肠毒性大肠杆菌的绿色荧光蛋白转化及表达研究

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绿色荧光蛋白

绿⾊荧光蛋⽩

绿⾊荧光蛋⽩（GFP）的转化表达及免疫印迹检测

王媛0811142

南开⼤学⽣命科学学院⽣物技术08级

⼀、摘要：

本实验利⽤酶切⽅法检测载体中所含GFP⽚段后，通过转化的⽅法把绿⾊荧光蛋⽩（GFP）外源基因转⼊⼤肠杆菌进⾏表达，通过免疫印记杂交⽅法（western blotting）分析GFP在⼤肠杆菌中的表达，在分离检测的全过程中（转化平板，细胞裂解，电泳，电转移），均可通过紫外灯清晰地检测到颜⾊亮丽的绿⾊荧光蛋⽩。

关键词：绿⾊荧光蛋⽩免疫印记杂交

⼆、引⾔：

绿⾊荧光蛋⽩是⼀种源于⽔母(Aequorea Victoria)等海洋⽆脊椎动物的蛋⽩，分⼦量为26.9KD。GFP的开放阅读框架长度约为740bp，编码238个氨基酸残基。GFP表达后折叠环化，在氧存在下，由65～67位的氨基酸残基环化，形成发⾊基团，⽆需添加任何酶和底物，在长紫外或蓝光激发下就能发荧光，荧光性质稳定，可保持10分钟。GFP能在不同的细胞内稳定表达，⽆种属、组织和位置特异性，对细胞⽆毒性且检测⽅法简单，将其作为报告基因已⼴泛应⽤于细胞⽣物学和分⼦⽣物学领域。

免疫印记⼜称蛋⽩质印记，是在凝胶电泳技术和固相免疫测定技术基础上发展起来的⼀种免疫检测技术。其原理是将膜与胶放在中间，上下加滤纸数层，做成“Sandwich”样的转移单位，并且保证带负电的蛋⽩质向阳极转移，即膜侧连接阳极或⾯向阳极，从⽽将电泳分离的蛋⽩从凝胶转移⾄固相载体上。

三、实验材料、仪器及⽅法：

3.1 实验材料

3.1.1 菌种

E.coli DH5α(pETH)菌株 E.coli DH5α(pETH-GFP)菌株 E.coli BL21菌株 E.coli BL21

绿色荧光蛋白基因克隆及表达结题报告

3.DNA琼脂糖电泳鉴定质粒
（1）制作胶板：琼脂糖凝胶的制备：称取0.3g琼脂糖，置于耐高温高压试剂瓶中，加入30mL TBE（O.5×TBE）缓冲液，将该试剂瓶放入微波炉加热2-3次，每次1-2分钟，直至琼脂糖溶解，加热时要反复观察溶液中的琼脂糖颗粒是否完全溶解并且
防止溶液溢出。取有机玻璃内槽，洗浄、晾干。取胶带将有机
(5)加入200μL的ddH2O溶解沉淀,加入 100μL醋酸铵,混匀后冰置5min。 (6)以12000r/min离心5min,取上清至一新的 Eppendorf管中,加入2倍体积的无水乙醇,室温放置5min后,以12000r/min冷冻离心15min,弃上清。 (7)沉淀用500μL的70%乙醇洗涤一次,以 12000r/min离心5min,弃上清。除尽乙醇后,冷冻干燥5~10min。 (8)加入20μL含有 RNaseA的ddH20(或TE 缓冲液)溶解提取物,充分溶解。
PART 02
实验技术路线图
菌株培养
DH5α PEGFP
-N3
DH5α PET28a
质粒提取
醋酸铵法
质粒提取
质粒 PEGFP
-N3
质粒 PET28a
电泳检测
检测合格
BamH1 Not1
GFP 连接
28a
切胶回收
GFP
醋酸钠沉淀法回收

绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取

南方医科大学

2011预防医学（卫生检验检疫）

摘要

目的：研究绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因在大肠杆菌中的基因克隆与重组表达，以及对其进行粗提取。方法：从E.coli DH5ɑ中用碱提取质粒的方法提取质粒pEGFP-N3和质粒pET-28a。然后用质粒DNA 的琼脂糖凝胶电泳对已经提取的产物进行电泳，确定从大肠杆菌中成功提取了质粒。再用限制性内切酶BamHI和NotI对成功提取的质粒进行酶切，并对酶切后的质粒进行琼脂糖凝胶电泳，用以确定已经提取了GFP基因。将含有GFP基因的质粒转化到感受态细胞E.coli BL-21中，用LB培养基对转化后的E.coli进行扩大培养。用IPTG诱导GFP基因表达可以看到浅绿色菌落。最后对绿色荧光蛋白进行粗提取。结论：本实验有助于学生掌握最基本的分子生物学实验技术，为进一步的实验奠定基础。

关键词：绿色荧光蛋白基因克隆重组表达转化粗提取

1 前言 (3)

2 实验目的 (4)

3 实验设备 (4)

4 材料及试剂 (5)

5 实验操作步骤 (5)

5.1操作流程 (5)

5.2质粒DNA的分离与纯化 (6)

5.2.1 质粒的培养 (6)

5.2.2 质粒的DNA的碱提取法 (6)

5.2.3 质粒DNA的鉴定与纯化 (7)

5.3酶切及连接 (8)

5.3.1 双酶切 (8)

5.3.2 回收酶切产物（采用DNA回收试剂盒进行回收） (8)

5.3.3 连接 (9)

5.4大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 (9)

绿色荧光蛋白GF基因的克隆表达和粗提取

绿色荧光蛋白G F基因

的克隆表达和粗提取SANY标准化小组#QS8QHH-HHGX8Q8-GNHHJ8-HHMHGN#

绿色荧光蛋白(G F P)基因的克隆、表达和粗提取

南方医科大学

2011预防医学（卫生检验检疫）

摘要

目的：研究绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因在大肠杆菌中的基因克隆与重组表达，以及对其进行粗提取。方法：从 DH5ɑ中用碱提取质粒的方法提取质粒pEGFP-N3和质粒pET-28a。然后用质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳对已经提取的产物进行电泳，确定从大肠杆菌中成功提取了质粒。再用限制性内切酶BamHI和NotI 对成功提取的质粒进行酶切，并对酶切后的质粒进行琼脂糖凝胶电泳，用以确定已经提取了GFP基因。将含有GFP基因的质粒转化到感受态细胞BL-21中，用LB培养基对转化后的进行扩大培养。用IPTG诱导GFP基因表达可以看到浅绿色菌落。最后对绿色荧光蛋白进行粗提取。结论：本实验有助于学生掌握最基本的分子生物学实验技术，为进一步的实验奠定基础。

关键词：绿色荧光蛋白基因克隆重组表达转化粗提取

1 前言

绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿

色荧光。它产生荧光无需底物或辅因子发色团是其蛋白质一级序列固有的。1962 年，下村修等分离纯化了水母中发光蛋白水母素，并发现一种绿色的荧光蛋白。1974 年，他们分离得到了这个蛋白，当时称绿色蛋白，以后称绿色荧光蛋白(GFP)[1]

绿色荧光蛋白在大肠杆菌中的克隆表达

菌体内成功诱导表达。
实验用品
PEGFP -N3模板、菌株E. coli DH5 α、E. coli BL21 、质粒 pET28a 、限制性内切酶 EcoRⅠ、 Hind Ⅲ、T4 DNA连接酶、1 kb DNA ladder
DNA 凝胶回收试剂盒及质粒小提试剂盒、DNA 纯化试剂盒及 IPTG、 PCR用试剂、卡那霉素、琼脂糖及 PCR 合成引物等、蛋白胨、酵母浸出粉、琼脂粉等。
（4）Pet28a的抗性是kana 抗性，通常所用的表达菌株是BL21（DE3），BL21（DE3） Gold等BL21（DE3）系列的宿主菌。
大肠杆菌的表达系统：
BL21（DE3）带有 T7 RNA 聚合酶基因的λ DE3溶原菌,T7 RNA 聚合酶基因由 lacUV5 启动子控制。未诱导时便有一定程度转录，因此适合于表达其产物对宿主细胞生长无毒害作用的一些基因。
目
1 实验背景
2 实验用品及方法介绍
录
3 实验流程
4 实验原理
5 具体实验步骤
6 实验结果预测
7 参考文献
实验背景
200810月8日，瑞典皇家科学院宣布，2008年诺贝尔化学奖由日本科学家下村修、美国科学家马丁·沙尔菲和美籍华裔科学家钱永健获得，他们三人在发现和研究绿色荧光蛋白(GFP)方面取得了突出成就。
实验流程
实验原理

绿色荧光蛋白GFP基因的克隆表达和粗提取

绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取

南方医科大学

2011预防医学（卫生检验检疫）

摘要

目的：研究绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因在大肠杆菌中的基因克隆与重组表达，以及对其进行粗提取。方法：从E.coli DH5ɑ中用碱提取质粒的方法提取质粒pEGFP-N3和质粒pET-28a。然后用质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳对已经提取的产物进行电泳，确定从大肠杆菌中成功提取了质粒。再用限制性内切酶BamHI和NotI 对成功提取的质粒进行酶切，并对酶切后的质粒进行琼脂糖凝胶电泳，用以确定已经提取了GFP基因。将含有GFP基因的质粒转化到感受态细胞E.coli BL-21中，用LB培养基对转化后的E.coli进行扩大培养。用IPTG诱导GFP基因表达可以看到浅绿色菌落。最后对绿色荧光蛋白进行粗提取。结论：本实验有助于学生掌握最基本的分子生物学实验技术，为进一步的实验奠定基础。

关键词：绿色荧光蛋白基因克隆重组表达转化粗提取

1 前言 (3)

2 实验目的 (5)

3 实验设备 (5)

4 材料及试剂 (6)

5 实验操作步骤 (6)

5.1操作流程 (6)

5.2质粒DNA的分离与纯化 (7)

5.2.1 质粒的培养 (7)

5.2.2 质粒的DNA的碱提取法 (7)

5.2.3 质粒DNA的鉴定与纯化 (8)

5.3酶切及连接 (9)

5.3.1 双酶切 (9)

5.3.2 回收酶切产物（采用DNA回收试剂盒进行回收） (10)

5.3.3 连接 (11)

5.4大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 (11)

肠毒性大肠杆菌的绿色荧光蛋白转化及表达研究

K 88上游引物序列 :5′-CA TCTG CTG CA TCTGG TATGG -3′
K 88下游引物序列 :5′-AA TTG CTACG TTCAG CG GAGC-3′
K 99上游引物序列 :5′-AAAAACACTGCTAG C-3′ K 99下游引物序列 :5′-AGTAG TAAA TA CG CC-3′ 50 μL PCR反应体系中包含 10 ×PCR buffer;200 μm o l /L dNTP;50 p m ol 引物 P1 和 P2;5 U 的 T aq DNA 聚合酶 , M g2 +浓度为 2 mm o l /L. K88 PCR 循环参数为 :96 ℃预变性 4 m in;然后进入 94℃ 60 s, 57℃ 60 s, 72℃ 60 s, 共 30 个循环 ;最后 72℃延伸 8 m in. K 99PCR 循环参数与 K88 相比 , 除了复性的温度由 57℃改为 55℃外 , 其余均相同. 1. 3%的琼脂糖凝胶电泳检测 PC R 产物 . (6)标记菌株的血清型鉴定将转化 3代的菌落和原始菌株与标准 K88 、K 99因子血清做玻片凝集试验 , 鉴定其血清型. (7)转化前菌株和未转化菌株的生长曲线测定取过夜培养物 , 按 1%接菌量置于新鲜的 LB液体培养基 , 于 37 ℃ , 150 r /m in振荡培养. 每隔 1 h 取样 , 用紫外分光光度计测 OD 600 吸收值 , 重复 2 次. 以时间为横坐标 , OD 600值为纵坐标做图 , 绘制生长曲线.

绿色荧光蛋白在大肠杆菌中的表达条件优化、纯化及鉴定

信号转导等。利用ＧＰ来检测目标蛋白的定位已为我们Ｆ提供了一种对细胞内的一些基本的生理过程进行更详尽观察
的新方法。本试验将ＧＰ的ｅＮＦＤＡ序列构建到大肠杆菌中表达，并且进行蛋白的纯化。培养过程中对各种条件（温
率 ” 。利用绿色荧光蛋白独特的发光机制，Ｊ可将ＧＰ作为蛋Ｆ
取４支经高温灭菌的装有４ｍＬＬＢ液体培养基的试管，编号，４支试管分别加入１０恤／Ｌ卡那霉素溶液４ｐ。将０ｇｍ．Ｌ பைடு நூலகம்选抗性选择平板上４个单克隆，加入４支已编号试管中，置
于摇床中，７ｏ２０ｒｒｎ培养４ｈ３Ｃ、０／ｉａ。在Ｄ６＝０６～０８０ｏ．．
１４８，０８．０１５
［０李和标．３］运动与大豆异黄酮的联合作用对去卵巢大鼠骨生物力学特性的研究［］Ｊ．齐齐哈尔医学院学报，００３（）１２２１，１７：００
—
１２．０３
［１刘卫平，３］吴［２张３］
颖，董
（Ｅ）３Ｄ３在７℃培养下，６为０６０８使用终浓度为０５ｍｌ的ＩｆＤ０． — ．，０．ｏＬｌＧ在１ ℃诱导培养１时，Ｉ — Ｆ融合ｍ／ｒ５２ｈＨＳＧＰ

绿色荧光蛋白在大肠杆菌中的克隆表达

PCR仪、凝胶成像系统、荧光显微镜DYY-6C电泳槽和电泳仪、高速台式离心机、UV2300 紫外可见分光光度计
目的基因：
EGFP (720bp)的基因片段:
ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGA CGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGA CCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGA CCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCG CCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACC CGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTT CAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATA TCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGAC GGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCT GCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATC ACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGT AA

绿色荧光蛋白基因在大肠杆菌中的克隆与表达

表达载体和宿主菌的选择 E.Coli BL21（DE3）是表达宿主菌

得到重组质粒pET-28a-GFP 转入表达菌株E.Coli BL21（DE3）经培养后用IPTG进行三个时间梯度的诱导表达GFP，紫外线下观察

掌握重组蛋白的基因表达和蛋白检测设计思想学习分子生物学实验主要操作技术

标记！
真核细胞表达载体，pEGFP-N3载体上携带有EGFP蛋白表达基因很强的复制能力高效的功能强大的启动子SV40和PCMV 多克隆位点具有neo基因，可以采用G418来筛选已成功转染了该载体的靶细胞

原核蛋白表达引用最多的系统在任何E.coli表达系统中，基础表达水平最低真正的调节表达水平的“变阻器”控制提供各种不同融合标签和表达系统配置具有可溶性蛋白生产、二硫键形成、蛋白外运和多肽生产等专用载体和宿主菌许多载体以LIC载体试剂盒方式提供，用于迅速定向克隆PCR产物许多宿主菌株以感受态细胞形式提供，可立即用于转化
http://baike.baidu.com/view/992207.ht m http://baike.baidu.com/view/2261117.h tm 郝福英周先碗朱玉贤主编《基础分子生物学实验》北京大学出版社 2010年11月第一版

丝氨酸－酪氨酸－甘氨酸生色基团蛋白质折叠，生色基团得以“亲密接触”, 经环化形成咪唑酮,并发生脱水反应。但此时还不能发射荧光,只有当有分子氧存在的条件下,发生氧化脱氢,方能导致绿色荧光蛋白发色团的“成熟”,形成可发射荧光的形式。

绿色荧光蛋白在大肠杆菌中的表达分子实验设计

绿色荧光蛋白在大肠杆菌中的表达

张历涵2013141241098

彭千2013141241068

一、质粒转化入感受态细胞并培养

1、原理

实验室提供的质粒首先要转入大肠杆菌进行培养与增殖，制备出感受态的细胞，我们就可以方便的将需克隆的质粒导入其中，使其繁殖，就能获得大量质粒。

所谓感受态，是指细菌生长过程中的某一阶段的培养物，只有某一生长阶段中的细菌才能作为转化的受体，能接受外源DNA而不将其降解的生理状态。感受态形成后，细胞生理状态会发生改变，出现各种蛋白质和酶，负责供体DNA 的结合和加工等。细胞表面正电荷增加，通透性增加，形成能接受外来的DNA 分子的受体位点等。本实验为了把外源DNA（重组质粒）引入大肠杆菌，就必须先制备能吸收外来DNA分子的感受态细胞。

2、实验步骤

2.1 DH-5α和BL-21感受态细胞的制备

（1）将0~4 ℃保存的DH-5α和BL-21菌种分别接种在LB液体培养基中37 ℃下250 r/min过夜培养16 h 。

（2）将分别接种过夜菌：LB按1:50的比例接种于2 mL的LB液体培养基中，37 ℃活化培养2～3 h至OD=0.3～0.5 。

（3）取1.5 mL菌液转入EP管中，置于冰上10 min, 然后于4 ℃下5000 r/min 离心5 min。弃上清液，沉淀加入0.1 mL预冷的0.1 mol/L CaCl2缓和悬菌。冰上放置15-30 min后，4 ℃下5000 r/min 离心10 min。

（4）弃上清液，沉淀用0.1 mL预冷的0.1 mol/L CaCl2（含15%甘油）缓和悬菌，放在－20 ℃冰箱内保存。

分子生物学实验设计实验

分子生物学实验设计实验题目：在大肠杆菌中表达绿色荧光基因（EGFP）学院：生命科学学院专业：生态学教师：吴传芳姓名/学号：余光辉/20方成/20

一、实验目的在大肠杆菌中表达绿色荧光蛋白二、实验流程三、实验试剂、材料及步骤(一)质粒DNA的提取1.原理碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。

经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求2.试剂LB培养液:胰蛋白胨（Tryptone）10g，酵母提取物（Yeastextract）5g，NaCl5g，琼脂（固体培养基）15g，用1NNaOH调pH7.5。

溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖，10mmol/EDTA-Na，25mmol/LTris-HCl(pH8.0)溶液Ⅱ：0.4mol/LNaOH，2%SDS临用前1：1配制。

溶液Ⅲ：5mol/L醋酸钾60ml冰醋酸11.5ml双蒸水28.5ml卡那霉素(20mg/mL)抽提液（饱和酚：氯仿：异戊醇=25：24：1）无水乙醇70%乙醇TE缓冲液或ddH2O培养含有pET28a质粒和pEGFP-N3质粒的大肠杆菌收集裂解细菌、分离纯化质粒DNApET-28a-EGFP的表达及观察

绿色荧光蛋白基因克隆及表达结果分析

3 结果与分析

3.1质粒提取

用醋酸铵法提取pET-28a 和pEGFP-N3质粒后，进行琼脂糖电泳检测质粒是否提取成功。得到电泳结果，如图一所示，3、4号泳道有明显清晰的条带说明pEGFP-N3提取成功。1、2泳道同样有明显清晰的条带，说明pET-28a 提取成功。

3.2

双酶切

用BamH1和Not1分别对pEGFP-N3和pET-28a 双酶切。1、2号泳道为pEGFP-N3的酶切结果，如图二所示，电泳会得到两条带，说明pEGFP-N3酶切成功。4号泳道为pET-28a 的酶切产物的电泳有明显条带，证明酶切成功。

3.3 抗性筛选

通过氯化钙法制备DH5α感受态细胞，用热激发将pET-28a-GFP 转入DH5α感

图 1 pET-28a 和pEGFP-N3质粒提取电泳图

1、2泳道为pET-28a 电泳结果 3、4号泳道为pEGFP-N3电泳结果

图 2 BamH1、Not1双酶切 pEGFP-N3和pET-28a

1、2号泳道为pEGFP-N3酶切产物 3号泳道为pEGFP-N3原始质粒 4号泳道为pET-28a 酶切产物 5号用泳道为pET-28a 原使质粒

受态细胞。转化重组质粒后涂平板，进行重组质粒的抗性筛选。因为28a中含有

抗卡那基因，所以筛选后可以得到含28a的重组质粒。从图中可以看出1号平板

长出较多菌落，说明DH5α感受态细胞存活。2号平板无菌落生长，说明DH5α中

不含抗卡那基因。3号板生长出较少菌落，证明卡那有活性。4号板无菌落生长。

失败原因其一可能是在倒了第一个平板加入卡那后，由于倒平板速度太慢，导致

绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取

绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取之杨若古

兰创作

南方医科大学

2011预防医学（卫生检验检疫）

摘要

目的：研讨绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因在大肠杆菌中的基因克隆与重组表达，和对其进行粗提取.方法：从E.coli DH5ɑ顶用碱提取质粒的方法提取质粒pEGFP-N3和质粒pET-28a.然后用质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳对曾经提取的产品进行电泳，确定从大肠杆菌中成功提取了质粒.再用限制性内切酶BamHI和NotI对成功提取的质粒进行酶切，并对酶切后的质粒进行琼脂糖凝胶电泳，用以确定曾经提取了GFP基因.将含有GFP 基因的质粒转化到感受态扩大培养.用IPTG引诱GFP基因表达可以看到浅绿色菌落.最初对绿色荧光蛋白进行粗提取.结论：本实验有助于先生把握最基本的分子生物学实验技术，为进一步的实验奠定基础.

关键词：绿色荧光蛋白基因克隆重组表达转化粗提取

1 前言3

2 实验目的4

3 实验设备4

4 材料及试剂5

5 实验操纵步调5

5.1操纵流程5

5.2质粒DNA的分离与纯化6

5.2.1 质粒的培养6

5.2.2 质粒的DNA的碱提取法6

5.2.3 质粒DNA的鉴定与纯化7

5.3酶切及连接8

5.3.1 双酶切8

5.3.2 回收酶切产品（采取DNA回收试剂盒进行回收）8 5.3.3 连接9

5.4.1 LB（Luria-Bertain）液体和固体培养基的配制（参考附录）9

5.4.2．感受态细胞的制备 (CaCl2法)9

5.4.3 转化涂板10

5.5GFP蛋白的引诱表达10

绿色荧光蛋白(GFP)基因地克隆、表达和粗提取

绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取

南方医科大学

2011预防医学（卫生检验检疫）

摘要

目的：研究绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因在大肠杆菌中的基因克隆与重组表达，以及对其进行粗提取。方法：从 E.coli DH5ɑ中用碱提取质粒的方法提取质粒pEGFP-N3和质粒pET-28a。然后用质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳对已经提取的产物进行电泳，确定从大肠杆菌中成功提取了质粒。再用限制性内切酶BamHI和NotI 对成功提取的质粒进行酶切，并对酶切后的质粒进行琼脂糖凝胶电泳，用以确定已经提取了GFP基因。将含有GFP基因的质粒转化到感受态细胞E.coli BL-21中，用LB培养基对转化后的E.coli进行扩大培养。用IPTG诱导GFP基因表达可以看到浅绿色菌落。最后对绿色荧光蛋白进行粗提取。结论：本实验有助于学生掌握最基本的分子生物学实验技术，为进一步的实验奠定基础。

关键词：绿色荧光蛋白基因克隆重组表达转化粗提取

1 前言 (3)

2 实验目的 (4)

3 实验设备 (4)

4 材料及试剂 (5)

5 实验操作步骤 (5)

5.1操作流程 (5)

5.2质粒DNA的分离与纯化 (6)

5.2.1 质粒的培养 (6)

5.2.2 质粒的DNA的碱提取法 (6)

5.2.3 质粒DNA的鉴定与纯化 (7)

5.3酶切及连接 (7)

5.3.1 双酶切 (7)

5.3.2 回收酶切产物（采用DNA回收试剂盒进行回收） (8)

5.3.3 连接 (9)

5.4大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 (9)

分子生物学实验设计报告绿色荧光蛋白的克隆表达

分子生物学实验设计报告

绿色荧光蛋白的克隆表达

陶成秋20

杨晨20

一、引言

基因标记技术是近年来发展起来的分子生物学技术。荧光蛋白基因在标记基因方面由于具有独特的优点而广受科学家们的关注。荧光蛋白是海洋生物体内的一类发光蛋白，分为绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和红色荧光蛋白。

绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白，共27kD，由238个氨基酸构成。当受到紫外或蓝光激发时，GFP发射绿色荧光。它产生荧光无需底物或辅因子，发色团是其蛋白质一级序列固有的。

基因克隆技术包括把来自不同物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构建成新的重组DNA，然后送入受体生物中去表达，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。采用重组DNA技术，将不同来源的DNA分子在体外进行特异性切割，重新连接，组装成一个新的杂合DNA分子。在此基础上，这个杂合分子能够在一定的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代分子。

研究绿色荧光蛋白在大肠杆菌体内的基因克隆和表达。通过质粒重组形成所需要的重组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入大肠杆菌体内，通过酶切、PCR及用IPTG诱导检测是否在大肠杆菌体内诱导表达成功。根据电泳结果及荧光现象得出结论，重组质粒在大肠杆菌体内成功诱导表达。

二、实验流程

三、具体实验方案

实验一、质粒DNA的提取

1.实验原理：

1）质粒(Plasmid)是一种染色体外的遗传因子，大小在1kb~200kb之间，是具有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒具有自主复制能力，，能使子代保持他们恒定的复制数，可表达它携带的遗传信息。它可以独立游离于细胞质内，也可以整合到细菌染色体中，它离开宿主细胞就不能复制，而它控制的许多生物学功能也是对

肠毒性大肠杆菌的绿色荧光蛋白转化及表达研究

绿色荧光蛋白

绿色荧光蛋白基因克隆及表达 结题报告

绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取

绿色荧光蛋白GF基因的克隆表达和粗提取

绿色荧光蛋白在大肠杆菌中的克隆表达

绿色荧光蛋白GFP基因的克隆表达和粗提取

肠毒性大肠杆菌的绿色荧光蛋白转化及表达研究

绿色荧光蛋白在大肠杆菌中的表达条件优化、纯化及鉴定

绿色荧光蛋白在大肠杆菌中的克隆表达

绿色荧光蛋白基因在大肠杆菌中的克隆与表达

绿色荧光蛋白在大肠杆菌中的表达分子实验设计

分子生物学实验设计实验

绿色荧光蛋白基因克隆及表达结果分析

绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取

绿色荧光蛋白(GFP)基因地克隆、表达和粗提取

分子生物学实验设计报告绿色荧光蛋白的克隆表达

绿色荧光蛋白基因克隆及表达结题报告