肝癌相关成纤维细胞的培养和鉴定及其对肝癌细胞增殖的影响
不同类型原发性肝癌组织中干细胞的表达及其预后
不同类型原发性肝癌组织中干细胞的表达及其预后原发性肝癌（primary liver cancer，PLC）是肝脏恶性肿瘤的一种常见类型，其中约80%的病例为肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC），20%为胆管细胞性肝癌（cholangiocarcinoma，CCA）。
干细胞（stem cells）被认为是参与肝癌发生和发展的重要因素之一。
干细胞具有自我更新、不定向分化、多能性等特性，可以通过转录调控、肿瘤微环境的改变等方式参与肿瘤的发生和发展。
本文将探讨不同类型原发性肝癌组织中干细胞的表达及其在预后中的作用。
一、肝癌组织中干细胞的表达1.肝癌干细胞肝癌干细胞（hepatocellular carcinoma stem cells，HCSCs）是一类具有干细胞特性的肝癌细胞，具有自我更新、不定向分化、多能性等特性。
HCSCs的存在和活化与肝癌的发生、进展、耐药以及复发等密切相关。
研究表明，HCSCs可以通过肿瘤干细胞标志物（如CD133、CD44、EpCAM等）的阳性表达来鉴定。
HCSCs的存在不仅可以促进肝癌的浸润和转移，还可以增加肿瘤耐药性，降低化疗和放疗的疗效。
HCSCs的存在还与肝癌的预后密切相关，HCSCs的高表达往往伴随着肝癌的恶性程度和预后的恶化。
二、干细胞在肝癌预后中的作用1. 预后评估肝癌组织中干细胞的表达水平和肿瘤预后密切相关。
多项研究表明，HCSCs和CCSCs的高表达与肝癌和胆管癌的预后明显相关。
HCSCs和CCSCs的高表达往往伴随着肿瘤的恶性程度增加、复发率增加、化疗抗药性增加以及晚期肝癌等不良预后的发生。
2. 治疗靶点肝癌干细胞作为肝癌发生和发展的关键因素之一，成为肝癌治疗中的重要靶点。
针对HCSCs和CCSCs的治疗不仅可以有效抑制肿瘤的浸润和转移，还可以降低肿瘤的耐药性，提高化疗和放疗的疗效。
目前，关于肝癌干细胞的治疗策略主要包括药物治疗、靶向治疗、免疫治疗、基因治疗等多种方式，但仍需进一步的研究和验证。
高中生物新教材选择性必修三同步讲义 第2章 第2节 第1课时 动物细胞培养
第2节动物细胞工程第1课时动物细胞培养[学习目标] 1.阐明动物细胞培养的条件和过程。
2.简述干细胞在生物医学工程中有广泛的应用价值。
一、动物细胞培养的条件和过程1．动物细胞工程(1)常用技术：动物细胞培养、动物细胞融合和动物细胞核移植等。
(2)基础：动物细胞培养。
2．动物细胞培养(1)概念：从动物体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后在适宜的培养条件下，让这些细胞生长和增殖的技术。
(2)培养条件①营养a．合成培养基：将细胞所需的营养物质(糖类、氨基酸、无机盐、维生素等)按种类和所需量严格配制而成的培养基。
b．天然成分：使用合成培养基时，通常需要加入血清等一些天然成分，原因是血清中含有尚未全部研究清楚的细胞所需的营养物质。
c．培养动物细胞一般使用液体培养基，也称为培养液。
②无菌、无毒的环境a．对培养液和所有培养用具进行灭菌处理。
b．在无菌环境下进行操作。
c．培养液需定期更换，以便清除代谢物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害。
③温度、pH和渗透压a．温度：以36.5 ℃±0.5 ℃为宜。
b．pH：以pH为7.2～7.4为宜。
c．适宜的渗透压。
④气体环境a．组成：动物细胞培养所需气体主要有O2和CO2。
b．不同气体的作用O2：是细胞代谢所必需的。
CO2：维持培养液的pH。
c．培养容器：通常采用培养皿或松盖培养瓶。
d．培养仪器：含有95%空气和5%CO2的混合气体的CO2培养箱。
(3)培养过程①②过程(4)相关概念①细胞贴壁：悬液中分散的细胞往往贴附在培养瓶的瓶壁上。
②接触抑制：当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞通常停止分裂增殖的现象。
③原代培养：指动物组织经处理后的初次培养。
④传代培养：分瓶后的细胞培养。
特别提醒区分两种“培养”的关键是看用胰蛋白酶处理的对象。
用胰蛋白酶对剪碎的动物组织进行处理，使其分散成单个细胞后进行培养，为原代培养；细胞培养过程中出现接触抑制，用胰蛋白酶处理使其从瓶壁上脱离下来分散成单个细胞，然后再用离心法收集，之后，将收集的细胞制成细胞悬浸，分瓶培养，为传代培养。
肿瘤相关成纤维细胞的分类-概述说明以及解释
肿瘤相关成纤维细胞的分类-概述说明以及解释1.引言1.1 概述概述：肿瘤相关成纤维细胞是一类紧密参与肿瘤发展和进展的细胞群体，其在肿瘤的生长、侵袭、转移和治疗抵抗等方面发挥着重要的作用。
成纤维细胞是一种基质细胞，主要分布在结缔组织中，具有合成胶原蛋白、细胞外基质和调节炎症反应等功能。
在肿瘤发展过程中，肿瘤相关成纤维细胞能够与癌细胞相互作用，促进肿瘤的增殖、侵袭和血管生成，同时也能够影响免疫细胞的功能，降低机体对肿瘤的抵抗能力。
随着对肿瘤微环境的研究不断深入，对肿瘤相关成纤维细胞的研究也逐渐受到重视。
成纤维细胞的异质性和功能多样性是研究的重点之一。
肿瘤相关成纤维细胞可以分为多个亚型，根据其表型、功能和来源等特征进行分类。
通过对肿瘤相关成纤维细胞的分类和研究，可以更好地认识其在肿瘤中的作用机制，并为肿瘤的诊断、治疗和预后评估提供新的思路和方法。
本文将对肿瘤相关成纤维细胞的分类进行详细的阐述和总结。
首先，将介绍成纤维细胞的定义和功能，为后续内容的理解奠定基础。
然后，将重点探讨成纤维细胞在肿瘤发展中的作用，包括其对肿瘤增殖、侵袭、转移和血管生成的影响等方面。
最后，将详细介绍不同类型的肿瘤相关成纤维细胞的分类方法，并探讨其在肿瘤研究和临床应用中的意义和潜力。
通过对肿瘤相关成纤维细胞的分类的深入研究，有助于我们更好地认识肿瘤的发生和发展机制，为肿瘤的个体化治疗提供新的思路和方法。
同时，通过针对特定类型的肿瘤相关成纤维细胞的干预，可以实现对肿瘤微环境的调控，达到更好的治疗效果。
因此，对肿瘤相关成纤维细胞的分类研究具有重要的理论和实践意义。
1.2文章结构1.2 文章结构本文将依次介绍肿瘤相关成纤维细胞的分类。
首先，引言部分将提供一个概述，简要介绍成纤维细胞在肿瘤发展中的重要作用，并阐述文章的目的。
接下来，正文部分将分为两个主要部分。
第一部分将定义和说明成纤维细胞的功能，包括其在正常生理状态下的作用，以及在肿瘤发展中的特殊功能。
肿瘤相关成纤维细胞对肝癌干细胞的影响
肿瘤相关成纤维细胞对肝癌干细胞的影响冯仁鑫;陈升;刘娇;宁北芳;谢渭芬【摘要】背景:肿瘤相关成纤维细胞(CAF)是肿瘤微环境中一类特殊的间质细胞,研究显示CAF在一些恶性肿瘤中可调节肿瘤干细胞(CSC)的干细胞特性和致瘤性.然而在肝细胞癌(HCC)中,CAF对CSC的调控作用尚不清楚.目的:探讨CAF对肝癌干细胞的影响.方法:分别采用免疫组化和免疫荧光技术标记CD44阳性CSC和α-SMA阳性CAF,观察两者在人HCC标本中的位置关系.从HCC手术标本中分离、纯化CAF和癌旁成纤维细胞(PTF),收集相应条件培养基和干细胞条件培养基.以real-time PCR检测CAF或PTF条件培养基培养的人肝癌细胞株HuH-7中的肝癌干细胞相关基因表达.采用流式细胞术分选肝癌干细胞表面标记物EpCAM阳性HuH-7细胞,以CAF或PTF干细胞条件培养基培养细胞,行干细胞成球实验.结果:在HCC标本中,CAF与CSC位置紧邻.与PTF组和对照组HuH-7细胞相比,CAF条件培养基处理组HuH-7细胞肝癌干细胞表面标记物基因和自我更新相关基因表达显著上调(P均＜0.05).CAF干细胞条件培养基处理组未经分选的HuH-7细胞和EpCAM阳性HuH-7细胞,成球率分别显著高于相应PTF组和对照组细胞(19.15％、32.13％对10.89％、19.57％和12.57％、19.77％,P均＜0.001).结论:CAF在肝癌干细胞自我更新能力的维持和促进中起重要作用.【期刊名称】《胃肠病学》【年(卷),期】2016(021)009【总页数】6页(P517-522)【关键词】癌,肝细胞;肿瘤相关成纤维细胞;肿瘤干细胞;自我更新;球形体,细胞【作者】冯仁鑫;陈升;刘娇;宁北芳;谢渭芬【作者单位】第二军医大学附属长征医院消化内科 200003;第二军医大学附属长征医院消化内科 200003;第二军医大学附属长征医院消化内科 200003;第二军医大学附属长征医院消化内科 200003;第二军医大学附属长征医院消化内科 200003【正文语种】中文背景：肿瘤相关成纤维细胞(CAF)是肿瘤微环境中一类特殊的间质细胞，研究显示CAF在一些恶性肿瘤中可调节肿瘤干细胞(CSC)的干细胞特性和致瘤性。
肿瘤相关成纤维细胞的分类
肿瘤相关成纤维细胞的分类全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：肿瘤是一种极具危害性的疾病，其发生和发展涉及到一系列复杂的细胞类型和信号通路。
成纤维细胞在肿瘤的形成过程中扮演着重要的角色。
成纤维细胞是一种起源于间叶的细胞，具有合成胶原蛋白和纤维蛋白等蛋白质的能力，是维持组织结构和功能的重要细胞之一。
在肿瘤的微环境中，成纤维细胞可以被肿瘤细胞引导或激活，从而发生功能和表型的改变，促进肿瘤的生长和扩散。
根据其在肿瘤微环境中的不同功能和表型，我们可以将肿瘤相关成纤维细胞进行分类。
一、活跃型成纤维细胞活跃型成纤维细胞是一种具有高度代谢活性和细胞增殖能力的成纤维细胞。
在肿瘤微环境中，活跃型成纤维细胞能够被肿瘤细胞激活，释放大量的细胞因子和生长因子，如基质金属蛋白酶、血管内皮生长因子等，促进肿瘤细胞的增殖和转移。
活跃型成纤维细胞还可以合成大量的胶原蛋白和纤维蛋白，形成肿瘤的基质支架，为肿瘤的生长和扩散提供支持。
抑制型成纤维细胞是一种在肿瘤微环境中发挥抑制作用的成纤维细胞。
在肿瘤发生时，抑制型成纤维细胞可以通过释放抑制性因子或直接抑制肿瘤细胞的增殖和转移，从而抑制肿瘤的生长和扩散。
抑制型成纤维细胞在肿瘤治疗中具有重要的作用，可以成为潜在的靶点和治疗策略。
肿瘤相关成纤维细胞的分类是一个复杂而又重要的研究领域，对其进行深入的研究可以为肿瘤的发生机制和治疗提供重要的启示。
希望未来在这方面的研究能够取得更多的进展，为肿瘤的防治工作做出更大的贡献。
【本文共涉及1132字】第二篇示例：肿瘤相关成纤维细胞是一类具有重要生物学功能的细胞类型，在肿瘤的发生和发展过程中扮演着重要的作用。
成纤维细胞是结缔组织中的一种细胞类型，主要起到细胞外基质合成和修复组织损伤的作用。
在肿瘤相关成纤维细胞中，存在着多个亚型，根据其表型和功能的不同可以将其分类为多种类型。
根据功能和作用的不同，可以将肿瘤相关成纤维细胞分为促进和抑制肿瘤生长的两类。
促进肿瘤生长的成纤维细胞主要通过促进肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭，促进肿瘤血管生成等途径来促进肿瘤的发展。
肝癌微环境中M2型肿瘤相关巨噬细胞对肝癌转移功能的影响及其机制研究
肝癌微环境中M2型肿瘤相关巨噬细胞对肝癌转移功能的影响及其机制研究一、本文概述肝癌，作为全球范围内致死率极高的恶性肿瘤之一，其发生、发展及转移过程涉及众多复杂的生物学机制。
在众多影响肝癌进程的微环境因素中，肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）的作用日益受到关注。
特别是M2型TAMs，因其具有促进肿瘤生长、侵袭和转移的特性，已成为肝癌研究的新热点。
本文旨在深入探讨M2型TAMs在肝癌微环境中对肝癌转移功能的影响及其潜在机制，以期为肝癌的诊疗提供新的思路和方法。
我们将首先概述肝癌的流行病学特征、临床表现及其治疗现状，以明确肝癌研究的背景和重要性。
随后，我们将重点分析M2型TAMs 在肝癌微环境中的分布、功能及其对肝癌转移的影响，通过文献综述和实验数据相结合的方式，揭示M2型TAMs与肝癌转移之间的内在联系。
在机制研究方面，我们将深入探讨M2型TAMs如何通过分泌特定细胞因子、趋化因子等方式，与肝癌细胞相互作用，促进肝癌的侵袭和转移。
我们还将关注M2型TAMs在肝癌免疫逃逸中的作用，以及其与肝癌预后的关系。
通过本文的研究，我们期望能够为揭示肝癌转移的分子机制提供新的视角，同时为开发针对M2型TAMs的肝癌治疗方法提供理论依据。
这不仅有助于提升我们对肝癌发生、发展过程的理解，还可能为肝癌的临床治疗带来革命性的突破。
二、材料与方法1 细胞系：本研究所用肝癌细胞系（HepG2和MHCC97H）及小鼠巨噬细胞系（RAW7）均购自中国科学院细胞库。
2 主要试剂：RPMI 1640培养基、胎牛血清（FBS）、青霉素/链霉素双抗、胰蛋白酶等细胞培养所需试剂购自Gibco公司；M2型巨噬细胞诱导剂IL-4和IL-13购自PeproTech公司；细胞迁移和侵袭实验所需Transwell小室购自Corning公司；RNA提取试剂Trizol、逆转录试剂盒及实时荧光定量PCR试剂盒购自Thermo Fisher Scientific公司；Western Blot所需试剂购自Bio-Rad公司；其他常用化学试剂均购自国药集团。
肝细胞肝癌肿瘤相关成纤维细胞的分离培养及鉴定
肝细胞肝癌肿瘤相关成纤维细胞的分离培养及鉴定*胡书娅1，郭庆喜1，杨楠2，刘祖平1，杨成万1，蒲霞1（西南医科大学附属医院：1病理科；2脊柱外科，四川泸州646000）摘要目的：通过分离纯化、培养及鉴定，获得人肝细胞肝癌组织中的肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)。
方法：采用组织块贴壁法获得原代细胞，通过差速酶消化法联合反复贴壁法进行纯化，再通过细胞形态观察和免疫细胞化学染色进行鉴定。
结果：成功分离出纯度较高的CAFs 。
细胞多呈长梭形或星芒状，核圆形或卵圆形。
免疫细胞化学染色示，细胞表达波形蛋白、α-平滑肌肌动蛋白和成纤维细胞活化蛋白。
结论：成功分离纯化并鉴定CAFs ，为下一步研究肝细胞癌相关成纤维细胞自身的生物学特性及其影响肝癌发生发展的机制提供了细胞学基础。
关键词肿瘤相关成纤维细胞；肝细胞肝癌；原代细胞培养中图分类号R735.7文献标志码Adoi:10.3969/j.issn.2096-3351.2018.01.008Isolation ，culture ，and identification of hepatocellularcarcinoma-associated fibroblastsHU Shuya 1，GUO Qingxi 1，YANG Nan 2，LIU Zuping 1，YANG Chengwang 1，PU Xia 11Department of Pathology ；2Department of Spinal Orthopedic ，the Affiliated Hospital of Southwest MedicalUniversity ，Luzhou 646000，Sichun Province ，ChinaAbstract Objective:To obtain cancer-associated fibroblasts (CAFs)from human hepatocellular carcinoma byisolation ，purification ，culture and identification.Methods:Primary hepatocellular CAFs were obtained by tissue adhesion and purified by differential enzyme digestion and repeated adherent method.Then ，the cells were identified using cytomorphological observation and immunocytochemical staining.Results:Highly purified CAFs were isolated successfully.Most CAFs were long-fusiform or star-shaped cells ，with round or oval nuclei.Immunocytochemical staining revealed that the cells expressed vimentin ，α-smooth muscle actin ，and fibroblastactivation protein.Conclusions:The successful isolation ，purification ，and identification of CAFs build a cytological basis for further study of the biological characteristics of hepatocellular CAFs and their impacts on the development and progression of hepatocellular carcinoma.Keywords Cancer-associated fibroblasts ；Hepatocellular carcinoma ；Primary cell culture基金项目：四川省教育厅重点项目（13ZA0233）；泸州市科技局指导性科研计划项目（泸市科【2013】134号）；泸州市-西南医科大学联合项目（2015LZCYD-S01(13/15)）第一作者简介：胡书娅，医师，硕士生。
759检验综合考试大纲
检验综合(科目代码：759)考试是为我校招收医学技术学术学位(专业代码：101000)医学检验技术方向(研究方向代码：01)硕士研究生而设置的具有选拔性质的全国统一入学考试初试科目，其目的是科学、公平、有效地测试考生是否具备继续攻读学术型硕士学位所需要的医学学科基础知识和基础技能。
评价的标准是高等学校和科研院所医学检验相关专业优秀本科毕业生能达到的及格或及格以上水平，以利于我校择优选拔，确保硕士研究生的招生质量。
检验综合考试范围为临床生物化学检验技术、临床免疫学检验技术、临床微生物学检验技术、临床分子生物学检验技术。
要求考生系统掌握上述学科中的基本理论、基本知识和基本技能，能够运用所学的基本理论、基本知识和基本技能综合分析、判断和解决有关理论问题和实际问题。
一、试卷满分及考试时间本试卷满分为300分，考试时间为180分钟。
二、答题方式答题方式为闭卷、笔试。
三、试卷内容结构临床生物化学检验技术、临床免疫学检验技术、临床微生物学检验技术、临床分子生物学检验技术各占约1/4。
四、试卷题型结构1.单项选择题（每题1.5分，共80题，共120分）2.名词解释(每题6分，共10题，共60分)3.简答题(每题10分，共6题，共60分)4.问答题(每题15分，共6题任选4题，共60分)一、临床生物化学检验技术1.绪论临床生化检验的概念、性质和任务；临床生化检验的主要内容。
2.临床生物化学检测方法的选择与评价检测系统的组成要素和特点；方法学评价的指标体系、常用指标、计算方法和意义；常用方法学评价实验的原理、注意事项和意义；标准品、校准品和质控品的性能差异和应用范围；量值溯源和测量不确定度的概念。
3.临床生物化学检测项目临床应用性能评价检验项目的诊断性能评价内容和统计方法；检验项目的诊断准确性、可靠性评价指标；检验项目临床应用性能评估的内容、临床意义与诊断性能；ROC曲线的概念、主要作用，联合试验的类型；参考区间的转移与验证方法。
卵巢癌相关成纤维细胞的培养及其对癌细胞侵袭力的影响
ｆｒ ｉ ｅ ｔ ， — ｏ ｔ ｓｌ ａｔ ｄ ｎ ｇ ｔ ｅ ｓ ｉｉｇ ｆｒ ｙｏ ｅ ｔ ．Ｃ Ｆ ｒ ｔｄ ｔｅ ｉｖ ｓ ｎ ｏ Ａ Ｖ Ｐ （ ｏ ｍ ｎｉ ａ ｓ ｏｈｍｕｃｅ ｃｉ ａ ｅ ａ ｖ ｔ ｎｎ ｔ ｒ ｉ ｖ ｎ ｍ ｎｎ ｉ ａ ｏ ｃ ｋ ａ ｎ Ａ ｓｐ ｏ ｅ ｈ ｎ ａｉ ｆ Ｏ ３（ ｍｏ ｏ Ｃ
［ 要］ 目的 摘
探讨卵巢癌相关成纤维细胞 （ Ａ ｓ 对 卵巢 癌细胞株 Ｃ Ｏ ３侵袭 力的影 响。方法 Ｃ Ｆ） ＡＶ
用组 织
块贴 壁培养法获得原代卵巢 Ｃ Ｆ 和卵巢正常成纤 维细胞 （ Ｆ ） 通过倒 置相差 显微镜 观察细 胞形态 和多种蛋 白 Ａｓ Ｎ ｓ； 的免疫组化染色 ， 对卵巢 Ｃ Ｆ 进行鉴定 ， Ａｓ 观察 Ｃ ｓ Ｃ Ｏ ３侵袭力 的影响 。结果 ＡＦ 对 Ａ Ｖ 获得纯 化的卵巢 Ｃ Ｆ ， 波 Ａ ｓ其 形蛋 白 、 一 Ⅱ 平滑肌肌动蛋 白染色呈 阳性 ， 角蛋 白呈 阴性 ；Ｃ Ｆ 可显著提高 Ｃ Ｏ ３的侵袭 能力 （ Ａｓ Ａ Ｖ Ｐ＜０Ｏ ） ． １ 。结论
ｉ ｇ ｔ ｒ ｈ ｌｇｃ ｌ ｂ ｅ ｖ ｔ ｎ ａ ｄ ｉ ｎ ｍｏ ｐ ｏｏ ｉａ ｓ ｒａ ｉ ｎ ｍｍｕ ｏ ｉｔ ｈ ｍｉ ａ ｔｉ ｉ ｇｏ ｅ ｔｉ ｒ ｔｉ ｓ ｈ ｆ ￣ ｏ ｏ ｏ ｏ ｎ ｈｓ ｃ ｏ ｅ ｃ ｌ ａ ｎｎ ｆ ｒ ｎ ｐ ｏｅ ｎ ．Ｔ ｅ ｅ ｅ ｓ ｃ ａ ｆ ＣＡＦ ｎ ｔ ｅ ｉｖ ｓｏ ｓ ｏ ａ ｉｎ ｏ ｈ ｎ ｆ
与 Ｎ ｓ 比，Ａ ｓ Ｆ相 Ｃ Ｆ 在形态结构 、 白表达等方面均有显著差异 ， 蛋 卵巢 Ｃ Ｆ 可增强 Ｃ Ｏ ３ Ａｓ Ａ Ｖ 侵袭作用 。
［ 关键 词 ］ 卵巢肿瘤 ； 癌相关成纤 维细胞 ； 细胞培养 ； 侵袭力 ［ 中图分 类号 ］ Ｒ ３ ． ７３７ ［ 文献标识码 ］ Ａ ［ 文章编 号］ １０ －６ Ｘ（０ ８ ２ －０ ２０ ０ ２２ ６ ２０ ） １ ３ －３ ０
乙肝病毒HBx基因稳转细胞系的建立及其诱导的内质网应激
乙肝病毒HBx基因稳转细胞系的建立及其诱导的内质网应激陆鹏;姜同翠;陈露;沈玉君;沈玉先;方圣云【摘要】目的建立乙肝病毒( HBV) HBx基因稳转细胞系，并观察该细胞系的增殖活性及内质网应激相关基因的表达情况。
方法采用 RT-PCR 法从 HepG2.2.15细胞株中克隆HBx基因编码区片段，构建pcDNA3.1-HBx真核表达质粒。
利用脂质体将pcDNA3.1-HBx转染至人HepG2细胞系，通过G418筛选后，经Western blot法对HBx的表达进行验证。
并用MTT法检测细胞的增殖活性，同时观察过表达HBx蛋白对内质网应激相关基因表达的影响。
结果成功构建了HBx 的真核表达质粒；建立了HBV HBx基因稳转细胞系；MTT法检测显示该细胞系增殖活性明显上升；同时也发现HBx基因的过表达可上调内质网应激相关基因BiP、PERK、ATF6、XBP1、MANF的表达，而CHOP的表达降低。
结论 HBx基因过表达可诱导内质网应激，并促进HepG2细胞增殖。
%Objective To establish the cell line stably expressing hepatitis B virus X protein ( HBx) by transfection of HBx to HepG2 cells and to investigate the effect of HBx on ER stress and proliferation. Methods HBx gene en-coding fragment cloned from HepG2 . 2 . 15 cells by RT-PCR was inserted to pcDNA3 . 1 vector to construct the pcD-NA3. 1-HBx eukaryotic expression plasmid and established the stable cell line after G418 screening. Cell prolifera-tion was determined by MTT method. The expressions of UPR genes were detected by PCR method. Results The HepG2s cell line tably expressing HBx was obtained. Overexpression of HBx up-regulated BiP, PERK, ATF6, XBP1, and MANF and down-regulated CHOP. The cell proliferation was enhanced in the HepG2s cells tably ex-pressing HBx. Conclusion Stably expressing HBxinduces ER stress by differentially regulating UPR genes and promotes the cell proliferation.【期刊名称】《安徽医科大学学报》【年(卷),期】2014(000)003【总页数】5页(P283-286,287)【关键词】HBx;细胞增殖;内质网应激【作者】陆鹏;姜同翠;陈露;沈玉君;沈玉先;方圣云【作者单位】安徽医科大学基础医学院，合肥230032; 安徽医科大学生物药物研究所，合肥230032;安徽医科大学基础医学院，合肥230032; 安徽医科大学生物药物研究所，合肥230032;安徽医科大学基础医学院，合肥230032; 安徽医科大学生物药物研究所，合肥230032;安徽医科大学基础医学院，合肥230032; 安徽医科大学生物药物研究所，合肥230032;安徽医科大学基础医学院，合肥230032; 安徽医科大学生物药物研究所，合肥230032;安徽医科大学基础医学院，合肥230032; 安徽医科大学生物药物研究所，合肥230032【正文语种】中文【中图分类】R34乙肝病毒(hepatitis B virus，HBV)感染引起的慢性乙型肝炎被普遍认为是导致肝癌发生的重要因素。
江苏省南京市六校联合体2023-2024学年高三10月联合调研生物试题及答案
D.图②③中的细胞有2个染色体组，12个四分体
5.某男子的一条14号和一条21号染色体相互连接形成一条异常染色体，如图甲。减数分裂时异常染色体的联会如图乙，配对的三条染色体中，任意配对的两条染色体分离时，另一条染色体随机移向细胞任一极。下列叙述正确的是（ ）
19.气孔开放与保卫细胞中积累K＋密切相关。研究发现水稻叶片保卫细胞细胞质膜上OSAI蛋白受光诱导后活性提高，泵出H＋，然后激活K+进入细胞，如图1所示，回答下列问题：
（1）水稻保卫细胞的内壁（靠气孔侧）厚而外壁薄，较薄的外壁易于伸长，向外扩展，当保卫细胞吸水膨胀时，气孔____。该情况下，④的含量短时间内将会____，进而可将更多的____中的能量转化为有机物中的化学能。
C.细胞自噬能降解细胞内的自身物质，维持细胞内环境的稳定
D.图中细胞自噬过程体现了细胞间的信息交流功能
4.编号①～⑤ 图像是显微镜下拍到的二倍体（2n＝24）哺乳动物精巢中减数分裂不同时期的图像。下列叙述正确的是（ ）
A.在减数分裂的过程中，细胞出现的先后顺序是①→②→③→⑤→④
B.用弱碱性溶液甲紫能使染色体染成深色，便于观察染色体的形态和数目
（3）部分mRNA在核糖体上翻译出 多肽借助引导肽进入____进行初步加工，之后由囊泡包裹沿着____进入高尔基体再进行加工、分泌。
（4）与DNA疫苗相比，mRNA疫苗的安全性更有优势，这是因为mRNA疫苗不会进入____内，减少了整合到宿主细胞基因组中的风险。与灭活病毒疫苗相比，RNA疫苗的优点有____（至少答两点）。
A.DNA水平上的分子生物学证据是研究生物进化最直接、最重要的证据
B.对尼安德特人线粒体DNA进行测序的目的是测定基因在染色体上的排列顺序
CXCL1与肝癌关系的研究进展
CXCL1与肝癌关系的研究进展发布时间：2023-06-28T11:13:59.158Z 来源：《中国医学人文》2023年2月2期作者：蔡育莹许壮志曲义坤通讯作者[导读]CXCL1与肝癌关系的研究进展蔡育莹许壮志曲义坤通讯作者（佳木斯大学附属第一医院；黑龙江佳木斯154000）摘要：CXC基序趋化因子配体1（CXCLI）作为多种信号转导通路中的关键枢纽，属于细胞因子超家族成员,通过其受体参与多种肿瘤的发生与演进过程。
近年来关于CXCLI与肝癌的关系被受学者关注，研究表明，趋化因子及其受体在肿瘤生长、转移和免疫逃逸中发挥重要作用。
本文根据既往学者的研究基础上就CXCLI与肝癌的关系作以综述。
关键词：肝癌；CXC基序趋化因子配体1(CXCL1)；肿瘤1肝癌概述肝癌作为是一个持续性的全球性健康问题，在世界范围内发病率逐年攀升。
据估算，根据2020年的统计数据，肝癌是发病率第六高、死亡率第三高的癌症[1]。
在中国，肝癌是影响人们健康的重要因素，在六大癌症中排名第二[2]。
肝细胞癌(HCC)是最常见的肝癌类型，约占75%~85%[2]。
通常发生在慢性肝病/肝硬化的病因下，预后较差。
HCC早期无典型症状，晚期通常表现为厌食、体重减轻、乏力、右上腹疼痛等症状，体格检查可发现黄疸或肝肿大。
利用超声LI-RADs进行分级、增强CT扫描或MRI成像是诊断可疑患者的关键，活检有时也是诊断所必需的。
血清甲胎蛋白(AFP)是诊断HCC最常用的生物标志物，但它既不敏感也不特异，不能可靠地用于排除HCC。
HCC的治疗方式在过去十年中不断发展，手术切除和移植仍然是早期和中期疾病的主要治疗模式，最适合切除的患者通常是单发肿瘤，没有血管侵犯的证据，有足够的肝储备。
但许多患者由于潜在的肝功能障碍或局部晚期疾病而不适合切除。
肝移植为最佳的长期结果提供了最好的机会，但肝移植与肝切除的判断是复杂的，需要权衡肝功能、是否存在门脉高压症、性能状况、肿瘤特征等多种因素。
肿瘤相关成纤维细胞鉴定方法-概述说明以及解释
肿瘤相关成纤维细胞鉴定方法-概述说明以及解释1.引言【1.1 概述】本文旨在介绍肿瘤相关成纤维细胞的鉴定方法。
肿瘤是一种常见的疾病，对人类健康产生了极大的威胁。
成纤维细胞作为一种重要的细胞类型，对肿瘤的发生和发展起着重要的调节作用。
因此，准确鉴定肿瘤相关成纤维细胞对于深入研究肿瘤的发病机制以及寻找新的治疗策略具有重要意义。
本文将首先介绍成纤维细胞的重要性，包括其在正常生理条件下的维持组织结构和功能的作用，以及在肿瘤中的调节效应。
接着，将详细介绍目前已经发展出的肿瘤相关成纤维细胞的鉴定方法，包括基于细胞表面标记物的鉴定方法、基于转录组学的鉴定方法以及基于细胞功能的鉴定方法。
每种方法都有其特点和优劣势，因此深入了解这些方法对于进行准确的成纤维细胞鉴定具有重要意义。
最后，文章将总结目前的研究进展，指出肿瘤相关成纤维细胞鉴定方法在临床治疗和预后评估中的应用前景，并展望未来可能的研究方向。
通过本文的介绍，希望能够增加研究人员对于肿瘤相关成纤维细胞的认识，并为肿瘤的个体化治疗提供新的思路和方法。
总之，本文将以概述的方式介绍肿瘤相关成纤维细胞鉴定方法，旨在促进对肿瘤发生发展机制的深入理解，为肿瘤的精准诊疗提供新的思路和策略。
1.2 文章结构文章结构部分的内容可以是：文章结构：本文分为引言、正文和结论三个部分。
引言部分旨在概述本文的内容和目的，并介绍了肿瘤相关成纤维细胞鉴定方法的重要性。
正文部分主要包括成纤维细胞的重要性和肿瘤相关成纤维细胞的鉴定方法。
结论部分对本文进行了总结，并展望了未来可能的研究方向。
引言部分的概述主要介绍了成纤维细胞在生物体内的重要性。
成纤维细胞是一种常见的真核细胞类型，广泛存在于不同组织和器官中，对于维持组织结构的稳定和修复起着重要作用。
然而，肿瘤相关成纤维细胞的功能和特性与正常成纤维细胞存在差异，其在肿瘤发生、发展和治疗中具有重要的调节作用。
因此，准确鉴定肿瘤相关成纤维细胞是探索肿瘤发展机制和开展有效治疗策略的基础。
慢病毒介导稳定高表达Cx32的Huh7细胞系建立及其对细胞增殖的影响
慢病毒介导稳定高表达Cx32的Huh7细胞系建立及其对细胞增殖的影响纪玉婷;杨燕;郑荣生;张吴琼;刘静【摘要】Aim To construct a lentiviral vector for stable delivery of the connexin32 (Cx32) gene in human hepatocellular carcinoma cell lineHuh7,and also to detect its effect on cell proliferation.Methods Human Cx32 gene sequence was obtained by whole gene synthesis and amplified by PCR,and was then inserted into LV5-GFP lentiviral vector to construct the recombinant plasmid LV5-GFP-hCx32.Following identified by restriction endonuclease digestion and DNA sequencing,this plasmid together with lentiviral package plasmid was transfected into 293T cells to produce the lentiviral particles,and the viral titer was assessed under fluorescent microscope.Targeted Huh7 cells were infected with the lentivirus (LV5-hCx32 and LV5-NC),and the infected cells after selection with puromycin were amplified and cultured.The expression and localization of Cx32 were detected by real-time RT-PCR,Western blot and immunofluorescence assay,respectively.The gap junction (GJ) function between adjacent cells was measured by dye transfer assay.The Huh7 cell proliferation capacity was determined by MTT and colony formation assays.Results The results of double enzyme digestion and DNA sequencing proved that the recombinant lentiviral vector LV5-GFP-hCx32 was successfully constructed.After packing in 293T cells,the recombinant lentivirus LV5-GFP-hCx32 with virus drops to 3 × 1011 TU · L-1 wasobtained.Huh7 cells transiently infected with the lentivirus LV5-GFP-hCx32 remarkably over-expressed Cx32 at both mRNA and proteinlevels.Moreover,Cx32 expression was also significantly up-regulated in stably transfected Huh7 cells,and the presence of enhanced functional GJ in intact cells could be detected due to an increased amount of Cx32 protein along the plasma membrane at cell-cell pared toLV5-NC group,the proliferation ability in Huh7 cells with recombinant Cx32 declined (P ＜ 0.05).Conclusions The lentiviral vector over-expressing Cx32 gene is successfully constructed,and can stably transfect Huh7 cells to yield sustained over-expression of exogenous Cx32 gene,thus eventually inhibits cell proliferation.%目的构建LV5-hCx32慢病毒表达载体,获得稳定高表达人缝隙连接蛋白32(connexin32,Cx32)的Huh7人肝癌细胞系,并研究Cx32对Huh7细胞增殖的影响.方法采用全基因合成法并经PCR扩增得到Cx32基因序列,将所得目的片段克隆到LV5-GFP载体上,获得重组慢病毒质粒LV5-GFP-hCx32,经酶切鉴定及DNA测序鉴定后,与慢病毒包装质粒系统共转染293T细胞中,包装成重组慢病毒颗粒,经荧光显微镜测定重组慢病毒滴度.将慢病毒载体LV5-hCx32和LV5-NC感染Huh7细胞,嘌呤霉素筛选出细胞阳性克隆并扩大培养.qRT-PCR、Western blot和免疫荧光法分析Cx32的表达及定位;细胞接种荧光示踪法检测细胞缝隙连接(gap junction,GJ)功能;MTT法及克隆形成实验观察细胞增殖能力的变化.结果双酶切及测序结果表明LV5-GFP-hCx32慢病毒载体构建成功,经293T细胞包装后,成功获得病毒滴度为3×1011TU·L-1的重组慢病毒LV5-GFP-hCx32,慢病毒瞬时感染后的Huh7细胞中Cx32 mRNA和蛋白表达水平明显增多,筛选后建立的稳定转染细胞系中Cx32也稳定高表达,并且部分表达于细胞膜,形成有功能性的GJ.过表达Cx32的Huh7细胞增殖能力减弱(P＜0.05).结论成功构建Cx32基因过表达慢病毒载体,该载体能够稳定感染Huh7细胞,使外源基因Cx32过表达并抑制细胞的增殖能力.【期刊名称】《中国药理学通报》【年(卷),期】2018(034)002【总页数】6页(P284-289)【关键词】肝细胞癌;缝隙连接蛋白32;慢病毒;载体构建;稳定转染;治疗靶点【作者】纪玉婷;杨燕;郑荣生;张吴琼;刘静【作者单位】蚌埠医学院第一附属医院肿瘤内科,安徽蚌埠233004;蚌埠医学院第一附属医院肿瘤内科,安徽蚌埠233004;蚌埠医学院第一附属医院肿瘤内科,安徽蚌埠233004;蚌埠医学院第一附属医院肿瘤内科,安徽蚌埠233004;蚌埠医学院第一附属医院肿瘤内科,安徽蚌埠233004【正文语种】中文【中图分类】R329.24;R373.9;R735.7;R735.702.2;R977.6消化道肿瘤是人类面临的重大难题，原发性肝癌是消化系统肿瘤的重要构成，其中约90%为肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)。
致癌物的实验报告
致癌物的实验研究二、实验目的1. 了解致癌物的定义和分类。
2. 探究常见致癌物的生物学效应。
3. 分析致癌物对细胞增殖和DNA损伤的影响。
4. 为预防致癌物暴露提供实验依据。
三、实验材料1. 实验动物：小鼠（雄性，体重20-25g）。
2. 实验试剂：致癌物（苯并芘、黄曲霉毒素B1、多环芳烃等），DNA损伤检测试剂盒，细胞培养试剂等。
3. 实验仪器：显微镜、细胞培养箱、PCR仪、凝胶成像系统等。
四、实验方法1. 致癌物处理：将小鼠随机分为实验组和对照组，实验组给予致癌物处理，对照组给予等体积的溶剂。
2. 细胞培养：将小鼠的皮肤成纤维细胞进行体外培养，分为实验组和对照组。
3. 致癌物暴露：将实验组细胞暴露于致癌物中，对照组细胞暴露于等体积的溶剂中。
4. 细胞增殖检测：采用MTT法检测细胞增殖情况。
5. DNA损伤检测：采用彗星实验检测DNA损伤情况。
五、实验结果1. 致癌物处理组小鼠的体重、毛发、皮肤颜色等外观表现与对照组无显著差异。
2. 致癌物处理组细胞增殖能力与对照组相比无显著差异。
3. 致癌物处理组细胞DNA损伤程度与对照组相比显著增加。
1. 致癌物处理组小鼠的外观表现无显著差异，说明致癌物对小鼠的急性毒性较小。
2. 致癌物处理组细胞增殖能力与对照组相比无显著差异，说明致癌物对细胞增殖能力的影响较小。
3. 致癌物处理组细胞DNA损伤程度与对照组相比显著增加，说明致癌物对细胞DNA有明显的损伤作用。
七、实验结论1. 常见致癌物对小鼠的急性毒性较小。
2. 致癌物对细胞增殖能力的影响较小。
3. 致癌物对细胞DNA有明显的损伤作用。
八、实验讨论1. 致癌物对小鼠的急性毒性较小，可能与实验动物的种类、处理剂量和实验时间有关。
2. 致癌物对细胞增殖能力的影响较小，可能与实验动物的细胞类型、处理剂量和实验时间有关。
3. 致癌物对细胞DNA的损伤作用可能是致癌物引发肿瘤的重要机制之一。
九、实验建议1. 在实验过程中，应严格控制致癌物的处理剂量和实验时间，以确保实验结果的准确性。
癌相关成纤维细胞的研究进展
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网络出版时间：２０２１－６－２４８：３７ 网络出版地址：ｈｔｔｐｓ：／／ｋｎｓ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／３４．１０７３．Ｒ．２０２１０６２３．１６１８．０１６．ｈｔｍｌ
癌相关成纤维细胞的研究进展
３ ＣＡＦ与免疫细胞之间的相互关系
ＣＡＦ通过分泌细胞因子、趋化因子和其他因子，如胶原 蛋白、基质金属 蛋 白 酶、层 粘 连 蛋 白 等，与 免 疫 细 胞 相 互 作 用，以调节 ＴＭＥ，促进肿瘤的发生、发展。 ３．１ ＣＡＦ与巨 噬 细 胞 的 相 互 作 用 ＣＡＦ通 过 分 泌 多 种 细 胞因子调节巨噬细胞，肿瘤相关巨噬细胞 （ｔｕｍｏｒａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ，ＴＡＭ）也可以调节 ＣＡＦ的状态。ＴＡＭ由 Ｍ１和 Ｍ２型两种不同表型的巨噬细胞组成。Ｍ１型 ＴＡＭ有抗肿瘤 作用，而 Ｍ２型 ＴＡＭ 具有免疫抑制功能，能促进肿瘤进展。 ＴＡＭ和 ＣＡＦ常在瘤组织的同一区域被检测到，但在不同肿 瘤中，两种细胞的比例不同。在胃肠道癌、肺癌、胰腺癌和前 列腺癌组织中，ＣＡＦ密度高于 ＴＡＭ；而脑瘤、淋巴瘤、肾癌和 肝癌 组 织 中，ＴＡＭ 的 密 度 较 高［８］。Ｙａｖｕｚ等［９］研 究 发 现， ＣＡＦ不仅可以通过单核细胞趋化蛋白１和基质细胞衍生因 子１招募单核细胞，还可将其分化为 Ｍ２型 ＴＡＭ，从而在乳 腺癌中发挥免疫抑制作用；他们的研究还发现，高级别 ＣＡＦ 与乳腺癌组织中 ＴＡＭ 的数量显著相关，也与 Ｋｉ６７增殖指 数较高和肿瘤体积较大相关。这种肿瘤细胞、ＣＡＦ和 Ｍ２型 ＴＡＭ之间复杂的相互作用，增强了肿瘤细胞的运动性，从而 促进了原发性 肿 瘤 的 逃 逸、转 移 扩 散 和 内 皮 细 胞 的 血 管 生 成。 ３．２ ＣＡＦ与 ＮＫ细胞的相互作用 在肿瘤免疫中，ＮＫ细 胞起重要作用，ＣＡＦ能通过不同的方式抑制 ＮＫ细胞的表达 和功能，促进肿瘤生长。ＮＫＧ２Ｄ是 ＮＫ细胞的激活受体，对 激活 ＮＫ细胞必不可少，ＭＩＣＡ／Ｂ作为 ＮＫＧ２Ｄ的 ２个配体， 在肿瘤细胞表面表达。Ｚｉａｎｉ等 研 ［１０］ 究发现黑色素瘤 ＣＡＦ 通过分泌基质金属蛋白酶，可降低 ＭＩＣＡ／Ｂ的表达，从而进 一步降低 ＮＫ细胞对黑色素瘤 ＮＫＧ２Ｄ依赖性细胞的毒性杀 伤活性。Ｚｈａｎｇ等 发 ［１１］ 现在结直肠癌中，ＣＡＦ可 通 过 分 泌 ＩＬ８吸引 单 核 细 胞，进 而 促 进 巨 噬 细 胞 Ｍ２极 化，ＴＡＭ 与 ＣＡＦ在 ＴＭＥ中协同作用，可抑制结直肠癌 ＮＫ细胞的功能。 ＮＫ细胞也可影响 ＣＡＦ的细胞因子表达，但这方面的研究有 限，尚待进一步探讨。 ３．３ ＣＡＦ与 Ｔ淋巴细胞的相互作用 研究表明，在肿瘤间 质中调节性 Ｔ细胞（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙＴｃｅｌｌｓ，Ｔｒｅｇ）高表达患者比 Ｔｒｅｇ低表达的患者预后差。在 ＴＭＥ中，Ｔｒｅｇ和 ＣＡＦ都起作 用，免疫调 节 因 子 在 ＣＡＦ中 的 表 达，可 以 诱 发 基 质 中 的 Ｔｒｅｇ。Ｃｏｓｔａ等［１２］发现，在三阴型乳腺癌中，有 ２个肌成纤维 细胞亚群 ＣＡＦＳ１和 ＣＡＦＳ４。ＣＡＦＳ１诱导 Ｔｒｅｇ的分化和活 性，并增加 Ｔ淋巴细胞的存活率，ＣＡＦＳ４没有表现出该特 性。因此，不同来源的 ＣＡＦ具有不同的生物学功能，尤其是
肝癌相分离免疫_概述说明以及解释
肝癌相分离免疫概述说明以及解释1. 引言1.1 概述肝癌是一种常见且危险的恶性肿瘤，其发病率和死亡率在全球范围内居高不下。
随着科技的进步和研究的深入，人们对于肝癌治疗的认识也在不断增加。
相分离免疫作为一种新型的治疗策略，在肝癌领域引起了广泛关注。
1.2 文章结构本文将围绕着肝癌相分离免疫展开论述。
首先将介绍什么是肝癌相分离免疫，以及其作用机制和应用领域。
接着会概述说明肝癌相分离免疫的意义，包括当前肝癌治疗面临的挑战、相分离免疫在治疗中的优势以及对患者生存率和生活质量的影响。
然后文章会解释肝癌相分离免疫的关键概念和技术方法，包括抗体介导的肿瘤细胞识别和攻击机制、免疫检查点抑制剂在肝癌治疗中的应用以及CAR-T 细胞疗法在肝癌治疗中的研究进展。
最后，文章将给出结论部分，总结肝癌相分离免疫的作用和意义，并展望其发展前景和面临的挑战，同时提出对未来发展的建议和展望。
1.3 目的本文旨在全面介绍肝癌相分离免疫，并说明其在肝癌治疗中的重要性和潜力。
通过对肝癌相分离免疫的概述、意义解释以及关键概念和技术方法的详细阐述，希望能够增加人们对于这一新型治疗策略的了解，并为未来相关研究提供参考与启示。
2. 肝癌相分离免疫:肝癌相分离免疫是一种新兴的免疫治疗策略，它通过搭建一个特殊的体外生物界面来实现肿瘤细胞的选择性识别和攻击。
在这个体外界面中，鉴定出对肝癌特异抗原具有高度亲和力的抗体和免疫细胞被结合在一起，并排除对正常细胞具有亲和力的抗体。
这种排他性选择性识别机制尤其适用于肝癌这类具有高度异质性的恶性肿瘤。
2.1 什么是肝癌相分离免疫:肝癌相分离免疫是指通过将对特定抗原具有高度亲和力的单克隆抗体与激活状态的免疫效应细胞（如T细胞、自然杀伤细胞等）结合在一起，并同时利用组织工程学技术或荧光显影技术将二者置于同一环境下，使得只有目标肿瘤细胞能够被检测到并受到攻击。
与传统的化疗、放疗和靶向治疗相比，肝癌相分离免疫具有更高的精确性和特异性。
肝癌临界区域免疫微环境鉴定研究
64*基金项目：苏州市科技局民生科技指导性项目（SKJYD2021103）作者简介：洪晗（1985.07-），男，硕士研究生，副主任医师，研究方向为肝癌的微创治疗△通讯作者：徐小永（1981.11-），男，博士研究生，副主任医师，研究方向为肝癌的综合治疗，邮箱**********************肝癌临界区域免疫微环境鉴定研究*洪晗 徐敏晖 金正康 李高超 徐小永△南京医科大学附属苏州医院（苏州市立医院东区）肝胆胰外科，江苏 苏州 215001【摘要】目的：鉴定肝癌临界区域免疫微环境，分析临界区的特殊免疫亚群构成，为肝癌临床治疗扩宽临床治疗思路以及提供新的治疗疗法。
方法：通过手术治疗方案获取21例肝癌患者的癌肿组织，划定相应区域后，重点将癌肿临界区域与癌旁组织进行对比，二者进行免疫荧光染色技术验证交界区域特征性T 细胞亚群，最后对组织进行染色，得出相应结果。
结果：肝癌临界区域有着其独特的免疫细胞亚群双阳T 细胞特异性的富集于交界区域，临界区域的相关细胞可能与肝癌患者的预后成正相关。
结论：肝癌临界区域有着其独特的免疫细胞构成，根据这一特异性，可进一步结合临床对肝癌患者进行相关靶向治疗与预后分析，这有利于肝癌患者的后续治疗以及预后效果的治疗分析。
【关键词】肝癌；异质性；免疫微环境【中图分类号】R735.7 【文献标识码】A 【文章编号】2096-5249（2023）23-0064-04在现代医学理论中，肿瘤是指发源于上皮组织中的恶性肿瘤，是人类最普遍的恶性肿瘤类型[1]。
肿瘤的主要特征为细胞分化和生长失常、细胞繁殖失控、侵袭和转移[2]。
其发生方式为一个多因素、多过程的复杂过程，可包括以下三种过程：启动、致癌和进化。
它与吸烟、感染、职业暴露、环境污染、不良饮食和遗传等因素密切相关。
肝癌是一种肝功能恶性癌症，可分为原发性和继发性二个类别。
原发型肝恶性癌症通常来源于肝功能的上皮细胞或间质性组织[3-5]。
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［文章编号］ １６７１－５８７Ⅹ（２０１２）０３－０４３８－０５［收稿日期］ ２０１１－０４－１６［基金项目］ 国家自然科学基金面上项目资助课题（ＮＳＦＣ ３０９７２９１４）；广东省科技计划项目资助课题（２００９Ｂ０６０７０００２４）；广东省自然科学基金面上项目资助课题（１０１５１００８９０１０００２０８）；中山大学高校基本科研业务费重大项目培育基金资助课题（１０ｙｋｊｃ０３）［作者简介］ 汪田甜（１９８３－），女，安徽省明光市人，医师，医学硕士，主要从事肝脏恶性肿瘤方面的研究。
［通信作者］ 吴祥元（Ｔｅｌ：０２０－８５２５２２１７，Ｅ－ｍａｉｌ：ｗｘｙ３０７＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ）肝癌相关成纤维细胞的培养和鉴定及其对肝癌细胞增殖的影响汪田甜１，贾昌昌２，张 琪２，董 敏１，李 星１，陈冠中２，吴祥元１（１．中山大学附属第三医院肿瘤内科，广东广州５１０６３０；２．中山大学附属第三医院肝移植中心，广东广州５１０６３０）［摘 要］ 目的：分离、培养及鉴定原代肝癌相关成纤维细胞（ｈＣＡＦ），阐明其在肝癌发生发展中的作用。
方法：采用酶消化法分离、纯化人ｈＣＡＦ，Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ法鉴定其相关蛋白标记物的表达，流式细胞术检测肝癌细胞Ｈｅｐ３Ｂ经ｈＣＡＦ上清处理后的增殖速度及细胞周期的变化，建立裸鼠移植瘤模型，观察ｈＣＡＦ对肝癌细胞生长的影响。
结果：在肝癌组织标本中成功分离出ｈＣＡＦ，Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ结果显示ｈＣＡＦ特异性地高表达α－平滑肌肌动蛋白（α－ＳＭＡ）。
ＣＣＫ８细胞增殖检测试剂盒检测证实，经ｈＣＡＦ上清处理后的Ｈｅｐ３Ｂ细胞增殖量为完全培养基处理４８ｈ细胞增殖量的１２６．０％、１２５．０％及１２０．５％，细胞增殖量差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。
流式细胞术结果显示，经ｈＣＡＦ上清处理后的Ｈｅｐ３Ｂ细胞增殖速度及细胞周期中处于Ｓ期的细胞数目均高于完全培养基处理的Ｈｅｐ３Ｂ细胞（Ｐ＜０．０５）。
ｈＣＡＦ与Ｈｅｐ３Ｂ共同接种至裸鼠皮下的成瘤体积［（１．３４±０．５２）ｃｍ３］明显大于单独接种Ｈｅｐ３Ｂ组［（０．５１±０．０９）ｃｍ３］，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。
结论：ｈＣＡＦ可以明显促进肝癌细胞系Ｈｅｐ３Ｂ的生长，其可能在肝癌生长过程中发挥重要作用。
［关键词］ 癌相关成纤维细胞；肝细胞肿瘤；增殖；肿瘤微环境［中图分类号］ Ｒ３２２．４７ ［文献标志码］ ＡＣｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓＷＡＮＧ Ｔｉａｎ－ｔｉａｎ１，ＪＩＡ Ｃｈａｎｇ－ｃｈａｎｇ２，ＺＨＡＮＧ Ｑｉ ２，ＤＯＮＧ Ｍｉｎ１，ＬＩ Ｘｉｎｇ１，ＣＨＥＮ Ｇｕａｎ－ｚｈｏｎｇ２，ＷＵ Ｘｉａｎｇ－ｙｕａｎ１（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｔｈｉｒｄ Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｓｕｎ Ｙａｔ－ｓｅｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１０６３０，Ｃｈｉｎａ；２．Ｌｉｖｅｒ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｔｈｉｒｄ Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｓｕｎ Ｙａｔ－ｓｅｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１０６３０，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｉｓｏｌａｔｅ，ｃｕｌｔｉｖａｔｅ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｔｈｅ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ（ｈＣＡＦ）ａｎｄ ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅｉｒ ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｒｏｌｅ ｉｎ ｔｈｅ ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｅｐｒｉｍａｒｙ ｈＣＡＦ ｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｂｙ ｅｎｚｙｍｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｈＣＡＦ ｗｅｒｅ ｅｘａｍｉｎｅｄ ｂｙ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅ ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅｓ ｏｆ Ｈｅｐ３Ｂｃｅｌｌｓ ａｆｔｅｒｈＣＡＦ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗｅｒｅ ｅｖａｌｕａｔｅｄ ｂｙ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｈＣＡＦ ｏｎ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌｓ ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｔｈｏｕｇｈ ｂｕｉｌｄｉｎｇ ａ ｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｔｕｍｏｒ ｍｏｄｅｌ ｉｎ ｎｕｄｅ ｍｉｃｅ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ｈＣＡＦ ｗｅｒｅ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｉｓｏｌａｔｅｄ ａｎｄ ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ ａｎｄ ｈｉｇｈｌｙ ｓｐｅｃｉｆｉｃｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄα－ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ａｃｔｉｎ（α－ＳＭＡ）ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｃａｐａｃｉｔｙ ｏｆ Ｈｅｐ３Ｂｗａｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ａｆｔｅｒ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｈＣＡＦ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉａ．Ｔｈｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｃａｐａｃｉｔｉｅｓ ｏｆ Ｈｅｐ３Ｂｗｅｒｅ １２６．０％，１２５．０％ａｎｄ １２０．５％ｏｆ ｔｈｏｓｅ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｍｅｄｉｕｍｆｏｒ ４８ｈ（Ｐ＜０．０５）．Ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｓ ｏｆ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｓ ｐｈａｓｅ ｗｅｒｅ ｈｉｇｈｅｒ８３４第３８卷 第３期２０１２年５月吉 林 大 学 学 报 （医 学 版）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｊｉｌｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｅｄｉｔｉｏｎ）Ｖｏｌ．３８Ｎｏ．３ Ｍａｙ ２０１２ｔｈａｎ ｔｈｏｓｅ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ４８ｈ（Ｐ＜０．０５）．Ｔｈｅ ｔｕｍｏｒ ｖｏｌｕｍｅ ｉｎ Ｈｅｐ３Ｂｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｈＣＡＦ ｃｏ－ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐ［（１．３４±０．５２）ｃｍ２］ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｌａｒｇｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｉｎ Ｈｅｐ３Ｂｃｅｌｌｓ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐ［（０．５１±０．０９）ｃｍ２］ｉｎ ｎｕｄｅ ｍｉｃｅ（Ｐ＜０．０５）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ ｈＣＡＦ ｃｏｕｌｄ ｐｒｏｍｏｔｅ ｔｈｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌ ｌｉｎｅ Ｈｅｐ３Ｂ，ａｎｄ ｈＣＡＦ ｍｉｇｈｔ ｐｌａｙ ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｒｏｌｅ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｃａｒｃｉｎｏｍａ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ；ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｕｍｏｒ；ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ；ｔｕｍｏｒ ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ 肿瘤相关成纤维细胞（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ，ＣＡＦ）又称作癌相关成纤维细胞，是肿瘤间质的重要组成成分，也是组成肿瘤微环境数目最多的一类细胞，其可以通过一系列的旁分泌机制直接或间接地参与肿瘤细胞生长、侵袭和转移过程［１－３］，因此ＣＡＦ被认为是肿瘤微环境中最重要的组成部分。
在肝癌组织中被证实存在着大量的ＣＡＦ［４－５］，而目前国内外对于肝癌相关成纤维细胞（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ＣＡＦ，ｈＣＡＦ）的研究甚少，ｈＣＡＦ在肝癌发生、发展中的作用尚不清楚。
因此，本研究旨在通过从肝癌组织中成功分离、培养ｈＣＡＦ，利用体外细胞增殖实验、细胞周期分析以及动物移植瘤模型观察ｈＣＡＦ对肝癌细胞增殖能力的影响，初步明确ｈＣＡＦ在肝癌发生、发展中的作用。
１ 材料与方法１．１ 细胞及主要试剂 无菌条件下取本院肝切除手术切下的新鲜肝癌组织标本３例及本院健康小儿包皮环切术后切下的新鲜包皮组织３例，肝癌组织标本在术后经病理证实为肝细胞肝癌。
肝癌细胞系Ｈｅｐ３Ｂ和胎肝细胞系ＬＯ２购于上海细胞库；人脐静脉血管内皮细胞（ＨＵＶＥＣ）购于美国典型培养库；原代ｈＣＡＦ及原代的正常人皮肤成纤维细胞（ｎｏｒｍａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ，ＮＦ）经酶消化法由组织中分离培养获得；高糖ＤＭＥＭ、双抗（青霉素、链霉素１００ｍｇ·Ｌ－１）和胎牛血清购于Ｇｉｂｃｏ公司；Ⅳ型胶原酶、胰蛋白酶和ＥＤＴＡ购于Ｓｉｇｍａ公司；蛋白提取试剂盒、ＢＣＡ法定量试剂盒、ＣＣＫ８细胞增殖检测试剂盒和细胞周期检测试剂盒购于南京凯基公司；α－平滑肌肌动蛋白（α－ＳＭＡ）抗体和Ｖｉｍｅｎｔｉｎ抗体购于Ａｂｃａｍ公司；Ｅ－钙黏蛋白（Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ）抗体购于Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ公司；６～８周龄的ＢＡＬＢ／ｃ裸鼠购自北京维通利华公司。
１．２ 细胞培养 肝癌细胞系Ｈｅｐ３Ｂ培养于含１００Ｕ·ｍＬ－１青霉素、１００ｍｇ·Ｌ－１链霉素和含１０％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ培养基中，使用含有ＥＤＴＡ的０．２５％的胰酶消化传代。
ＨＵＶＥＣ培养于含２０％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ培养基中，用含有ＥＤＴＡ的０．０５％胰酶消化传代。
１．３ ｈＣＡＦ的分离、培养及纯化 在手术室切取新鲜肝癌组织标本３～５ｇ，置于含有抗生素的ＰＢＳ中冰上短暂保存。
取出标本在超净工作台中用含双抗的ＰＢＳ清洗数次，修剪肝癌组织将毗邻的非肝癌组织及肿瘤内明显的血管结构剔除，将修剪后的组织用眼科剪剪成糊状，大小约为１ｍｍ×１ｍｍ×１ｍｍ。
用８～１０ｍＬ １ｇ·Ｌ－１的Ⅳ型胶原酶在摇床上３７℃消化组织约５～６ｈ，消化后ＰＢＳ清洗２次，用含１０％ＦＢＳ的高糖ＤＭＥＭ培养基重悬并过２００目滤网，最后将过滤后的细胞悬液调整至细胞密度为１０６ ｍＬ－１，接种于２５ｃｍ２培养瓶中，置于３７℃细胞培养箱中培养。
４８ｈ后第１次换液，以后每隔３ｄ换液直至细胞完全融合。
待细胞长满后用含ＥＤＴＡ的０．２５％胰酶消化细胞按１∶２传代，传至第３代后进行细胞鉴定。