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大分子聚合酶链式反应技术在植物病原体检测中的应用

大分子聚合酶链式反应技术在植物病原体检测中的应用近年来，植物病原体的检测成为了农业生产中非常重要的一环，而大分子聚合酶链式反应技术（PCR）则是检测病原体的一种重要手段。

在这篇文章中，我们将探讨PCR技术在植物病原体检测中的应用。

一、 PCR的基本原理PCR技术是通过体外扩增DNA分子的手段来检测病原体的。

具体而言，PCR 过程中，通过引入一对引物来定位被检测的DNA分子，然后通过热循环的方式不断复制出大量的DNA分子，从而实现DNA分子的扩增。

PCR技术相对于传统的检测方式，具有高灵敏度、快速、准确的特点。

这使得PCR技术在病原体检测中得到了广泛应用。

二、 PCR技术在植物病原体检测中的具体应用1. PCR技术在病原体种类鉴定中的应用通过PCR技术，可以根据特定引物的选择来判定被检测样品中所含的病原菌种类。

例如，可以通过选择适当的引物，来鉴定样品中是否存在快速生长的革兰氏阴性菌。

并且，由于PCR技术的高灵敏度和高效性，可以检测出非常微小的DNA 片段，从而有效地避免了病原菌的漏检情况。

2. PCR技术在病原体数量检测中的应用除了在病原菌种类的鉴定中，PCR技术在病原菌数量检测中也具有广泛应用。

该检测方法可以通过对PCR扩增产物进行定量分析，进而实现病原菌数量的精确检测。

对于一些必须要进行数量检测的实践应用场景，PCR技术在这方面的应用是非常有价值的。

3. PCR技术在病原体检测中的其他应用此外，PCR技术还可以在诊断样品中不同的病原体菌株进行区分，为农业生产的全面提高和保障提供有力的技术支持。

三、 PCR技术在植物病原体检测中的优势相对于常规的检测方式，PCR技术在植物病原体检测中具有独特的优势。

首先，PCR技术具有非常高的检测灵敏度，可以检测出较低浓度的病原体。

其次，PCR技术不会受到样品中非目标DNA的影响，可以使得检测结果更加准确。

再者，PCR技术的操作也非常方便，并且操作流程相对简单，因此可以很好地节省实验人员的时间成本和样品成本。

弓形虫pcr检测操作方法

弓形虫pcr检测操作方法弓形虫PCR检测是一种高效、灵敏和特异的分子诊断方法，能够在短时间内检测到弓形虫DNA的存在。

该方法不仅适用于临床患者的诊断，还可以在食品和环境样本中检测弓形虫的污染情况。

下面将介绍PCR检测弓形虫的具体操作方法。

1. 样品的处理和提取在进行PCR检测之前，需要从样本中提取出弓形虫DNA。

其中，临床样本包括血液、脑脊液、尿液、胎盘和胸腺组织等；食品和环境样本包括生肉、蔬菜、水和土壤等。

样品处理和提取方法主要包括三种：碱裂解法、有机溶剂法和商用提取盒法。

其中商用提取盒法是最为常用的方法，其具体操作步骤如下：首先，将样品加入提取液中，加入玻璃珠粉，在粗糙的颤动台上颤动5~10分钟，破坏样品细胞壁并充分混匀。

然后将混合液转移到离心管中，离心10~15分钟，使液体分离成沉淀和上清液。

接着吸取上清液，再通过离心柱或聚丙烯酰胺凝胶柱，获得纯化的DNA溶液。

2. PCR反应成功提取的DNA样品接着需要进行PCR反应，具体操作如下：首先将PCR反应液配置好。

反应液成分包括Taq DNA聚合酶、dNTPs、PCR 缓冲液和引物。

其中引物一般采用B1和B2引物，其序列为5'-TCC TGT CCG AAG GTC GAT GAA-3'和5'-TCT TAA ACT TGC GAA GAC ATC TTG TC-3'，能够特异性地扩增弓形虫18S rRNA基因序列。

然后将PCR反应液均匀地加到PCR管中，加入提取的模板DNA，盖上片盖，置于PCR仪中进行扩增。

PCR反应参数通常为95预处理5分钟，然后进行40~45个循环反应，每次包括95脱变性30~60秒、55退火30~60秒和72延伸20~40秒，最后72延伸10分钟，以保证PCR扩增的有效性。

3. 分析PCR产物PCR反应完成后，需要对PCR产物进行电泳检测，以判断是否扩增出预期的弓形虫DNA片段。

具体操作步骤如下：首先将PCR产物与DNA加载缓冲液混合均匀，通过电泳将产物分离出来，然后将电泳胶放入染料溶液中，染色20~30分钟后，洗净染料，放入透明的塑料袋中，然后将其放置到照相机中进行成像。

弓形虫三磷酸核苷水解酶基因的克隆与序列分析

ｓｒｅｎｅｄｎｄｄｅｃｅａｉｎｔｉｅｂＢｇＨ、Ｈｉｆｉｄｙｌｎｄ Ⅲ ｄｇｅｓｏａｎｄｅｑｎｃｉｔｉｎｓｕｅｅｄ．ＴｈＤＮｅＡｓｑｕｅｅｅｎｃａｎｉｄｔｓ
ｄｅｄｕｅｄｒｏｅｉｓｑｕｎｃｗｅａｎｙｚｃｐｔｎｅｅｅｒｅａｌｅｄ．Ｒｅｌｔｓｕｓ：ＴｅｈＮＴａｓｇｎｅａｓｐｅｆｉａｌｌＰｅｅｗｓｃｉｃｙａｍｐｆｉｄ，ｌｉｅＤｓｑｅｎｅｎｙｓｈｏｅｄｈａｔｅｅｇｔｆｏｅｄｅｓ８１ａｓｐｒ．ＴｈｍｏｌｙｏｆＮＡｅｕｃａａｌｓｉｓｗｔｔｈｌｎｈｏｃｌｎｇｎｅｗａ１２ｂｅａｉｈｅｏｏｇｔｉＳｈｄｅｃａｉａｄＳｅｕｅｅａｓ０ｄｕｅｄｍｎｏｃｉｓｑｎｃｗ１ｔｏｈｉｔＧｅｂｎｔａｔｎｈｅｎｅａｋ．Ｃｏｎｃｌｓｉｎ：ＴＮＴａｓｕｏｈｅＰｅ．ＩＩ
刚地弓形虫（ｏｏｌｓａｇｎｉ）是专性细胞Ｔｘｐａｍｏｄｉ内寄生的机会致病性原虫，呈世界性分布。三磷酸核苷水解酶（ｕｌｏｉｅｔｉｈｓｈｔｙｒｌｓ，ｎｃｅｓｄｒｐｏｐａｅｈｄｏａｅＮＰｓ）为分布于弓形虫速殖子表面一种主要特异Ｔａｅ性抗原Ｉ引，其对虫体在宿主细胞内的寄生和繁殖１】都具有重要的作用［。目前，国内关于弓形虫病诊３１断和疫苗候选抗原的研究主要集中在Ｐ０（Ａ１和３ＳＧ）Ｐ２２抗原［６，而对ＮＰｓ４１－Ｔａｅ的研究鲜见报道。因此，我们对弓形虫Ｒ株的ＮＰｓ基因进行扩增与克隆，ＨＴａｅ

弓形虫表面抗原SAG1基因的克隆表达、纯化与鉴定

Ｅ３ＨｅｉｅｓＰ，ａｉＳ，ｒｅｅｅ１Ｖａｖｄｊｇｌｒ２ｒｇｒＯｚｋＶｅｂｋｎＥ，ｔａ．ｌｅｕｕａｊｖｉｓｇｎｓｆｒｒｈｅｔｃｌｒｏｔｌｒｃ［］ｅｅｍｅｔｏｉｔｖｎｒｕａｕｆｗｔａｔＪ．ｎｇｉｏ
因素，细胞化的ＢＶＣ可能是一种更好的重建右室流出道去Ｊ
材料。
［］６
ＤｅｔＤ，ＫｕｕｔａｎｄＰＫ．Ｂｉｐｒｔｅｉａｔａｖｄｔａｏｏｓｈｔｃｈｅｒｖｌｅ — ｒｎ— ｐｌｃｎｇａｉｏｒｒｉｈｈａｓ：ｅｅｔｏｎｄｅｗｔｃｏｌｃｒｍｉｒｃｉｓｕｃｏｓｏｐｃｔｄｙ
建右室流出道临床应用［］中华胸心血管外科杂志，Ｊ．
２０２（）３８３１０５，１６：２ — ３．
以增加组织强度和降低抗原性，得去细胞ＢＶＣ管道。获Ｊ我们应用Ｔｉｎ－０ｒｏＸ１０四步法去除ＢＶ细胞成分，ｔＪＣ未去细胞的ＢＶＪＣ表面尚见部分失活的内皮细胞，质层有较基
但由于脱细胞后ＢＶ基质层无细胞成分，原膨松，ＪＣ胶宿主成纤维细胞更利于爬行迁入，期成纤维细胞的增殖功能远是否会导致ＢＶＣ管腔增厚狭窄及瓣膜增厚失功等几个问题Ｊ
Ｅ］Ａｒｆｇｎ１９，３４：７—７．Ｊ．ｔａｄ，９９２（）３２３６ｉＯｒ［］ＳｈｅＪＴｓｏＪ，ＬｅｙＲ．Ｃｌｉｃｔｎｏｏｉｅ７ｃｉｎＦ，ａＷｖＪａｃｆａｉｆｂｖｎｉｏ

生活养生-弓形虫的检查原理是什么

文章导读弓形虫是一种寄生在细胞里面的寄生虫，会跟随血液的流动到达身体的每一个部位，会使人的免疫力下降，患上各种疾病，弓形虫的常规检查一般分为病理检查，免疫学检查，皮内实验等检查方法。

病原检查1、直接镜检取患者血液、骨髓或脑脊液、胸腹水、痰液、支气管肺泡灌洗液、眼房水、羊水等作涂片，或淋巴结、肌肉、肝、胎盘等活组织切片，作瑞氏或姬氏染色镜检可找到滋养体或包囊，但阳性率不高。

亦可作直接免疫荧光法检查组织内弓形虫。

2、动物接种或组织培养取待检体液或组织悬液，接种小白鼠腹腔内，可产生感染并找到病原体，第一代接种阴性时，应盲目传代3次。

或作组织(猴肾或猪肾细胞)培养以分离、鉴定弓形虫。

3、DNA杂交技术国内学者首次应用32P标记含弓形虫特异DNA序列的探针，与患者外周血内细胞或组织DNA进行分子杂交，显示特异性杂交条带或斑点为阳性反应。

特异性和敏感性均高。

此外，国内亦已建立多聚酶链反应诊断本病，并与探针杂交、动物接种和免疫学检查方法相比较，显示春具高度特异、敏感和快速等优点。

[4]免疫学检查1、检测抗体所用抗原主要有速殖子可溶性抗原(胞质抗原)和胞膜抗原。

前者的抗体出现较早(用染色试验、间接免疫荧光试验检测)、而后者的抗体出现较晚(用间接血凝试验等检测)。

同时采用多种方法检测可起互补作用而提高检出率。

由于弓形虫在人体细胞内可长期存在，故检测抗体一般难以区别现症感染或以往感染，可根据抗体滴度的高低以及其动力学变化加以判断。

2、检测抗原系用免疫学方法检测宿主细胞内的病原(速殖子或包囊)、在血清及体液中的代谢或裂解产物(循环抗原)。

是早期诊断和确诊的可靠方法。

国内外学者建立了McAb-ELISA以及McAb与多抗的夹心型ELISA法检测急性患者血清循环抗原，其敏感度为能检出血清中0.4μg/ml的抗原。

[4]皮内试验以受染小白鼠腹腔液或鸡胚液作抗原。

常出现延迟性、结核菌素反应。

可用作流行病学调查。

目前应用不多。

聚合酶链式反应在生物检测中的应用

聚合酶链式反应在生物检测中的应用随着生物技术的发展和进步，生物检测已成为现代科学技术中必不可少的一个环节。

其中，聚合酶链式反应（PCR）应用广泛，因其具有高灵敏度、高特异性和高效率等特点，可以快速且准确地检测出微量DNA或RNA。

下面，我们来探讨PCR在生物检测中的应用。

一、定量检测聚合酶链式反应在生物检测中最常用、也是最重要的应用就是进行DNA或RNA定量检测。

PCR技术最早应用于生物学领域，其作用是将少量的DNA扩增到可检测水平。

利用PCR技术，可以定量获取目标DNA浓度等信息。

这在某些研究中，比如在病毒学研究中是非常重要的。

二、病原体检测另外，PCR技术也可应用于病原体检测。

PCR方法对比传统的病原体检测方法有逐渐淘汰的趋势。

PCR可以重复扩增目标DNA或RNA，从而使得原本不易检测的病原体在短时间内得到高灵敏度和高特异性的检测，避免传染疾病的传播。

近年来，此类检测方法已在医学、农业、环境保护等领域得到广泛应用。

三、基因分型除此之外，PCR也可用于基因分型。

它可以检测DNA等分子化合物，从而判断个体的基因型，即基因在相应位点上的具体基序列。

这在现代生物学领域中是非常重要的一个应用。

四、人类身份鉴定最后，PCR还有一项非常重要的应用——人类身份鉴定。

根据DNA指纹的独特性，PCR可以比对不同人的DNA指纹，从而判断其身份。

这在刑事案件中、亲子鉴定等方面有着广泛的应用。

总之，聚合酶链式反应技术是现代生物检测技术中非常重要的一个分支。

它不仅能定量检测DNA或RNA，还可以用于病原体检测、基因分型及人类身份鉴定等领域，为人类的生命健康和社会安稳提供有力的保障。

随着生物技术的飞速发展，相信PCR技术必将呈现出更为广泛的应用前景。

【必背知识点】人教生物选择性必修3第3章基因工程第2-3节

第3章基因工程第2节基因工程的基本操作程序1．培育转基因抗虫棉主要需要四个步骤：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。

（P76）2．PCR是聚合酶链式反应的缩写。

它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。

（P77）3．PCR技术可以分为变性、复性和延伸三步。

（如下图）（P78）4．PCR反应过程可以在PCR扩增仪（PCR仪）中自动完成，完成以后，常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。

（P79）5．基因表达载体要包括以下四个基本的结构：目的基因、启动子、终止子、标记基因。

（P80）6．构建基因表达载体的目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。

（P80）7．启动子位于目的基因的上游，它是RNA聚合酶识别和结合的部位。

（P80）8．标记基因的作用：鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。

（或供重组DNA的鉴定和选择）。

9．熟悉基因表达载体构建的过程。

10．花粉管通道法有多种操作方式。

例如，可以用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；可以在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。

除此之外，将目的基因导入植物细胞常用的方法还有农杆菌转化法。

（P81）11．转化是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。

（P81“资料卡”）12．农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。

农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T－DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。

根据农杆菌的这种特点，如果将目的基因插入Ti质粒的T－DNA中，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞。

聚合酶链式反应技术及应用ppt

1989年美国《Science》杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。
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PCR的应用
• 研究
– 基因克隆，DNA测序，分析突变
• 诊断
– 细菌、病毒、寄生虫检测，诊断
• 人类基因组工程
– 遗传图谱的构建，DNA测序，表达图谱
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引物溶解温度（Tm值）
引物的Tm值一般控制在55-60度, 尽可能保证上下游引物的Tm值一致,一般不超过2度. 如果引物中的G+C含量相对偏低,则可以使引物长度稍长,而保证一定的退火温度.
Tm=2(A+T)+4(C+G)
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引物自身
引物间3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败; 引物3’端的几个碱基与模板DNA需严格配对，并最好为低稳定性结构。
恶性肿瘤（癌基因或抑癌基因）
PCR-RFLP法：
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限制性内切酶
突变限制性内切酶
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Ras基因
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(三) 单链构型多态性分析法（PCR-Single Strand Conformation Polymorphism，简称PCRSSCP）
• 本法就是将PCR 产物双链DNA（dsDNA）变性为单链DNA （ssDNA），加样于变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，由于DNA 分子在凝胶中的电泳迁移率与其分子量和空间结构有关，而空间结构又与ssDNA序列有关。因此，电泳结束后， ssDNA带位置的差异即可反映出PCR产物序列的差异。

具有特异免疫反应活性的弓形虫重组SAG1抗原及其单克隆抗体的制备、鉴定和..

英文缩写ＡｃｒＡＰＳＢＣＩＰＢｉＳＢＳＡＤＡＢｄＨ２０ＤＭＳＯＤＮＡｄＮＴＰＥＢＥＤＴＡＥＬＩＳＡＨＡＴＨｅＤｅＳＨＴＨＲＰＩＰＴＧＩＲＳＫｂＫＤＬＢＭｃＡｈ２一ＭＥＮｉＮＴＡＮＢＴ缩略词表英文全称中文全称Ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ聚丙烯酰胺Ａｍｍｏｎｉｕｍｐｅｒｓｕｌｆａｔｅ过硫酸铵５－Ｂｒｏｍｏ——４——ｃｈｌｏｒｏ——３——ｉｎｄｏｌｙｌ——ｐｈｏｓｐｈａｔｅ５一溴一４一氯一３一吲哚一磷酸Ｎ．Ｎ、一Ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｂｉｓａｃｒｙｌａｍｉｄｅ哑甲基双丙烯酰胺Ｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍａｌｂｕｍｉｎ牛血清白蛋白３．３＇－ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ３，３＇－二氨基联苯胺ｄｉｓｔｉｌｌｅｄｗａｔｅｒ蒸馏水ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ二甲基亚砜ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ脱氧核糖核酸ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ脱氧核苷三磷酸ｅｔｈｄｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ溴化乙锭ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｏｔｅｔｒａａｅｅｔｉｃａｃｉｄ乙二胺四乙酸Ｅｎｚｙｍｅｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂａｎｔａｓｓａｙ酶联免疫吸附试验Ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎａｎｄｔｈｙｍｉｄｉｎｅ次黄嘌呤、氨基喋呤胸腺嘧啶核苷Ｎ二２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ—Ｎ’一２一ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｅＮ－２一羟乙基哌嗪一Ｎ一２一乙磺酸Ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅａｎｄｔｈｙｍｉｄｉｎｅ次黄嘌呤、腺嘧啶核苷Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ辣根过氧化物酶（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ—Ｂ一１）一Ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ异丙基一ＢＤ－硫代半乳糖苷ｒａｂｂｆｆｓｅｒｕｉＴｌｉｍｍｕｎｉｚｅｄｂｙｔａｃｈｙｚｏｉｔｅａｎｔｉｇｅｎｏｆＺｇｏｎｄｉｉ免疫兔血清ｋｉｌｏｂａｓｅｓ千碱基ＫｉｌｏＤａｌｔｏｎ千道尔顿ＬｕｒｉａｂｒｏｔｈＬＢ培养基ｍｏｎｏｅｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙ单克隆抗体２－ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ２－巯基乙醇ｎｉｃｋｅ卜ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃｅｔｉｃ镍一次氮基三乙酸４一Ｎｉｔｒｏｂｌｕｅｔｅｔｒａ—ｚｏｌｉｕｍｃｈｌｏｒｉｄｅ氯化硝基四氮唑蓝ＮＲＳＯＤＰＢＳＰＣＲＰＥＧＰＭＳＦＲＮａｓｅｒＤⅢＳＤＳ—ＰＡＧＥＴＥＭＥＤＴＭＢＴｒｉＳｎｏｒｍａｌｒａｂｂｉｔｓｅｒｕｍｏｐｔｉｃａｌｄｅｎｓｉｔｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ—ｂｕｆｆｅｒｅｄｓａｌｉｎｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌｆｌｕｏｕｒｉｄｅｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎｓｐｅｒｍｉｎｕｔｅｓｏｄｉｕｍｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ—ｐｏｌｙａｅｒｙｌａｍｉｄｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒＯｐｈＯｒｅｓｉｓＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ＇－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ＇－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅＮ－ｔｒｉＳ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ．２．正常兔血清光密度磷酸盐缓冲溶液聚合酶连反应聚乙二醇苯甲基磺酰氟核糖核酸酶每分钟转速十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ＇－四甲基乙二胺Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ＇－四甲基联苯胺三羟甲基氨基甲烷具有特异免疫反应活性的弓形虫重组ＳＡＧｌ抗原及其单克隆抗体的制备、鉴定和初步应用（中文摘要）硕士研究生：言慧导师：陈晓光教授弓形虫（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａｇｏｉ７ｄｉｉ）是一种专性细胞内寄生的医学原虫，能感染几乎所有恒温动物（包括人类），引起弓形虫病，全世界近１／３的人口受到威胁。

聚合酶链反应技术建立巴尔通体的检测鉴定方法并用于诊断临床疑似猫抓病合并双侧支气管肺炎患者分析

聚合酶链反应技术建立巴尔通体的检测鉴定方法并用于诊断临床疑似猫抓病合并双侧支气管肺炎患者分析1. 引言1.1 背景聚合酶链反应（PCR）技术是一种在分子生物学中广泛应用的技术，可以在短时间内扩增DNA片段。

巴尔通体是一种由巴尔通体菌引起的疾病，病原体主要通过猫抓、猫咬或接触猫的皮肤创伤而传播。

猫抓病是一种常见的感染性疾病，主要表现为局部淋巴结的炎症反应。

猫抓病合并双侧支气管肺炎是一种较为罕见但严重的并发症，容易导致呼吸系统的功能障碍。

巴尔通体的检测鉴定在诊断猫抓病及其并发症的过程中具有重要意义。

传统的检测方法主要依靠临床表现和实验室检测，但存在着诊断准确性低、耗时长等缺点。

建立一种快速、准确且可靠的巴尔通体检测鉴定方法尤为重要。

本研究旨在利用PCR技术建立一种高效的巴尔通体检测方法，探索其在临床疑似猫抓病合并双侧支气管肺炎患者中的应用，为疾病的诊断和治疗提供更为准确的依据。

通过本研究，期望能够提高巴尔通体感染的早期诊断率，减少疾病的传播风险，并为临床治疗提供更好的指导。

本文将重点探讨巴尔通体的检测鉴定方法及其在临床应用中的意义，为该领域的研究和实践提供参考和启示。

1.2 研究目的研究目的：本研究旨在建立一种快速、准确的聚合酶链反应（PCR）技术，用于检测和鉴定巴尔通体，以提高对猫抓病合并双侧支气管肺炎的诊断准确性和效率。

通过该方法的建立和应用，我们希望可以为临床医生提供一种有效的诊断工具，帮助他们更早地发现和治疗这类临床疑似病例，提高患者的治疗效果和生存率。

我们也希望通过本研究的开展，为进一步深入探讨猫抓病合并肺部感染的发病机制提供更为可靠的实验依据，促进相关领域的研究进展，为临床实践提供更多有益信息和指导。

2. 正文2.1 建立巴尔通体的检测鉴定方法差不多了，继续加油！建立巴尔通体的检测鉴定方法是本研究的核心内容之一。

我们通过文献调研和实验验证，确定了聚合酶链反应技术作为检测巴尔通体的最佳方法。

PCR-CRISPR-Cas12a华支睾吸虫囊蚴检测方法的建立和应用

PCR-CRISPR-Cas12a华支睾吸虫囊蚴检测方法的建立和应用华支睾吸虫病（clonorchiasis）是一种寄生虫引起的肝脏疾病，由华支睾吸虫卵子进入人体消化系统引起。

该疾病在亚洲地区很常见，特殊在中国南部的一些河流和湖泊四周分外普遍。

华支睾吸虫囊蚴是该寄生虫的青年阶段，对人体健康造成严峻恐吓。

因此，开发一种高效、准确的检测方法对于早期诊断和预防疾病传播至关重要。

近年来，聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）和CRISPR/Cas12a基因编辑技术的进步为寄生虫病的检测提供了新的方法和手段。

PCR是一种敏感且特异的DNA扩增技术，可以从少许样本中扩增目标DNA片段。

CRISPR/Cas12a是一种靶向基因组编辑的新技术，它可以识别和切割特定的DNA序列。

结合使用PCR和CRISPR/Cas12a技术可以将传统的分子生物学检测与基因组编辑技术相结合，从而实现疾病的高效、准确检测。

为了建立PCR-CRISPR/Cas12a检测方法，起首需要从华支睾吸虫囊蚴中提取DNA。

可以选择从患者的粪便样本中提取寄生虫的DNA，并使用PCR扩增华支睾吸虫特异性的基因序列作为靶标。

随后，将PCR扩增的产物经过电泳检测，确认是否成功扩增目标基因。

在得到PCR扩增的基因片段后，可以使用CRISPR/Cas12a进行进一步的检测。

CRISPR/Cas12a会识别并切割目标基因片段，产生一个特定的信号，用于裁定样本中是否存在菌体。

这个过程通常以便携式CRISPR检测试纸为主，可以在30分钟内完成检测。

试验结果显示，PCR-CRISPR/Cas12a方法对华支睾吸虫囊蚴的检测具有高度的灵敏度和特异性。

与传统的显微镜检查、病原学培育和酶联免疫吸附试验（ELISA）相比，PCR-CRISPR/Cas12a方法具有更高的准确性和速度。

此外，PCR-CRISPR/Cas12a方法还可以在少样本量的状况下进行检测，适用于早期感染的诊断。

弓形虫GJS株微线体蛋白3基因的克隆、表达及鉴定

弓形虫GJS株微线体蛋白3基因的克隆、表达及鉴定弓形虫GJS株微线体蛋白3基因的克隆、表达及鉴定引言：弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种寄生虫，可引起弓形虫病。

弓形虫具有多样的感染途径，对人体和动物造成严重威胁。

微线体蛋白（MIC）是弓形虫在侵袭宿主细胞过程中起关键作用的蛋白质。

本研究以弓形虫GJS株为研究对象，通过克隆、表达及鉴定微线体蛋白3基因，旨在进一步理解微线体蛋白在弓形虫侵染过程中的功能和机制。

材料与方法：1. 弓形虫GJS株的培养与提取：在含有40%猪血清的DMEM培养基中，将弓形虫GJS株培养至稳定生长期。

通过离心将弓形虫分离并洗涤。

使用蛋白酶K和牛血清蛋白解裂弓形虫，提取总蛋白。

2. 微线体蛋白3基因的克隆：根据微线体蛋白3基因的已知序列，设计引物并通过PCR扩增。

将扩增产物纯化后进行测序验证。

3. 微线体蛋白3基因的表达：将纯化扩增产物连接至表达载体，并在大肠杆菌中进行转化。

转化后的细菌进行培养和诱导表达。

4. 蛋白的纯化与鉴定：通过亲和层析纯化表达的蛋白，并通过SDS-PAGE蛋白质分离与Western blotting进行鉴定。

结果：通过PCR扩增和测序验证，成功获得了微线体蛋白3基因的克隆产物。

将克隆产物连接至表达载体并进行转化后，在条件诱导下，成功获得了表达的微线体蛋白3。

通过亲和层析纯化获得了纯化后的蛋白，SDS-PAGE分离后通过Western blotting进一步进行鉴定。

结果验证了蛋白的表达和纯化成功。

讨论：本研究成功克隆并表达了弓形虫GJS株微线体蛋白3基因。

微线体蛋白在弓形虫侵染过程中发挥重要作用。

已有研究表明，微线体蛋白介导了弓形虫与宿主细胞的黏附，是感染过程中的关键因子。

通过微线体蛋白3基因的克隆与表达，有助于进一步研究微线体蛋白所参与的分子机制。

本研究还通过亲和层析纯化和Western blotting鉴定了表达的微线体蛋白3。

这些结果为进一步研究微线体蛋白3的结构和特性提供了基础。

聚合酶链反应在其他微生物检测中的应用

聚合酶链反应在其他微生物检测中的应用一、PCR检测人乳头瘤病毒人乳头瘤病毒的存在与多种皮肤黏膜的良、恶性增生，特别是宫颈癌的发生、发展密切相关，病毒的各型基因序列与其生物学行为存在高度相关性，不同基因型的HPV具有不同的致病危险性。

HPVDNA的检测和分型对了解相关病情、判断预后及指导治疗具有重要价值，特别是对女性生殖道肿瘤的癌情预报具有重要意义。

由于缺乏体外培养系统和可靠的血清反应物，所以HPV的检测几乎完全依赖于分子生物学检测方法。

（一）标本采集检查前告知患者1.月经正常妇女，在月经来潮后10～18天为最佳检查时间。

2.检查前48小时内不要作阴道冲洗，不要用避孕药膏等阴道内用药物。

3.检查前48小时最好不要行性生活。

4.检查前不进行醋酸或碘液涂抹。

（二）标本收集1.按医生指示，仰卧于检查床上。

2.由医生以窥阴器或阴道张开器暴露宫颈。

然后使用专用的HPV 采样刷置于宫颈口采集标本（最好在取样前先用棉签擦去宫颈分泌物）。

3.将专用宫颈刷置于宫颈口，轻轻搓动宫颈刷使其顺时针旋转5圈。

4.慢慢取出宫颈刷，将其放入标有患者编号的取样管中，取样管内已加有专用细胞保存液，折断其刷头入管中，拧紧瓶盖。

5.样本一经采集，则应尽可能快的送至检测实验室；如若不能马上送检样本，请于4℃保存，请在2个星期之内进行检测。

（三）HPVDNA检测1.人乳头瘤病毒（HPV）核酸扩增（PCR）荧光检测法同Tagman 原理。

2.人乳头瘤病毒（HPV）核酸扩增分型检测法采用“导流杂交”技术原理，将HPV探针固定于膜纤维中，使目标分子（单链DNA）主动导流穿过固定有探针的薄膜并与互补探针相结合，形成复合物而被固定下来。

未被结合固定的分子穿过薄膜后被除去。

因此，它加速了互补分子之间的相互作用，将杂交时间从几个小时降低至几分钟，比传统杂交法省时几百倍。

整个HPV基因分型实验主要由以下三个分实验组成：宫颈细胞总DNA的抽提，基因扩增（PCR），导流杂交。

《弓形虫SRS29C基因敲除株的构建与鉴定》

《弓形虫SRS29C基因敲除株的构建与鉴定》一、引言弓形虫病作为一种世界范围内分布广泛的寄生虫病，严重危害了人类的健康和农业生产。

针对弓形虫疾病的研究一直备受关注，其中基因敲除技术为研究弓形虫的生物学特性和致病机制提供了新的途径。

本文将重点探讨弓形虫SRS29C基因敲除株的构建与鉴定过程，以期为相关研究提供理论依据和技术支持。

二、材料与方法1. 材料（1）弓形虫株：本实验选用的弓形虫株为敏感型速殖子株。

（2）质粒与酶：构建基因敲除载体所需的质粒和限制性内切酶。

（3）细胞与培养基：用于培养弓形虫的细胞系及相应培养基。

2. 方法（1）SRS29C基因的克隆与敲除载体的构建首先，通过PCR技术扩增SRS29C基因片段，并将其克隆至敲除载体中。

敲除载体的构建包括选择合适的酶切位点、连接片段及构建载体等步骤。

（2）基因敲除株的构建将构建好的敲除载体通过显微注射等方法导入弓形虫速殖子中，经过一定时间的筛选和培养，获得SRS29C基因敲除株。

（3）基因敲除株的鉴定通过PCR、Western blot、实时荧光定量PCR等方法对获得的基因敲除株进行鉴定，验证SRS29C基因是否成功敲除。

三、实验结果1. SRS29C基因的克隆与敲除载体的构建通过PCR技术成功扩增出SRS29C基因片段，并将其克隆至敲除载体中。

经酶切和测序验证，确认敲除载体构建成功。

2. 基因敲除株的构建将构建好的敲除载体通过显微注射等方法导入弓形虫速殖子中，经过一定时间的筛选和培养，成功获得SRS29C基因敲除株。

3. 基因敲除株的鉴定通过PCR、Western blot和实时荧光定量PCR等方法对获得的基因敲除株进行鉴定。

结果显示，SRS29C基因在敲除株中的表达水平显著降低或完全消失，证实了SRS29C基因的成功敲除。

同时，通过对敲除株的生物学特性进行分析，发现其与野生型弓形虫相比在生长速度、形态等方面存在差异。

四、讨论本实验成功构建了弓形虫SRS29C基因敲除株，并对其进行了鉴定。

聚合酶链式反应及其在基因诊断中的应用

欢迎共阅聚合酶链式反应及其在基因诊断中的应用聚合酶链式反应于1983年由美国Cetus 公司的K.Mullis 发明，并和定点突变的发明者M.Smith 一起荣获1993年度诺贝尔化学奖，为生命科学领域的研究开创了崭新时代。

一、PCR 反应原理和反应过程DNA 的体外复制包括3个步骤：变性（denaturation ）:94 ?C ~95 ?C退火（延伸（ 3二、PCR （一）参与PCR 1 模板cDNA ，再以 cDNA 2、引 12）长度为18 ~ 25个核苷酸3）二条引物之间避免形成引物二聚体4）引物的碱基组成应平衡5）引物退火温度计算：Tm=2（A+T ）+（C+G ）6）引物的5`端可被修饰（引入酶切位点、引入突变位点、生物素等标记）3、脱氧核苷三磷酸（dNTP ）是dATP 、dCTP 、dGTP 和dTTP4种脱氧核苷三磷酸的混合物。

反应体系中各种核苷酸的浓度必须一致，浓度过高虽能加快反应速度，但非特异性扩增也随之增加dNTP浓度：20 ~ 200umol/L,浓度升高增加非特异性扩增。

4、DNA聚合酶从一种生活在热泉（80℃~90℃）中的水栖噬热菌（Thermus aquaticus, Taq）中提取，有很高的耐热稳定性。

Taq 酶的作用:模板指导下，以dNTP为原料，在引物3’-OH末端加上脱氧单核苷酸，形成3’, 5’ -磷酸二酯键，使DNA链沿5’→3’方向延伸，催化DNA合成。

最适酶量：1-2.5U （酶量过多，导致非特异性扩增）Taq DNA，耐热的具有5DNA及当dNTP6pH基质：（二）PCR反应时间（变性、退火、延伸）循环次数（PCR效率及产物量）1、温度变性温度：94 ~ 97 ℃退火温度：低于引物Tm 5 ℃左右。

温度过高会降低扩增效率；温度过低：增加非特异性扩增。

延伸温度：72度，此时Taq酶具有较高的酶促活性。

2、时间第一次变性应给予足够时间（5 ~ 7分钟）。

弓形虫GRA1基因的克隆与原核表达

弓形虫GRA1基因的克隆与原核表达孙玲;刘慧颖;李淑红;宫鹏涛;张西臣;宁静【摘要】目的:克隆并构建PET-28a-GRA1重组表达载体,转化人大肠杆菌E.coli BL21,诱导表达并鉴定,为进一步研究GRA1的生物学特性和免疫保护作用奠定实验基础.方法:根据GenBank中编码GRA1的已知基因序列设计并合成一对引物,应用PCR技术扩增GRA1基因,插入原核表达载体PET-28a中,构建重组表达质粒PET-28a-GRA1,转化E.coli BL21,IPTG诱导后,进行SDS-PAGE和Western blotting 鉴定.结果:克隆的GRA1基因与GenBank收录的基因序列同源性为100%.对重组质粒进行酶切和PCR鉴定,获得573 bp大小的目的基因片段,与预期结果相符,成功地构建了重组质粒PET-28a-GRA1.SDS-PAGE电泳分析表明重组蛋白条带的相对分子质量约为24 000,Western blotting显示重组蛋白能被鼠抗弓形虫血清识别.结论:成功获取GRA1基因,构建了PET-28a-GRA1重组质粒并获得了高效表达.【期刊名称】《吉林大学学报（医学版）》【年(卷),期】2011(037)004【总页数】5页(P631-635)【关键词】刚地弓形虫;GRA1;克隆;基因表达【作者】孙玲;刘慧颖;李淑红;宫鹏涛;张西臣;宁静【作者单位】吉林大学白求恩医学院病原生物学教研室,吉林长春130021;吉林大学白求恩医学院病原生物学教研室,吉林长春130021;吉林省长春市绿园区疾病预防控制中心,吉林长春130062;吉林大学白求恩医学院病原生物学教研室,吉林长春130021;吉林大学畜牧兽医学院预防兽医学系,吉林长春130062;吉林大学畜牧兽医学院预防兽医学系,吉林长春130062;吉林大学畜牧兽医学院预防兽医学系,吉林长春130062【正文语种】中文【中图分类】R349.64刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种细胞内寄生的原虫，其中间宿主非常广泛[1]。

荧光定量聚合酶链反应诊断弓形虫感染的实验研究

荧光定量聚合酶链反应诊断弓形虫感染的实验研究符生苗;阮和球;陈鑫萍;庞海云;凌奕;徐文;杨力芳【期刊名称】《中国热带医学》【年(卷),期】2002(2)1【摘要】目的探讨荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）对孕妇与新生儿弓形虫（TOX）感染的诊断价值。

方法以完全闭管式的PCR和荧光探针杂交技术相结合所产生的实时检测定量PCR方法,检测了产妇的血清标本和新生儿脐血标本,同时与常规 PCR法和酶联免疫吸附法（ELISA）比较。

结果 225例产妇中,FQ-PCR阳性28例,平均拷贝数值（ml-1）为1.68×105,阳性率为12.44％,常规PCR阳性率为12.89％,TOX-IgG阳性29例,阳性率为 12.89％,IgM阳性33例,阳性率为14.67％。

179例新生儿中,FQ-PCR阳性7例,平均拷贝数值（ml-1）为2.29×105,阳性率为3.91％,常规PCR阳性率为5.03％,TOX-IgG阳性11例,阳性率为6.15％,IgM阳性3例,阳性率为1.68％。

结论FQ-PCR特异性比ELISA法高,可以检测TOX的真实感染和复制情况,对TOX的临床诊断、治疗方案的选择和疗效观察有较大的应用价值。

【总页数】3页(P6-8)【关键词】弓形虫;聚合酶链反应;DNA;弓形虫病;动物实验;诊断;TOX感染【作者】符生苗;阮和球;陈鑫萍;庞海云;凌奕;徐文;杨力芳【作者单位】海南省人民医院医学研究中心;中山医科大学达安基因诊断中心【正文语种】中文【中图分类】R531.8;R382.5【相关文献】1.应用荧光定量聚合酶链反应技术诊断胎儿弓形虫感染 [J], 马玉燕;牟瑞丽;王磊一;江森2.荧光定量聚合酶链反应在胃黏膜幽门螺杆菌感染诊断中的应用研究 [J], 任英霞;崔东来;张玉琢3.荧光定量聚合酶链反应诊断乙型肝炎病毒感染研究进展 [J], 黄欣4.荧光定量聚合酶链反应检测性病患者感染单纯疱疹病毒Ⅱ的实验研究 [J], 颜丹;李燎;颜海婴;赵家兰;卿晟;黄文才5.双色荧光定量聚合酶链反应诊断生殖器溃疡性疾病病因的实验研究及临床应用评价 [J], 朱慧兰;胡斌;李润祥;林路洋;熊斯颖;赖维因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

应用加端PCR克隆弓形虫P30基因

应用加端PCR克隆弓形虫P30基因
赵文忠;王祥生
【期刊名称】《中国兽医寄生虫病》
【年(卷),期】1998(006)004
【摘要】为了采用基因工程方法大量生产高效抗原提供技术，根据已发表的弓形虫ＲＨ株Ｐ３０的核苷酸序列，设计了一对加端引物，动用ＰＣＲ方法，从弓形虫ＮＴ株中扩增出约８００ｂｐ的片段。

产物经ＥｃｏＲＩ和ＸｂａＩ酶切后，克隆进ＰＵＣ１９载体，经酶切和ＰＣＲ鉴定，插入片段为Ｐ３０基因。

【总页数】2页(P1-2)
【作者】赵文忠;王祥生
【作者单位】长春农牧大学兽医研究所寄生虫病研究室;长春农牧大学兽医研究所寄生虫病研究室
【正文语种】中文
【中图分类】Q782
【相关文献】
1.刚地弓形虫NT株P30基因的克隆与表达 [J], 张理航;刘茂军;吕芳;李贺侠;吴叙苏;冯志新;邵国青
2.编码弓形虫表面抗原P30基因的克隆及在E.coli中的表达 [J], 占国清;吴少庭;李国光;高世同;林敏;郑春福
3.弓形虫P30基因的克隆及其在E.coli中的融合表达 [J], 王素华;曲道峰;蔡渭明;杜爱芳
4.弓形虫P30抗原基因的PCR扩增及克隆的初步研究 [J], 姜淑芳;古钦民
5.刚地弓形虫P30(SAG1)基因的克隆与表达 [J], 张佃波;公茂庆;魏庆宽;李谨;黄炳成;刘克义
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弓形虫SAG1基因原核表达与间接ELISA检测方法的建立的开题报告

弓形虫SAG1基因原核表达与间接ELISA检测方法的建立的开题报告1. 研究背景弓形虫是一种单细胞寄生虫，可引起人和动物的弓形虫病。

弓形虫SAG1基因是弓形虫病原体表面的一种重要抗原蛋白，是诊断弓形虫病的重要参考因素之一。

因此，建立高效、快速、精准的弓形虫SAG1基因原核表达和间接ELISA检测方法对于弓形虫病的诊断和防控具有重要的现实意义。

2. 研究目的本研究旨在建立弓形虫SAG1基因的原核表达和间接ELISA检测方法，为弓形虫病的诊断和防控提供可靠依据。

3. 研究内容（1）采用PCR技术克隆弓形虫SAG1基因；（2）将克隆的基因定向克隆到原核表达载体pET28a中，并在大肠杆菌中进行原核表达；（3）进行蛋白质表达和纯化后，鉴定表达产物的纯度和活性；（4）以表达产物为抗原，建立间接ELISA检测方法，并优化实验条件；（5）用本方法对弓形虫病患者和阳性对照样本进行测试，评估方法的灵敏度和特异性。

4. 研究意义建立弓形虫SAG1基因原核表达和间接ELISA检测方法，不仅可为弓形虫病的诊断和防控提供更加有效的手段，还为安全高效的疫苗研发提供了重要支持。

5. 研究进展本研究目前处于基础探索阶段，已完成弓形虫SAG1基因的克隆和原核表达，正在进行表达产物的纯化和检测。

后续将继续优化实验条件和检测方法，开展相关测试，深入探究弓形虫SAG1基因原核表达和间接ELISA检测方法的可靠性和应用前景。

6. 研究计划本研究计划在12个月内完成，具体执行计划如下：第1-2个月：文献研究和基因克隆；第3-4个月：原核表达和蛋白质纯化；第5-6个月：鉴定表达产物的纯度和活性；第7-8个月：建立间接ELISA检测方法，并进行优化；第9-10个月：用本方法对样本进行测试，评估灵敏度和特异性；第11-12个月：研究总结和成果论文撰写。

7. 研究预期成果（1）成功建立弓形虫SAG1基因原核表达和间接ELISA检测方法；（2）评估方法的灵敏度和特异性，并发表相关的研究论文；（3）为弓形虫病的诊断、防控和疫苗研发提供理论和实验依据。

用聚合酶连反应检测异常妊娠妇女弓形虫感染

用聚合酶连反应检测异常妊娠妇女弓形虫感染
叶世勤;谭继英
【期刊名称】《甘肃科技纵横》
【年(卷),期】2003(32)3
【摘要】探讨异常妊娠与弓形虫感染的关系.PCR方法可以用于临床上弓形虫感染的检测.
【总页数】1页(P93)
【作者】叶世勤;谭继英
【作者单位】兰州医学院第二附属医院,甘肃,兰州,730030;兰州医学院病原生物学教研室,甘肃,兰州,730030
【正文语种】中文
【中图分类】R71;R53
【相关文献】
1.抗原捕获聚合酶链反应分型检测妇女生殖器单纯疱疹病毒 [J], 刘军连;王德堂;王红英;喻启桂;徐志凯
2.聚合酶链反应掺入法制备标记探针检测弓形虫感染的研究 [J], 吴少庭;陈志辉
3.聚合酶链反应检测弓形虫感染的临床应用 [J], 卢锋;张百让
4.应用聚合酶链反应对有异常妊娠史妇女人巨细胞病毒感染的探讨 [J], 许素菊;李希发;李彬;王建平;张云秀
5.用ELISA和PCR检测异常妊娠妇女弓形虫感染 [J], 谭继英;高峻;叶世勤;史大中因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。