实验琼脂糖凝胶电泳一原理二目的掌握核酸电泳的方法

Total RNA from Arabidopsis plants
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 1819 20 21 M
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
2011.5.23
14 15 16 17
Total RNA from Arabidopsis Plants
10×TBE Buffer (pH8.3) 组份浓度 配制量 配制方法
10×MOPS Buffer 组份浓度200 mM MOPS, 20 mM NaOAc, 10 mM EDTA 配制量1 L 配制方法 1. 称量41.8 g MOPS，置于1 L烧杯中。 2. 加约700 ml DEPC处理水，搅拌溶解。 3. 使用2 N NaOH调节pH值至7.0。 4. 再向溶液中加入下列试剂。 5. 用DEPC处理水将溶液定容至1 L。 6. 用0.45 mm滤膜过滤除去杂质。 7. 室温避光保存。 注：溶液见光或高温灭菌后会变黄。变黄时也可使用，但变黑时不要使用。
4、电泳缓冲液(10*) TAE TBE TPE
50×TAE Buffer(pH8.5) 组份浓度 2 M Tris-醋酸, 100 mM EDTA 配制量 1 L 配制方法 1. 称量下列试剂，置于1 L烧杯中。
2. 2. 向烧杯中加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。 3. 加入57.1 ml的醋酸，充分搅拌。 4. 加去离子水将溶液定容至1 L后，室温保存。
实验琼脂糖凝胶电泳一原理二 目的掌握核酸电泳的方法
(DNA用)
本制品是核酸电泳用Loading Buffer。向电泳样品溶液中加入1/6量即可 上样电泳。 本制品中含有色素溴酚蓝（Bromophenol Blue)、二甲苯腈蓝FF（Xylene Cyanol FF)，可以观察电泳的进行情况。溴酚蓝在琼脂糖凝胶（0.5% ~ 1.4%）中约与300 bp的双链线状DNA的迁移速度相同（在0.5×TBE中)， 而二甲苯腈蓝FF则与4 k bp的双链线状DNA的迁移速度相等。溴酚蓝与 二甲苯腈蓝FF在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移速率则随凝胶浓度的改变而不 同。 本缓冲液配制组成合理，缓冲液中不含核酸酶（DNase或RNase)，泳带 清晰，是实验室常用的凝胶电泳上样用缓冲液。一般来说，PCR反应后 的琼脂糖凝胶电泳以及短链DNA的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，常使用本制 品。
10×Loading Buffer (RNA电泳用) 组份浓度
配制量10 ml 配制方法 1. 称量下列试剂，置于10 ml离心管中。
2. 2. 向离心管中加入约4 ml的DEPC处理水后，充分搅拌溶解。 3. 加入5 ml的甘油（Glycerol）后，充分混匀。 4. 用DEPC处理水定容至10 ml后，室温保存。
上样注意事项
➢加样时枪头不要碰坏凝胶控壁，否则DNA带型不整齐，加 样前要用枪头吸打凝胶孔中的溶液以赶走样品空中的气泡； ➢每孔最大上样量取决于DNA样品片段的大小，数目及样品 孔形状与容量； ➢每孔最大上样容积决定于样品孔体积； ➢DNA marker可在两侧的样品孔均加上．
电泳注意事项
➢电源接通前应该核实凝胶的方向是否放置正确；
(DNA用)
本制品是核酸电泳用Loading Buffer。制品中含有SDS， 可即刻停止各 种酶促反应。使用时向酶促反应液中加入1/10量的本制品，即可上样 电泳。 本制品中含有色素溴酚蓝（Bromophenol Blue)，可以观察电泳的进行 情况。溴酚蓝在琼脂糖凝胶（0.5% ~ 1.4%）中约与300 bp的双链线状 DNA的迁移速度相同（在0.5×TBE中)。 本缓冲液配制组成合理，缓冲液中不含核酸酶（DNase或RNase)，特别 适用于各种酶促反应的停止以及各种酶促反应后的琼脂糖凝胶电泳。 一般来说，各种限制酶、修饰酶的酶促反应后电泳时，常使用本制品。
凝胶浓 度和wk.baidu.com
DNA 分子的 有效分 离范围
凝胶 PAG PAG PAG PAG PAG agarose agarose agarose agarose agarose agarose agarose
胶浓度（％） 3.5 5 8 12 20 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0
线性DNA的大小 100-2000bp 80-500 60-400 40-200 6-100 5-60kb 1-20 0.8-10 0.5-7 0.4-6 0.2-4 0.1-3
➢电泳仪有电压不一定标志电泳槽已经接通，应该观察正负极 铂金丝是否有气泡出现，如负极的气泡（H2)比正极的(O2)多一 倍，表示电泳槽已接通电源，几分钟后可见指示剂溴酚蓝向正 极移动；
➢电泳过程中，EtBr向负极移动，与DNA的泳动方向相反，较 长时间的电泳会造成靠正极方向的凝胶中EB的含量降低，对于 含量较少的DNA fragment检测困难，可重新染色．
3、制样：根据上样缓冲液的浓度加样，如6*loading buffer,则1ul loading buffer +5 ul DNA sample,类推。
4、点样：用移液器将DNA加到样品孔中。注意加DNA Marker。
5、接通电源，红为正极，黑为负极，DNA往正极移动，1-5V/cm，
6、根据指示剂移动位置决定终止电泳。将电压调到零，关机，再 取出凝胶，EB染色10-20分钟，紫外灯下观察，照相。
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011121314151617181920212223M
➢凝胶中加入EB 进行电泳，便于随时紫外线下观察电泳状态， 但EB会导致线性DNA迁移率下降１５％．
1、凝胶制备：称取1g agarose,加100ml 0.5 TAE or TBE，微波炉 或电炉溶解。
2、制胶：待熔化的agarose温度降到60℃以下后，将agarose倒进 插了梳子的胶盒中。30-40 min后，胶完全凝固，取梳子，将胶放 入电泳槽中，缓冲液没过胶约 0.5 –1cm。