工具酶简介材料
第2章 工具酶
34
限制酶的星活性（ Star activity ） 。指某些限制酶在不适的环境中其 识别序列发生改变（切割与识别序 列相似的序列）的现象。
35
影响酶活性的因素
底物
酶
36
1.底物DNA样品的纯度
蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、 SDS、 NaCl等。
①加大酶的用量
②加大反应总体积（稀释）
29
Hsu I
不完全同裂酶
识别位点相同，但切点不同。 如Xma I 和 Sma I。
Xma I 5’-CCCGGG -3’ 3’-GGGCCC-5’ 5’-CCCGGG-3’ 3’-GGGCCC-5’
Sma I
30
同尾酶(Isocaudamers）
识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如 BamH I、Bgl Ⅱ、Bcl I、Xho Ⅱ等。
Ⅱ型限制性内切酶
1970年，由H.O. Smith和K.W. Wilcox从 流感嗜血菌中分离出来。分离的第一个酶 是Hind Ⅱ。 限制-修饰系统分别由限制酶与修饰酶两 种不同酶分子组成，分子量小，能识别 DNA的特殊序列，种类多，在基因工程中 起重要作用。
17
能识别双链DNA的特殊序列，并在这个 序列内进行切割，产生特异的DNA片段。 其种类繁多。 通常所指的DNA限制性核酸内切酶。 在基因工程技术中，I型不能用，Ⅲ型酶 基本不用， Ⅱ型酶最有用。
26
Pvu Ⅱ等产生的平末端
5’… G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G … 3’ 3’… C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C … 5’
PvuⅡ 37 ℃
5’… G-C-T-C-A-G-OH 3’… C-G-A-G-T-C-P
基因工程的工具酶
用衔接物分子连接平末端的DNA片段
衔接物：指用化学方法 合成的一段由若干个核 苷酸组成的、具有一个 或数个限制酶识别位点 的寡核苷酸片段
四、重组DNA实验的一般程序
a. 选用一种对载体DNA只具唯一限制识别位点的限制酶
（如EcoR I）作位点特异的切割，形成全长的具粘性 末端的线性DNA分子 b. 再将外源DNA片段也用同一种酶作相同的消化。 c. 混合，加入DNA连接酶。由于具有相同的（如EcoR I） 粘性末端，能退火形成双链结合体。其中单链缺口经 DNA连接酶封闭之后，便产生稳定的杂种DNA分子。
核酸水解酶类
核酸内切酶 核酸外切酶
DNA聚合酶 RNA聚合酶 DNA连接酶 磷酸酶 核苷酸激酶 核苷酸转移酶 甲基化酶
程常用工具酶 限制性核酸内切酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 核酸酶 核酸修饰酶
分子克隆最常用两个工具酶
“分子 剪刀”
⒈ 限制性核酸内切酶 —— 在DNA上核苷酸的 特定连接处以特定的方式把DNA双链切开。如EcoRI, HpaI
④ 反应体积和甘油浓度：
商品化的限制性内切核酸酶均加50％甘油 作为保护剂，一般在-20℃保存。酶切反应时， 加酶的体积一般不超过总反应的10％，否则甘 油浓度过高，影响酶切反应
⑤ 反应时间：通常为1h；进行大量DNA酶切反 应时一般让酶解过夜
⑥ DNA纯度和结构 DNA样品中所含的蛋白质、有机溶剂、
4. Taq DNA聚合酶
5. 逆转录酶：依赖于RNA的DNA聚合酶
6. RNA聚合酶
大肠杆菌DNA聚合酶I
以一条DNA为模板通过聚合作用把脱氧核苷酸加到 双链DNA分子的 3’-OH 端而合成新的 DNA.
用途：DNA缺口平移中标记DNA探针
基因工程常用的工具酶
基因工程常用的工具酶常州工程职业技术学院制药与生物工程技术系生物制药0911 刁亚军学号:2009423134引言:在基因工程的研究和发展过程当中，有许多必不可少的因素影响和制约着基因工程的进展。
本篇综述主要讲述的是基因工程常用的一些工具酶，他们包括限制性内切酶，DNA聚合酶，T4噬菌体DNA连接酶，T4多聚核苷酸激酶，碱性磷酸酶，核酸酶。
这些酶在基因工程中发挥着非常重要的作用。
限制性内切酶限制性核酸内切酶是可以识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶，简称限制酶。
根据限制酶的结构,辅因子的需求切位与作用方式，可将限制酶分为三种类型，分别是第一型（Type I）、第二型（Type II）及第三型（Type III）。
Ⅰ型限制性内切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；而Ⅱ型限制性内切酶只催化非甲基化的DNA的水解。
III型限制性内切酶同时具有修饰及认知切割的作用。
限制性内切酶的由来一般是以微生物属名的第一个字母和种名的前两个字母组限制性核酸内切酶成，第四个字母表示菌株(品系)。
例如，从Bacillus amylolique faciens H中提取的限制性内切酶称为Bam H，在同一品系细菌中得到的识别不同碱基顺序的几种不同特异性的酶，可以编成不同的号，如HindII、HindIII，HpaI、HpaII，MboI、MboI等。
限制性内切酶（restriction endonuclease）:一种在特殊核甘酸序列处水解双链DNA的内切酶。
Ⅰ型限制性内切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；而Ⅱ型限制性内切酶只催化非甲基化的DNA的水解。
别名Endodeoxyribonuclease简称限制酶酶反应限制性内切酶能分裂DNA分子在一限定数目的专一部位上。
它能识别外源DNA并将其降解。
单位定义在指明pH与37℃，在0.05mL反应混合物中，1小时消化1μg的λDNA的酶量为1单位。
分子生物学实验常用工具酶总结
分子生物学实验常用工具酶总结————————————————————————————————作者: ————————————————————————————————日期：现代分子生物学实验手册工具酶基因工程：在人工可以控制条件下,将基因剪切或重新组合,再导入另一生物体内,使这些基因在其中表达并遗传下去的一门技术。
核心:对基因进行人工切割、连接和重新组合，构建重组ＤNA。
工具酶:在基因工程的重组DNA过程中，所需要用到的酶的统称。
一、限制性内切酶(restriｃｔion endonuclease)主要功能:对外源性的双链ＤNＡ进行切割、水解，不允许外源性ＤNＡ存在于细菌自身细胞内。
(这种酶能对在自身细胞内存在的DＮA种类给予限制——限制性内切酶）限制-修饰系统:合成限制性内切酶的细胞,其自身的ＤNA不受酶的切割,这是因为细菌细胞还会合成一种修饰酶,可以对自身DNA进行修饰，即改变ＤNA 原来具有的可以被限制性内切酶识别的核酸顺序结构，从而不被限制性内切酶识别及切割、水解。
保护自身遗传物质稳定的机制。
限制性内切酶：从原核生物中发现的,约6０0种，可识别108种不同的特定ＤＮA顺序。
以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键，产生DＮA片段的5’端为P,3’端为-ﻩＯＨ。
命名：获得该酶的细菌属名的第一个字母（大写)＋该菌种名的前两个字母（小写）+株系的字母（小写）或数字+罗马数字(同一株菌种不同内切酶的编号）例:细菌属名细菌种名菌株名称限制酶名称Arthrobａcter luｔeuｓＡｌu IEｓcｈerichｉa coli RY１3Eco R ＩH Hａm H IBａｃiｌlus amyｌoｌiquｅｆaciｅnsHaemoｐｈilus influeｎzae Rd ＨinｄIII（一)三种常用内切酶1. I型限制性内切酶同时兼有切割DＮＡ的功能和修饰酶的修饰功能。
在酶的识别位点上,若ＤNA两条链菌没有发生甲基化,则行使内切酶的功能,对ＤＮA进行切割，同时转变成ATP酶。
生物工艺学第2章 基因工程工具酶1
大肠杆菌B
大肠杆菌K
10-4（限制作用） 修饰的phage λ (K)
1（修饰作用）
R-M 系统
细菌中存在位点特异性限制酶和特异性甲基化酶，构成了 寄主控制的限制—修饰系统 (R-M Restriction-modification system)。 R-M 系统是细菌安内御外的积极措施。细菌 R-M 系统的 限制酶可以降解 DNA，为避免自身 DNA 的降解，细菌可以修 饰（甲基化酶）自身 DNA，未被修饰的外来 DNA 则会被降解。 个别噬菌体在被降解之前已经发生了修饰，则可免予被降 解。
（3）牛血清蛋白 (BSA)
BSA 是酶稳定剂，可避免热、表面张力、化学品导致 的酶变性。过量 BSA 会引起电泳拖尾。
限制性核酸内切酶的反应条件
3. 星活性
限制性内切酶识别特异性放宽。 EcoRⅠ在正常情况下识别 GAATTC 序列发生切割，但 如果缓冲液中甘油浓度超过 5%，其识别位点发生松动，可在 AATT 处发生切割，EcoRⅠ这种特殊的识别能力叫做星活性， 用 EcoRⅠ*表示。星活性可造成位点切割机率不等，降解不 完全。 影响因素：甘油浓度 12-20%，酶与 DNA 比例，离子强 度，45% 聚乙二醇 (PEG)，有机溶剂，8% 二甲基亚枫，二 价阳离子，12% 乙醇。
自然界的许多微生物体内存在着一些具有
特异功能的酶类。这些酶类参与微生物的核酸 代谢，在核酸复制和修复等反应中具有重要作 用，有的酶还作为微生物区别自己和非己的 DNA 进而降解非己 DNA 的防御工具。在研究
掌握了利用这些酶类对基因切割、拼接操作方
法后，人类获得了最好的基因工程工具。
Hale Waihona Puke 基因工程工具酶及其应用限制性核酸内切酶的发现
基因工程工具酶
实际基因工程操作中目的基因 片段和载体用两种限制性内切 酶分别酶切，形成两不同的粘 性 末 端 ， 后 用 DNA 连 接 酶 连 接 （确保连接方向准确）。
1. DNA连接酶的基本性质
DNA连接酶的反应条件
1. DNA连接酶的基本性质
平头双链DNA片段的连接操作
2. DNA连接酶的种类
1. 限制性内切酶的发现和种类 几乎所有的限制性内切酶都要和能识 别且甲基化相同DNA位点的甲基化酶共 同作用。甲基化后，DNA位点被保护起 来，所以宿主细胞内的甲基化DNA能够 不被限制性内切酶所消化。限制-修饰系 统也称为R-M系统。
1. 限制性内切酶的发现和种类
限制性内切酶：识别双链DNA分子的特定序列， 并切割DNA双链。主要存在于原核细菌中，帮助 限制外来DNA的入侵。
2. Klenow大片段酶
Klenow酶的基本用途
三、DNA连接酶
1. DNA连接酶的基本性质
（1）修复双链DNA上缺口处的磷酸二酯键
1. DNA连接酶的基本性质
（2）修复与RNA链结合的DNA链上缺口处的磷酸二酯键
1. DNA连接酶的基本性质
（3）连接多个平头双链DNA分子
1. DNA连接酶的基本性质
b.
Ⅲ型核酸内切限制酶大约从距离识别序列 25bp处切割DNA分子。——远距离定点切 割
c.Ⅰ型核酸内切限制酶和Ⅲ型核酸内切限制酶，在 切割反应过程中，都会沿着DNA分子移动，因 此是一种需要能量的过程。——需要能量的反 应
d.Ⅰ型和Ⅲ型核酸内切限制酶，一般(通常)都是大 型的多亚基的复合物，既具有内切酶活性，又 具有甲基化酶活性。——内切酶活性和甲基化 酶活性 所以Ⅰ型和Ⅲ型核酸内切限制酶在基因工程中应 用价值不大。 II型酶的切割DNA片段活性和甲基化作用是分开 的，且其核酸内切作用又具有序列特异性，在 基因工程中广泛应用。 通常所指的限制性内切核酸酶都是指II型酶。
第二章 生物技术常用的工具酶
例如：EcoRⅠ 从大肠杆菌（Escherichia coli) R株分离 的第一种限制酶命名为EcoRⅠ， 其中E 代表属名 （Escherichia)，co 代表种名（coli)，R 代表株系 （RY13），Ⅰ 代表该菌株中首次分离到。
Hind Ⅲ
属 种 株 序
Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶
Sau3AI的酶切位点为GATC，但胞嘧啶“C”被甲 基化（修饰）后，Sau3AI的内切酶活性即被抑制。
二、限制酶的分类
• 根据其识别和切割序列的特性、催化条件及修饰活性 等，一般将限制酶分为I，Ⅱ，Ⅲ三大类。I类和Ⅲ类酶 不适用于基因工程。
• 基因工程所用的酶一般为Ⅱ类酶。 Ⅱ类酶的特点： Ⅱ型核酸内切限制酶仅有内切核酸酶的活性，而没 有甲基化酶的活性； 反应条件需Mg2+； 对DNA的水解有很强的特异性，它要求严格的识别 序列和切割点。
第二章 生物技术常用的工具酶
使核酸降解的核酸酶类（核酸内切酶和核酸 外切酶） 催化核酸合成的酶类（DNA聚合酶、RNA 聚合酶、DNA连接酶等） 核酸修饰酶类（甲基化酶、激酶、核酸转 移酶、磷酸酶等）
3′→5′外切酶 5′→3′外切酶
核酸外切酶：从DNA或RNA链的一端逐个水解下单核苷酸。 磷酸酶：是一种能够将对应底物去磷酸化的酶。 核苷酸转移酶：催化核糖核苷酸还原、生成相应的脱氧核糖核苷酸的酶。 甲基化酶：是作为限制与修饰系统中的一员，用于保护宿主DNA不被相应的限制酶所切割。 核苷酸激酶：催化ATP的γ -磷酸转移到DNA或RNA的5′-OH末端生成ADP的反应。
1μL
1μL 1μL
四、 使用时的注意事项
1) DNA连接酶不能催化两单链DNA分子连接； 2) 只能连接双链DNA分子的单链缺刻(nick)；
基因工程的工具酶
T
T
A
G
C
C
G
怎样切？ • 基因的剪刀——限制性内切酶（简称限制酶）
例：大肠杆菌(E.coli)的一种限制酶能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。
限制酶
限制酶
几种II型限制性核酸内切酶的酶切位点
Pst I
Provindencia stuartii 164
Haemophilus influenzae Rd
4363 pBR322物理图谱
练习题
为了绘制长为3.0kb BamH Ⅰ限制性片段的限制性图谱，分别用EcoR Ⅰ、Hpa Ⅱ、 EcoR Ⅰ+Hpa Ⅱ消化这一片段的三个样品，然后通过凝胶电泳分离DNA片段，溴化乙锭染色后观 察DNA带型。请根据这些结果绘制一个限制性图谱，要标明EcoR Ⅰ和Hpa Ⅱ识别位点间的 相对位置，以及它们之间的距离（kb）。
现非特异性的DNA片段的现象。 易产生星活性的内切酶用*标记。如：EcoR I*
造成星活性参数 甘油浓度12-20%，酶与DNA比例，离子强度，45%聚乙二醇(PEG)，有机溶剂，8%二甲基
亚枫，二价阳离子，12%
限制性内切酶的应用
1、重组DNA前的切割 2、构建新质粒 3、构建物理图谱 4、DNA分子杂交 5、制备DNA探针 6、亚克隆以用作序列分析 7、基因定位，DNA同源性研究。
A. 连接的两条链必须分别具有 3′端自由羟基（-OH）和5 ′端磷酸基团（-P），而且只有这两 个基团彼此相邻时才能进行连接反应；
B. 在羟基和磷酸基团间形成磷酸二酯键是一种耗能过程，因此连接反应必须有能量分子的参与， 通常有两种能量分子，即ATP和NAD+。
是两条链－因此不能将两条单链连接起来或使单链环化起来。
分子生物学实验常用工具酶总结
分子生物学实验常用工具酶总结现代分子生物学实验手册工具酶基因工程：在人工可以控制条件下，将基因剪切或重新组合，再导入另一生物体内，使这些基因在其中表达并遗传下去的一门技术。
核心：对基因进行人工切割、连接和重新组合，构建重组DNA。
工具酶：在基因工程的重组DNA过程中，所需要用到的酶的统称。
一、限制性内切酶（restriction endonuclease）主要功能：对外源性的双链DNA进行切割、水解，不允许外源性DNA存在于细菌自身细胞内。
（这种酶能对在自身细胞内存在的DNA种类给予限制——限制性内切酶）限制-修饰系统：合成限制性内切酶的细胞，其自身的DNA不受酶的切割，这是因为细菌细胞还会合成一种修饰酶，可以对自身DNA进行修饰，即改变DNA原来具有的可以被限制性内切酶识别的核酸顺序结构，从而不被限制性内切酶识别及切割、水解。
保护自身遗传物质稳定的机制。
限制性内切酶：从原核生物中发现的，约600种，可识别108种不同的特定DNA顺序。
以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键，产生DNA片段的5’端为P，3’端为- OH。
命名：获得该酶的细菌属名的第一个字母（大写）+该菌种名的前两个字母(小写)+株系的字母（小写）或数字+罗马数字（同一株菌种不同内切酶的编号）细菌属名细菌种名菌株名称限制酶名称Arthrobacter luteusAlu I Escherichia coli RY13Eco R IBacillus amyloliquefaciens HHam H I Haemophilus influenzae RdHin d III1. I型限制性内切酶同时兼有切割DNA的功能和修饰酶的修饰功能。
在酶的识别位点上，若DNA两条链菌没有发生甲基化，则行使内切酶的功能，对DNA进行切割，同时转变成ATP酶。
若DNA双链中有一条链已发生甲基化，则此类酶显示修饰酶的作用，对另一条DNA进行甲基化修饰，然后在行切割功能。
分子生物学工具酶
10/16/2019
客户定位
Ad characteristics
Attention-getting Believable Informative
Score
Fermentas Average
74%
58%
86%
75%
84%
64%
限制性内切酶的应用
限制酶谱的绘制 基因的亚克隆分析 各种DNA分子的体外重组 基因和染色体结构的分析 基因的体外突变等诸方面
具有全球第二大的产限制酶的菌株 (2500株)库 REBASE 中30% 限制酶经过Fermentas的鉴定 30%II型限制－修饰相关基因在Fermentas得到克隆 全球率先合成了“人造”酶(Eco57MI, N.Bpu10I) 生产中执行最高级别的生产标准（LO Test） 致力于通过提高生产效率从而提升产品质量和价格竞争力 全球限制性内切酶(REs)生产的领先企业 市场份额：20％左右，个别国家超过30％的市场占有率
内切酶种类第二多 ISO9002 认证和质量控制
Five Buffer Plus System，加有 BSA
Y+/Tango™，通用双酶切buffer 价格优势
未经 LO测试
有认证 非主要产品线 9种 buffers, 不提供
BSA 未提供双酶切的详细信
息 大幅度折扣
价格优势
仅有出厂化验日期, 距客 户购买日期可能会有一 年之久
价格相当
10/16/2019
与竞争对手的比较
Fermentas
vs
Takara
LO 测试– 达到PureExtreme™: 无其它 活性的污染
种类第二多 ISO9002 认证和质量控制
工具酶名词解释
工具酶名词解释工具酶是指由一种复杂分子结构组成的低分子物质，它们可以促进有机化学反应从而发挥作用。
它们是自然界中最重要的细胞活动调节剂，可以参与有机化学反应中的通路，使各种细胞生物化学反应实现有机物到有机物的转换。
从生物化学的角度来看，这些工具酶是细胞活动的调节因子，负责调节细胞的各种生物化学反应。
它们可以改变有机物的形式，调节有机物的活动，从而控制有机物的分子形式，使其更易于进行生物反应。
工具酶是生物体利用外界物质并进行代谢的重要组成部分，参与各种复杂的代谢过程，使受激发的物质获得或损失电荷，从而发挥作用。
目前，工具酶的分类已经分为多种类型，如糖蛋白酶，核酸酶，核糖核酸酶，脂质酶，金属结合酶等，各具特定功能，可以发挥不同的作用。
糖蛋白酶系列，指可以将一个糖基连接到一个蛋白质分子上，蛋白质糖基化是一种调节细胞功能常见而重要的发生方式。
核酸酶可以降解核酸链，以消耗外来分子或催化它们的化学反应，是DNA和RNA的合成和修饰的重要头枢钮。
核糖核酸酶涉及有机物的转化，能够促进核糖凝集体的构建，从而控制细胞的生长和分化。
脂质酶可以催化多种脂的氧化和还原反应，是有机物的重要生物合成反应，这些反应的发生是细胞能量代谢的重要组成部分。
金属结合酶是一类具有识别能力的蛋白质，它能够将金属结合到蛋白质上，通过特定结构和特定位置，控制着多种代谢路径，参与生物体内各种复杂的代谢反应。
工具酶对于细胞的生理活动起着重要作用，可以把一种有机物转化为另一种有机物，从而调节细胞内化学反应的速度。
另外，它们也可以介导细胞的信号传导，是调节细胞功能的重要组成部分。
此外，它们还可以作为一种药物，用于治疗某些疾病，如糖尿病，心脏病等。
综上所述，工具酶是一类重要的生物活性物质，具有多种功能，起着绝对重要的作用。
它们能够参与细胞的生物化学反应，促进细胞的生理活动，调节有机物的形态；同时也可以作为药物，用于治疗某些疾病。
因此，为了更好地发挥工具酶的作用，在科学研究及应用中，对工具酶的研究和应用具有重要意义。
分子生物学实验常用工具酶总结
现代分子生物学实验手册工具酶基因工程：在人工可以控制条件下，将基因剪切或重新组合，再导入另一生物体内，使这些基因在其中表达并遗传下去的一门技术。
核心：对基因进行人工切割、连接和重新组合，构建重组DNA。
工具酶：在基因工程的重组DNA过程中，所需要用到的酶的统称。
一、限制性内切酶（restriction endonuclease）主要功能：对外源性的双链DNA进行切割、水解，不允许外源性DNA存在于细菌自身细胞内。
（这种酶能对在自身细胞内存在的DNA种类给予限制——限制性内切酶）限制-修饰系统：合成限制性内切酶的细胞，其自身的DNA不受酶的切割，这是因为细菌细胞还会合成一种修饰酶，可以对自身DNA进行修饰，即改变DNA原来具有的可以被限制性内切酶识别的核酸顺序结构，从而不被限制性内切酶识别及切割、水解。
保护自身遗传物质稳定的机制。
限制性内切酶：从原核生物中发现的，约600种，可识别108种不同的特定DNA顺序。
以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键，产生DNA片段的5’端为P，3’端为- OH。
命名：获得该酶的细菌属名的第一个字母（大写）+该菌种名的前两个字母(小写)+株系的字母（小写）或数字+罗马数字（同一株菌种不同内切酶的编号）例：细菌属名细菌种名菌株名称限制酶名称Arthrobacter luteus Alu IEscherichia coli RY13Eco R IBacillus amyloliquefaciens H Ham H I Haemophilus influenzae Rd Hin d III（一）三种常用内切酶1. I型限制性内切酶同时兼有切割DNA的功能和修饰酶的修饰功能。
在酶的识别位点上，若DNA两条链菌没有发生甲基化，则行使内切酶的功能，对DNA进行切割，同时转变成ATP酶。
若DNA双链中有一条链已发生甲基化，则此类酶显示修饰酶的作用，对另一条DNA进行甲基化修饰，然后在行切割功能。
基因工程的工具酶
第二章基因工程的酶学基础内容一、概述二、限制性内切核酸酶三、DNA连接酶四、其他工具酶一、概述工具酶：在生物技术中常用的各种工具酶系指能用于DNA和RNA分子的切割、连接、聚合、反转录等有关的各种酶系统称为工具酶。
工具酶名称主要功能限制性内切核酸酶在DNA分子内部的特异性的restriction endonucleases 碱基序列内部进行切割DNA连接酶将两条以上的线性DNA分子或片段DNA ligase 催化形成磷酸二酯键连接成一个整体DNA聚合酶I通过向3’端逐一增加核苷酸以填补双链DNA分子上的单链DNA polymerase I 裂口，即5’→3’DNA聚合酶活性与3’→5’及5’→3’外切酶活性多核苷酸激酶催化将把一个磷酸分子加到多核苷酸链的DNA polymerase kinease 5’-OH末端上(接下表格)工具酶名称主要功能反转录酶以RNA分子为模板合成互补的cDNA链reverse transcriptaseDNA末端转移酶将同聚物尾巴加到线性双链或单链DNA分子的3’-OH DNA terminal transferase 末端或DNA的3’-末端标记dNTP碱性磷酸酶去除DNA,RNA,dNTP的5’磷酸基团BAP orCIAP核酸外切酶III 降解DNA3’-OH末端的核苷酸残基exonuclease III降解酶S1 降解单链DNA或RNA,产生带5’磷酸的单核苷酸或nuclease S1寡聚核苷酸，同时也可切割双链核酸分子的单链工具酶名称主要功能核酸酶Bal 31 降解双链DNA,RNA的5’及3’末端，nuclease Bal31Taq DNA聚合酶能在高温（72℃）下的单链DNA为模板，Taq DNA polymerase从5’→3’方向合成新生的互补链核糖核酸酶专一性降解RNARNase脱氧核糖核酸酶内切核酸酶，水解单链或双链DNA DNase二、限制性内切核酸酶1、限制性核酸内切酶的分类2、限制性核酸内切酶的命名原则3、限制性核酸内切酶的基本特征4、影响限制性内切酶的活性因素5、限制性核酸内切酶的应用1、限制性核酸内切酶的分类限制性核酸内切酶主要分成三大类：I类：能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切割双链，但切割序列没有专一性，是随机的。
第二章基因工程操作的工具酶10315
常见的限制性内切酶
限制性核酸内切酶名称 识别序列和切割点
EcoR Ⅰ
G↓AATTC
HindⅡ
GTPy↓PuAC
Hind Ⅲ
A↓AGCTT
BsuR I
GG↓CC
Pst Ⅰ Sma Ⅰ Xba Ⅰ Xho Ⅰ BamHⅠ Not Ⅰ
CTGCA↓G CCC↓GGG
T↓CTAGA C↓TCGAG G↓GATCC
•
HindIII
Xba I
• -A
CTAGA-
• -TTCGA
T
•
Klenow酶填补
• -AAG
CTAGA-
• -TTCGA
TCT-
•
-AAGCTAGA-
•
-TTCGATCT-
C.平末端连接
• -AAGCCCGGGTCG- - GGAGGTTAACCT-
• -TTCGGGCCCAGC- - CCTCCAATTGGA
②2个单链断裂部位在DNA分子上的分布通常 不是彼此直接相对的；
Pst Ⅰ酶切 5’ … C – T –G –C–A↓G … 3’ 3’ … G↑A–C – G–T– C… 5’
③断裂结果形成的DNA片段往往具有互补的 单链延伸末端。
EcoRⅠ： 5’ … G↓A –A- T –T – C … 3’ 3’ … C – T –T –A –A↑G … 5’
以内切方式水解DNA，产物的5’为p， 3’ 为 OH。
限制性内切酶的发现
Luria和Human发现： λ．K噬菌体 ---------------Ecoli λ．B噬菌体---------------- Ecoli 广泛存在于原核细菌 。
由宿主控制的对外源DNA的限制(restriction) 和对内源DNA的修饰(modification)现象称 为宿主细胞的限制和修饰作用。
第三章 工具酶
1. 来源
原核生物。
3. 功能
自我保护作用。
细菌的限制和修饰系统（R/M体系） （1）限制（Restriction） 2. 性质 内切酶。 即在核酸分子链的内部制造切口的酶。
5’3’GAATTC CTTAAG
EcoR I
可将侵入细菌体内的外源DNA切成小片断。 非甲基化
-3’ -5’
5’3’-
G-3’ 5’-AATTC CTTAA-5’ 3’-G
b.3’突出的粘性末端 Pst I c.平齐末端
5’-CTGCAG-3’ 5’3’3’ -GACGTC ACGTC-5’
5’-GATATC ATC-3’ EcoR V 5’ 3’3’ -CTA TAG TAG-5’
2
2012-2-17
② 3’端凸出（如Pst I切点）
5’3’CTGCAG GACGTC
CTGCA-3’ 5’-G G-5’ 3’-ACGTC
② 5’末端标记 凸出的5’末端可用DNA多核苷酸激酶 进行32P标记。 凸出的3’端可以通过末端转移酶添加几 个多聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等） 造成人工粘性末端 造成人工粘性末端。 ③ 补平成平齐末端 粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐 末端。
三、影响限制性内切酶活性的因素 1. DNA的纯度 DNA中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、 SDS、EDTA及高浓度的盐离子等，都可能 抑制酶的活性。 一般采取： ①纯化DNA ②加大酶的用量 ③延长保温时间 ④ 扩大酶催化反应体积（ >20l），使 潜在的抑制因素被相应稀释
2. DNA的甲基化程度 大肠杆菌一般有两种甲基化酶修饰质粒： dam甲基化酶（修饰GATC中的A）； dcm甲基化酶（修饰CC dc CCA/TGG / GG的C） ）。 基因工程中必须使用甲基化酶失活 突变的菌株。
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工具酶简介材料
概念：应用于基因工程的各种酶的总称，包括核酸序列分析、标记探针制备、载体构建、目的基因选取、重组体DNA制备等程序中所需要的酶类。
基因工程常用的的工具酶可粗略的分为限制酶，连接酶，聚合酶和修饰酶四大类。
其中，以限制性核酸内切酶和DNA连接酶在分子克隆中的作用最为突出。
酶的特性：高效性、专一性、作用条件温和（动物体：35～40℃,PH为6.5～8.0之间；植物体：40～50℃,PH为4.5～6.5之间；细菌和真菌体内的酶最适温度差别较大，有的酶最适温度可高达70℃.）
DNA限制性内切酶：（分子手术刀或基因剪刀,主要分布在微生物中，具有识别特定的核苷酸序列，切割待定的切点的特异性，产生黏性末端。
）
1968年，smith等人从流感嗜血杆菌株出两个内切酶，HindⅡ和hindⅢ，为基因工程的诞生奠定了基础。
截至目前为止，已经分离出400余种Ⅱ类酶，搞清识别点的有300种，商品化的约100余种，实验室常用的有20种。
生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。
是可以将外来的DNA切断的酶，即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA却无损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息。
由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶(简称限制酶)
限制性内切酶有Ⅰ型和Ⅱ型限制性DNA内切酶之分，Ⅱ型能严格识别核酸序列，并在识别区内特定的核苷酸处切开DNA双链。
故通常所指都是Ⅱ型限制性DNA内切酶。
识别分四核苷酸，五核苷酸，八核苷酸和六核苷酸，其中以六核苷酸为主，其序列旋转对称。
切口分黏性末端和平末端，产生3′－OH和5′－P末端。
内切酶品种多，使用时应注意温度、缓冲液用量（一般1μg DNA/2-5单位酶）等反应条件。
限制性内切酶可将特定核苷酸序列的特定位置的磷酸二酯键断开，一种限制性内切酶只可识别一种特定核苷酸序列，限制性内切酶是基因工程的主要工具之一。
DNA连接酶：（分子缝合针或基因针线，连接磷酸二酯键两个相同的黏性末端。
）它是一种封闭DNA链上缺口酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链的5'-PO4与另一DNA链的3'-OH生成磷酸二酯键。
但这两条链必须是与同一条互补链配对结合的(T4DNA连接酶除外)，而且必须是两条紧邻DNA链才能被DNA连接酶催化成磷酸二酯键。
连接酶有T4噬菌体DNA连接酶、T4噬菌体RNA连接酶、大肠埃希菌DNA连接酶等。
DNA连接酶可连接平端，也连接粘端。
反应需有Mg2+和ATP存在，pH7.5-7.6。
最适温度37℃，30℃以下活性明显下降，但考虑到被连接DNa 的稳定性和粘性末端的退火温度，一般平端连接用20-25℃，粘端连接用12℃左右。
聚合酶：
又称DNA聚合酶。
系专司生物催化合成脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)的一类酶的统称。
可分为以下几个类群:(1)依赖DNA的DNA聚合酶；(2)依赖RNA的DNA聚合酶；
(3)依赖DNA的RNA聚合酶；(4)依赖RNA的RNA聚合酶。
前两者是DNA聚合酶，
它使DNA复制链按模板顺序延长。
如在原核生物中仅就大肠杆菌中已被发现的就有三种(分别简称为P01Ⅰ，P01Ⅱ和P01Ⅲ等)；DNA聚合酶只能在有引物的基础上，即在DNA或RNA引物的3′-OH延伸，这DNA的合成方向记为5′→3′。
换言之DNA聚合酶催化反应除底物(αNTP)外，还需要Mg2+、模板DNA和引物，迄今细胞内尚无发现可从单体起始DNA的合成。
同样，上述(3)和(4)是催化RNA生物合成反应中最主要的RNA 合成酶，它们以四种三磷酸核糖核苷(NTP)为底物，并需有DNA模板以及Mn2+及Mg2+的存在下，在前一个核苷酸3′-OH与下一个核苷酸的5′-P聚合形成3′，5′-磷酸二酯键，其新生链的方向也是5′→3′。
RNA聚合酶也大量存在于原核和真核生物的细胞中。
如大肠杆菌RNA聚合酶分子量4.8×105，由5条多肽链组成，分别命名为α，α，β，β′，和γ，全酶可用α2ββ′λ表示。
真核生物RNA聚合酶分子大于5×105，由10～12个大小不等亚基组成。
聚合酶除作为自然界生命活动中不可缺少的组分外，在实验室中大多用作生命科学研究的工具酶类之一。
聚合酶有DNA聚合酶（以DNA为模板合成DNA大肠埃希菌DNA聚合酶Ⅰ，大肠埃希菌DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow大片段），T4或T7噬菌体DNA聚合酶等）；RNA聚合酶（以DNA为模板合成RNA，T7或T3噬菌体RNA聚合酶）；逆转录酶（以RNA为模板合成DNA，除RNA病毒中发现外，发现大肠埃希菌DNA聚合酶Ⅰ和Taq DNA聚合酶都有逆转录活性）。
大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ具有5′→3′聚合酶活性和5′→3′，3′→5′外切酶活性。
Klenow 片段是DNA聚合酶Ⅰ被枯草杆菌酶作用产生的一个大片段，有5′→3′聚合酶和5′→3′外切酶活性，无3′→5′外切酶活性。
可用于缺口翻译（Nick translation）法标记核酸，也可用于DNA序列测定，修补DNA链等。
核酸酶：
核酸酶有DNase、RNase、核酸酶S1等，可水解相应的DNA和RNA，核酸酶S1可降解单链DNA和RNA，用量增大也可降解双链核酸。
它可用于切去ds-cDNA合成中产生的发夹环。
末端转移酶在Mg2+存在下，选择3′－OH端单链DNA为引物加成核苷酸，在Co2+存在下，选择3′－OH端双链DNA为引物加成核苷酸，形成多聚核苷酸尾。
常用于核酸末端标记和核酸连接的互补多聚尾（连接器）。
修饰酶：
体内有些酶可在其他酶的作用下，将酶的结构进行共价修饰，使该酶活性发生改变，这种调节称为共价修饰调节(covalent modification regulation)，这类酶称为修饰酶(prosessing enzyme)。
碱性磷酸酶去除5′－P，可防止二分子DNA片段5′端P基团自身空间障碍，影响DNA分子之间的连接，一般用碱性磷酸酶处理载体DNA除去5′端P基团，在连接酶作用下目的基因的5′端P先与载体3′端OH连接，再通过复制修复另一条链，使二条链完全连接。
该方法大大提高了连接效率。
中文名称：磷酸二酯键
英文名称：phosphodiester bond
两个核苷酸分子核苷酸残基的两个羟基分别与同一磷酸基团形成的共价连接键。
生物化学与分子生物学（一级学科）；核酸与基因（二级学科）
DNA中的磷酸二酯键
磷酸二酯键
英文名称：phosphodiester linkage
一种化学基团，指一分子磷酸与两个醇（羟基）酯化形成的两个酯键。
该酯键成了两个醇之间的桥梁。
例如一个核苷的3ˊ羟基与另一个核苷的5ˊ羟基与同一分子磷酸酯化，就形成了一个磷酸二酯键。
脱氧核糖与磷酸之间连接的键为磷酸二酯键。
如图所示，磷酸和二个糖、醇等的羟基（R—OH，R′—OH）形成酯时的键为磷酸二酯键。
代表性的磷酸二酯键是核酸的核苷酸间的键，由于相邻核苷酸的糖的3′－OH和5′－OH中磷酸分子脱氢，五碳糖脱去羟基而形成磷酸二酯键而聚合起来。
此键可由酸、碱或酶的作用而水解。
DNA聚合酶，限制性核酸内切酶（限制酶），DNA连接酶都可作用于磷酸二酯键。
DNA聚合酶及DNA连接酶可催化磷酸二酯键的形成。
限制性内切酶可将特定核苷酸序列的特定位置的磷酸二酯键断开，一种限制性内切酶只可识别一种特定核苷酸序列，限制性内切酶是基因工程的主要工具之一。