实验琼脂糖凝胶电泳一原理二目的掌握核酸电泳的方法
琼脂糖凝胶电泳原理
琼脂糖凝胶电泳原理简介琼脂糖凝胶电泳是一种常用的分离和检测生物大分子的方法。
它基于琼脂糖凝胶作为分离介质，通过电场作用使分子在凝胶中按照大小和形态的差异进行迁移，达到分离的目的。
该原理广泛应用于核酸和蛋白质的分离与分析领域。
原理琼脂糖凝胶电泳原理如下： 1. 凝胶制备：首先将琼脂糖与缓冲液混合并加热溶解，随后冷却形成凝胶。
凝胶的浓度可以根据需要调整，一般较低浓度的琼脂糖凝胶用于分离大分子，较高浓度的琼脂糖凝胶用于分离小分子。
2. 样品加载：将待分离的样品加入凝胶孔中。
琼脂糖凝胶是一种多孔的基质，具有类似于过滤器的功能。
样品中的分子会被凝胶网状结构所限制，在电场作用下沿凝胶中的微小通道向电极处迁移。
3. 电泳过程：连接正负极电源，通过电场使得带电分子根据大小和形态的差异在凝胶中迁移。
电泳时间的长短与迁移距离成正比，某些情况下可以通过控制电场强度或者时间来调节分离效果。
4. 可视化检测：根据需要，可以利用染色剂或标记物对凝胶中的分子进行可视化检测。
例如，核酸可以通过乙溴化氢染色可视化，蛋白质可以通过银染法或共价标记物进行检测。
琼脂糖凝胶电泳的原理主要涉及到两个方面：凝胶基质和电场迁移。
凝胶基质琼脂糖凝胶是一种由聚糖构成的多孔基质，其主要成分是琼脂糖和缓冲液。
琼脂糖是一种天然的含羟基多糖，具有较好的凝胶性质。
琼脂糖的浓度和凝胶构建方式可以根据需要来设计，以实现对待分离分子大小和分辨率的调控。
电场迁移琼脂糖凝胶电泳是利用电场作用使带电分子在凝胶中迁移。
电泳过程中，凝胶中的聚糖构成了一套通道网络，负载着电场的分布，变为一种微电泳介质。
带电分子受到电场力的影响，在凝胶中的通道中迁移。
根据分子的大小和形态的差异，迁移速率不同，从而实现分离效果。
较小的分子会迁移得更远，而较大的分子会受到较大的凝胶阻力，迁移距离较短。
应用琼脂糖凝胶电泳在生物学领域的应用非常广泛。
主要包括以下几个方面： - 核酸分离与分析：琼脂糖凝胶电泳可以用于核酸的分离与分析。
生物化学经典实验DNA琼脂糖凝胶电泳的原理、步骤、试剂配制、结果分析分析
凝胶冷却至50°C，加EB至终浓度0.5μg/ml
铺
胶
凝胶凝固后取出梳子
加电泳缓冲液
准备样品
点
样
电
泳
注意观察溴酚蓝染液的迁移
紫外灯下观察电泳结果
照
相
DNA琼脂糖凝胶电泳
实验原理
琼脂糖为链状多糖 →绳状琼脂糖束→大网孔型凝
胶 ——分离、鉴定、纯化DNA
在 pH 值为 8.0～8.3 时，核酸分子碱基几乎不解
离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电泳时 向正极移动。
采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分
子筛的作用下，使分子大小和构象不同的核酸分
子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片 段检测其大小的目的。
实验原理
当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium
bromide, EB)染色, 在紫外光下至少可以检出110ng的DNA条带, 从而可以确定DNA片段在凝胶 中的位置。
此外, 还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA
条带, 用于以后的克隆操作。
状DNA>开环DNA
DNA片段越长，泳动速度越慢
在低电压时，泳动速度与电场强度成正比
不同浓度琼脂糖分离DNA分子的范围
琼脂糖浓度（W/V,%） 分离范围（kb）
0.3
0.6 0.7 0.9 1.2
5-60
1-20 0.8-10 0.5-7 0.4-6
1.5
2.0
0.2-4
0.1-3
DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。
胶浓（%） 0.6 溴酚蓝 b 0.15kb
2kb
1.6kb
操作步骤
琼脂糖凝胶的制备：溶化，冷却，EB 凝胶板的制备：加梳子，倒胶 样品的制备：样品+1/5体积溴酚蓝
琼脂糖凝胶电泳实验
琼脂糖凝胶电泳实验2011-11-03 09:43:56 来源：生物秀评论：0 我要评论实验二琼脂糖凝胶电泳实验【实验目的】(1)学习琼脂糖凝胶电泳的基本原理；(2)掌握使用水平式电泳仪的方法；(3)学习在含有甲醛的凝胶上进行RNA电泳的方法。
【实验原理】琼脂糖凝胶电泳是基因工程实验室中分离鉴定核酸的常规方法。
核酸是两性电解质，其等电点为pH2-2.5，在常规的…实验二琼脂糖凝胶电泳实验【实验目的】(1)学习琼脂糖凝胶电泳的基本原理；(2)掌握使用水平式电泳仪的方法；(3)学习在含有甲醛的凝胶上进行RNA电泳的方法。
【实验原理】琼脂糖凝胶电泳是基因工程实验室中分离鉴定核酸的常规方法。
核酸是两性电解质，其等电点为pH2-2.5，在常规的电泳缓冲液中(pH约8.5),核酸分子带负电荷，在电场中向正极移动。
核酸分子在琼脂糖凝胶中泳动时，具有电荷效应和分子筛效应，但主要为分子筛效应。
因此，核酸分子的迁移率由下列几种因素决定：(1)DNA的分子大小。
线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中移动，因而迁移得越慢。
(2)DNA分子的构象。
当DNA分子处于不同构象时，它在电场中移动距离不仅和分子量有关，还和它本身构象有关。
相同分子量的线状、开环和超螺旋质粒DNA在琼脂糖凝胶中移动的速度是不一样的，超螺旋DNA移动得最快，而开环状DNA移动最慢。
如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA带难以确定是质粒DNA不同构象引起还是因为含有其他DNA引起时，可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收，用同一种限制性内切酶分别水解，然后电泳，如在凝胶上出现相同的DNA图谱，则为同一种DNA。
(3)电源电压。
在低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。
但是随着电场强度的增加，不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，片段越大，因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大，因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。
DNA琼脂糖凝胶电泳
学习核酸电泳的原理和优缺点，掌握琼脂糖 凝胶电泳检测DNA的技术。
二、实验原理
带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。琼 脂糖凝胶电泳是进行核酸研究的重要手段，是核 酸基因组DNA、核酸扩增等技术所不可或缺的组 成部分。浓度不同的琼脂糖可形成网孔大小不同 的分子筛，能用于分离不同分子量的核酸片段， 是分离、鉴定和纯化核酸的一种常用方法。
三、实验流程
四、实验步骤
（1）1 xTAE溶液的配制：50 xTAE溶液稀释成1 xTAE溶液。 （2）配制1%琼脂糖凝胶：用电子秤称取0.30g琼脂糖，小心移入三角瓶中，加入1 xTAE 电泳缓冲液30ml，轻轻摇匀后放入微波炉中加热30s，完全沸腾后溶液清澈透明取出， 冷却至55℃，倒入已插好样品梳的制胶槽中，胶厚3~5mm，小心赶走气泡。 （3）室温放置30~45 min，胶凝固后，小心拔出梳子，取出制胶板，放入加有1 xTAE电 泳缓冲液的电泳槽中，缓冲液高出凝胶表面1mm。 （4）用微量移液器在点样板上将5μl DNA 液+2μl 上样缓冲液充分混匀，然后用移液器 将样品加入样品孔中，一定要包括合适的DNA 分子量标准物，记录点样顺序。 （5）盖上电泳槽的盖子，连接好电线和电源，打开电源，在1~10V/cm 凝胶的电压降下 进行电泳。 （6）当加样缓冲液中的溴酚蓝迁移至足够分离DNA 片段的距离时，关闭电源。 （7）将凝胶置于0.5μg/ml 溴化乙锭中染色10 min，在紫外下观察，拍照，保存照片。
五、注意事项
（1）凝胶中DNA的上样量要合适，太多会引起DNA条 带模糊，太少又会引起条带信号弱或无DNA带。 （2）EB染色时要带
实验琼脂糖凝胶电泳的原理和方法
实验琼脂糖凝胶电泳的原理和方法实验琼脂糖凝胶电泳（Agarose gel electrophoresis）是一种常用的分离DNA和RNA分子的技术。
它基于琼脂糖凝胶电泳原理，利用琼脂糖凝胶的孔隙大小和电泳电场的力对DNA和RNA分子进行分离。
琼脂糖是一种高分子多糖，当加热溶解后冷却凝固时，形成一个多孔的凝胶网络。
这个凝胶网络中的孔隙大小是可以调控的，通过改变琼脂糖的浓度可以得到不同孔隙大小的凝胶。
1.制备琼脂糖凝胶：按照实验需要，称取适量琼脂糖加入缓冲液中，搅拌使其溶解，然后加热至溶解。
等溶液冷却至约50℃时，在一个电泳板间夹两块玻璃片或塑料片，将琼脂糖凝胶溶液倒入电泳板中，并将梳子插入凝胶中，让凝胶固化。
2.样品制备：将要检测的DNA或RNA分子提取和纯化，并用缓冲液稀释合适浓度。
添加适量的DNA荧光染料或核酸染色剂，使其在紫外光下可见。
3.样品加载：将样品加入琼脂糖凝胶的凝胶孔口中，注意不要将样品推到凝胶中。
4.电泳分离：将凝胶板放入电泳槽中，加入适量缓冲液，注意保证电泳液中缓冲液位置高于凝胶。
然后将负极电极和正极电极分别连接到电泳槽的两端，开启电源，施加适当电压使DNA或RNA分子在电场力的作用下进行电泳分离。
5.染色和可视化：电泳结束后，取出凝胶板，并用染色剂对DNA或RNA分子进行染色。
染色剂与DNA或RNA结合后，用紫外光照射凝胶，通过相应设备观察凝胶上的条带形成。
实验琼脂糖凝胶电泳的原理是基于DNA和RNA分子在电场下按照大小进行分离的特性。
在电场作用下，DNA或RNA分子荷负性被引向正极（阴极）方向移动。
琼脂糖凝胶的孔隙大小可以根据需要调控，大分子难以通过，小分子易于通过。
因此，DNA或RNA分子根据其大小不同，通过孔隙大小的限制，从而形成条带，完成了对DNA或RNA的分离。
琼脂糖凝胶电泳检测实验报告
琼脂糖凝胶电泳检测实验报告一、实验目的本实验旨在通过琼脂糖凝胶电泳检测方法，对DNA分子进行分离和检测，掌握琼脂糖凝胶电泳技术的操作步骤和原理，并了解其在生物学领域中的应用。
二、实验原理琼脂糖凝胶电泳是一种常用的分离DNA分子的方法。
其原理是利用电场作用力将DNA分子从样品中移动到凝胶中，并根据DNA分子大小不同，在凝胶中形成不同迁移距离的带状图案。
根据带状图案可以得到DNA片段大小及其相对含量。
三、实验步骤1.制备琼脂糖凝胶：将1g琼脂糖加入100ml TAE缓冲液中，加热搅拌至溶解，冷却至60℃左右时倒入模具中，待冷却成固体后取出。
2.制备DNA样品：将待检测DNA样品加入适量TAE缓冲液中，使其浓度为50ng/ul。
3.装载样品：取出制备好的琼脂糖凝胶，将其置于电泳槽中，加入适量TAE缓冲液，然后将DNA样品注入琼脂糖凝胶孔中。
4.进行电泳：将电泳槽盖好，接通电源，设定电压和时间，进行电泳。
5.染色和成像：取出琼脂糖凝胶，进行染色处理，然后用成像仪拍摄带状图案。
四、实验结果通过琼脂糖凝胶电泳检测方法，成功分离出待检测DNA样品中的DNA分子，并形成了带状图案。
根据带状图案可以看出不同大小的DNA片段在凝胶中形成了不同迁移距离的带状图案。
五、实验分析1.影响DNA迁移距离的因素：DNA片段大小、琼脂糖浓度、电场强度等因素都会影响DNA分子在凝胶中的迁移距离。
一般来说，较小的DNA片段在相同条件下迁移距离较大。
2.应用领域：琼脂糖凝胶电泳技术广泛应用于生物学领域中对DNA分子的检测和分析。
例如，可以用于分析DNA序列、检测基因突变等。
六、实验总结通过本次实验，我们掌握了琼脂糖凝胶电泳技术的操作步骤和原理，并了解了其在生物学领域中的应用。
同时，我们也发现琼脂糖凝胶电泳技术具有操作简单、成本低廉、结果可靠等优点，是一种常用的DNA分子检测方法。
实验15 琼脂糖凝胶电泳的原理和方法
溴化乙锭（EB）为扁平状分子，在紫外光照射下发射 荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物，其荧光强度 与DNA的含量成正比。据此可粗略估计样品DNA浓度。
注意事项：
EB是致癌物质，切勿用手接触，更不要污染环境。 实验过程中操作要保持安静、镇定，注意样品不能混样，
5
琼脂糖凝胶电泳的缺点： 1) 机械强度差，易破碎，浓度不能太低； 2) 易被细菌污染，不易保存，临用前配制； 3) 琼脂糖支持层上的区带易于扩散，电泳后
必须立即固定染色； 4) 与PAGE相比，分子筛作用小，区带少。
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三、琼脂糖凝胶电泳的应用
目前，琼脂糖凝胶电泳常用于分离、鉴定核酸，如 DNA鉴定、DNA限制性内切酶图谱制作等。由于这种方法操 作方便，设备简单，需样品量少，分辨能力高，已成为基 因工程研究中常用实验方法之一。
常用荧光染料溴乙锭(EB)染色，在紫外光下观察D NA条带，用紫外分析仪拍照，或用凝胶成像系统输出 照片，并进行有关的数据分析。
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五、琼脂糖凝胶电泳分离血浆脂蛋白
原理 血浆脂蛋白经饱和苏丹黑B预染后，以琼
脂糖凝胶为支持介质，在pH8.6巴比妥缓冲液 中电泳，根据各脂蛋白的组成、大小、形状 分离成不同区带。
HDL 少 少 多 多
小 高 快
pH 8.6 > pI ，各种脂蛋白均带负电，电泳时由 负极到正极；VLDL为圆形，受阻力小，LDL形态 不规则，受阻力大，所以VLDL跑在前。
CM
LDL
VLDL HDL
—
+
加样槽
β
前β
α
临床应用：高脂蛋白血症的分型 CM β 前β α
正常 Ⅰ型 Ⅱa型 Ⅱb型 Ⅲ型 Ⅳ型 Ⅴ型
DNA琼脂糖凝胶电泳实验原理及超详细步骤
DNA琼脂糖凝胶电泳实验原理及超详细步骤物品准备水平电泳槽、电泳仪、微波炉、紫外透射仪、锥形瓶、琼脂糖、电泳缓冲液(1xTBE) 溴化乙锭(EB)溶液、上样缓冲液等实验原理DNA分子在琼脂糖中泳动时有电荷效应和分子筛效应，但主要为分子筛效应。
在pH值为8.0- 8.3时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。
采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。
核酸分子中嵌入荧光染料(如EB )后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。
实验步骤（1）准备制胶架，用蒸馏水将电泳槽和梳子冲洗干净，放在水平桌面上，并架好梳子（2）配制琼脂糖凝胶及倒胶，琼脂糖凝胶浓度与线形DNA的最佳分辨范围a.以1%的胶为例，三角瓶内0.6g琼脂糖+60ml(0.5xTBE)煮胶溶解冷却至60C(不烫手)b.加入溴化乙锭溶液（终浓度0.5ug/ml）或按照1ul/30mL的比例加入DNAgreen 染料，并充分混匀。
c.倒板,小胶倒入25-30ml左右琼脂糖溶液，大胶则60-70ml左右，若需切胶回收，凝胶可适当加厚。
d.室温下充分凝固，大约30分钟-1小时e.垂直向上拔出梳子f.将胶板放入电泳槽g.向电泳槽中加入0.5xTBE缓冲液至刚没过凝胶表面1-2nm.（3）加样将DNA样品(5ul)与6X上样缓冲液( 1ul)混匀后，用微量加样枪小心加入样品孔内，上样量根据样品浓度可适当调整，若DNA含量偏低，则可依上述比例增加上样量，但总体积不可超过样品槽容量（一般小孔40ul为上限，大孔200ul为上限，具体和制胶膜规格相关）。
注意加样枪的枪头不可插入过深，以免刺穿凝胶，导致样品外溢。
每加完一个样品要更换枪头，以防止EB污染。
（4）电泳接通电源，一般红色为正极，黑色为负极，切记DNA样品由负极往正极泳动(靠近加样孔的一端为负)，电压为5V/cm (长度以两个电极之间的距离计算)，一般控制电压保持在110v，电流在40mA以上。
琼脂糖凝胶电泳技术的原理和方法
琼脂糖凝胶电泳技术的原理和方法一、原理：琼脂糖凝胶电泳是一种常用的分离和分析生物大分子的方法。
其原理是利用琼脂糖凝胶作为固定相，通过电场作用将待分离物质在凝胶中进行分离。
琼脂糖凝胶是一种具有多孔结构的凝胶介质，可以根据待分离物质的尺寸和电荷特性进行分离。
二、方法：1. 准备琼脂糖凝胶：首先，按照所需的凝胶浓度和体积配制琼脂糖溶液。
然后，在琼脂糖溶液中加入缓冲液，并搅拌均匀。
将混合液倒入凝胶板中，待其凝固后，准备好使用的琼脂糖凝胶。
2. 样品制备：将待分离的样品进行处理，如蛋白质样品可以经过蛋白质提取和纯化步骤，DNA样品可以进行酶切等处理。
3. 样品加载：将处理好的样品加载到琼脂糖凝胶中。
可以使用样品井或样品孔进行加载，确保每个样品均匀地加载到凝胶中。
4. 电泳条件设置：根据待分离物质的特性和需求，设置适当的电泳条件。
包括电场强度、电泳时间和缓冲液pH值等。
5. 电泳分离：将凝胶板放入电泳槽中，连接电源，进行电泳分离。
在电场的作用下，待分离物质会在凝胶中进行迁移，根据其尺寸和电荷特性进行分离。
6. 结果分析：电泳结束后，可以通过染色等方法观察凝胶板上的带状图案。
根据不同的染色方法，可以观察到不同的待分离物质，如蛋白质带、DNA带等。
三、应用：琼脂糖凝胶电泳技术在生物科学研究中具有广泛的应用。
其中，常见的应用有以下几个方面：1. 蛋白质分离与鉴定：可以通过琼脂糖凝胶电泳技术对蛋白质进行分离和鉴定。
蛋白质在电泳过程中根据其分子量的不同而分离成多个带状条带，通过染色或Western blotting等方法可以对目标蛋白质进行定性或定量分析。
2. DNA分析：琼脂糖凝胶电泳技术在DNA分析中也有重要应用。
可以通过电泳分离来检测DNA片段的长度和纯度，如测序片段、PCR产物等。
3. RNA分析：琼脂糖凝胶电泳技术也可以用于RNA的分析。
通过电泳分离可以检测RNA的大小、纯度和相对含量等。
4. 蛋白质-核酸相互作用研究：通过琼脂糖凝胶电泳技术，可以研究蛋白质与核酸之间的相互作用。
DNA的琼脂糖凝胶电泳实验原理和方法步骤
⑸100倍电泳缓冲液的配制：
4mol/LTris-HCl（pH8..0），2mol/L醋酸钠，200mmol/LEDTA
称取，无水乙酸钠，，先用400ml双蒸水加热搅拌溶解后，再用冰乙酸调pH至（大约加入冰乙酸50ml），然后定容至500ml。用时稀释100倍。
DNA的琼脂糖凝胶电泳实验原理和方法步骤
琼脂糖凝胶电泳是用于分离、鉴定和提纯DNA片段的标准方法。琼脂糖是从琼脂中提取的一种多糖，具亲水性，但不带电荷，是一种很好的电泳支持物。DNA在碱性条件下（pH8 0的缓冲液）带负电荷，在电场中通过凝胶介质向正极移动，不同DNA分子片段由于分子和构型不同，在电场中的泳动速率液不同。溴化乙锭（EB）可嵌入DNA分子碱基对间形成荧光络合物，经紫外线照射后，可分出不同的区带，达到分离、鉴定分子量，筛选重组子的目的。…
4、待琼脂糖胶凝固后，在电泳槽内加入电泳缓冲液，然后拔出梳子。
5、加样
将DNA样品与加样缓冲液（loading buffer）按4：1混匀后，用微量移液器将混合液加到样品槽中，每槽加10-20μl，记录样品的点样次序和加样量。
6、电泳
安装好电极导线，点样孔一端接负极，另一端接正极，打开电源，调电压至3-5V/cm，电泳1-3hr，当溴酚蓝移到距凝胶前沿1-2cm时，停止电泳。
2、琼脂糖凝胶的制备
称取琼脂糖溶解在电泳缓冲液中，（按的琼脂糖含量，1-25kb大小的DNA用1%的凝胶，20-100kb的DNA用%的凝胶，200-2000bp的DNA用%的凝胶）置微波炉或沸水浴中加热至完全溶化（不要加热至沸腾），取出摇匀。
3、灌胶
琼脂糖凝胶电泳技术
1、实验目的：学习与掌握DNA电泳的技术方法，利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度、含量以及分子量，及分离不同大小DNA片段。
2、实验原理：电泳概念及种类*• 电泳：是指带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动的现象电泳基本原理迁移率（或泳动度）是指带电颗粒在单位电场强度下泳动的速度，可用下列公式计算：Ｕ=υ/E =(d/t)/(V/l) =dl/VtＵ为迁移率（cm2·V-1·min-1）；υ为颗粒泳动速度（cm·s-1）；E 为电场强度（V·cm-1）；d 为颗粒泳动的距离（cm）；l为滤纸有效长度（cm）；V为实际电压（V）；t为通电时间（s或min）。
通过测量d, l, V, t, 即可计算出被分离物质的迁移率。
1迁移率单位= 10-5 cm2·V-1·min-1在确定的条件下，某物质的迁移率为常数，是该物质的化学特征常数颗粒带净电荷多，直径小而接近于球形，则在电场中泳动速度快，反之则泳动速度慢。
迁移率还与分子的形状，介质粘度，颗粒所带电荷有关，迁移率与颗表面电荷成正比，与介质粘度及颗粒半径成反比。
影响琼脂糖电泳迁移的主要因素*电场强度溶液的pH值溶液的离子强度电渗现象温度的影响支持物的影响电泳的分类按分离原理分类：1.区带电泳2.移界电泳3.等速电泳4.聚焦电泳按有无固体支持物分类影响琼脂糖电泳迁移的主要因素DNA的大小DNA的构象*琼脂糖浓度*缓冲液*不同构像质粒分离不同大小DNA片段的合适琼脂糖凝胶浓度缓冲液TAE：乙酸盐缓冲液TBE：硼酸盐缓冲液TPE：磷酸盐缓冲液实验操作1. 用胶带将洗净、干燥的水平板的边缘封住，形成一个胶模并水平放置。
2. 按水平板的长×宽×0.5cm胶厚，量取0.5×TBE，并按0.7％的浓度称取agarose琼脂糖，在微波炉或电炉上加热至全熔* （清澈透明）。
3. 等凝胶温度降至大约50－60℃以下时，加入1 mg/L溴化乙锭（EB）至终浓度为0.5ug/mL ；摇匀并轻快地倒入水平板中，除掉气泡，插入梳子*。
PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳讲义(工艺实验)
t-PA基因的PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳实验讲义一、实验目的1.掌握PCR反应的原理和方法；2.掌握琼脂糖凝胶电泳分离和鉴定DNA的原理和方法。
二、实验原理PCR原理: 首先使双链DNA在反应液中热变性而分开成单链, 然后在低温下与两个引物进行退火。
使引物与单链DNA配对结合, 再在中温下利用TaqDNA聚合酶的聚合活性及热稳定性进行聚合反应。
每经过一次变性, 退火, 延伸三个步骤为一个循环, 通过三个不同温度的重复循环, 在经过约30次后, 所扩增的特定DNA序列的数量可增至10000000倍, 由于一轮扩增的产物又充当下一轮扩增的模板, 所以在这周而复始的过程中每完成一个循环, 就基本上使目的DNA物增加一倍。
变性（denaturation）: 双链DNA在92－96℃变性成单链DNA。
退火（annealing）: 引物在45-72℃与模板的互补区域相结合。
延伸（extension）: 在72℃条件下DNA聚合酶将dNTP连续加到引物的3’-OH端, DNA 链的延伸方向为5’-3’。
DNA琼脂糖凝胶电泳原理：DNA分子在碱性环境中带负电荷, 外加电场用下, 向正极泳动。
不同的DNA片段由于其由荷、分子量大小及构型的不同, 在电泳时的泳动速率就不同, 从而可以区分出不同的区带, 电泳后经溴乙锭（EB）染色；在波长254nm紫外光照射下, DNA呈现橙红色荧光。
琼脂糖凝胶电泳所需 DNA样品量仅为 0.5-0.1μg, 溴乙锭检测 DNA, 灵敏度很高, 10mg 或更少的DNA即可检出。
三、实验仪器超净工作台、回转式恒温调连摇瓶机、培养箱、冰箱、深冷冰箱（-70℃）、冷冻离心机、PCR仪、电泳仪、水平电泳槽、紫外凝胶成像系统、紫外分光光度计、恒温水浴锅、移液器、微波炉。
四、实验药品蛋白陈、酵母粉、氯化钠、琼脂、氯仿、异戊醇、异丙醇、琼脂糖、饱和酚、氯化苄、CTAB.臭酚蓝、醋酸钠、DL2000Marker、TaqDNA聚合酶、Pfu酶、Dntp、Tris、HCl、Tris-HCl、葡萄糖、NaOH、乙醇、乙酸钾、冰乙酸、蔗糖、ddH2O、EB.EDTA.SDS、引物。
核酸琼脂糖凝胶电泳原理
核酸琼脂糖凝胶电泳原理核酸琼脂糖凝胶电泳是一种常用的核酸分析方法。
它通过核酸分子在琼脂糖凝胶上的迁移速度，实现对核酸分子的大小分离和纯化。
这种方法被广泛应用于DNA和RNA的分离和检测，可用于研究生物学中许多问题，如基因组分析、DNA测序、PCR产物分析、RNA剪接等。
核酸琼脂糖凝胶电泳的原理是基于核酸带电分子在电场作用下在琼脂糖凝胶中迁移，由此分离不同大小的分子。
琼脂糖凝胶是一种多孔性的凝胶材料，它可以通过孔径大小的不同选择不同大小的核酸分子。
琼脂糖凝胶存在于不同的浓度（即凝胶密度）中，根据不同的要求选择不同的密度，可以得到分离效果更好的凝胶。
在电泳前，琼脂糖凝胶被浸泡在缓冲溶液中，以保持凝胶的稳定性和适宜pH值。
核酸的分离和检测是通过核酸电泳仪来实现的。
核酸电泳仪由外部电源、电泳仪仪器、电容器、多通道探针等组成。
核酸试样通过特定方法加入到琼脂糖凝胶的槽内，接下来加入电泳缓冲液，使缓冲液和试样混合均匀。
然后将电泳仪按需要设置电泳时间、电场强度等，并且使缓冲液移动到大夹板中。
通过施加特定电场，核酸分子被迫移动，最终到达琼脂糖凝胶的底部。
在电泳结束时，用染料对琼脂糖凝胶进行染色，以使DNA或RNA带能够被清晰地观察到。
核酸琼脂糖凝胶电泳的准确性取决于许多因素，如电场强度、凝胶浓度、琼脂糖凝胶孔径和核酸带电质量等。
如果核酸分子太大，可能会受到凝胶的限制，从而无法被完全分离。
另一方面，如果核酸分子太小，可能会被快速通过凝胶而无法被分析。
因此，实验者需要逐步优化核酸琼脂糖凝胶电泳条件，以获得最佳的分离效果。
总之，核酸琼脂糖凝胶电泳是一种可靠的核酸分离和检测方法。
它适用于许多生物学研究领域，是现代分子生物学中不可缺少的技术。
实验琼脂糖凝胶电泳及DNA纯化
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常用的电泳缓冲液
4℃ 保存备用.
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么么么么方面
• Sds绝对是假的
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么么么么方面
• Sds绝对是假的
常用的6X载样缓冲液
Ⅰ 0.25%溴酚蓝 ，0.25%二甲苯青 ，40%蔗糖 水溶液 Ⅱ 0.25%溴酚蓝 ，0.25%二甲苯青 ，30%甘油 水溶液
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⑵ 用胶带将制胶板两端封好，插入适当梳子，将溶解 的琼脂糖（约50℃）倒入，室温冷却凝固。
⑶ 将凝胶置入电泳槽中，加1×TAE电泳缓冲液至液面 覆盖凝胶1-2mm，小心垂直向上拔出梳子。
⑷ 用移液器吸取PCR产物样品4μl于封口膜上，再加入 2μl 的6X载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔。
⑸ 打开电源开关，调节电压至3-5V/cm，可见到溴酚 蓝条带由负极向正极移动，电泳约30min-60min。
电泳：
实验一的PCR产物样品。 电泳仪，电泳槽，电子天平，移液器，枪头，微波 炉，紫外凝胶成像系统等。
琼脂糖，1XTAE电泳缓冲液，溴化乙锭（EB），6X载 样缓冲液
纯化：
回收试剂盒
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四、实验步骤 ⑴ 1g 琼脂糖加入100ml 1×TAE电泳缓冲液中，摇匀。 在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解。
9. 加入和硅胶树脂等量（体积比）30μL的灭菌蒸馏水后搅匀，55 ℃水 浴中放置10分钟。
10. 离心（10，000 rpm、1分钟）后吸取上清液，尽量注意不要吸取硅 胶树脂。此回收上清液即可为DNA回收溶液。
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DNA的琼脂糖凝胶电泳实验原理和方法步骤
取出凝胶，放在含有溴化乙锭的染色液中染色30min，即可在254nm的紫外灯下观察，有橙红色荧光条带的位置，即为DNA条带，或在紫外灯下照相记录电泳图谱。溴化乙锭是致癌剂，操作时要小心，必须戴手套。
附：
⑴5×TBE（tris-硼酸及EDTA）缓冲液的配制(1000ml)：
Tris 54g，硼酸，LEDTA20ml，将pH调到，定容至1000ml，4℃冰箱保存，用时稀释10倍。
一、实验目的
学习和掌握琼脂糖电泳法鉴定DNA的原理和方法。
二、实验原理
琼脂糖凝胶电泳是用于分离、鉴定和提纯DNA片段的标准方法。琼脂糖是从琼脂中提取的一种多糖，具亲水性，但不带电荷，是一种很好的电泳支持物。DNA在碱性条件下（的缓冲液）带负电荷，在电场中通过凝胶介质向正极移动，不同DNA分子片段由于分子和构型不同，在电场中的泳动速率液不同。溴化乙锭（EB）可嵌入DNA分子碱基对间形成荧光络合物，经紫外线照射后，可分出不同的区带，达到分离、鉴定分子量，筛选重组子的目的。
2、琼脂糖凝胶的制备
称取琼脂糖溶解在电泳缓冲液中，（按的琼脂糖含量，1-25kb大小的DNA用1%的凝胶，20-100kb的DNA用%的凝胶，200-2000bp的DNA用%的凝胶）置微波炉或沸水浴中加热至完全溶化（不要加热至沸腾），取出摇匀。
3、灌胶
将冷却到60℃的琼脂糖溶液轻轻倒入电泳槽水平板上。
称取，，先用800ml双蒸水，加热搅拌溶解后，再用盐酸调pH至（大约加入盐酸20ml），然后定容至1000ml。
⑸100倍电泳缓冲液的配制：
4mol/LTris-HCl（pH8..0），2mol/L醋酸钠，200mmol/LEDTA称取，无水乙酸钠，，先用400ml双蒸水加热搅拌溶解后，再用冰乙酸调pH至（大约加入冰乙酸50ml），然后定容至500ml。用时稀释100倍。
dna的琼脂糖凝胶电泳实验原理和操作步骤
一、实验目的琼脂糖凝胶电泳是常用的检测核酸的方法，学习DNA琼脂糖凝胶电泳的使用技术，掌握有关的技术和识读电泳图谱的方法。
二、实验原理琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定DNA、RNA分子混合物的方法，这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。
DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。
在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。
DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。
不同构型的DNA分子的迁移速度不同。
如环形DNA分子样品，其中有三种构型的分子：共价闭合环状的超螺旋分子（cccDNA）、开环分子(ocDNA)、和线形DNA分子(IDNA)。
这三种不同构型分子进行电泳时的迁移速度大小顺序为:cccDNA＞IDNA＞ocDNA核酸分子是两性解离分子，pH3.5是碱基上的氨基解离，而三个磷酸基团中只有一个磷酸解离，所以分子带正电，在电场中向负极泳动；而pH8.0-8.3时，碱基几乎不解离，而磷酸基团解离，所以核酸分子带负电，在电场中向正极泳动。
不同的核酸分子的电荷密度大致相同，因此对泳动速度影响不大。
在中性或碱性时，单链DNA与等长的双链DNA的泳动率大致相同。
影响核酸分子泳动率的因素主要是：1、样品的物理性状即分子的大小、电荷数、颗粒形状和空间构型。
一般而言，电荷密度愈大，泳动率越大。
但是不同核酸分子的电荷密度大致相同，所以对泳动率的影响不明显。
对线形分子来说，分子量的常用对数与泳动率成反比，用此标准样品电泳并测定其泳动率，然后进行DNA分子长度（bp）的负对数——泳动距离作标准曲线图，可以用于测定未知分子的长度大小。
DNA分子的空间构型对泳动率的影响很大，比如质粒分子，泳动率的大小顺序为：cDNA ＞IDNA＞ocDNA但是由于琼脂糖浓度、电场强度、离子强度和溴化乙锭等的影响，会出现相反的情况。
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10×Loading Buffer (RNA电泳用) 组份浓度
配制量10 ml 配制方法 1. 称量下列试剂，置于10 ml离心管中。
2. 2. 向离心管中加入约4 ml的DEPC处理水后，充分搅拌溶解。 3. 加入5 ml的甘油（Glycerol）后，充分混匀。 4. 用DEPC处理水1011121314151617181920212223M
Total RNA from Arabidopsis plants
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 1819 20 21 M
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
2011.5.23
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Total RNA from Arabidopsis Plants
(DNA用)
本制品是核酸电泳用Loading Buffer。制品中含有SDS， 可即刻停止各 种酶促反应。使用时向酶促反应液中加入1/10量的本制品，即可上样 电泳。 本制品中含有色素溴酚蓝（Bromophenol Blue)，可以观察电泳的进行 情况。溴酚蓝在琼脂糖凝胶（0.5% ~ 1.4%）中约与300 bp的双链线状 DNA的迁移速度相同（在0.5×TBE中)。 本缓冲液配制组成合理，缓冲液中不含核酸酶（DNase或RNase)，特别 适用于各种酶促反应的停止以及各种酶促反应后的琼脂糖凝胶电泳。 一般来说，各种限制酶、修饰酶的酶促反应后电泳时，常使用本制品。
4、电泳缓冲液(10*) TAE TBE TPE
50×TAE Buffer(pH8.5) 组份浓度 2 M Tris-醋酸, 100 mM EDTA 配制量 1 L 配制方法 1. 称量下列试剂，置于1 L烧杯中。
2. 2. 向烧杯中加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。 3. 加入57.1 ml的醋酸，充分搅拌。 4. 加去离子水将溶液定容至1 L后，室温保存。
凝胶浓 度和
DNA 分子的 有效分 离范围
凝胶 PAG PAG PAG PAG PAG agarose agarose agarose agarose agarose agarose agarose
胶浓度（％） 3.5 5 8 12 20 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0
线性DNA的大小 100-2000bp 80-500 60-400 40-200 6-100 5-60kb 1-20 0.8-10 0.5-7 0.4-6 0.2-4 0.1-3
➢凝胶中加入EB 进行电泳，便于随时紫外线下观察电泳状态， 但EB会导致线性DNA迁移率下降１５％．
1、凝胶制备：称取1g agarose,加100ml 0.5 TAE or TBE，微波炉 或电炉溶解。
2、制胶：待熔化的agarose温度降到60℃以下后，将agarose倒进 插了梳子的胶盒中。30-40 min后，胶完全凝固，取梳子，将胶放 入电泳槽中，缓冲液没过胶约 0.5 –1cm。
10×TBE Buffer (pH8.3) 组份浓度 配制量 配制方法
10×MOPS Buffer 组份浓度200 mM MOPS, 20 mM NaOAc, 10 mM EDTA 配制量1 L 配制方法 1. 称量41.8 g MOPS，置于1 L烧杯中。 2. 加约700 ml DEPC处理水，搅拌溶解。 3. 使用2 N NaOH调节pH值至7.0。 4. 再向溶液中加入下列试剂。 5. 用DEPC处理水将溶液定容至1 L。 6. 用0.45 mm滤膜过滤除去杂质。 7. 室温避光保存。 注：溶液见光或高温灭菌后会变黄。变黄时也可使用，但变黑时不要使用。
实验琼脂糖凝胶电泳一原理二 目的掌握核酸电泳的方法
(DNA用)
本制品是核酸电泳用Loading Buffer。向电泳样品溶液中加入1/6量即可 上样电泳。 本制品中含有色素溴酚蓝（Bromophenol Blue)、二甲苯腈蓝FF（Xylene Cyanol FF)，可以观察电泳的进行情况。溴酚蓝在琼脂糖凝胶（0.5% ~ 1.4%）中约与300 bp的双链线状DNA的迁移速度相同（在0.5×TBE中)， 而二甲苯腈蓝FF则与4 k bp的双链线状DNA的迁移速度相等。溴酚蓝与 二甲苯腈蓝FF在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移速率则随凝胶浓度的改变而不 同。 本缓冲液配制组成合理，缓冲液中不含核酸酶（DNase或RNase)，泳带 清晰，是实验室常用的凝胶电泳上样用缓冲液。一般来说，PCR反应后 的琼脂糖凝胶电泳以及短链DNA的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，常使用本制 品。
3、制样：根据上样缓冲液的浓度加样，如6*loading buffer,则1ul loading buffer +5 ul DNA sample,类推。
4、点样：用移液器将DNA加到样品孔中。注意加DNA Marker。
5、接通电源，红为正极，黑为负极，DNA往正极移动，1-5V/cm，
6、根据指示剂移动位置决定终止电泳。将电压调到零，关机，再 取出凝胶，EB染色10-20分钟，紫外灯下观察，照相。
上样注意事项
➢加样时枪头不要碰坏凝胶控壁，否则DNA带型不整齐，加 样前要用枪头吸打凝胶孔中的溶液以赶走样品空中的气泡； ➢每孔最大上样量取决于DNA样品片段的大小，数目及样品 孔形状与容量； ➢每孔最大上样容积决定于样品孔体积； ➢DNA marker可在两侧的样品孔均加上．
电泳注意事项
➢电源接通前应该核实凝胶的方向是否放置正确；
➢电泳仪有电压不一定标志电泳槽已经接通，应该观察正负极 铂金丝是否有气泡出现，如负极的气泡（H2)比正极的(O2)多一 倍，表示电泳槽已接通电源，几分钟后可见指示剂溴酚蓝向正 极移动；
➢电泳过程中，EtBr向负极移动，与DNA的泳动方向相反，较 长时间的电泳会造成靠正极方向的凝胶中EB的含量降低，对于 含量较少的DNA fragment检测困难，可重新染色．