流体培养基主要用于厌氧菌的培养，也可用于需气菌培养；胰酪大豆胨液体培养基适用于真菌和需气菌的培养。

培养基的制备及培养条件培养基可按以下处方制备，亦可使用按该处方生产的符合规定的脱水培养基。

配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。

制备好的培养基应保存在2～25℃、避光的环境，若保存于非密闭容器中，一般在3周内使用；若保存于密闭容器中，一般可在一年内使用。

1. 硫乙醇酸盐流体培养基酪胨 (胰酶水解) 15.0g 酵母浸出粉 5.0g葡萄糖 5.0g 氯化钠 2.5gL-胱氨酸 0.5g 新配制的 0.1% 刃天青溶液 1.0ml硫乙醇酸钠 0.5g 琼脂 0.75g(或硫乙醇酸) （ 0.3 ml) 纯化水 1000ml除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微温溶解，调节pH 为弱碱性，煮沸，滤清，加入葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调节pH 值使灭菌后为7.1±0.2。

分装至适宜的容器中，其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培2养基氧化层（粉红色）不超过培养基深度的1/2。

灭菌。

在供试品接种前，培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/5，否则，须经100℃水浴加热至粉红色消失（不超过20 分钟），迅速冷却，只限加热一次，并防止被污染。

2015版药典无菌检查法与微生物鉴定

μm
A级 3520准(1)
浮游菌 cfu/ m3
沉降表面微生物
菌接触碟（f9 / 0mm）（f55 cfu mm） /4h(2) cfu /
5指手套 cfu /手套
<1 <1 <1 <1
B级 3520
29
352000 2900
10 5
5
5
C级 352000 2900 3520000 29000 100 50 25
2015版中国药典通则
9203 药品微生物实验室质量管理指导原则 9205 药品洁净实验室微生物监测和控制指导原则 9206 无菌检查用隔离系统验证指导原则
GMP2010年版对洁净度的规定及确认标准
悬浮粒子最大允许数/立方米
洁静态净
动态
度
级 ≥0.5
≥5.0 ≥0.5
≥5.0
别 μm
μm μm
比较项目
检验条件规定人员要求培养基、培养条件与时间
培养基灵敏度检查与方法验证用菌株检验方法稀释剂与薄膜过滤冲洗液
结果判断与复试规定
ChP2010
USP35
EP7.0
总体10000级、局部100级
应在无菌条件下进行。
应在无菌条件下进行。
具备微生物专业知识，并经过无经培训和认可菌技术的培训
经培训和认可
硫乙醇酸盐流体培养基
30～35℃；20～25℃(三部）
改良马丁培养基 23～28℃
均培养14天，
转种后细菌培养2天、真菌培养3天
硫乙醇酸盐流体培养基 30～35℃ 胰酪大豆胨液体培养基
20～25℃ 培养不少于14天转种后培养不少于4天

无菌检查操作规程2015

无菌检查操作规程1.目的建立无菌检查标准操作规程，确保检查结果准确、可靠。

2.使用范围本公司无菌产品的无菌检查3.职责质量部QC4.依据2015版《中国药典》通则1101GB/T 19973.2—2005(ISO11737—2：1998）《疗器械的灭菌微生物学方法第2部分:确认灭菌过程的无菌试验》GB/T 14233。

2-2005 《医用输液、输血、注射器具检验方法第2部分：生物学试验方法》5.内容5.1.无菌检查环境保障5.1.1.无菌检査的所有操作均需在严格控制微生物污染的环境下进行，即无菌检査应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行。

5.1.2.操作环境的无菌保障程度将直接影响无菌检查结果，为了保证无菌检查用洁净室（区）环境的稳定性，确保检查结果的可靠性，对洁净室（区）的环境定期监测并采取合理的措施保证洁净环境符合要求。

5.1.3.无菌检查全过程必须严格遵守无菌操作,防止微生物污染.5.1.4.洁净区的温度、湿度等参数必须符合相应洁净级别的要求.5.1.5.无菌检查操作还需要对检查环境进行监控，5.2.培养基、稀释液、缓冲液5.2.1.硫乙醇酸盐流体培养基,市售培养基干粉.除另有规定，接种后应置30～35℃培养.5.2.2.胰酪大豆胨液体培养基，市售培养基干粉。

接种后应置20~35℃培养. 5.2.3.中和或灭活用培养基，按上述硫乙醇酸盐流体培养基或胰酪大豆胨液体培养基的处方及制法，在培养基灭菌或使用前加入适宜的中和剂、灭活剂或表面活性剂，其用量同方法适用性试验.5.2.4.胰酪大豆胨琼脂培养基，市售培养基干粉。

5.2.5.沙氏葡萄糖液体培养基，市售培养基干粉。

5.2.6.沙式葡萄糖琼脂培养基，市售培养基干粉。

5.2.7.PH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液，市售培养基干粉。

5.2.8.0.9％无菌氯化钠溶液.5.2.9.培养基使用性检查无菌检査用的硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基等应符培养基的无菌性检査及灵敏度检査的要求。

2015版无菌检查法

2015版无菌检查法
方法适用性试验
结果判断
与对照管比较，如含供试品各容器中的试验菌均生长良好，则说明供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计，照此检查方法和检查条件进行供试品的无菌检查。如含供试品的任一容器中的试验菌生长微弱、缓慢或不生长，则说明供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用，应采用增加冲洗量、增加培养基的用量、1使3 用中和剂或灭活剂2015版、无菌检查法
无菌性检查每批培养基随机取不少于 5 支（瓶），置各培养基规定的温度培养 14天，应无菌生长。
6
2015版无菌检查法
培养基的适用性检查
灵敏度检查
菌液制备接种金黄色葡萄球菌、铜
7
2015版无菌检查法
培养基适用性检查直观区别
2010版 2015版
相应菌种接种所用培养基
金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌
胰酪大豆胨液体培养基
营养肉汤培养基调节 pH 值使灭菌后为 7.2 ± 0.2
胰酪大豆胨琼脂培养基
营养琼脂培养基调节pH 值使灭菌沙氏葡萄糖液体后为 7.2±0.2 培养基
改良马丁琼脂培调节 pH值使灭菌沙氏葡萄糖琼脂
养基
后为 6.4±0.2 培养基
5
调节 pH 使灭菌后pH值为 7.3±0.2
照菌；抗厌氧菌的供试品，以生孢梭菌为
对照菌；抗真菌的供试品，以白色念珠菌
为对照菌。阳性对照试验的菌液制备同方
法适用性试验，加菌量小于 100cfu，供试
品用量同供试品无菌检查时每份培养基接
种的样品量。阳性对照管培养 48～72 小时
16
9
2015版无菌检查法

2015年药典无菌检查(常州培训)

Ø 注：菌悬液在室温下2h使用,若保存在2 ～8 ℃可在24小时内使用。
2020年1月
228
9.3 培养基灵敏度检查
培养基灵敏度检查使用6株菌见下表
2020年1月
229
9.4 培养基适用性检查
培养基接种
金黄色葡萄球菌2支
硫乙醇酸盐流体培养基
铜绿假单胞菌2支
12ml（7支）
生孢梭菌2支
空白对照1支分别接种小于100cfu金黄色葡萄球菌、铜绿假单孢菌、生孢梭菌菌悬液各2支,另1支不接种作为空白对照,培养3天，逐日观察结果。
3)方法适用性试验按“供试品的无菌检查”的规定及下列要求进行操作。对每一试验菌应逐一进行方法确认。
2020年1月
333
10.1 方法适用性试验
菌种及菌液制备：除大肠埃希菌
（Escherichia coli）[CMCC(B) 4 4102〕外，
金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉同培养基灵敏度检查。
2020年1月
226
注：10倍梯度稀释；选择适宜的3个稀释级别；要求＜100cfu/ml。
2020年1月
227
9.2 培养基适用性检查
菌液制备
Ø 接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体基中或胰酪大豆胨琼脂培养基上，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30～35℃培养18 ～24h；
Ø供试品检查时，培养基的用量和高度同方法适用性试验。
2020年1月
224
9、培养基适用性检查
Ø 无菌检查用的硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基等应符合培养基的无菌检查及灵敏度检查的要求。

2015年版《中国药典》无菌检查法解读

2015年版《中国药典》无菌检查法解读杨晓莉;李辉;绳金房;钱维清;胡昌勤【摘要】目的解读2015年版《中国药典》无菌检查法的主要增修订情况.方法对比2015年版《中国药典》无菌检查法与2010年版《中国药典》无菌检查法的主要差异.结果 2015年版《中国药典》无菌检查法在检查内容、检查方法、培养体系及质量控制理念等方面都作了较大修订.结论 2015年版《中国药典》将无菌检查法完善成为更加科学并与国际接轨的检查方法.【期刊名称】《中国药业》【年(卷),期】2015(024)024【总页数】5页(P7-11)【关键词】无菌检查法;2015年版《中国药典》;无菌药品;培养体系;质量控制【作者】杨晓莉;李辉;绳金房;钱维清;胡昌勤【作者单位】陕西省食品药品检验所,陕西西安 710065;陕西省食品药品检验所,陕西西安 710065;陕西省食品药品检验所,陕西西安 710065;上海市食品药品检验所,上海 201203;中国食品药品检定研究院,北京 100050【正文语种】中文【中图分类】R954;R921.2无菌检查法是指用于检查药典要求无菌的药品、生物制品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的方法［1］，是药品微生物检查体系的重要组成部分，药品微生物是关系药品安全性的关键指标之一。

无菌药品的微生物污染是影响药品生产质量和引发临床不良事件的主要因素，近年来发生的“欣弗事件及刺五加事件”等严重药害事件都是无菌药品的微生物污染导致［2］。

目前，美国、欧盟、日本等国家或组织无菌检查法已协调一致［3］。

2010年版《中国药典》及之前版本收录的无菌检查法与国际通用的标准在检查理念、培养体系、方法要求等诸多方面有显著差异。

在国家药品安全规划与标准提高的目标下，2015年版《中国药典》借鉴国外药典先进技术经验，以新的控制理念为指导，结合我国国情对无菌检查法的检测范围及环境要求、培养体系、方法适用性、检查方法、偏差调查与过程控制等方面都做了较大修订，进一步完善了无菌检查法，修订后的无菌检查法正逐步与国际通用标准一致。

1无菌试验操作规程-2015版中国药典

1.目的：制定无菌检验标准操作规程，确保检验操作正确。

2.范围：本标准适用于本公司成品无菌检验操作。

3.职责：生产部负责提供待检验产品，质量部负责检验，出具检验报告。

4.内容：4.1.标准依据：《中国药典》2015年版通则（1101）无菌检查法。

4.2.简述：无菌检查方法系用于检查无菌医疗器械是否无菌的一种方法。

若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。

4.3.环境要求：该项检查应在无菌条件下进行。

其全过程必须严格遵守无菌操作。

防止微生物污染，但所采取的措施不得影响供试品中微生物的检出。

操作前环境洁净度应经验证。

日常检验需对试验环境进行监控。

4.4.方法验证：进行该项检查前应进行方法适用性试验。

4.5.人员要求：无菌检查人员必须具备微生物专业知识，并经过无菌技术培训。

4.8.消毒剂配制：75％乙醇溶液（配制酒精棉球用）。

0.2％新洁尔灭溶液（配制消毒棉球用）。

2％来苏尔溶液（配制消毒棉球用）。

4.9.试剂及培养基的配制：4.9.1.0.1％蛋白胨水溶液：取蛋白胨1.0g，加水1000ml,微温使溶解，滤清，调节PH值至7.1±0.2，分装，灭菌。

2015版《中国药典》无菌、洁净室测定

24
2010 版
1.接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌新鲜培养物 ----至营养肉汤培养基或营养肉汤琼脂培养基上 2.接种生孢梭菌的新鲜培养物 ----至硫乙醇酸盐流体培养基中 3.接种白色念珠菌的新鲜培养物 ----至改良马丁培养基中或改良马丁琼脂培养基上 4.接种黑曲霉的新鲜培养物 ----至改良马丁琼脂斜面培养基上
1
2
无菌检查的起源无菌检查的发展历史无菌检查法的发展宗旨
3
与静脉输液的起源和应用有关
——1665年，欧洲勃兰登堡候国御医约翰▪西吉斯蒙德▪埃尔斯霍尔茨发表了《新灌药法及其方式方法》 ——1831年，西欧霍乱肆虐，为了拯救在死亡线上挣扎的病人，苏格兰医生赖特大胆启用静脉输液疗法，他将大量煮沸过的食盐水静脉输注给霍乱病人使大部分病人得救。 ——赖特在实践中观察到了输液产生的“注射热” ——随着显微镜的发明和微生物的发现，人们开始了输液无菌检查的研究。
3.以国际发展趋势为主导，遵照2015年版药典编制大纲要求，最终以二部为基础，在检验数量、检验量、阳性对照样品量、阳性对照试验方法、培养温度等方面互相兼顾，作原则性要求而不作具体细则规定。致力于今后逐步统一完善。
局限性
微生物污染可以发生在生产、储存、运输、货架、使用等环节任何时段，产品中微生物的污染可以是不均匀的。
8
比较项目
实验环境要求
2010
总体1000级、局部100级
USP35
应在无菌条件下进行
EP7.0
应在无菌条件下进行
人员要求
培养基、培养条件与时间
具备微生物专业知识，并经过无菌技术培训
均培养14天，转种后细菌培养2天、真菌培养3 天