报告基因检测

荧光素酶报告基因检测原理

荧光素酶报告基因检测原理荧光素酶（Luciferase）是一种常见的报告基因，用于检测基因表达水平或蛋白质交互作用等。

荧光素酶报告基因检测原理主要基于荧光素酶催化氧化荧光素发光的特性，利用荧光素酶与底物荧光素结合后产生荧光的反应来检测特定基因的表达量或蛋白质相互作用。

荧光素酶基因通常被用作报告基因，它不会干扰到被测基因表达的水平或蛋白质相互作用。

荧光素酶基因常与被测基因共同转染到细胞中，然后加入荧光素底物，荧光素酶与荧光素底物结合后发生氧化反应，产生荧光信号，荧光信号与荧光素酶表达量或蛋白质相互作用强度成正比。

通过检测荧光信号的强度，可以精确地反映被测基因的表达量或蛋白质相互作用强度。

荧光素酶报告基因检测原理的实验步骤通常包括以下几个过程：1. 克隆荧光素酶基因：首先需要从合适的来源（如萤火虫）中提取荧光素酶基因，并进行PCR扩增和克隆，将荧光素酶基因插入到合适的表达载体中。

2. 转染表达载体：将克隆好的表达载体转染到目标细胞中，使其表达荧光素酶基因。

3. 加入荧光素底物：加入荧光素底物，荧光素酶与荧光素底物结合后发生氧化反应，产生荧光信号。

4. 检测荧光信号：使用荧光计或荧光显微镜等设备检测荧光信号的强度，从而反映被测基因的表达量或蛋白质相互作用强度。

荧光素酶报告基因检测原理具有灵敏度高、可重复性好、操作简便等优点，因此被广泛应用于基因表达分析、蛋白质相互作用研究、药物筛选等领域。

同时，荧光素酶报告基因检测原理也存在一些局限性，如可能存在背景荧光干扰、荧光素底物的选择和加入量等因素会影响荧光信号的强度。

因此，在实验设计和数据分析过程中需要注意控制这些干扰因素，以保证检测结果的准确性和可靠性。

荧光素酶报告基因检测原理是一种重要的基因表达分析和蛋白质相互作用研究方法，其应用前景广阔，有望在医学、生物学和药物研发等领域发挥重要作用。

双荧光素酶报告基因检测实验步骤

双荧光素酶报告基因检测实验步骤引言：双荧光素酶报告基因检测是一种常用的实验方法，它利用双荧光素酶（Dual-Luciferase）系统来研究基因表达的调控机制。

本文将详细介绍双荧光素酶报告基因检测的实验步骤，以及实验中需要注意的事项。

一、材料准备1. 双荧光素酶报告基因载体：包含荧光素酶基因和Renilla荧光素酶基因。

2. 细胞培养基：适用于所研究细胞的培养基。

3. 转染试剂：常用的转染试剂有聚乙烯醇（Polyethylenimine，PEI）、脂质体等。

4. 荧光素酶底物：如荧光素、Renilla荧光素等。

5. 其他实验所需试剂：如维生素C、PBS缓冲液等。

二、细胞处理1. 细胞培养：将所研究的细胞株接种在含有适当浓度的培养基中，培养至适当的细胞密度。

2. 细胞分组：根据实验设计，将细胞分为实验组和对照组。

3. 细胞转染：将双荧光素酶报告基因载体转染至细胞中，可以使用PEI等转染试剂进行转染。

三、荧光素酶检测1. 收集细胞：根据实验设计，收集转染后的细胞。

2. 细胞裂解：使用细胞裂解缓冲液裂解细胞，释放内部的荧光素酶和Renilla荧光素酶。

3. 荧光素酶检测：将细胞裂解液与荧光素酶底物混合，测定荧光素酶活性。

4. Renilla荧光素酶检测：将细胞裂解液与Renilla荧光素酶底物混合，测定Renilla荧光素酶活性。

四、数据处理与分析1. 荧光素酶活性计算：根据荧光素酶底物降解产生的荧光信号强度，计算荧光素酶活性。

2. Renilla荧光素酶活性计算：根据Renilla荧光素酶底物降解产生的荧光信号强度，计算Renilla荧光素酶活性。

3. 相对荧光素酶活性计算：将荧光素酶活性除以Renilla荧光素酶活性，得到相对荧光素酶活性。

4. 统计分析：使用适当的统计方法，如t检验、方差分析等，对实验数据进行统计分析。

五、注意事项1. 实验条件统一：实验过程中，保持细胞培养条件的统一，如培养基组成、温度、湿度等。

报告基因

报告基因定义报告基因(reporter gene)是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。

把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控，筛选得到转化体。

特征作为报告基因，在遗传选择和筛选检测方面必须具有以下几个条件：(1)已被克隆和全序列已测定；(2)表达产物在受体细胞中本不存在，即无背景，在被转染的细胞中无相似的内源性表达产物；(3)其表达产物能进行定量测定。

应用在植物基因工程研究领域，已使用的报告基因有以下几种：胭脂碱合成酶基因(nos)、章鱼碱合成酶基因(ocs)、新霉素磷酸转移酶基因(nptⅡ)、氯霉素乙酰转移酶基因(cat)、庆大霉素转移酶基因、葡萄糖苷酶基因、荧光酶基因等。

nos、ocs这两个基因是致瘤土壤农杆菌(Agrobacterium tumfaciens)的Ti质粒特有的，对Ti质粒进行改造，用相应的致瘤农杆菌转化植物体时，如果外源基因转入植物体中，则这两种报告基因在植物根茎叶中均能表达，不受发育调控，检测时直接用转化体提取液进行纸电泳，染色后在紫外光下观察荧光即可。

nptⅡ、cat及庆大霉素转移酶基因，均为抗生素筛选基因，相关的酶可以对底物进行修饰(磷酸化、乙酰化等)，从而使这些抗生素失去对植物生长的抑制作用，使得含有这些抗性基因的转化体能在含这些抗生素的筛选培养基上正常生长，也可以用转化体提取液体，外用同位素标记，放射自显影筛选转化体。

目前常用的一种报告基因是β-D-葡萄糖苷酶基因，该酶催化底物形成β-D-葡萄糖苷酸，它在植物体中几乎无背景，组织化学检测很稳定，可用分光光谱、荧光等进行检测。

荧光酶基因(luc)是1985年从北美荧火虫和叩头虫cDNA文库中克隆出来的，该酶在有ATP、Mg2＋、O2和荧光素存在下发出荧光，这样就可用转基因植物整株或部分直接用X-光片或专门仪器进行检测。

gus报告基因

gus报告基因随着基因科技的不断发展，越来越多的人开始关注自己的基因信息。

而近年来，Gus报告基因成为了热门话题之一。

那么什么是Gus报告基因呢？Gus报告基因是由Gus Health公司提供的基因检测服务，旨在通过对个体DNA样本的分析，为客户提供关于健康、运动、营养、皮肤护理、基因亲属关系等方面的个性化建议和指导。

近年来，越来越多的人通过Gus报告基因获取自己的基因信息，并通过这些信息来优化自己的生活方式。

Gus报告基因的检测流程十分简单，客户只需要在网上下单，收到检测包裹后依照说明书采集口腔唾液后将样本寄回公司。

约两周后，客户可以获得自己的基因检测结果，并获得个性化的建议和指导。

那么Gus报告基因检测的结果都包括哪些内容呢？首先是健康方面。

Gus报告基因可以检测出客户是否携带有害突变基因，以及是否存在易感基因，提前了解个体健康的风险，有利于尽早采取措施进行预防和治疗。

其次是运动方面。

据研究，每个人的身体对不同类型的锻炼有不同的反应。

Gus报告基因检测结果可以显示客户是否适合进行高强度训练、有氧运动还是力量训练等不同类型的锻炼。

再者是营养方面。

Gus报告基因可以检测出客户是否存在乳糖不耐受、咖啡因代谢能力等基因变异，为客户提供更加个性化的饮食建议。

此外，Gus报告基因还可以检测出客户皮肤老化的风险，提供关于皮肤护理的建议；并且可以通过DNA亲属检测，了解亲属间的遗传关系。

但是需要注意的是，Gus报告基因并不是一份“命运报告单”，不能确定一个人未来发生某种疾病的概率。

每个人的基因信息都受到许多因素的影响，因此仅仅基于基因信息来进行健康管理是远远不够的。

另外，Gus报告基因也不应被视为100%准确的检测解决方案。

每种基因检测技术都有其局限性和误差率。

因此，必须对检测结果不以基因为唯一依据，而是作为综合评估的参考之一。

总的来说，Gus报告基因是一项非常有用的检测服务，可以为人们提供个性化的健康管理指导。

报告基因检测基因检测是一种通过对个体的DNA进行分析，以获取有关其遗传信息的科学方法。

它可以帮助我们了解个体的潜在风险，预测疾病的可能性，并提供个性化的医疗建议。

在本报告中，将介绍基因检测的意义、流程以及结果解读。

一、基因检测意义随着科技的进步，人们对基因的理解也日益深入。

基因检测作为一种无创、高效的检测方法，被广泛应用于医学领域。

它能够帮助我们了解自身的遗传特征，包括易感基因、基因突变等信息。

通过基因检测，我们可以预测一系列可能发生的疾病，如心血管疾病、遗传性癌症等。

同时，基因检测也为个体提供了个性化的医疗建议，包括针对潜在风险的预防措施、早期筛查等。

二、基因检测流程基因检测的流程主要包括样本采集、DNA提取、测序分析以及结果解读。

1. 样本采集：通常采集的样本包括口腔黏膜拭子、唾液或血液等。

这些样本含有个体的DNA，可以用于后续的分析。

2. DNA提取：样本中的DNA需要被提取出来，并进行纯化处理，以保证后续的测序分析的准确性。

3. 测序分析：提取到的DNA将经过测序仪的高通量测序，得到包含个体所有基因信息的原始数据。

4. 结果解读：通过对原始数据的分析和解读，可以得到个体的基因信息，包括潜在风险、遗传病变等。

结果将通过专业的遗传学家或医生进行解读，为个体提供有针对性的医疗建议。

三、基因检测结果解读基因检测结果需要经过专业的解读，以确保准确性和可靠性。

结果将提供有关个体的遗传特征、遗传疾病风险以及潜在的治疗或预防措施等信息。

1. 遗传特征：基因检测可以揭示个体的遗传特征，包括眼色、头发颜色、肤色等。

这些特征信息虽然对健康没有直接影响，但可以帮助个体了解自身遗传背景。

2. 遗传疾病风险：基因检测可以预测个体患某些疾病的可能性。

例如，某些基因突变与癌症的发生存在一定的关联。

通过分析个体的基因数据，可以评估其患某些遗传性疾病的风险。

3. 治疗或预防措施：基因检测结果还可以为个体提供相应的医疗建议。

双荧光素酶报告基因检测实验过程

双荧光素酶报告基因检测实验过程在生物实验室里，双荧光素酶报告基因检测可真是一门有趣的技术。

听起来复杂，其实也不难，咱们就来聊聊这其中的酸甜苦辣吧。

双荧光素酶就像两个好朋友，默契配合，帮助我们探测基因的活动。

想象一下，一对小伙伴儿，打着灯笼，帮你照亮那条神秘的基因小路。

你看看，这灯光一亮，哎呀，所有的秘密都暴露无遗了！咱们实验的第一步就是准备样品。

这个过程呢，就像做一顿美味的家常菜，得有好食材。

我们需要选择适合的细胞或者组织，像是挑选新鲜的蔬菜水果一样，小心翼翼。

然后把这些样品处理得干干净净，保证它们能发出耀眼的荧光。

你瞧，这准备工作就像打好基础，只有基础打牢，后面的实验才会顺顺利利。

就这点小细节，可别大意了哦。

就是要把我们的双荧光素酶基因转染到细胞里。

转染的过程其实挺像是给细胞植入一个小秘密，嘿嘿，细胞可不知道它们要接收什么新鲜玩意儿。

一旦转染成功，细胞就开始疯狂表达这两个荧光素酶，像是开了趴一样热闹。

不久后，这些小家伙儿就会开始发光，灯火通明。

这时候，你可能会想，“哇，真的发光了？”没错，这就是科学的魅力，真是让人惊叹不已啊。

然后，我们就得用荧光显微镜来观察这些细胞。

看着这些发光的小家伙，就像看星星一样，特别美妙。

这里的关键在于调节显微镜的参数，光亮得刚刚好，不多不少。

太亮了可能看不清，太暗了就显得有些无趣。

就像调味料，得掌握好分寸。

这个过程有点像是在做一场灯光秀，要把每一个细节都调到最佳，才能让你眼前一亮。

然后呢，咱们得定量分析一下这些荧光的强度。

说白了，就是要算一算，哪些基因在欢欢喜喜地工作，哪些可能在“打瞌睡”。

这可不是简单的算术题，而是一场数据的盛宴。

把所有的荧光强度都记录下来，汇总成一个漂亮的数据表。

看到那些图表的时候，你会觉得，哎，自己的努力真是没有白费。

每一个数字都像是一颗颗璀璨的宝石，闪闪发光。

哦，对了，实验过程中还得小心翼翼，不要让外部因素影响到结果。

就像在厨房里，锅得掌握好温度，火候过了就糟糕了。

荧光素酶报告基因检测

荧光素酶报告基因检测荧光素酶报告基因检测是一种常用的生物学实验技术，它利用荧光素酶作为报告基因，通过检测其活性来研究目标基因的表达情况。

荧光素酶报告基因检测技术具有灵敏度高、操作简便、结果快速等优点，在分子生物学研究和生物医学领域得到了广泛的应用。

荧光素酶报告基因检测的原理是利用荧光素酶与其底物荧光素结合产生荧光反应，从而实现对目标基因表达的定量和定性检测。

在实验操作中，首先需要构建含有荧光素酶报告基因的表达载体，然后转染至目标细胞中。

随后添加荧光素底物，荧光素酶与底物结合产生荧光信号，通过荧光测定仪器检测荧光强度，从而反映目标基因在细胞中的表达水平。

荧光素酶报告基因检测技术在基因表达调控、信号转导、蛋白质相互作用等方面发挥着重要作用。

通过该技术可以实现对基因表达水平的定量检测，进而研究基因的调控机制和功能。

在药物筛选、基因治疗、疾病诊断等领域，荧光素酶报告基因检测也被广泛应用，为生物医学研究和临床诊断提供了重要的实验手段。

荧光素酶报告基因检测技术的发展不断推动着生物学研究的进步，但在实验操作中也需要注意一些关键问题。

例如，合理设计实验方案、选择合适的表达载体、优化转染条件等，都会对实验结果产生重要影响。

因此，在进行荧光素酶报告基因检测时，需要充分了解该技术的原理和操作要点，严格按照操作规程进行实验操作，确保获得准确可靠的实验结果。

总的来说，荧光素酶报告基因检测技术作为一种重要的生物学实验技术，具有广泛的应用前景和重要的科学研究意义。

通过对目标基因表达水平的检测和分析，可以深入了解基因调控机制、信号转导途径等生物学问题，为生命科学领域的研究提供有力支持。

随着生物技术的不断发展和完善，相信荧光素酶报告基因检测技术在未来会发挥更加重要的作用，为人类健康和生命科学研究做出更大贡献。

报告基因检测系统

第六章报告基因检测系统公司现已发展的有三种报告基因检测系统:NF-Kb,p53,NFAT.根据待检基因对其作用的原理,及在药物,抗体等作用下,产生的不同效果,这三种报告基因系统又具体可以分为:NF-kB 刺激系统和NF-kB 抑制系统;p53刺激系统和p53抑制系统;NFAT刺激系统和NFAT抑制系统.1. NF-kB 报告基因检测系统(NF-kB 刺激系统;NF-kB 抑制系统)1.1细胞培养1)细胞株及材料细胞株: 293-T细胞培养基: DMEM(10%FBS GBICO),DMEM(无血清)培养器皿:T75(75cm2)培养瓶(以下相同),24孔细胞培养板2)细胞培养及铺板a) 传代:用DMEM(10%FBS) 培养基接种293T至75 cm2培养瓶,细胞长满后铺板并传代.注:一般一瓶细胞总数可以达到3×107个,可以按1:8分瓶.b) 铺板:细胞消化:将培养好的293 T细胞,倾去培养基,加入1-2ml1×胰酶轻轻摇晃以覆盖整瓶细胞,37℃培养箱放置2-3min,观察细胞从瓶壁上脱落下来(也可以用手拍击瓶壁),显微镜下观测到细胞成单个,或是只有2-3个细胞聚团,即可以加入含有血清的DMEM(10%FBS) 10ml左右,终止胰酶的消化作用,随后从中取少量细胞计数.细胞计数:如果细胞密度较大,可按一定倍数稀释后计数,细胞密度的计算按照公式:细胞密度(单位:个/ml)=(4个大方格的细胞总数/4)×104×稀释倍数铺板: 24孔板按照每孔1.0105(NF-kB 刺激系统)或0.8105(NF-kB 抑制系统),接种体积为500L来铺板.细胞加入后将24孔板沿水平面桌面的方向前后左右来回晃动(勿转动),使细胞能够均匀分布,放置细胞培养箱生长.1. 2 转染1)试剂及材料:转染试剂:Lipofectamin 2000质粒: a:对照质粒:pEF-BOSTRAF6(NF-kB 刺激系统)Dominant negative TRAF6 (NF-kB 抑制系统)b:NF-kB-luc report plasmidc:目的基因质粒,构建在pEF-FN载体上2)转染:铺板后24小时转染,每个样品须作3个重复孔,目的是为消除实验误差,并且在24孔板上相应位置做好标记.在A,B两个eppendorf管中分别加入:A:0.1g NFkB-luc reporter gene+0.4g interest gene+ serum free DMEM 至终体积50l/孔.B:1.5L lipofectamine 2000+48.5L serum free DMEM 体积为50l /孔,室温放置5minA,B二者混合,室温放置20-30min后将混合液缓慢而均匀的加到24孔板细胞液中,每孔为100L,轻轻摇晃,使DNA分布均匀,培养24hr.NF-kB 刺激系统:negative cotrol: pEF-BOSpositive control:TRAF6,NF-kB 抑制系统:negative cotrol: pEF-BOSpositive control:Dominant negative TRAF6(TRAF6 DN).(进一步具体转染方法可以参照Lipofectamin2000的说明书.)1.3 细胞收获及处理刺激因子:TNF(肿瘤坏死因子),母液浓度2g/Ml,使用浓度20ng/mlBuffer: 5×PBL裂解液 (Tricine:pH7.8,40 mM;NaCL: 50 mM;EDTA: 2 mM;MaSO4: 1 mM;DTT: 5 mM;Triton X-100:1% )1) NF-kB 刺激系统:转染后24小时先通过荧光显微镜观察GFP表达的强弱以判断转染效率,处理细胞.2)NF-kB 抑制系统:转染后24小时先通过荧光显微镜观察GFP表达的强弱以判断转染效率加药刺激:TNF用DMEM 培养基稀释后,200l/孔换液.加药刺激12-16小时后收细胞.3)细胞处理:吸干培养液,24孔板中每孔加入1×PBL buffer,在摇床上振荡10-15分钟.置于冰上后,取出5l裂解液,加入发光管中,可以马上上机检测,可以马上上机,或放入-80C保存.1.4 luciferase 分析参见promega公司的TECHNICAL MANUAL 上机操作方法附在后面.1.5 Western-blot检测待检基因的表达情况见后.2. p53报告基因检测系统(P53抑制系统)p53刺激系统仍在优化之中,因此主要介绍p53抑制系统的操作步骤.2.1 细胞培养及铺板1)细胞株及材料:细胞株: Saos(p53-/-),细胞骨肉瘤细胞(Osteosarcoma cell),缺失p53基因. 培养基: DMEM(10%FBS GBICO),DMEM(无血清)培养器皿:75cm2培养瓶,24孔细胞培养板2)细胞培养及铺板:a)传代:用DMEM(10%FBS) 培养基接种Saos至75cm2培养瓶,细胞长满后铺板并传代.一瓶75cm2的细胞长满约为1107个.b) 铺板:细胞消化:将培养好的Saos细胞(75cm2培养瓶),倾去培养基,加入2ml胰酶轻轻摇晃以覆盖整瓶细胞,37℃培养箱放置2-3min.观察细胞从瓶壁上脱落下来(也可以用手拍击瓶壁),显微镜下观测到细胞成单个,或是只有2-3个细胞聚团,即可以加入含有血清的DMEM(10%FBS)10 ml左右,终止胰酶的消化作用.细胞计数:如果细胞密度较大,可按一定倍数稀释后计数.细胞密度(单位:个/ml)=(4个大方格的细胞总数/4)×104×稀释倍数铺板:24孔板的细胞接种量为每孔1.0105个,接种体积为500l来铺板.细胞加入后将24孔板沿水平面桌面的方向前后左右来回晃动(勿转动),使细胞能够均匀分布,放置细胞培养箱生长.2.2 转染1)试剂及材料:转染试剂:Lipofectamin 2000质粒: a:对照质粒:pEF-BOS; P53 wild type plasmidb:P53-luc report plasmidc:目的基因质粒,构建在pEF-FN载体上2)转染:铺板后24小时转染,每个样品须作3个重复孔,目的是为消除实验误差,并且在24孔板上相应位置做好标记.在a,b两个eppendorf管中分别加入:a:0.1g P53-luc reporter gene+0.4g interest gene+ 25ng P53 wild type plasmid +serum free DMEM 至终体积50l/孔.(negative cotrol不加P53 wild type plasmid)b:1.5L lipofectamine 2000+48.5L serum free DMEM 体积为50l /孔,室温放置5mina,b二者混合,室温放置20-30min后将混合液缓慢而均匀的加到24孔板细胞液中,每孔为100l,轻轻摇晃,使DNA分布均匀,培养24hr.P53抑制系统:negative cotrol: pEF-BOSpositive control:pEF-BOS+P53 wild type plasmid(进一步具体转染方法可以参照Lipofectamin2000的说明书.)2.3 细胞收获及处理Buffer: 5×PBL裂解液 (Tricine:pH7.8,40 mM;NaCL: 50 mM;EDTA: 2 mM;MaSO4: 1 mM;DTT: 5 mM;Triton X-100:1% )1) 转染后24小时先通过荧光显微镜观察GFP表达的强弱以判断转染效率.2) 细胞处理:吸干培养液,24孔板中每孔加入1×PBL buffer,室温下摇床上振荡10-15分钟.置于冰上,取出5L裂解液,加入发光管中,可以马上上机检测,或放入-80C保存.2.4 luciferase 分析上机操作方法附在后面.2.5 Western-blot检测待检基因的表达情况操作附在后面.3. NFAT报告基因检测系统(NFAT刺激系统;NFAT抑制系统)3.1 细胞培养1)细胞株及材料:细胞株:Jurkat-T细胞培养基:RPMI 1640(10%FBS GBICO;1%双抗),RPMI 1640(无血清)培养器皿:75cm2培养瓶;175cm2培养瓶;25 cm2培养瓶;96孔细胞培养板2)Jurkat-T细胞的培养:Jurkat-T细胞为悬浮细胞,细胞活力好时,镜检多为10-20个细胞聚团,少游离的单个细胞,细胞圆而透亮.一般培养按密度来计算,起始培养密度不要低于1105个/ ml,24hr后细胞密度即可达到2105个/ ml,以此类推在第五天上即可以达到1.6106个/ ml,根据这个来调整接种密度及传代天数.最好细胞的密度高不能超过1.6106个/ ml.例如,起始培养密度2105个/ ml,体积30 ml,在第三天时, 细胞密度达到8105个/ ml,细胞总数达到2.4107个,因为检测一个待检基因的电击所需细胞数量为1107,所以,此培养的细胞数只能做 2.4个样品,因此,根据实验所需要检测的样品数目来调整培养细胞的体积(象175cm2的培养瓶可以培养200-250ml,细胞总数可以达到16-20107,这样就可以电击16-20个样品).3.2 电击转化细胞总数达到检测样品所需则可转染.转染用品:电击仪,400mm 电击杯(Biorad #1652088)质粒: a:对照质粒:NFAT刺激系统:negative control:pEF-BOSposivie control: SYC plasmidNFAT抑制系统: negative control:pEF-BOSposivie control: SLIM plasmidb: NFAT-luc report plasmidc:目的基因质粒,构建在pEF-FN载体上试剂: 台盼蓝(0.4%)用于活细胞计数.1)将Jurkat-T细胞转到50ml离心管中,细胞计数(细胞密度最好在1106左右).2) 1000rpm离心,用无血清的RPMI1640培养液收集细胞,调整浓度为2.5107/ml,每个电极杯中加入400l细胞液(细胞数为1107个).3)依次加入10g NFAT-luc reporter gene和20ug interest gene(体积控制在20l以内),使质粒和细胞混匀(尽量不要有bubble).NFAT-luc reporter gene是每个电击杯都必须加的可以先在加到电击杯之前预先和细胞混好.4)电击条件250V,950F.电击前轻轻弹击电击杯,将杯底的细胞重悬起来,注意不要产生气泡.电击时观察一下time constant(约为24ms).5)电击完后立即弹击电击杯的侧壁数次,室温下放置30min.6)将电极杯中的细胞加到10ml RPMI1640培养液中(含serum)24cm2培养瓶,培养40hr(即培养到第三天上午).3.3 铺板,加药C305:1:60稀释使用PMA: 储存浓度为0.5mg/ml,应用浓度为50ng/ml(稀释10000倍)) Ionomycin: 储存浓度为1mM,应用浓度为1M(稀释1000倍));详见附1.1) 将转染培养40hr后的细胞转到15ml离心管中,进行活细胞计数(台盼蓝染色),离心收细胞,调整细胞浓度为2106个/ml.2) 在96孔板中,每孔加50l细胞(细胞数为1105个),每个样品还是要做3个复孔.NFAT刺激系统,NFAT抑制系统可以同时进行,前者无需加药刺激,后者需要做C305抗体刺激和PMA+ Ionomycin刺激,因此,一个样品需要做9个复孔.按顺序在96孔板中加入细胞,并相应做好标记.3) 对于NFAT刺激系统,直接在每孔中补加50l新鲜培养基,使终体积为100l;对于NFAT抑制系统分别加入50l C305(anti-TCR, 60倍稀释);或50l PMA(50ng/ml)+Ionomycin(1M),刺激8-12小时.3.4细胞收获及处理试剂:5×PBL裂解液(同前).将刺激8-12小时后的细胞取出,每孔加入25L 5PBL buffer,将细胞置于-80C保存,准备第二天检测.3.5 Luciferase检测将细胞培养板取出,37C放置10-15min,将裂解液融化,显微镜下确认细胞已完全裂解,取出5L裂解液置于发光管中,上机检测.3.6.Western-blot检测待检基因的表达情况见下.4.Western-blot试剂:Flag-antibody(1:4000)goat anti-mouse-HRPPierces显色底物.取剩余细胞裂解液加入SDS Loading buffer.裂解液与SDS Loading buffer比例视蛋白浓度而定.一般293 T细胞裂解液按1:1加入2SDS Loading buffer,Jurkat T和Saos细胞裂解液按6:1加入6 SDS Loading buffer.100℃加热变性5-10分钟,上样.聚丙烯酰胺蛋白胶浓度为10%,75V/125V.一般Jurkat T和Saos细胞上样量为20l,293 T细胞为8l.电泳:根据所要分离的蛋白质分子量大小,配制适当浓度的SDS-PAGE胶,常用浓度为10%-20%转膜湿转在一适当容器中加入转移缓冲液,将与凝胶相同大小的硝酸纤维素膜和4张普通滤纸浸泡约10min(若用PVDF膜,则首先要将PVDF膜置于甲醇中浸透10min,然后和硝酸纤维素膜同样使用);依次将2张滤纸,SDS-PAGE胶,膜,2张滤纸叠放在一起,对齐并赶出其中的气泡; 将膜靠近阳极装入转膜电泳槽中(胶在阴极);接通电源,在4℃冰浴中进行转膜,恒流300毫安(或恒压100伏)转膜>1hr,或恒压30伏转膜过夜.B,半干转在一适当容器中加入转移缓冲液,将与凝胶相同大小的硝酸纤维素膜和2张约3mm厚滤纸浸泡约10min;依次将1张滤纸,SDS-PAGE胶,膜,1张滤纸叠放在一起,对齐并赶出其中的气泡; 将膜靠近阳极(底部)装入转膜仪中(膜在下,胶在上);接通电源,恒流0.8毫安/cm2膜, 转膜1.5hrs;杂交(以下各步均置于摇床上进行)a) 将转好的膜浸于5%脱脂奶中封闭30min;b) 将膜浸于含有一抗(终浓度为1μg/ml)的TBST中室温1hr;c) 用TBST将膜浸洗3次,至少10min/次;d) 将膜浸于含有二抗的TBST中室温30min;e) 用TBST将膜浸洗3次,>10min/次,膜即可用于显色反应.若使用偶联酶标抗体(例如:anti-flag-HRP),则在牛奶封闭后, 将膜浸于含有抗体的TBST中1hr,然后用TBST将膜浸洗3次,10min/次,膜即可用于显色反应. 显色目前主要使用PIERCE试剂盒显色将膜表面的液体略微沥干,置于干净的保鲜膜上;将等体积的底物1和底物2混合(通常用量为10μl / cm× cm膜)后,均匀覆盖于膜的表面,避光放置3-5min;将膜表面的液体略微沥干后,用干净的保鲜膜包裹,固定于暗盒中即可压X光片,压片时间可适当调节;显影,定影,分析结果.膜的strip--膜经Strip后可继续用于另一次western blot实验将膜浸于stripping buffer中,50℃放置30min;(最好放在通风柜中)用TBST浸洗膜2次,每次置于摇床上10min;5% 脱脂奶粉封闭30分钟.相关试剂:5×SDS-PAGE电泳缓冲液:Tris碱 15.1g, 甘氨酸94g, SDS 5g,加水定容至1000ml.转膜缓冲液:Tris碱 4.55g, 甘氨酸21.625g, 甲醇 200ml,加水定容至1000ml. TBST:1×TBS,0.1% Tween-20.Stripping buffer 100ml -巯基乙醇: 700ul2%SDS: 2g62.5mM Tris HCl: 0.76g, pH6.75. 注释5.1几种药物的储存浓度和应用浓度TNF 1106U/瓶 1mg=4107U, 1106U=25g 溶于12.5ml PBS中,浓度为2g/ml.储存浓度:2g/ml,100l分装,存于-40℃应用浓度:20ng/ml(稀释100倍)C305 60倍稀释使用.C305原液分装存于-80℃,稀释后存于-20℃,短期(不超于一周)可放置4℃,并加入少量NaN3,无菌操作.PMA and Ionomycin(dissolved in DMSO)PMA:1支1mg溶于2ml DMSO 即0.5mg/ml储存浓度:0.5mg/ml,3l 分装(储存于-80C)应用浓度:50ng/ml(稀释10000倍)Ionomycin: 1mg/747.1(MW)=1.3310-3mmol 溶于 1.33ml,浓度为1mM.(储存于-80C)储存浓度:1mM,6l 分装.应用浓度:1M(稀释1000倍)各系统的controlNF-kB 刺激系统:TRAF6与NFkB reporter gene共转染, 作为positive control. NF-kB 抑制系统:Dominant negative TRAF6与NFkB reporter gene共转染,抑制TNF诱导的NFkB活性.p53抑制系统:wt-P53与p53-luc共转染,作为positive control.NFAT刺激系统:SYK与NFAT-luc共转染,作为positive control.NFAT抑制系统:SLIM与NFAT-luc共转染,抑制C305诱导的NFAT活性,作为positive control.5.3 Lumat LB P507仪器操作步骤开机,和注入反应底物.a.开机后,仪器的液晶屏出现:b.选择 -OTHERS- 选项,进入子菜单:c.选择 OPER.FUNCT.选项,进入菜单:d.选择 REAGENT 选项,进入菜单:e.选择PRIME 选项,进入菜单:f.选择INJECT 1选项,进入菜单:g.取一只干净的上样管插入到检测槽中,显示屏上立即显示:h.选择START 选项,检测槽开始旋转,显示屏上显示:i.当没有加入底物的情况下,此时是将导管内的残留水分抽出,确定导管内的水分全部抽干后,将底物瓶换上,此时屏幕显示程序返回到"e".重复e-h步骤将底物充满整个导管.j.当界面回到"e"时,按"EXIT"键返回到界面"a".上样检测:a.b.选择"MEASURE",进入界面:c.选择"PROTOCOLS",可以打开一个事先储存的程序,进入界面:根据提示键入数字3,并按"enter"键,进入程序3.d.选择"PRINT LIST"选项,可以打印出程序3的各项检测参数:e.选择:"YES"进入界面:f.键入"enter"键,进入界面:g.按提示将样品管插入到检测槽中并按"START"键,开始检测:h.第一个样品的第一个复孔读值出来后,仪器屏幕会自动提示加入第一个样品的第二个复孔样品管:与步骤"g"相同,略,屏幕出现加入第三个复孔样品管:第三个复孔读值出来后,仪器自动计算"MEAN"值,并打印在纸上.屏幕出现下一样品检测命令:以后操作与f-h相同.检测完仪器的清理所有样品检测完毕后,按"exit"键回到仪器开始状态,并将底物瓶换成空瓶:选择"OTHERS"选项,与"1 开机加底物"步骤中的b-d相同,进入:选择"OTHERS"选项,进入界面:c.选择"WASH"选项,进入界面:选择"INJECT 1",与"1 开机加底物"步骤中的f-g相同根据提示选择"START"键,进入界面:将残留在导管中的底物全部吸出后(可回收再用),将空瓶换成水瓶后重复上述操作洗涤1-2遍,直至收集管中无底物颜色为止,再将水瓶换成空瓶后抽干导管中的残留水分,即可按"EXIT"键退回仪器初始菜单,关机.注:双报告基因系统的检测程序为6号程序.。

荧光素酶报告基因检测

荧光素酶报告基因检测
荧光素酶报告基因检测的原理是利用荧光素酶（Luciferase）作为报告基因，将其与感兴趣的基因启动子区域连接，构建成重组融合基因。

当该融合基因转染到细胞中后，若目标基因启动子区域受到调控，荧光素酶的表达水平也会受到影响。

通过加入荧光素底物后，荧光素酶会产生荧光信号，其强度与目标基因的表达水平成正比，从而可以通过检测荧光信号的强度来间接反映目标基因的表达水平。

荧光素酶报告基因检测在科研领域中有着广泛的应用。

首先，它可以用于研究基因的调控机制。

通过构建不同长度或突变的基因启动子区域，可以了解到底哪些区域对基因的表达起着关键作用。

其次，荧光素酶报告基因检测也可以用于筛选药物或其他化合物对基因表达的影响。

通过将荧光素酶报告基因检测与高通量筛选技术相结合，可以快速筛选出对特定基因表达具有调控作用的化合物。

此外，荧光素酶报告基因检测还可以用于研究信号转导通路、蛋白质相互作用等多个研究领域。

相比于其他报告基因检测技术，荧光素酶报告基因检测具有许多优势。

首先，荧光素酶的底物具有极高的灵敏度和稳定性，使得
检测结果具有较高的准确性和重复性。

其次，荧光素酶报告基因检
测的操作简单、快速、成本较低，适用于大规模的样品检测。

此外，荧光素酶报告基因检测还可以通过荧光信号的定量来精确测定基因
的表达水平，而不受到其他细胞因素的干扰。

总之，荧光素酶报告基因检测是一种广泛应用于分子生物学研
究领域的技术，其原理简单、灵敏度高、操作方便、成本低，因此
受到了科研人员的青睐。

相信随着技术的不断进步，荧光素酶报告
基因检测将在生命科学领域发挥更加重要的作用。

双荧光素酶报告基因实验

双荧光素酶报告基因实验双荧光素酶报告基因实验是一种常用的生物学实验方法，用于研究基因的表达情况和调控机制。

该实验利用双荧光素酶作为报告基因，通过测定其荧光强度来反映目标基因的表达水平。

以下是双荧光素酶报告基因实验的详细步骤及注意事项。

实验步骤：1. 转染细胞，首先，将目标基因的启动子区域和报告基因的编码区域克隆到适当的表达载体中，然后将该表达载体转染至目标细胞中。

2. 处理细胞，在转染后的细胞中，根据实验设计的需要，可以给予不同的处理，如药物处理、基因敲除等。

3. 提取蛋白，收集处理后的细胞，进行蛋白提取，并测定蛋白的浓度。

4. 测定荧光强度，将提取的蛋白加入相应的底物，利用荧光分光光度计测定双荧光素酶的荧光强度。

5. 数据分析，根据测定的荧光强度数据，分析目标基因的表达水平及其受到处理的影响。

注意事项：1. 转染条件的优化，不同细胞对转染条件的要求不同，需要进行转染条件的优化实验，以确保转染效率和细胞存活率。

2. 底物的选择，选择适合双荧光素酶的底物，并根据实验需要选择合适的检测波长。

3. 控制实验的设计，在实验中应设置适当的对照组，以确保实验结果的可靠性和准确性。

4. 数据的统计分析，对实验数据进行统计分析，包括均值、标准差等指标的计算，以确保实验结果的可靠性。

总结：双荧光素酶报告基因实验是一种重要的分子生物学实验方法，可以用于研究基因的表达调控机制。

在进行该实验时，需要严格控制实验步骤，注意实验细节，以确保实验结果的准确性和可靠性。

希望本文提供的实验步骤和注意事项对您进行双荧光素酶报告基因实验有所帮助。

报告基因检测

报告基因检测目录1. 基因检测的概念1.1 基因检测的定义1.2 基因检测的原理2. 基因检测的应用2.1 遗传性疾病的风险评估2.2 药物反应性评估3. 基因检测的操作流程3.1 采样3.2 DNA提取3.3 基因检测方法选择3.4 数据分析及结果解读4. 基因检测的优势与局限4.1 优势4.2 局限1. 基因检测的概念1.1 基因检测的定义基因检测是通过科学技术手段，对个体遗传物质中的基因进行检测和分析，以获取有关遗传信息的过程。

1.2 基因检测的原理基因检测原理主要是通过PCR扩增、DNA测序等技术，对个体遗传物质进行分析，检测其中的基因序列。

2. 基因检测的应用2.1 遗传性疾病的风险评估基因检测可以帮助个体评估患遗传性疾病的风险，以采取相应的预防和治疗措施。

2.2 药物反应性评估基因检测可以预测个体对某些药物的反应性，帮助医生做出更加有效和个性化的治疗方案。

3. 基因检测的操作流程3.1 采样基因检测通常需要采集个体口腔内的唾液或者抽取一定量的血液作为样本。

3.2 DNA提取实验室需要提取样本中的DNA，并进行后续的基因检测分析。

3.3 基因检测方法选择根据需要检测的基因信息，选择合适的基因检测方法，如全基因组测序、基因芯片等。

3.4 数据分析及结果解读对基因检测数据进行分析和解读，得出相应的结论并告知相关个体。

4. 基因检测的优势与局限4.1 优势基因检测可以及早发现疾病风险，指导个体的健康管理及治疗方案制定。

4.2 局限基因检测结果有时受到环境和生活方式等外部因素干扰，需要综合考虑。

荧光素酶报告基因检测

荧光素酶报告基因检测荧光素酶报告基因检测是一种非常重要和有效的检测方法。

它是基于荧光素酶报告基因技术的分子生物学技术，可以用来检测特定基因的表达情况。

荧光素酶报告基因检测的原理基于荧光素酶（luciferase）的活性，在其底物（luciferin）存在的情况下可以发出强烈的荧光信号。

因此，通过将荧光素酶基因放入需要检测的基因区域中，可以根据荧光素酶的活性来测定基因的表达情况。

这种技术广泛应用于生化和分子生物学研究，可以用于许多应用，包括药物研发、基因治疗和疾病诊断等。

以下是荧光素酶报告基因检测在三个不同领域的应用案例：1. 荧光素酶报告基因检测在癌症治疗中的应用一项为期一年的研究以多发性骨髓瘤（MM）患者为对象，研究了荧光素酶报告基因检测在癌症治疗中的应用。

结果表明，该检测方法可以用于评估患者对治疗的反应。

这个结果对临床医生更好地选择治疗方案和对治疗效果的监测非常有帮助。

2. 荧光素酶报告基因检测在药物筛选中的应用一项在2020年发表在Journal of Chemical Information and Modeling的研究表明，荧光素酶报告基因检测可以用于筛选潜在的抗病毒药物。

该研究展示了荧光素酶报告基因检测与其他基于荧光的筛选方法相比的优越性，并借此成功地开发了两种新型药物。

3. 荧光素酶报告基因检测在转基因作物研究中的应用一项针对棉花研究的研究表明，荧光素酶报告基因检测可以用于评估转基因作物的基因表达。

该研究在转基因棉花中成功地使用了荧光素酶基因，实现了在植物组织中的基因定量测量和活性报告。

总之，荧光素酶报告基因检测是一种非常有效和多样化的检测方法，其应用范围广泛，可以在许多领域提供有力的支持。

无论是在临床、生物制药还是基因科学领域，荧光素酶报告基因检测都具有重要的应用前景。

同时，荧光素酶报告基因检测在基因表达、蛋白质表达、分泌、酶活性等方面的检测也得到广泛应用。

这种检测方法对于研究疾病分子机制、药物筛选、基因治疗等领域的发展具有重要意义。

报告基因检测原理

报告基因检测原理
基因检测是一项通过对个体基因进行分析来了解其遗传信息的技术，这项技术被广泛应用于医学、生物学等领域。

基因检测的原理是通过对个体DNA序列进行分析，从而得出其遗传信息，例如患病风险、药物代谢能力等。

基因检测的过程包括DNA提取、DNA测序、数据分析等步骤。

DNA提取是基因检测的第一步，它是将个体样本中的DNA分离出来的过程。

常用的DNA提取方法包括血样提取、口腔拭子提取等。

DNA 提取完成后，接下来就是DNA测序。

DNA测序是将DNA序列进行解码的过程，这个过程可以通过不同的技术来实现，例如Sanger测序、高通量测序等。

DNA测序完成后，就需要对数据进行分析了。

数据分析是基因检测的核心，它通过对DNA序列进行分析，得出个体的遗传信息。

数据分析过程中，需要使用各种算法和工具来处理数据，例如比对、变异检测等。

最终，数据分析得出的结果可以帮助人们了解个体的遗传信息，例如患病风险、药物代谢能力等。

总的来说，基因检测原理包括DNA提取、DNA测序、数据分析等步骤，这些步骤需要使用各种技术和工具。

基因检测技术的发展，为人类健康和生物研究带来了很大的帮助。

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报告基因检测方法

报告基因检测方法
以下是 6 条关于报告基因检测方法的内容：
1. 嘿，你知道基因检测就像打开生命密码的钥匙吗？就拿癌症检测来说吧，它能像侦探一样揪出可能藏在身体里的坏家伙！想象一下，如果我们能提前知道身体的风险，那该多好啊。

报告基因检测方法就能做到这点呀！比如说，通过检测特定的基因标记，来判断是否有患病的可能。

这不是很神奇吗？
2. 哇塞，报告基因检测方法简直太酷啦！就好比是给身体内部来一场大揭秘！比如说，对胎儿进行基因检测，能提前了解宝宝是否健康。

这不是像开了上帝视角一样吗？想想看，如果早知道一些潜在问题，那不就能早早做好准备和应对啦！
3. 嘿，报告基因检测方法可不得了啊！就跟在黑暗中点亮一盏明灯似的。

比如说，检测自己是否携带某种遗传疾病的基因，这不就像是给自己的健康提前打预防针嘛！难道你不想知道自己身体里隐藏着哪些秘密吗？
4. 哎呀呀，报告基因检测方法真的太重要啦！它就像是一个超级聪明的顾问。

比如，通过基因检测来选择更适合自己的药物，这多精准啊！这难道不是为我们的健康保驾护航吗？
5. 哇哦，报告基因检测方法真的超厉害的呢！就像是有一双无形的手在操控着一切。

比如，检测自己的运动天赋基因，这不就可以更好地发挥自己的优势嘛！你说这有多神奇呀！
6. 嘿，不得不说报告基因检测方法真的牛！简直就是我们健康的守护天使啊！就像检测过敏基因，以后就能避免那些让我们难受的过敏原啦！这不是给自己的生活带来大大的便利吗？
结论：报告基因检测方法具有非常重要的意义和价值，能让我们更好地了解自己的身体，为健康提供有力的保障。

基因检测报告怎么解读

基因检测报告怎么解读目录1. 概述1.1 什么是基因检测报告1.2 基因检测的意义2. 报告内容解读2.1 遗传疾病风险2.2 药物代谢能力2.3 基因变异解读3. 如何应对基因检测报告3.1 健康管理3.2 生活方式调整3.3 医疗建议4. 数据隐私和安全4.1 个人信息保护4.2 数据使用授权4.3 风险防范措施1. 概述1.1 什么是基因检测报告基因检测报告是通过对个体的基因进行分析，得出与其健康相关的信息的文档。

报告通常包括个体的遗传疾病风险、药物代谢能力、基因变异等内容。

1.2 基因检测的意义基因检测可以帮助个体了解自己的遗传疾病风险，指导生活方式和健康管理，个性化医疗建议等，对于预防疾病、优化健康非常有益。

2. 报告内容解读2.1 遗传疾病风险基因检测报告中的遗传疾病风险部分通常列出个体可能患疾病的概率，包括常见遗传病和罕见病，对于个体未来健康的重点关注提供指导。

2.2 药物代谢能力药物代谢能力部分会根据个体的基因型，评估其对某些药物的代谢能力，从而指导用药安全。

2.3 基因变异解读基因变异解读部分会详细分析个体基因的具体突变情况，解释突变的功能影响和可能的健康风险，为个体提供更深入的遗传信息。

3. 如何应对基因检测报告3.1 健康管理根据基因检测报告的结果，个体可以采取有针对性的健康管理措施，包括定期体检、饮食调整、运动计划等，提高生活质量和健康水平。

3.2 生活方式调整基因检测结果也可以指导个体调整生活方式，如避免某些诱发因素、规律作息、减轻压力等，有助于降低疾病风险。

3.3 医疗建议根据基因检测报告，个体可以获取个性化的医疗建议，包括疾病预防、治疗方案、用药安全等，使医疗更加精准和有效。

4. 数据隐私和安全4.1 个人信息保护在进行基因检测时，确保个人信息的保护，避免信息泄露和滥用，保障个体的隐私权益。

4.2 数据使用授权在向第三方分享基因检测结果时，需明确授权范围和目的，合理使用个体的基因信息，保证数据安全。

荧光报告基因检测

蛋白质相互作用研究
总结词
荧光报告基因检测可用于研究蛋白质相互作用，揭示蛋白质之间的相互关系和作用机制。
详细描述
通过将荧光报告基因与蛋白质进行融合表达，可以观察荧光信号的变化来判断蛋白质之间的相互作用。这种方法能够提供高时空分辨率的蛋白质相互作用信息，有助于深入了解蛋白质的功能和调控机制。
THANKS
感谢观看
细胞定位与追踪
总结词
荧光报告基因检测可用于细胞定位与追踪，观察细胞内不同组分的分布和动态变化。
详细描述
通过将荧光报告基因与细胞内特定组分进行标记，可以观察荧光信号在细胞内的分布和动态变化。这种方法有助于了解细胞内不同组分的分布和功能，为研究细胞生长、发育
和疾病发生机制提供有力支持。
药物筛选与毒性评估
蓝色荧光蛋白 ( BFP)
总结词
蓝色荧光蛋白是一种能够发出蓝色光的荧光报告基因，具有高亮度和稳定性，适用于标记和检测深色物质。
详细描述
蓝色荧光蛋白最早是从珊瑚虫中分离出来的，它可以在蓝光或紫外光的激发下发出蓝色荧光。由于其发出的蓝色光具有较高的亮度，蓝色荧光蛋白在标记和检测深色物质时具有较好的应用价值。然而，与绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白相比，蓝色荧光蛋白的发光
选择荧光报告基因
根据实验目的和需求，选择适当的荧光报告基因，如绿色荧光蛋白 ( GFP) 等。
转染或转化
将荧光报告基因通过转染或转化方法导入到样本中，使其在细胞或组织中表达。
培养与观察
在适当的条件下培养样本，观察荧光报告基因的表达情况，记录荧光信号。
荧光信号的检测与记录
01
选择荧光检测设备
要点一
总结词

报告基因检测系统

第六章报告基因检测系统公司现已发展的有三种报告基因检测系统:NF-Kb,p53,NFAT.根据待检基因对其作用的原理,及在药物,抗体等作用下,产生的不同效果,这三种报告基因系统又具体可以分为:NF-kB 刺激系统和NF-kB 抑制系统;p53刺激系统和p53抑制系统;NFAT刺激系统和NFAT抑制系统.1. NF-kB 报告基因检测系统(NF-kB 刺激系统;NF-kB 抑制系统)1.1细胞培养1)细胞株及材料细胞株: 293-T细胞培养基: DMEM(10%FBS GBICO),DMEM(无血清)培养器皿:T75(75cm2)培养瓶(以下相同),24孔细胞培养板2)细胞培养及铺板a) 传代:用DMEM(10%FBS) 培养基接种293T至75 cm2培养瓶,细胞长满后铺板并传代.注:一般一瓶细胞总数可以达到3×107个,可以按1:8分瓶.b) 铺板:细胞消化:将培养好的293 T细胞,倾去培养基,加入1-2ml1×胰酶轻轻摇晃以覆盖整瓶细胞,37℃培养箱放置2-3min,观察细胞从瓶壁上脱落下来(也可以用手拍击瓶壁),显微镜下观测到细胞成单个,或是只有2-3个细胞聚团,即可以加入含有血清的DMEM(10%FBS) 10ml左右,终止胰酶的消化作用,随后从中取少量细胞计数.细胞计数:如果细胞密度较大,可按一定倍数稀释后计数,细胞密度的计算按照公式:细胞密度(单位:个/ml)=(4个大方格的细胞总数/4)×104×稀释倍数铺板: 24孔板按照每孔1.0105(NF-kB 刺激系统)或0.8105(NF-kB 抑制系统),接种体积为500L来铺板.细胞加入后将24孔板沿水平面桌面的方向前后左右来回晃动(勿转动),使细胞能够均匀分布,放置细胞培养箱生长.1. 2 转染1)试剂及材料:转染试剂:Lipofectamin 2000质粒: a:对照质粒:pEF-BOSTRAF6(NF-kB 刺激系统)Dominant negative TRAF6 (NF-kB 抑制系统)b:NF-kB-luc report plasmidc:目的基因质粒,构建在pEF-FN载体上2)转染:铺板后24小时转染,每个样品须作3个重复孔,目的是为消除实验误差,并且在24孔板上相应位置做好标记.在A,B两个eppendorf管中分别加入:A:0.1g NFkB-luc reporter gene+0.4g interest gene+ serum free DMEM 至终体积50l/孔.B:1.5L lipofectamine 2000+48.5L serum free DMEM 体积为50l /孔,室温放置5minA,B二者混合,室温放置20-30min后将混合液缓慢而均匀的加到24孔板细胞液中,每孔为100L,轻轻摇晃,使DNA分布均匀,培养24hr.NF-kB 刺激系统:negative cotrol: pEF-BOSpositive control:TRAF6,NF-kB 抑制系统:negative cotrol: pEF-BOSpositive control:Dominant negative TRAF6(TRAF6 DN).(进一步具体转染方法可以参照Lipofectamin2000的说明书.)1.3 细胞收获及处理刺激因子:TNF(肿瘤坏死因子),母液浓度2g/Ml,使用浓度20ng/mlBuffer: 5×PBL裂解液 (Tricine:pH7.8,40 mM;NaCL: 50 mM;EDTA: 2 mM;MaSO4: 1 mM;DTT: 5 mM;Triton X-100:1% )1) NF-kB 刺激系统:转染后24小时先通过荧光显微镜观察GFP表达的强弱以判断转染效率,处理细胞.2)NF-kB 抑制系统:转染后24小时先通过荧光显微镜观察GFP表达的强弱以判断转染效率加药刺激:TNF用DMEM 培养基稀释后,200l/孔换液.加药刺激12-16小时后收细胞.3)细胞处理:吸干培养液,24孔板中每孔加入1×PBL buffer,在摇床上振荡10-15分钟.置于冰上后,取出5l裂解液,加入发光管中,可以马上上机检测,可以马上上机,或放入-80C保存.1.4 luciferase 分析参见promega公司的TECHNICAL MANUAL 上机操作方法附在后面.1.5 Western-blot检测待检基因的表达情况见后.2. p53报告基因检测系统(P53抑制系统)p53刺激系统仍在优化之中,因此主要介绍p53抑制系统的操作步骤.2.1 细胞培养及铺板1)细胞株及材料:细胞株: Saos(p53-/-),细胞骨肉瘤细胞(Osteosarcoma cell),缺失p53基因. 培养基: DMEM(10%FBS GBICO),DMEM(无血清)培养器皿:75cm2培养瓶,24孔细胞培养板2)细胞培养及铺板:a)传代:用DMEM(10%FBS) 培养基接种Saos至75cm2培养瓶,细胞长满后铺板并传代.一瓶75cm2的细胞长满约为1107个.b) 铺板:细胞消化:将培养好的Saos细胞(75cm2培养瓶),倾去培养基,加入2ml胰酶轻轻摇晃以覆盖整瓶细胞,37℃培养箱放置2-3min.观察细胞从瓶壁上脱落下来(也可以用手拍击瓶壁),显微镜下观测到细胞成单个,或是只有2-3个细胞聚团,即可以加入含有血清的DMEM(10%FBS)10 ml左右,终止胰酶的消化作用.细胞计数:如果细胞密度较大,可按一定倍数稀释后计数.细胞密度(单位:个/ml)=(4个大方格的细胞总数/4)×104×稀释倍数铺板:24孔板的细胞接种量为每孔1.0105个,接种体积为500l来铺板.细胞加入后将24孔板沿水平面桌面的方向前后左右来回晃动(勿转动),使细胞能够均匀分布,放置细胞培养箱生长.2.2 转染1)试剂及材料:转染试剂:Lipofectamin 2000质粒: a:对照质粒:pEF-BOS; P53 wild type plasmidb:P53-luc report plasmidc:目的基因质粒,构建在pEF-FN载体上2)转染:铺板后24小时转染,每个样品须作3个重复孔,目的是为消除实验误差,并且在24孔板上相应位置做好标记.在a,b两个eppendorf管中分别加入:a:0.1g P53-luc reporter gene+0.4g interest gene+ 25ng P53 wild type plasmid +serum free DMEM 至终体积50l/孔.(negative cotrol不加P53 wild type plasmid)b:1.5L lipofectamine 2000+48.5L serum free DMEM 体积为50l /孔,室温放置5mina,b二者混合,室温放置20-30min后将混合液缓慢而均匀的加到24孔板细胞液中,每孔为100l,轻轻摇晃,使DNA分布均匀,培养24hr.P53抑制系统:negative cotrol: pEF-BOSpositive control:pEF-BOS+P53 wild type plasmid(进一步具体转染方法可以参照Lipofectamin2000的说明书.)2.3 细胞收获及处理Buffer: 5×PBL裂解液 (Tricine:pH7.8,40 mM;NaCL: 50 mM;EDTA: 2 mM;MaSO4: 1 mM;DTT: 5 mM;Triton X-100:1% )1) 转染后24小时先通过荧光显微镜观察GFP表达的强弱以判断转染效率.2) 细胞处理:吸干培养液,24孔板中每孔加入1×PBL buffer,室温下摇床上振荡10-15分钟.置于冰上,取出5L裂解液,加入发光管中,可以马上上机检测,或放入-80C保存.2.4 luciferase 分析上机操作方法附在后面.2.5 Western-blot检测待检基因的表达情况操作附在后面.3. NFAT报告基因检测系统(NFAT刺激系统;NFAT抑制系统)3.1 细胞培养1)细胞株及材料:细胞株:Jurkat-T细胞培养基:RPMI 1640(10%FBS GBICO;1%双抗),RPMI 1640(无血清)培养器皿:75cm2培养瓶;175cm2培养瓶;25 cm2培养瓶;96孔细胞培养板2)Jurkat-T细胞的培养:Jurkat-T细胞为悬浮细胞,细胞活力好时,镜检多为10-20个细胞聚团,少游离的单个细胞,细胞圆而透亮.一般培养按密度来计算,起始培养密度不要低于1105个/ ml,24hr后细胞密度即可达到2105个/ ml,以此类推在第五天上即可以达到1.6106个/ ml,根据这个来调整接种密度及传代天数.最好细胞的密度高不能超过1.6106个/ ml.例如,起始培养密度2105个/ ml,体积30 ml,在第三天时, 细胞密度达到8105个/ ml,细胞总数达到2.4107个,因为检测一个待检基因的电击所需细胞数量为1107,所以,此培养的细胞数只能做 2.4个样品,因此,根据实验所需要检测的样品数目来调整培养细胞的体积(象175cm2的培养瓶可以培养200-250ml,细胞总数可以达到16-20107,这样就可以电击16-20个样品).3.2 电击转化细胞总数达到检测样品所需则可转染.转染用品:电击仪,400mm 电击杯(Biorad #1652088)质粒: a:对照质粒:NFAT刺激系统:negative control:pEF-BOSposivie control: SYC plasmidNFAT抑制系统: negative control:pEF-BOSposivie control: SLIM plasmidb: NFAT-luc report plasmidc:目的基因质粒,构建在pEF-FN载体上试剂: 台盼蓝(0.4%)用于活细胞计数.1)将Jurkat-T细胞转到50ml离心管中,细胞计数(细胞密度最好在1106左右).2) 1000rpm离心,用无血清的RPMI1640培养液收集细胞,调整浓度为2.5107/ml,每个电极杯中加入400l细胞液(细胞数为1107个).3)依次加入10g NFAT-luc reporter gene和20ug interest gene(体积控制在20l以内),使质粒和细胞混匀(尽量不要有bubble).NFAT-luc reporter gene是每个电击杯都必须加的可以先在加到电击杯之前预先和细胞混好.4)电击条件250V,950F.电击前轻轻弹击电击杯,将杯底的细胞重悬起来,注意不要产生气泡.电击时观察一下time constant(约为24ms).5)电击完后立即弹击电击杯的侧壁数次,室温下放置30min.6)将电极杯中的细胞加到10ml RPMI1640培养液中(含serum)24cm2培养瓶,培养40hr(即培养到第三天上午).3.3 铺板,加药C305:1:60稀释使用PMA: 储存浓度为0.5mg/ml,应用浓度为50ng/ml(稀释10000倍)) Ionomycin: 储存浓度为1mM,应用浓度为1M(稀释1000倍));详见附1.1) 将转染培养40hr后的细胞转到15ml离心管中,进行活细胞计数(台盼蓝染色),离心收细胞,调整细胞浓度为2106个/ml.2) 在96孔板中,每孔加50l细胞(细胞数为1105个),每个样品还是要做3个复孔.NFAT刺激系统,NFAT抑制系统可以同时进行,前者无需加药刺激,后者需要做C305抗体刺激和PMA+ Ionomycin刺激,因此,一个样品需要做9个复孔.按顺序在96孔板中加入细胞,并相应做好标记.3) 对于NFAT刺激系统,直接在每孔中补加50l新鲜培养基,使终体积为100l;对于NFAT抑制系统分别加入50l C305(anti-TCR, 60倍稀释);或50l PMA(50ng/ml)+Ionomycin(1M),刺激8-12小时.3.4细胞收获及处理试剂:5×PBL裂解液(同前).将刺激8-12小时后的细胞取出,每孔加入25L 5PBL buffer,将细胞置于-80C保存,准备第二天检测.3.5 Luciferase检测将细胞培养板取出,37C放置10-15min,将裂解液融化,显微镜下确认细胞已完全裂解,取出5L裂解液置于发光管中,上机检测.3.6.Western-blot检测待检基因的表达情况见下.4.Western-blot试剂:Flag-antibody(1:4000)goat anti-mouse-HRPPierces显色底物.取剩余细胞裂解液加入SDS Loading buffer.裂解液与SDS Loading buffer比例视蛋白浓度而定.一般293 T细胞裂解液按1:1加入2SDS Loading buffer,Jurkat T和Saos细胞裂解液按6:1加入6 SDS Loading buffer.100℃加热变性5-10分钟,上样.聚丙烯酰胺蛋白胶浓度为10%,75V/125V.一般Jurkat T和Saos细胞上样量为20l,293 T细胞为8l.电泳:根据所要分离的蛋白质分子量大小,配制适当浓度的SDS-PAGE胶,常用浓度为10%-20%转膜湿转在一适当容器中加入转移缓冲液,将与凝胶相同大小的硝酸纤维素膜和4张普通滤纸浸泡约10min(若用PVDF膜,则首先要将PVDF膜置于甲醇中浸透10min,然后和硝酸纤维素膜同样使用);依次将2张滤纸,SDS-PAGE胶,膜,2张滤纸叠放在一起,对齐并赶出其中的气泡; 将膜靠近阳极装入转膜电泳槽中(胶在阴极);接通电源,在4℃冰浴中进行转膜,恒流300毫安(或恒压100伏)转膜>1hr,或恒压30伏转膜过夜.B,半干转在一适当容器中加入转移缓冲液,将与凝胶相同大小的硝酸纤维素膜和2张约3mm厚滤纸浸泡约10min;依次将1张滤纸,SDS-PAGE胶,膜,1张滤纸叠放在一起,对齐并赶出其中的气泡; 将膜靠近阳极(底部)装入转膜仪中(膜在下,胶在上);接通电源,恒流0.8毫安/cm2膜, 转膜1.5hrs;杂交(以下各步均置于摇床上进行)a) 将转好的膜浸于5%脱脂奶中封闭30min;b) 将膜浸于含有一抗(终浓度为1μg/ml)的TBST中室温1hr;c) 用TBST将膜浸洗3次,至少10min/次;d) 将膜浸于含有二抗的TBST中室温30min;e) 用TBST将膜浸洗3次,>10min/次,膜即可用于显色反应.若使用偶联酶标抗体(例如:anti-flag-HRP),则在牛奶封闭后, 将膜浸于含有抗体的TBST中1hr,然后用TBST将膜浸洗3次,10min/次,膜即可用于显色反应. 显色目前主要使用PIERCE试剂盒显色将膜表面的液体略微沥干,置于干净的保鲜膜上;将等体积的底物1和底物2混合(通常用量为10μl / cm× cm膜)后,均匀覆盖于膜的表面,避光放置3-5min;将膜表面的液体略微沥干后,用干净的保鲜膜包裹,固定于暗盒中即可压X光片,压片时间可适当调节;显影,定影,分析结果.膜的strip--膜经Strip后可继续用于另一次western blot实验将膜浸于stripping buffer中,50℃放置30min;(最好放在通风柜中)用TBST浸洗膜2次,每次置于摇床上10min;5% 脱脂奶粉封闭30分钟.相关试剂:5×SDS-PAGE电泳缓冲液:Tris碱 15.1g, 甘氨酸94g, SDS 5g,加水定容至1000ml.转膜缓冲液:Tris碱 4.55g, 甘氨酸21.625g, 甲醇 200ml,加水定容至1000ml. TBST:1×TBS,0.1% Tween-20.Stripping buffer 100ml -巯基乙醇: 700ul2%SDS: 2g62.5mM Tris HCl: 0.76g, pH6.75. 注释5.1几种药物的储存浓度和应用浓度TNF 1106U/瓶 1mg=4107U, 1106U=25g 溶于12.5ml PBS中,浓度为2g/ml.储存浓度:2g/ml,100l分装,存于-40℃应用浓度:20ng/ml(稀释100倍)C305 60倍稀释使用.C305原液分装存于-80℃,稀释后存于-20℃,短期(不超于一周)可放置4℃,并加入少量NaN3,无菌操作.PMA and Ionomycin(dissolved in DMSO)PMA:1支1mg溶于2ml DMSO 即0.5mg/ml储存浓度:0.5mg/ml,3l 分装(储存于-80C)应用浓度:50ng/ml(稀释10000倍)Ionomycin: 1mg/747.1(MW)=1.3310-3mmol 溶于 1.33ml,浓度为1mM.(储存于-80C)储存浓度:1mM,6l 分装.应用浓度:1M(稀释1000倍)各系统的controlNF-kB 刺激系统:TRAF6与NFkB reporter gene共转染, 作为positive control. NF-kB 抑制系统:Dominant negative TRAF6与NFkB reporter gene共转染,抑制TNF诱导的NFkB活性.p53抑制系统:wt-P53与p53-luc共转染,作为positive control.NFAT刺激系统:SYK与NFAT-luc共转染,作为positive control.NFAT抑制系统:SLIM与NFAT-luc共转染,抑制C305诱导的NFAT活性,作为positive control.5.3 Lumat LB P507仪器操作步骤开机,和注入反应底物.a.开机后,仪器的液晶屏出现:b.选择 -OTHERS- 选项,进入子菜单:c.选择 OPER.FUNCT.选项,进入菜单:d.选择 REAGENT 选项,进入菜单:e.选择PRIME 选项,进入菜单:f.选择INJECT 1选项,进入菜单:g.取一只干净的上样管插入到检测槽中,显示屏上立即显示:h.选择START 选项,检测槽开始旋转,显示屏上显示:i.当没有加入底物的情况下,此时是将导管内的残留水分抽出,确定导管内的水分全部抽干后,将底物瓶换上,此时屏幕显示程序返回到"e".重复e-h步骤将底物充满整个导管.j.当界面回到"e"时,按"EXIT"键返回到界面"a".上样检测:a.b.选择"MEASURE",进入界面:c.选择"PROTOCOLS",可以打开一个事先储存的程序,进入界面:根据提示键入数字3,并按"enter"键,进入程序3.d.选择"PRINT LIST"选项,可以打印出程序3的各项检测参数:e.选择:"YES"进入界面:f.键入"enter"键,进入界面:g.按提示将样品管插入到检测槽中并按"START"键,开始检测:h.第一个样品的第一个复孔读值出来后,仪器屏幕会自动提示加入第一个样品的第二个复孔样品管:与步骤"g"相同,略,屏幕出现加入第三个复孔样品管:第三个复孔读值出来后,仪器自动计算"MEAN"值,并打印在纸上.屏幕出现下一样品检测命令:以后操作与f-h相同.检测完仪器的清理所有样品检测完毕后,按"exit"键回到仪器开始状态,并将底物瓶换成空瓶:选择"OTHERS"选项,与"1 开机加底物"步骤中的b-d相同,进入:选择"OTHERS"选项,进入界面:c.选择"WASH"选项,进入界面:选择"INJECT 1",与"1 开机加底物"步骤中的f-g相同根据提示选择"START"键,进入界面:将残留在导管中的底物全部吸出后(可回收再用),将空瓶换成水瓶后重复上述操作洗涤1-2遍,直至收集管中无底物颜色为止,再将水瓶换成空瓶后抽干导管中的残留水分,即可按"EXIT"键退回仪器初始菜单,关机.注:双报告基因系统的检测程序为6号程序.。

报告基因检测原理

报告基因检测原理
基因检测是一种用于研究人类基因组和遗传变异的方法。

它可以帮助人们了解自己的基因组，并预测可能患有的遗传性疾病。

基因检测的原理主要包括以下几个方面。

首先，基因检测需要收集样本，一般是口腔拭子、血液、尿液等。

样本中的DNA会被提取出来，并经过特定的处理，如PCR扩增等，以增加其数量。

接着，基因检测需要对DNA进行测序。

目前常用的测序技术包括Sanger测序、Illumina测序等。

在测序过程中，DNA序列会被分成小片段，然后被读取和记录下来。

通过对这些片段进行比对和拼接，就可以得到完整的DNA序列信息。

然后，基因检测需要对DNA序列进行分析。

分析的过程包括识别某些特定基因的突变和变异，以及评估这些变异对健康的影响。

这需要比对DNA序列与基因库中的已知基因信息，并进行相关的计算和分析。

最后，基因检测需要将分析得到的结果与临床数据结合，以确定某些基因变异所带来的风险和潜在的健康问题。

这可以帮助医生和患者做出更好的治疗决策和预防措施。

总之，基因检测原理涉及到样本采集、DNA提取、测序分析和临床应用等多个方面。

这项技术对于人类基因组和健康的研究具有重要的意义和应用前景。

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常用的报告基因

常用的报告基因报告基因是一种用于监测基因表达或功能研究的工具。

它们被广泛用于分子生物学、遗传学和细胞生物学等领域。

在报告基因实验中，报告基因通常与目标基因融合，以便通过检测报告基因的表达水平来间接评估目标基因的表达情况。

1. 荧光素酶基因：荧光素酶是一种能够在特定底物存在下产生荧光的酶。

常用的荧光素酶基因包括萤火虫荧光素酶（luciferase）和海肾荧光素酶（renilla luciferase）。

通过检测荧光素酶的活性，可以间接评估目标基因的表达水平。

2. 绿色荧光蛋白基因（GFP）：GFP是一种在特定波长的紫外光照射下能够发出绿色荧光的蛋白质。

GFP可以与目标基因融合，通过观察荧光信号来评估目标基因的表达情况。

3. β半乳糖苷酶基因（βgal）：βgal是一种能够在特定底物存在下产生蓝色沉淀的酶。

通过检测蓝色沉淀的形成，可以间接评估目标基因的表达水平。

4. 荧光素酶基因：荧光素酶是一种能够在特定底物存在下产生荧光的酶。

常用的荧光素酶基因包括萤火虫荧光素酶（luciferase）和海肾荧光素酶（renilla luciferase）。

通过检测荧光素酶的活性，可以间接评估目标基因的表达水平。

5. β半乳糖苷酶基因（βgal）：βgal是一种能够在特定底物存在下产生蓝色沉淀的酶。

通过检测蓝色沉淀的形成，可以间接评估目标基因的表达水平。

这些报告基因在不同的实验中具有各自的优势和特点。

选择合适的报告基因取决于实验目的和实验条件。

通过使用报告基因，我们可以更准确地评估基因表达情况，为科学研究提供有力的工具。

1. 细胞表面标记基因：细胞表面标记基因通常用于监测特定细胞类型的表达或功能。

这些基因可以被融合到目标基因中，通过检测细胞表面标记的表达来间接评估目标基因的表达情况。

2. 报告基因与转录因子融合：在某些实验中，报告基因可以被融合到转录因子中，以监测特定转录因子的活性和功能。

通过检测报告基因的表达水平，可以间接评估转录因子的活性和功能。

什么是报告基因

为什么是报告基因写一篇文章（step by step thinking）在现代科学发展的过程中，报告基因成为了一项重要的研究领域。

报告基因（Reporter Gene）是指在转基因生物中植入的一种可以表达特定的可检测信号的基因，用于追踪和研究目标基因的表达和功能。

它以其独特的特点和广泛的应用领域在生命科学研究中扮演着重要的角色。

在进行生物学研究时，科学家们往往需要了解特定基因的表达和功能。

然而，基因的表达是一个复杂而庞大的过程，传统的研究方法往往难以满足需求。

报告基因技术的出现为科学家们提供了一种高效、准确的研究手段。

报告基因技术的步骤可以分为以下几个方面：1.基因选择：在进行报告基因研究之前，科学家们需要选择合适的基因作为报告基因。

报告基因应具有较高的表达水平、稳定性和可检测性。

常用的报告基因包括荧光蛋白基因（如绿色荧光蛋白基因）、荧光素酶基因等。

2.基因克隆：选定报告基因后，科学家们需要将其克隆到适当的表达载体中。

表达载体是一种能够将基因导入到目标细胞中并实现基因表达的工具。

常用的表达载体包括质粒、病毒载体等。

克隆过程需要进行基因片段的扩增、连接、转化等步骤。

3.细胞转染：一旦成功克隆了报告基因到表达载体中，科学家们需要将表达载体导入目标细胞中。

这个步骤被称为细胞转染，常用的转染方法有化学转染、电转染、病毒载体转染等。

转染成功后，报告基因将被目标细胞所接受。

4.检测和分析：转染后，科学家们可以通过检测和分析报告基因的表达情况来了解目标基因的表达和功能。

常用的检测方法包括荧光显微镜观察、流式细胞术、荧光素酶检测等。

通过这些方法，科学家们可以可视化地观察和定量化目标基因的表达。

报告基因技术的应用领域广泛。

在基因组学研究中，报告基因可以帮助科学家们了解基因调控网络、基因表达的时序和空间分布等。

在药物研发中，报告基因可以帮助科学家们评估药物的效果和副作用。

在生物工程领域，报告基因可以用于监测和优化目标基因的表达水平，提高生产效率。