实验琼脂糖凝胶电泳一原理二目的掌握核酸电泳的方法
DNA的琼脂糖凝胶电泳实验原理和操作步骤
DNA的琼脂糖凝胶电泳实验原理和操作步骤DNA的琼脂糖凝胶电泳是一种常用的分子生物学技术，用于分析DNA 的大小和纯度，以及进行DNA分子的分离和纯化。凝胶电泳实验可以帮助我们确定DNA样本的大小和获得纯化的DNA片段供进一步研究使用。下面是DNA琼脂糖凝胶电泳实验的原理和操作步骤。
【原理】
DNA琼脂糖凝胶电泳是根据DNA分子在电场中的不同迁移速率来分离大小不同的DNA片段。琼脂糖凝胶是一种凝胶状物质，其孔隙大小能够将DNA分子限制在一定范围内，较大的DNA分子迁移速率较慢，而较小的DNA分子迁移速率较快。琼脂糖凝胶通常是在平均浓度为1%至2%之间的范围内制备，以便在不同大小的DNA分子之间提供适当的分辨率。
实验中，DNA样品通过切割酶或PCR等方法获得，样品经过核酸电泳缓冲液稀释，并在琼脂糖凝胶板上进行电泳。凝胶板两侧连接电源，DNA 的带电粒子将在电场的作用下从负极迁移到正极，迁移过程中形成DNA的“条带”，条带的位置和长度反映了DNA的大小。通常，DNA条带由荧光染料或核酸染料标记，以便在电泳结束后进行可视化。
【操作步骤】
以下是DNA琼脂糖凝胶电泳实验的一般操作步骤：
1.制备琼脂糖凝胶板：
a.准备琼脂糖粉末和核酸电泳缓冲液（通常为TAE或TBE缓冲液）。
b.按照说明书将琼脂糖粉末溶解于核酸电泳缓冲液中。
c.将溶液加热至沸腾并搅拌，使琼脂糖完全溶解。
d.将溶液倒入预先准备好的电泳仓中，插入梳子或制备好的孔板，使其凝固。
2.样品制备：
a.提取DNA样品并测定其浓度。
b. 将DNA样品稀释到适当浓度，通常为10-50 ng/μL。
实验琼脂糖凝胶电泳的原理和方法
一块正方形琼脂糖凝胶板(10cm×10cm或 20cm×20cm)呈45°置于中央，电场在N-S和W-E之间交 替建立。电场交替改变的时间长短与欲分离的DNA分子大 小有关。电泳时，DNA分子处在连续间隔交替的电场中。 首先向S极移动，然后改向E极。在每次电场方向改变时， DNA分子就要有一定的时间松弛，改变形状和迁移方向。 只有当DNA分子达到一定构型后，才能继续前进。DNA分 子净移动方向与加样线(图中点线)垂直，使样品中各组分 沿同一泳道形成各自的区带。交变脉冲电泳可有效分离数 百万bp的大分子DNA。较新式的仪器电极间的角度和脉冲
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二、琼脂糖凝胶电泳
概念：以琼脂糖凝胶作支持体的电泳方式。
天然琼脂（agar）:又名琼胶、菜燕、冻粉，从石花菜及 其它红藻类植物提取出来的一种线状高聚物。 琼脂糖（agarose） 琼脂胶（agaropectin）
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天然琼脂(agar)是一种多聚糖，主要由 琼脂糖(约占80%)及琼脂胶组成。琼脂糖是 由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带 电荷。而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强 酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场 作用下能产生较强的电渗现象，加之硫酸根 可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离 效果。
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(2)
缺少离子时，电流太小，DNA迁移慢；相反， 高离子强度的缓冲液由于电流太大会大量产热 ， 严重时，会造成胶熔化和DNA 常用的电泳缓冲液有EDTA(pH8.0)和Tris-乙 酸(TAE)，Tris-硼酸(TBE)或Tris-磷酸(TPE)等 ，浓度约为50mmol/L(pH7.5-7.8) 。电泳缓冲液 一般都配制成浓的贮备液，临用时稀释到所需倍
实验琼脂糖凝胶电泳一原理二目的掌握核酸电泳的方法
(DNA用)
本制品是核酸电泳用Loading Buffer。向电泳样品溶液中加入1/6量即可 上样电泳。 本制品中含有色素溴酚蓝（Bromophenol Blue)、二甲苯腈蓝FF（Xylene Cyanol FF)，可以观察电泳的进行情况。溴酚蓝在琼脂糖凝胶（0.5% ~ 1.4%）中约与300 bp的双链线状DNA的迁移速度相同（在0.5×TBE中)， 而二甲苯腈蓝FF则与4 k bp的双链线状DNA的迁移速度相等。溴酚蓝与 二甲苯腈蓝FF在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移速率则随凝胶浓度的改变而不 同。 本缓冲液配制组成合理，缓冲液中不含核酸酶（DNase或RNase)，泳带 清晰，是实验室常用的凝胶电泳上样用缓冲液。一般来说，PCR反应后 的琼脂糖凝胶电泳以及短链DNA的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，常使用本制 品。
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011121314151617181920212223M
M12 3
4 5 67 8 9
2011-5-24
10 11 12
电泳仪有电压不一定标志电泳槽已经接通，应该观察正负极 铂金丝是否有气泡出现，如负极的气泡（H2)比正极的(O2)多一 倍，表示电泳槽已接通电源，几分钟后可见指示剂溴酚蓝向正 极移动；
琼脂糖凝胶电泳实验原理和实验方法
琼脂糖凝胶电泳实验原理和实验方法
琼脂糖凝胶电泳实验原理和实验方法
[实验原理]
电泳是现在用于分离和纯化DNA片段的最常用技术。包含电解质的多孔支持介质----“胶”并把它置于静电场中。则DNA分子将向阳极移动，这是因为DNA分子沿其双螺旋骨架两侧带有含负电荷的磷酸根残基。当DNA长度增加时，来自电场的驱动力和来自凝胶的阻力之间的比率就会降低，不同长度的DNA片段就会表现出不同的迁移率。因而就可依据DNA分子的大小来使其分离。该过程通过把示踪染料（Purple Loading Dye）或分子量标准参照物(Ladder)和样品(DNA&RNA)一起进行电泳而得到检测。分子量标准参照物也可以提供一个用于确定DNA片段大小的标准。
琼脂糖凝胶适用于分离大小在0.2-50Kb范围内的DNA片段。
[实验用品]
1.琼脂糖 1.0%
1.0g琼脂糖+100ml电泳缓冲液(TAE),微波炉中火30秒至沸腾,熔化的琼脂物冷却至60℃时可加入10mg/ml溴化乙锭10μl,充分混匀,将温热的凝胶倒入已置好梳子(鉴定胶用细密点的梳子；回收胶用粗稀的梳子）的胶膜中在室温下放置30-45min后现进行电泳。
1.5%:琼脂糖1.5g。
2.电泳缓冲液
50×TAE Tris 乙酸 Tris 242g 终2 mol/L
乙酸57.1ml 终1mol/L
0.5M EDTA200ml pH8.0 终100mmol/LdH2O 补足至1000ml
使用时稀释1×TAE。
5×TBE Tris 硼酸 Tris 54g 终445mmol/L
核酸电泳方法
核酸电泳是一种分离核酸的方法，主要包括琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。以下是两种核酸电泳方法的介绍：
1.琼脂糖凝胶电泳：
（1）将琼脂糖在所需缓冲液中加热熔化成清澈、透明的溶胶，然后倒入胶模中，凝固后将形成一种固体基质，其密度取决于琼脂糖的浓度。
（2）将凝胶置电场中，在中性pH值下带电荷的核酸通过凝胶网孔向阳极迁移，迁移速率受到核酸的分子大小、构象、琼脂糖浓度、所加电压、电场、电泳缓冲液、嵌入染料的量等因素影响。
（3）在不同条件下电泳适当时间后，大小、构象不同的核酸片段将处在凝胶不同位置上，从而达到分离的目的。
（4）凝胶的制备和电泳操作方法包括以下步骤：选择琼脂糖、配制缓冲液、加热熔化琼脂糖、灌制凝胶、电泳、染色和观察。
2.聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）：
（1）聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和交联剂聚乙烯吡咯烷酮（PVP）在催化剂作用下形成的三维网状结构。该凝胶具有孔径大小适合核酸分离，且与样品间无反应的特点。可通过改变基质的百分比来调整孔径大小，从而有效分离不同大小的核酸。
（2）凝胶电泳常用于分离蛋白质，例如SDS-PAGE技术是常用的蛋白表达分析技术之一。它根据检体中蛋白质分子量大小的不同，使其在电泳胶中分离。在大肠杆菌表达纯化外源蛋白的实验中，SDS-PAGE 是必不可少的操作步骤。
（3）聚丙烯酰胺凝胶电泳适用于分离同工酶及其亚型、大分子核酸等。
实验五--核酸琼脂糖凝胶电泳
实验五核酸琼脂糖凝胶电泳
一、实验目的
琼脂糖凝胶电泳是常用的检测核酸的方法，具有操作方便、经济快速等优点。本实验学习DNA琼脂糖凝胶电泳的使用技术，掌握有关的技术和识读电泳图谱的方法。
二、实验原理
琼脂糖凝胶电泳是用于分离、鉴定和提纯DNA片段的标准方法。琼脂糖是从琼脂中提取的一种多糖，具亲水性，但不带电荷，是一种很好的电泳支持物。DNA在碱性条件下（pH8.0的缓冲液）带负电荷，在电场中通过凝胶介质向正极移动，不同DNA分子片段由于分子和构型不同，在电场中的泳动速率也不同。溴化乙锭（EB）可嵌入DNA分子碱基对间形成荧光络合物，经紫外线照射后，可分出不同的区带，达到分离、鉴定分子量，筛选重组子的目的。但是EB具有致癌性，所以我们选用无毒，高灵敏度是Ex Green染料，。此核酸染料在紫外透照仪及可见光透射仪上均可使用。ExGreen外观呈红色，与核酸结合后，可用300 nm （紫外透射仪）激发。
三、材料、仪器和试剂
1、材料大肠杆菌中提取的质粒DNA
2、仪器电泳仪；台式离心机；恒温水浴锅；微波炉；紫外透射仪；照相机或者凝胶成像系统
3、试剂
（1）50×TAE电泳缓冲液：称取Tris 242g，EDTA 37.2g，加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解，加入57.1ml的醋酸，充分搅拌，加去离子水定容至1L，室温保存。
（2）6×电泳上样缓冲液：0.25%溴酚蓝、40%（W/V）蔗糖水溶液，贮存于4℃。
（3）溴化乙锭（EB）溶液母液：将EB配制成10mg/mL。用铝箔或黑纸包裹容器，贮存于室温即可。
DNA琼脂糖凝胶电泳
学习核酸电泳的原理和优缺点，掌握琼脂糖 凝胶电泳检测DNA的技术。
二、实验原理
带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。琼 脂糖凝胶电泳是进行核酸研究的重要手段，是核 酸基因组DNA、核酸扩增等技术所不可或缺的组 成部分。浓度不同的琼脂糖可形成网孔大小不同 的分子筛，能用于分离不同分子量的核酸片段， 是分离、鉴定和纯化核酸的一种常用方法。
五、注Leabharlann Baidu事项
（1）凝胶中DNA的上样量要合适，太多会引起DNA条 带模糊，太少又会引起条带信号弱或无DNA带。 （2）EB染色时要带好一次性塑料手套，避免污染。
三、实验流程
四、实验步骤
（1）1 xTAE溶液的配制：50 xTAE溶液稀释成1 xTAE溶液。 （2）配制1%琼脂糖凝胶：用电子秤称取0.30g琼脂糖，小心移入三角瓶中，加入1 xTAE 电泳缓冲液30ml，轻轻摇匀后放入微波炉中加热30s，完全沸腾后溶液清澈透明取出， 冷却至55℃，倒入已插好样品梳的制胶槽中，胶厚3~5mm，小心赶走气泡。 （3）室温放置30~45 min，胶凝固后，小心拔出梳子，取出制胶板，放入加有1 xTAE电 泳缓冲液的电泳槽中，缓冲液高出凝胶表面1mm。 （4）用微量移液器在点样板上将5μl DNA 液+2μl 上样缓冲液充分混匀，然后用移液器 将样品加入样品孔中，一定要包括合适的DNA 分子量标准物，记录点样顺序。 （5）盖上电泳槽的盖子，连接好电线和电源，打开电源，在1~10V/cm 凝胶的电压降下 进行电泳。 （6）当加样缓冲液中的溴酚蓝迁移至足够分离DNA 片段的距离时，关闭电源。 （7）将凝胶置于0.5μg/ml 溴化乙锭中染色10 min，在紫外下观察，拍照，保存照片。
实验琼脂糖凝胶电泳的原理和方法
pH 8.6 > pI ，各种脂蛋白均带负电，电泳时由负 极 到正 极 ； VLDL 为圆 形，受阻力小， LDL 形 态 不 规则，受阻力大，所以VLDL跑在前。
CM LDL VLDL HDL
—
+
加样槽
β
前β
α
临床应用：高脂蛋白血症的分型 CM β 前β
α
正常 Ⅰ型 Ⅱa型 Ⅱb型 Ⅲ型 Ⅳ型 Ⅴ型
在凝胶中，DNA片段迁移距离(迁移率)与碱 基对的对数成反比，因此通过已知大小的标准 物移动的距离与未知片段的移动距离进行比较， 便可测出未知片段的大小。 但是当DNA分子大小超过20kb时，普通琼脂 糖凝胶就很难将它们分开。此时电泳的迁移率 不再依赖于分子大小，因此，应用琼脂糖凝胶 电泳分离DNA时，分子大小不宜超过此值。
五、交变脉冲电场凝胶电泳
一般琼脂糖凝胶电泳只能分离小于20kb的DNA。 这是因为在琼脂糖凝胶中，DNA分子的有效直径超 过凝胶孔径时，在电场作用下，迫使DNA变形挤过 筛孔，而沿着泳动方向伸直，因而分子大小对迁移 率影响不大。如此时改变电场方向，则DNA分子必 须改变其构象，沿新的泳动方向伸直，而转向时间 与DNA分子大小关系极为密切。
(4)电泳后区带易染色，样品易洗脱，便于定量测定。
琼脂糖凝胶电泳的缺点： (1) 机械强度差，易破碎，浓度不能太低。 (2) 易被细菌污染，不易保存，临用前配制。 (3) 琼脂糖支持层上的区带易于扩散，电泳后必须 立即固定染色。 (4) 与PAGE相比，分子筛作用小，区带少。
DNA琼脂糖凝胶电泳实验原理及超详细步骤
DNA琼脂糖凝胶电泳实验原理及超详细步骤
DNA琼脂糖凝胶电泳实验原理及超详细步骤
物品准备
⽔平电泳槽、电泳仪、微波炉、紫外透射仪、锥形瓶、琼脂糖、电泳缓冲液(1xTBE) 溴化⼄锭(EB)溶液、上样缓冲液等
实验原理
DNA分⼦在琼脂糖中泳动时有电荷效应和分⼦筛效应，但主要为分⼦筛效应。在pH值为8.0- 8.3时，核酸分⼦碱基⼏乎不解离，磷酸全部解离，核酸分⼦带负电，在电泳时向正极移动。采⽤适当浓度的凝胶介质作为电泳⽀持物，在分⼦筛的作⽤下，使分⼦⼤⼩和构象不同的核酸分⼦泳动率出现较⼤的差异，从⽽达到分离核酸⽚段检测其⼤⼩的⽬的。核酸分⼦中嵌⼊荧光染料(如EB )后，在紫外灯下可观察到核酸⽚段所在的位置。
实验步骤
（1）准备制胶架，⽤蒸馏⽔将电泳槽和梳⼦冲洗⼲净，放在⽔平桌⾯上，并架好梳⼦
（2）配制琼脂糖凝胶及倒胶，琼脂糖凝胶浓度与线形DNA的最佳分辨范围
a.以1%的胶为例，三⾓瓶内0.6g琼脂糖+60ml(0.5xTBE)煮胶溶解冷却⾄60C(不烫⼿)
b.加⼊溴化⼄锭溶液（终浓度0.5ug/ml）或按照1ul/30mL的⽐例加⼊DNAgreen 染料，并充分混匀。
c.倒板,⼩胶倒⼊25-30ml左右琼脂糖溶液，⼤胶则60-70ml左右，若需切胶回收，凝胶可适当加厚。
d.室温下充分凝固，⼤约30分钟-1⼩时
e.垂直向上拔出梳⼦
f.将胶板放⼊电泳槽
g.向电泳槽中加⼊0.5xTBE缓冲液⾄刚没过凝胶表⾯1-2nm.
（3）加样
将DNA样品(5ul)与6X上样缓冲液( 1ul)混匀后，⽤微量加样枪⼩⼼加⼊样品孔内，上样量根据样品浓度可适当调整，若DNA含量偏低，则可依上述⽐例增加上
DNA琼脂糖凝胶电泳实验原理和方法步骤
DNA琼脂糖凝胶电泳实验原理和方法步骤
实验原理：
DNA是带有负电荷的分子，当在电场力作用下，可以根据分子的大小
和形状移动到琼脂糖凝胶上。琼脂糖凝胶的作用是形成一个微孔状的网状
结构，可以筛选DNA根据大小进行分离。较小的DNA片段能够通过网状结
构移动较快，而较大的DNA片段则移动较慢。通过观察DNA在凝胶上的迁
移距离和与各种标准DNA片段的比较，可以确定样品中DNA片段的大小。
方法步骤：
准备工作：
1.准备琼脂糖凝胶：按照产品说明书或实验方案将琼脂糖溶解在适量
的缓冲液中，同时加热至完全溶解。
2.准备电泳槽：将琼脂糖凝胶倒入电泳槽中并插入电极，确保凝胶充
分固化并全部覆盖缓冲液。
样品处理：
1.提取DNA样品：根据实验需求，从细胞或组织中提取DNA。
2.消化DNA：将DNA溶液加入适量的限制性内切酶反应缓冲液，并在
适当的温度下孵育一段时间，以消化DNA并产生DNA片段。
3.加入标记：对DNA样品进行标记，如使用荧光染料或放射性同位素。
4.加入加载缓冲液：将DNA样品与适量的加载缓冲液混合，以便在电
泳过程中均匀加载样品。
电泳：
1.装载样品：将标记好的DNA样品加载到琼脂糖凝胶的孔上。可以使
用微量吸管或特殊的装载器具，确保每个孔中加载相同数量的DNA。
2.加载DNA标准：在其中一个孔中加载大小已知的DNA标准，以用于
分析和确定样品中的DNA片段大小。
3.电泳运行：将电泳槽连接到电源，并设定合适数值的电流和电压。
运行电泳直到DNA杂质和标准DNA片段迁移到适当位置（通常为30分钟
至数小时）。
染色和可视化：
跑核酸电泳胶
琼脂糖核酸凝胶电泳
一、实验原理
琼脂糖凝胶电泳是用琼脂或琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。对于分子量较大的样品，如大分子核酸、病毒等，一般可采用孔径较大的琼脂糖凝胶进行电泳分离。
琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制容易，分离范围广，尤其适于分离大片段DNA。普通琼脂糖凝胶分离DNA的范围为0.2-20kb，利用脉冲电泳，可分离高达10^7bp的DNA片段。
在生理条件下，DNA分子糖-磷酸骨架中的磷酸基团呈离子化状态，故DNA实际上呈多聚阴离子状态，在电场中向正极方向迁移。糖-磷酸骨架在结构上重复，故等量的双链DNA 几乎带等量的净电荷。
如电场强度一定、电泳介质相同，电泳速率就取决于核酸分子的大小和构型。构型相似的分子：分子量越大、迁移越慢。分子量相同的分子(如质粒)：cccDNA迁移最快、L-DNA 次之、ocDNA最慢。
二、实验步骤
1、配制TAE缓冲液
50×TAE Buffer (pH8.5)
组份浓度：2 M Tris-醋酸，100 mM EDTA
配制量：1 L
配制方法:1.称量下列试剂，置于1 L烧杯中。
Tris 242 g
Na2EDTA·2H2O 37.2 g
2.向烧杯中加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。
3.加入57.1 ml的乙酸，充分搅拌。
4.加去离子水将溶液定容至lL后，室温保存。
用时稀释成1×TAE Buffer (pH8.5)
2、配制琼脂糖凝胶
配制方法：1.配制适量的电泳及制胶用的缓冲液(通常是0.5×TBE或1×TAE)。
电泳的实验原理和方法
电泳的实验原理和方法
电泳是一种广泛应用于生物学、生化学等领域的实验技术，它基于带电粒子在电场中受力的原理，通过不同带电粒子间的迁移速率差异来实现分离、检测和定量分析。
电泳实验原理：
电泳实验的核心原理是基于带电粒子在电场中受到电场力的影响而产生迁移运动。电场力可以通过带电粒子与电场构成的电场线之间的元素电荷之间相互作用来解释。当带电粒子处于电场中时，它受到的电场力大小与电荷量和电场强度有关。电场力的方向始终与带电粒子所携带的电荷种类有关，正电荷受力方向与电场力相同，负电荷则相反。
电泳实验通常有几种常见的方式，如蛋白质电泳、核酸电泳等。我将以核酸电泳为例介绍实验方法。
电泳实验方法：
核酸电泳是一种常用的实验技术，用于分离核酸片段并进行造影、检测和定量分析。核酸电泳实验方法具体步骤如下：
1. 准备样品：制备待分离的核酸样品，例如DNA或RNA。样品需通过提取、纯化等方法进行前处理。
2. 制备电泳胶：根据所需分离的核酸片段大小选择适当浓度的琼脂糖（如琼脂糖琼脂糖或超低熔点琼脂糖）并与缓冲液混合。将混合液加热溶解，并平衡至适当温度后，用模具将混合液倒入电泳槽中形成胶柱。
3. 加载样品：向电泳胶中的样品孔中加入样品，可使用微量吸管或自动装载器。注意控制加载量和保持样品孔装载均匀。
4. 电泳运行：将电泳槽浸入缓冲液中，连接电源，设置适当的电场强度和运行时间。电场强度（电压/距离）会影响样品在胶槽中的迁移速率。根据目的选择适当的电场强度。
5. 结果可视化：在电泳结束后，根据需要可以对胶柱进行染色。例如，可以使用DNA染料（如溴化乙锭）对DNA进行直接观察。
琼脂糖凝胶电泳实验原理及步骤
实验三琼脂糖凝胶电泳
一、实验原理
琼脂糖凝胶电泳是分离和纯化DNA 片段的常用技术。把DNA样品加入到一块包含电解质的多孔支持介质（琼脂糖凝胶）的样品孔中，并置于静电场上。由于DNA分子的双螺旋骨架两侧带有含负电荷的磷酸根残基，因此在电场中向正极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，因而可依据DNA分子的大小来使其分离。凝胶电泳不仅可分离不同分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，而构型不同的DNA分子。在电泳过程中可以通过示踪染料或相对分子质量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测。相对分子质量标准参照物相对可以提供一个用于确定DNA片段大小的标准。在凝胶中加入少量溴化乙锭(ethidium bromide, EB)，其分子可插入DNA的碱基之间，形成一种络合物，在254～365nm波长紫外光照射下，呈桔红色荧光，因此也可对分离的DNA 进行检测。
一般琼脂糖凝胶电泳适用于大小在0.2kb～50kb范围内的DNA片段。本实验介绍琼脂糖凝胶的制备以及琼脂糖凝胶电泳在DNA片段分离中的应用方法。
二、仪器及试剂
1.仪器及耗材：
水平电泳槽、电泳仪、凝胶成像分析系统、微波炉、微量移液器、透明胶带、点样板或parafilm、100 ml或250 ml锥形瓶、量筒、吸头等。
2.试剂及配制：
50×TAE缓冲液的配制：2 mol/L Tris-乙酸，0.05 mol/L EDTA（pH
8.0）
配制1000 ml
Tris 242 g
琼脂糖凝胶电泳实验
琼脂糖凝胶电泳实验
2011-11-03 09:43:56 来源：生物秀评论：0我要评论
实验二琼脂糖凝胶电泳实验
【实验目的】
（1）学习琼脂糖凝胶电泳的基本原理；
（2）掌握使用水平式电泳仪的方法；
（3）学习在含有甲醛的凝胶上进行RNA电泳的方法。
【实验原理】
琼脂糖凝胶电泳是基因工程实验室中分离鉴定核酸的常规方法。核酸是两性电解质，其等电点为，在常规的电泳缓冲液中（pH约），核酸分子带负电荷，在电场中向正极移动。核酸分子在琼脂糖凝胶中泳动时，具有电荷效应和分子筛效应，但主要为分子筛效应。因此，核酸分子的迁移率由下列几种因素决定：
（1）DNA的分子大小。线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中移动，因而迁移得越慢。（2）DNA分子的构象。当DNA分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋质粒DNA在琼脂糖凝胶中移动的速度是不一样的，超螺旋DNA移动得最快，而开环状DNA移动最慢。如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA带难以确定是质粒DNA不同构象引起还是因为含有其他DNA引起时，可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收，用同一种限制性内切酶分别水解，然后电泳，如在凝胶上出现相同的DNA图谱，则为同一种DNA。
（3）电源电压。在低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，片段越大，因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大，因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb 的DNA 片段的分辨率达到最大，所加电压不得超过5v/cm。
琼脂糖凝胶电泳技术的原理和方法 ppt课件
胶板设计（27人）： •每11孔胶板（4人：2样品 +1marker）。
琼脂糖凝胶电泳技术的原理和方法
2.加样
5μl质粒DNA+1μl loading buffer 混匀； 15μlPCR 产 物 +3μl loading buffer，混匀； 10μl 酶 切 产 物 +2μl loadingbuffer混匀； 5μl DNA Marker(每板胶一孔）
液 （ 6X loading buffer）和DNA分子量标准（Marker ） 等。
琼脂糖凝胶电泳技术的原理和方法
1.凝胶电泳系统
美国Bio-rad伯乐 小型水平电泳槽Mini-Sub Cell GT Cell
DYY-6C型 双稳定时电泳仪电源（北 京六一） 输出范围（显示分辨率）： 6-600V(1V) 4-400mA (1mA) 240W
低毒，灵敏度较高的染料；可
以加入样品中。dsDNA呈现绿 价格稍高，灵敏度 较
色荧光,而ssDNA呈红色荧光, 低。背景强烈。
能较好地区分dsDNA与ssDNA。
新型低毒，高灵敏度染料，可 价格昂贵。对小于50
以加入样品中。
bp染色缺失，小于100
DNA的琼脂糖凝胶电泳实验原理和操作步骤
一、实验目的
琼脂糖凝胶电泳是常用的检测核酸的方法，学习DNA琼脂糖凝胶电泳的使用技术，掌握有关的技术和识读电泳图谱的方法。
二、实验原理
琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定DNA、RNA分子混合物的方法，这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。不同构型的DNA分子的迁移速度不同。如环形DNA分子样品，其中有三种构型的分子：共价闭合环状的超螺旋分子（cccDNA）、开环分子(ocDNA)、和线形DNA分子(IDNA)。这三种不同构型分子进行电泳时的迁移速度大小顺序为: cccDNA＞IDNA＞ocDNA
核酸分子是两性解离分子，pH3.5是碱基上的氨基解离，而三个磷酸基团中只有一个磷酸解离，所以分子带正电，在电场中向负极泳动；而 pH8.0-8.3时，碱基几乎不解离，而磷酸基团解离，所以核酸分子带负电，在电场中向正极泳动。不同的核酸分子的电荷密度大致相同，因此对泳动速度影响不大。在中性或碱性时，单链DNA与等长的双链DNA的泳动率大致相同。
影响核酸分子泳动率的因素主要是：
1、样品的物理性状
即分子的大小、电荷数、颗粒形状和空间构型。一般而言，电荷密度愈大，泳动率越大。但是不同核酸分子的电荷密度大致相同，所以对泳动率的影响不明显。
对线形分子来说，分子量的常用对数与泳动率成反比，用此标准样品电泳并测定其泳动率，然后进行DNA分子长度（bp）的负对数——泳动距离作标准曲线图，可以用于测定未知分子的长度大小。
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Total RNA from Arabidopsis plants
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 1819 20 21 M
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
2011.5.23
14 15 16 17
Total RNA from Arabidopsis Plants
10×TBE Buffer (pH8.3) 组份浓度 配制量 配制方法
10×MOPS Buffer 组份浓度200 mM MOPS, 20 mM NaOAc, 10 mM EDTA 配制量1 L 配制方法 1. 称量41.8 g MOPS，置于1 L烧杯中。 2. 加约700 ml DEPC处理水，搅拌溶解。 3. 使用2 N NaOH调节pH值至7.0。 4. 再向溶液中加入下列试剂。 5. 用DEPC处理水将溶液定容至1 L。 6. 用0.45 mm滤膜过滤除去杂质。 7. 室温避光保存。 注：溶液见光或高温灭菌后会变黄。变黄时也可使用，但变黑时不要使用。
4、电泳缓冲液(10*) TAE TBE TPE
50×TAE Buffer(pH8.5) 组份浓度 2 M Tris-醋酸, 100 mM EDTA 配制量 1 L 配制方法 1. 称量下列试剂，置于1 L烧杯中。
2. 2. 向烧杯中加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。 3. 加入57.1 ml的醋酸，充分搅拌。 4. 加去离子水将溶液定容至1 L后，室温保存。
实验琼脂糖凝胶电泳一原理二 目的掌握核酸电泳的方法
(DNA用)
本制品是核酸电泳用Loading Buffer。向电泳样品溶液中加入1/6量即可 上样电泳。 本制品中含有色素溴酚蓝（Bromophenol Blue)、二甲苯腈蓝FF（Xylene Cyanol FF)，可以观察电泳的进行情况。溴酚蓝在琼脂糖凝胶（0.5% ~ 1.4%）中约与300 bp的双链线状DNA的迁移速度相同（在0.5×TBE中)， 而二甲苯腈蓝FF则与4 k bp的双链线状DNA的迁移速度相等。溴酚蓝与 二甲苯腈蓝FF在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移速率则随凝胶浓度的改变而不 同。 本缓冲液配制组成合理，缓冲液中不含核酸酶（DNase或RNase)，泳带 清晰，是实验室常用的凝胶电泳上样用缓冲液。一般来说，PCR反应后 的琼脂糖凝胶电泳以及短链DNA的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，常使用本制 品。
10×Loading Buffer (RNA电泳用) 组份浓度
配制量10 ml 配制方法 1. 称量下列试剂，置于10 ml离心管中。
2. 2. 向离心管中加入约4 ml的DEPC处理水后，充分搅拌溶解。 3. 加入5 ml的甘油（Glycerol）后，充分混匀。 4. 用DEPC处理水定容至10 ml后，室温保存。
上样注意事项
➢加样时枪头不要碰坏凝胶控壁，否则DNA带型不整齐，加 样前要用枪头吸打凝胶孔中的溶液以赶走样品空中的气泡； ➢每孔最大上样量取决于DNA样品片段的大小，数目及样品 孔形状与容量； ➢每孔最大上样容积决定于样品孔体积； ➢DNA marker可在两侧的样品孔均加上．
电泳注意事项
➢电源接通前应该核实凝胶的方向是否放置正确；
(DNA用)
本制品是核酸电泳用Loading Buffer。制品中含有SDS， 可即刻停止各 种酶促反应。使用时向酶促反应液中加入1/10量的本制品，即可上样 电泳。 本制品中含有色素溴酚蓝（Bromophenol Blue)，可以观察电泳的进行 情况。溴酚蓝在琼脂糖凝胶（0.5% ~ 1.4%）中约与300 bp的双链线状 DNA的迁移速度相同（在0.5×TBE中)。 本缓冲液配制组成合理，缓冲液中不含核酸酶（DNase或RNase)，特别 适用于各种酶促反应的停止以及各种酶促反应后的琼脂糖凝胶电泳。 一般来说，各种限制酶、修饰酶的酶促反应后电泳时，常使用本制品。
凝胶浓 度和wk.baidu.com
DNA 分子的 有效分 离范围
凝胶 PAG PAG PAG PAG PAG agarose agarose agarose agarose agarose agarose agarose
胶浓度（％） 3.5 5 8 12 20 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0
线性DNA的大小 100-2000bp 80-500 60-400 40-200 6-100 5-60kb 1-20 0.8-10 0.5-7 0.4-6 0.2-4 0.1-3
➢电泳仪有电压不一定标志电泳槽已经接通，应该观察正负极 铂金丝是否有气泡出现，如负极的气泡（H2)比正极的(O2)多一 倍，表示电泳槽已接通电源，几分钟后可见指示剂溴酚蓝向正 极移动；
➢电泳过程中，EtBr向负极移动，与DNA的泳动方向相反，较 长时间的电泳会造成靠正极方向的凝胶中EB的含量降低，对于 含量较少的DNA fragment检测困难，可重新染色．
3、制样：根据上样缓冲液的浓度加样，如6*loading buffer,则1ul loading buffer +5 ul DNA sample,类推。
4、点样：用移液器将DNA加到样品孔中。注意加DNA Marker。
5、接通电源，红为正极，黑为负极，DNA往正极移动，1-5V/cm，
6、根据指示剂移动位置决定终止电泳。将电压调到零，关机，再 取出凝胶，EB染色10-20分钟，紫外灯下观察，照相。
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011121314151617181920212223M
➢凝胶中加入EB 进行电泳，便于随时紫外线下观察电泳状态， 但EB会导致线性DNA迁移率下降１５％．
1、凝胶制备：称取1g agarose,加100ml 0.5 TAE or TBE，微波炉 或电炉溶解。
2、制胶：待熔化的agarose温度降到60℃以下后，将agarose倒进 插了梳子的胶盒中。30-40 min后，胶完全凝固，取梳子，将胶放 入电泳槽中，缓冲液没过胶约 0.5 –1cm。