肠毒性大肠杆菌的绿色荧光蛋白转化及表达研究

第45卷　增刊2006年5月 厦门大学学报(自然科学版)Journal of Xia men University (Natural Science )Vol .45　Sup.M ay 2006 收稿日期:2005212227 基金项目:福建省发展和改革委员会重大产业技术开发专项(20042427)资助 作者简介:朱红梅(1981-),女,硕士研究生. 3通讯作者:fzliubo@ ;htzhou@jingxian .x mu .edu .cn肠毒性大肠杆菌的绿色荧光蛋白转化及表达研究朱红梅1,周涵韬1,23,张赛群1,2,曹　宜2,刘　波23(1.厦门大学生命科学学院,福建厦门361005;2.福建省农业科学院生物技术中心,福建福州350003)摘要:通过电击转化法,将带有gfp 标记基因的pG LO 质粒成功转化到肠毒素型大肠杆菌K 88、K 99中,经过紫外检测及荧光显微镜检测均发现转化菌株发出绿色的荧光,表明gfp 基因得到稳定、高效的表达.进一步通过PCR 分子鉴定、血清型鉴定、微生物学特性分析均表明,转化菌株与原始菌株是一致的.该转化菌株将为研究肠毒性大肠杆菌的致病机理及益生素的筛选提供有效的手段.关键词:肠毒性大肠杆菌;绿色荧光蛋白;遗传转化中图分类号:Q 943.2 文献标识码:A 文章编号:043820479(2006)S 20043204 肠毒素性大肠杆菌(Enter ot oxigenic Escherichia co 2li .,ETEC )是一类引起人和幼畜(初生仔猪、犊牛、羔羊及断奶仔猪)腹泻的重要病原菌,初生幼畜被ETEC 感染后,常因剧烈水样腹泻和迅速脱水而死亡,发病率和死亡率均很高,是目前的研究热点之一[1].猪源产肠毒素性大肠杆菌的黏附素抗原主要有K 88,K 99,987P .来自多管水母(A equoreavitoria )的绿色荧光蛋白(green fluorescence p r otein,GFP )基因是目前应用广泛的一种报告基因[2].在各种不同的系统中表达后,重组GFP 均可吸收蓝光,发出明亮的绿色荧光.与其它生物标记基因比较,它的最大优点是不需要任何底物或额外的辅助因子,利用其发出的荧光就可以实现对生物的活体监测[3],为重组子的筛选及诸多生物学、免疫学试验提供了一个直观手段.本研究利用gfp 基因标记ETEC,希望获得gfp 基因稳定表达、特性稳定的发光标记菌株,为进一步研究ETEC 侵染途径及治病机理奠定基础,同时也方便益生素的筛选及效果评价.1　材料与方法1.1　材　料肠毒性大肠杆菌菌株C83905(K 88ac ),C83529(K 99)由福建省农科院畜牧兽医研究所提供.质粒pG 2LO 购自B i o 2Rad 公司,有Amp (氨卞青霉素)抗性和阿拉伯糖调控蛋白和gfp 基因.蛋白胨为上海生工BB I 公司产品,酵母抽提物为OXO I D 公司.d NTPs 、TaqDNA 聚合酶、购自上海生工;100bp DNA Ladder 购自B i olabs .BECK MAN 冷冻离心机,B i o 2Rad Gene Pulser Ⅱ电穿孔仪,B i o 2Rad 电泳仪,OLY MP US 荧光显微镜.1.2　实验方法(1)质粒提取方法挑取紫外灯下发绿色荧光的质粒宿主菌DH 5α的单菌落,于10mL 含100μg ・mL -1Amp 的LB 液体培养基中,37℃振荡培养过夜.碱裂解法提取质粒[4].提取的质粒用0.8%琼脂糖电泳检测纯度.(2)感受态细胞的制备在NA 液体中摇床震荡培养ETEC 至OD 600为0.6,取菌液冰浴10m in,8000r/m in 4℃离心收集菌体.冰预冷的无菌水洗菌体4次,最后将菌体重悬于10%甘油中,-70℃冰箱保存备用.(3)电击转化2mm 电转化杯冰上预冷后,分别加入100μL 感受态细胞和50ng 质粒,冰浴10m in 后进行电击转化,电击条件为2.5kV ,200Ω,25μF .电击结束立即加入900μL 的NA 培养基,混匀并转入1.5mL 的Eppen 2dorf 管中,于37℃、120r/m in 的摇床上振荡培养2h,取100μL 菌液涂布在NA +100μg ・mL -1Amp +6mg・mL -1阿拉伯糖(ara )筛选培养基上,并置于37℃培养箱培养16h .(4)转化子的荧光检测将筛选培养基上长出的菌落,紫外灯照射检测绿色荧光.用接种环挑取稀释后的菌液置于载波片上,常规压片,荧光显微镜观察.(5)标记菌株的PCR 鉴定细菌基因组DNA 的提取方法参照少量制备・44　・ 厦门大学学报(自然科学版) 2006年DNA [5]的操作步骤,0.8%琼脂糖电泳鉴定基因组DNA.参考李鹏[6]的研究,根据发表的K 88及K 99菌毛结构基因序列,分别合成2对特异性引物.K 88上游引物序列:5′2CAT CTGCTGCAT CTGGT AT 2GG 23′K 88下游引物序列:5′2AATTGCT ACGTT CAGCG 2G AGC 23′K 99上游引物序列:5′2AAAAACACTGCT AGC 23′K 99下游引物序列:5′2AGT AGT AAAT ACGCC 23′50μL PCR 反应体系中包含10×PCR buffer;200μmol/L d NTP;50p mol 引物P1和P2;5U 的Taq DNA 聚合酶,Mg 2+浓度为2mmol/L.K 88PCR 循环参数为:96℃预变性4m in;然后进入94℃60s,57℃60s,72℃60s,共30个循环;最后72℃延伸8m in .K 99PCR 循环参数与K 88相比,除了复性的温度由57℃改为55℃外,其余均相同.1.3%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR 产物.(6)标记菌株的血清型鉴定将转化3代的菌落和原始菌株与标准K 88、K 99因子血清做玻片凝集试验,鉴定其血清型.(7)转化前菌株和未转化菌株的生长曲线测定取过夜培养物,按1%接菌量置于新鲜的LB 液体培养基,于37℃,150r/m in 振荡培养.每隔1h 取样,用紫外分光光度计测OD 600吸收值,重复2次.以时间为横坐标,OD 600值为纵坐标做图,绘制生长曲线.2　结果与分析2.1　转化菌株荧光检测电击转化后筛选培养基上长出的菌落,肉眼直接观察呈绿色,用紫外光照射则发出强烈绿色荧光(图1).用荧光显微镜观察,可看到清晰的绿色发光的杆状细菌.标记菌落分别命名为K 882pG LO 、K 992pG LO (图2).2.2　转化菌株分子鉴定提取转化菌株及原始菌株基因组DNA,进行菌毛结构基因的PCR 扩增.K 88、K 882pG LO 基因组DNA 上都扩增得到大小约为800bp 的预期片段(图3);K 99、K 992pG LO 基因组DNA 上都扩增到大小约为500bp 的预期片段(图4).PCR 鉴定结果表明转化后的宿主菌与原始菌具有基因背景上的一致性.2.3　转化子的血清型鉴定血清学鉴定结果(见表1)表明,所转化菌株K 882pG LO 、K 992pG LO 与未转化的宿主菌K 88、K 99血清型一致.2.4　未转化菌株和转化菌株的生长曲线比较 转化菌株与原始菌株的对照生长曲线如图5、6所示.未转化菌株和转化菌株的生长状况一致.显著性分析表明转化菌株与原始菌株的差异不显著(p >0.05).3　讨　论近年来,国内外对ETEC 的分子结构、致病机理及免疫防治研究进展迅速,取得了一些结果.一般认为表1　菌株血清鉴定结果Tab .1　The ser ol ogical identificati on results of strainsK 88K 882pG LO K 99K 992pG LO O 抗原O 138O 138O 101O 101K 抗原K 88K 88K 99K 99增刊 朱红梅等:肠毒性大肠杆菌的绿色荧光蛋白转化及表达研究 ・45　・图3　K 88、K 882pG LO PCR 产物电泳分析图谱Fig .3　Electr ophoresis analysis f or the PCR a mp lificati onp r oducts of K 88and K 882pG LO M.Marker (100bp ladder );1.the a mp lificati on strand of K 88;2.the a mp lificati on strand of K 882pG LO 图4　K 99、K 992pG LO PCR 产物电泳分析图谱Fig .4　Electr ophoresis analysisfor the PCR a mp lificati onp r oducts of K 99and K 992pG LO ,M.Marker (100bp ladder );1.the a mp lificati on strand of K 99;2.the a mp lificati on strand of K 992pGLO 图5　K 88、K 882pG LO 生长曲线图 Fig .5　The gr owth graph of K 88and K 882pG LO 图6　K 99、K 99pG LO 生长曲线图 Fig .6　The gr owth graph of K 99and K 992pG LO ETEC 属非侵袭性细菌[7],细菌进肠道后,借助位于细菌表面的菌毛上的定居因子(CF Aa )粘附在宿主小肠上皮细胞表面,细菌繁殖并分泌毒素(耐热肠毒素LT(heat stable enter ot oxin )和/或不耐热肠毒素ST (heat labile enter ot oxin ),毒素进入细胞导致水钠代谢混乱,造成分泌性腹泻;但也有研究表明,ETEC 的致病机理可能更复杂,仍有许多不明之处[8],例如该菌是否具有侵袭性,毒素能否进入或影响肠道其它部位组织或细胞,对LT 与ST 的作用部位问题一直未解决[9].陈清等[10]通过切片观察到主要在空肠和回肠组织病变,有明显的炎症反应.用免疫组织化学技术对毒素的定位进行了观察,表明LT 和ST 除分布于粘膜上皮细胞表层外,也分布于肌层细胞,甚至浆膜层,分布弥漫.提出一个假设,LT 和ST 能够通过细胞间隙进入上皮下的粘肌层及肌层,作用于肌细胞.LT 或ST 甚至可进入血流,导致毒血症发生.GFP 检测时具有不需要外源底物或辅助因子而发光的特性,为验证上诉假设提供了一种可能性.有研究发现,用gfp 基因编码绿色荧光蛋白GFP,可以监测基因表达和在活细胞里定位蛋白质,实现在消化道内实时监测GFP 菌株的代谢情况[11,12].Valdivia 等[13]利用GFP 研究了鼠伤寒沙门氏菌(Sal m onella typhi m uri 2um ,St ),结果证明GFP 的表达并不影响菌的侵入宿主过程或在宿主中的繁殖;用落射荧光显微镜可在活的哺乳动物细胞中看到表达的GFP 荧光,从而精确观察到活菌与活宿主细胞之间的相互作用.将带有gfp 标记基因的肠毒性大肠杆菌建立动物感染模型,在体外筛选特定的发光菌株,从而可以分析定植情况,进而为研究其致病机制提供一种手段.目前肠毒性大肠杆菌的gfp 转化及其应用,尚未见报道.同时这种带有荧光标记的肠毒性大肠杆菌在疾病预防治疗上也可以得到应用.添加抗生素是预防和治疗肠毒性大肠杆菌的主要措施之一,但近年来,抗生素的大量使用,引起的高残留,遭到了广泛的置疑和反对,而利用调整肠道正常菌群的微生物活菌剂-益生素[14]作为饲料添加剂的研究和应用已逐渐成为国内外的热点.益生素作用机制中有一种微生物学说,益生素参与消化道有益菌群与致病菌之间生存和繁殖的空间竞争、时间竞争、定居部位竞争以及营养竞争,限制致病菌的生存、繁殖.那如何准确检查治病菌的细菌易・46　・ 厦门大学学报(自然科学版) 2006年位率是评价益生素有效性的一个标准.而带有GFP标记的肠毒性大肠杆菌,通过带有荧光这样的特殊标记,则可以准确、简单、快速的反应细菌易位率[15]的变化,为益生素筛选、评价提供有效的依据.致谢:感谢扬州大学生物药品研究室帮助完成菌株的血清型鉴定.参考文献:[1]　周凯,郑海州,边艳青,等.肠产毒性大肠杆菌分子生物学及基因工程疫苗的研究进展[J].微生物学杂志,2003,23(5):44-47.[2]　Chalfie M,Tu Y,Euskirchen G,et al.Green fluorescentp r otein as a marker of gene exp ressi on[J].Science,1994,263:802-805.[3]　Cody C W,Prasher D C,W ester W M,et al.Che m icalstructure of the hexapep tide chr omophore on Aequorea greenfluorescent p r otein[J].B i ochem istry,1993,32:1212-1218.[4]　萨姆布鲁克J,拉塞尔D W.分子克隆实验指南[M].黄培堂,王嘉玺,朱厚础,等译.3版.北京:科学出版社,2002:27-30.[5]　奥斯伯F,布伦特R,金斯顿RE,等.精编分子生物学实验指南[M].3版.北京:科学出版社,1999:39. 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