稳定转染细胞株的制备

稳定转染细胞株的制备

带质粒的大肠杆菌的激活和扩增

（1）取-80℃冻存的带有质粒的大肠杆菌在室温解冻，或者放置37℃恒温水中约 2min,待冰完全融解即可使用。

（2）LB 培养基的制备按照如下配方配制

胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L

酵母提取物(Yeast extract) 5g/L

氯化钠(NaCl) 10g/L

用 NaOH 调节该培养基的 pH,使其达到 7.4，高温高压灭菌后室温保存，使用时加入氨苄青霉素(浓度为 0.1mg/ml)

（3）LB 固体培养基的制备到 200mlLB 液体培养基加入 3g 琼脂混匀后高温高压灭菌，待冷却至约55℃时在无菌条件下加入氨苄青霉素摇匀，分别倒入 6-7 个培养皿中，用封口膜封边，并倒置放于4℃保存。

（4）扩增用接种环按照四线法将解冻后的工程菌涂布接种到 LB 固体培养基上，待凉干后，用封口膜将培养皿封闭，然后倒置于37℃恒温箱中培养过夜(不能摇晃)，根据情况可适当延长培养时间。观察培养基上的单克隆工程菌，待长出后，用接种环将一个单克隆工程菌转移接种到 10mlLB 液体培养基中，放入掁荡培养箱中37℃摇荡培养过夜，第二天观察，待 LB 液体培养基变浑浊后，4℃ 冰箱保存，以待进行下一步质粒的提取。

质粒的提取

准备质粒提取盒和扩增的带质粒大肠杆菌培养液

（1）取 75ml 扩增变浑浊的 LB 液体培养基置于试管中。

（2）5,000×g 离心 10 分钟，弃去上清液，将试管倒置在滤纸上空干。

（3）取出质粒提取盒，用 3ml 细胞重悬浮液对试管中的细胞进行重悬浮。

（4）加入 3ml 细胞裂解液，轻轻摇晃试管混匀，室温下孵育 3 分钟，产生白色絮状沉淀，然后加入 5ml 中和液混匀

（5）将 Clearing Column(兰色)放入一新的 50ml 离心管，将上述试管中裂解后的液体倒入兰管，孵育 2 分钟，1500×g 离心 5 分钟，效果不佳的话可再离心一次，离心液待用。

（6）将 Binding Column(白色)放入一新的 50ml 离心管，取上述离心液倒入白管，1500×g 离心 3 分钟，弃去离心液。

（7）在白管中加入 5ml 内毒素清洗液(需加异丙醇)，1500×g 离心 3 分钟，弃去离心液，在白管中再加 20ml 柱洗液(含有乙醇)，1500×g 离心 5 分钟，弃去离心液后，继续1500×g 离心 10 分钟，以保证彻底除去乙醇。

（8）取出白管，在滤纸上轻敲白管顶端的尖嘴，以保证去除试管中的乙醇，并用滤纸擦去白管外壁上的乙醇。

（9）把白管放入一个新的 50ml 离心管中，加入 600μl 无核酸酶的水(要把水加到白管中的 DNA 结合膜上),然后 1500-2000×g 离心 5 分钟

（10）收集离心管中的滤液，并转到 1.5mlEP 管中，密封，-20℃保存。

提取质粒的 DNA 电泳鉴定

（1）制胶取 0.15g 琼脂糖，15ml 1×TAE 混匀，微波炉加热 20 分钟，使之熔化，待自然冷却 60-70℃ 时，加入 0.25μl EB,轻轻混匀。

（2）将冷却至约60℃ 的凝胶倒入准备好的胶床内，厚度约 5mm,室温静置 1h,待胶固化后，置于电泳槽中，样品端位于负极。

（3）倒入1×TAE 缓冲液，覆盖住胶面，拔起梳子

（4）在样品中按 1：6 体积比加入上样缓冲液，混匀。

（5）在加样孔中分别加入 Marker 和样品。

（6）盖上电泳槽，通上电，电压 80v,时间约 20-25min,开始电泳。

（7）电泳结束，取出凝胶，照相后观察。

提取质粒后浓度的测定

（1）取 EP 管，标上记号。

（2）其中一个加双重蒸馏水 80μl，其余加样品 80μl(样品按:提取质粒 2μl ，双重蒸馏水 78μl 混匀而成).

（3）用核酸计算器测定，并记录结果。

（4）经测定，PCI-neo-PDCD 重组质粒的浓度为 764ng/μl, PCI-neo-空质粒的浓度为 524 ng/μl.

稳定转染细胞株的筛选

（1）G418 配制取 1g G418,加入 10mlPBS 溶液，浓度为 100mg/ml,完全溶解后，过滤分装到 1mlEP 管中，密封，-20℃保存。

（2）浓度梯度试验确定 G418 的最佳筛选浓度用培养基把 G418 稀释成 100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml、600μg/mll、700μg/ml、 800μg/ml、900μg/ml、1000μg/ml不同筛选浓度。选对数期DU145 细胞消化后稀释成1000-2000cell/ml 细胞悬液，铺 24 孔板，每孔 1ml ，过夜使之贴壁，然后换液，换成含不同浓度 G418 的培养基，培养 10-14 天，每 3 天换一次液，在筛选 10～14 天内能够杀死所有细胞的最小 G418 浓度即为最佳筛选浓度，筛选时比该浓度再高一个级别，维持培养时使用筛选浓度的一半

（3）细胞转染。取对数期前列腺癌 DU145 细胞，消化后用无双抗 10％血清培养液制成细胞悬液(2000cell/ml)，接种到 35mm 培养皿中过夜，培养到 70% 汇合率，进行转染。取出培养皿，吸去培养皿中的培养液，并每皿加入 RPMI 1640 培养液约 0.5ml 重复冲洗细胞两遍，而后每皿加入 RPMI 1640 培养液 1.5ml, 转染复合物混合液 0.5ml. 轻轻混匀，放入37℃， 5％CO2 孵育箱中培养 6 h 左右，进行换液，换成含 10%血清的普通培养基，在37℃，5％CO2 孵育箱中继续培养 24h 左右.

转染复合物的制取：

250μl 无血清培养基 OPTI-MEM + 5μl Lipofectamine 2000（混合 5min）

250μl 无血清培养基 OPTI-MEM +1.9μl 空质粒（混合 5min）

上述二者混合后，室温静置 20min，即为空质粒的转染复合物。

250μl 无血清培养基 OPTI-MEM + 5μl Lipofectamine 2000（混合 5min）

250μl 无血清培养基 OPTI-MEM +1.31μl PDCD5 重组质粒（混合 5min）

上述二者混合后，室温静置 20min，即为 PDCD5 重组质粒的转染复合物。

注: 转染复合物一旦形成，应立即加入培养皿中进行细胞转染。

（4）稳定转染细胞株的筛选

从37℃，5％CO2 孵育箱中取出培养皿，弃去含转染试剂的培养基，用 PBS 冲洗细胞 2 遍，胰蛋白酶消化，接种 1/2 的细胞到 100 mm 培养皿中，加入含 500 μg/ml G418 的新鲜培养基，每 2-3 天更换一次新的筛选培养基，每天观察细胞的死亡情况。当正常细胞完全死亡后，换用新的不含 G418 的培养基培养。每天观察细胞生长状态。在细胞达到60%汇合率时再用含 500 μg/ml G418 的培养基筛选一次。当细胞达到 90%以上汇合率时将细胞转移至培养瓶中继续培养（转染后 10-12 天左右）以后每隔 4-5 天再用含 500 μg/ml G418 的培养基筛选。。直到稳定表达转染质粒的细胞达到一定数量后可以收集样