EV71抗原BA_ELISA检测方法的建立及应用
elisa检测抗原的方法和原理
elisa检测抗原的方法和原理Elisa检测抗原的方法和原理Elisa（酶联免疫吸附试验）是一种常用的生物化学分析方法，用于检测和量化样品中存在的抗原物质。
本文将由浅入深地介绍Elisa 检测抗原的方法和原理。
1. 什么是ElisaElisa是一种特异性、敏感性较高的免疫学检测方法，广泛应用于医学、生物学和生命科学研究领域。
它利用抗原和抗体之间的特异性结合反应，通过酶和底物的反应生成可见的颜色或荧光信号，从而实现对抗原物质的检测和定量。
2. Elisa检测方法Elisa检测方法主要分为四个步骤：涂覆、孵育、洗涤和检测。
涂覆在一片试验板或微孔板的孔中，将需要检测的抗原分子或抗体分子吸附在表面上，形成涂层。
一般采用多孔板，每个孔都对应一种待检测的物质。
涂层的材料可以是抗原、抗体或其他可与待检测物质特异结合的生物分子。
孵育将待检测样品或已知浓度的标准样品加入到涂覆好的孔中，使待检测物质与已涂覆的抗原或抗体结合。
样品与抗原或抗体发生特异性结合是Elisa方法的核心步骤，关系到试验的准确性和灵敏度。
洗涤通过洗涤步骤去除未与抗原或抗体结合的物质，以减少非特异结合引起的干扰。
洗涤可以使用缓冲液或其他溶液进行多次重复的洗涤步骤，以确保洗掉非特异性结合物质。
检测在经过洗涤步骤后，加入与目标物质特异性结合的检测抗体，将其与已结合的物质结合。
检测抗体上常附带有酶标记物质，如辣根过氧化物酶（HRP）。
加入底物后，酶标记物质催化反应，产生可见的颜色或荧光信号。
3. Elisa检测原理Elisa检测原理基于抗原与抗体之间的特异性结合，以及酶标记物质的催化作用。
Elisa方法一般有三种形式：间接Elisa、直接Elisa和竞争性Elisa。
不同形式的Elisa基本原理是一致的，只是在特定的步骤中有所差异。
间接Elisa间接Elisa将抗原吸附到试验板上，待检测样品与吸附的抗原结合，然后加入与目标物质特异性结合的一级抗体。
一级抗体上常附带辣根过氧化物酶等酶标记物质，再加入底物后产生可见的信号。
人封闭抗体(BA)酶联免疫分析(ELISA)试剂盒使用说明书
人封闭抗体（BA）酶联免疫分析（ELISA）试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定人血清，血浆及相关液体样本中封闭抗体（BA）的含量。
实验原理：本试剂盒应用双抗原夹心法测定标本中人封闭抗体（BA）水平。
用纯化的人封闭抗体包被微孔板，制成固相抗原，往包被抗原的微孔中依次加入封闭抗体（BA），再与HRP标记的封闭抗体结合，形成抗原-抗体-酶标抗原复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB 在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的封闭抗体（BA）呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人封闭抗体（BA）浓度。
试剂盒组成：试剂盒组成48孔配置96孔配置保存说明书1份1份封板膜2片（48）2片（96）密封袋1个1个酶标包被板1×481×962-8℃保存标准品：135ng/L0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存标准品稀释液 1.5ml×1瓶 1.5ml×1瓶2-8℃保存酶标试剂 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存样品稀释液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存显色剂A液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存显色剂B液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存终止液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存20倍浓缩洗涤液20ml×1瓶23ml×1瓶2-8℃保存样本处理及要求：1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
抗EV71病毒人源抗体Fab段表达基因的构建及序列分析
单 克 隆 抗 体 库 奠 定 基 础 。 方 法 从 Ｅ Ｖ ７ １病 毒 中和 抗 体 阳性 且 免 疫 功 能健 全 的成 人 全 血 中 ， 分 离 淋 巴细 胞 并 提 取 总 Ｒ ＮＡ， 经
反转录获得 ｅ ＤＮＡ。 用 一 组 人 Ｉ ｇ Ｇ Ｆ ａ ｂ基 因特 异 性 引 物 ， 从合成 的 ｃ Ｄ ＮＡ 中 分 别 扩 增 抗 体 轻 、 重链可 变 区， 应用重 叠 Ｐ Ｃ Ｒ 技 术构建 Ｆ ａ ｂ段表 达 基 因 ， 测 序 分 析 抗 体 基 因 的 多样 性 。结 果 成 功扩 增人 抗体 可 变 区基 因 并 组 装 Ｆ ａ ｂ段 表 达 盒 ， 表 达 盒 的长 度约为 １ ５ ０ ０ ｂ ｐ ， 测序分析结果表 明， Ｆ ａ ｂ段 的 多样 性 可 达 ９ ４ ． １ ２ 。 结 论 成 功 构 建 入 源 抗 体 Ｆ ａ ｂ段 基 因 ， 为抗 Ｅ Ｖ７ １病 毒 人 源 性 单 克 隆抗 体 库 的制 备 奠 定 了基础 。
Ｆ ａ ｈ ｆ ｒ ａ ｇ ｍｅ ｎ ｔ ｓ ａ ｇ ａ ｉ ｎ ｓ ｔ ＥＶ７ １ ．Ｔｏ ｔ ａ ｌ ＲＮＡ ｗａ ｓ ｅ ｘ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ｅ ｄ ｆ ｒ ｏ ｍ ｐ ｅ ｒ ｉ ｐ ｈ ｅ ｒ ａ ｌ ｂ ｌ ｏ ｏ ｄ［ ｙ ｍｐ ｈ ｏ ｃ ｙ ｔ ｅ ｓ ｏ ｆ ａ ｎ ｏ ｒ ｍａ ｌ ａ ｄ ｕ ｌ ｔ ｔ ｈ ａ ｔ ｗａ ｓ ｐ ｏ ｓ ｉ ｔ ｉ ｖ ｅ ｗｉ ｔ ｈ ＥＶ７ １ ｎ ｅ ｕ ｔ ｒ ａ ｌ ｉ ｚ ｉ ｎ ｇ ａ ｎ ｔ ｉ ｂ ｏ ｄ ｙ ．Ｗ ｉ ｔ ｈ ｔ ｈ ｅ ｒ ｅ ｖ ｅ ｒ ｓ ｅ － ｔ ｒ ａ ｎ ｓ ｃ ｒ ｉ ｂ ｅ ｄ ｃ ＤＮＡｓ ａ ｓ ｔ ｅ ｍｐ ｌ ａ ｔ ｅ ｓ 。ｖ ａ ｒ ｉ ａ ｂ ｌ ｅ ｒ ｅ ｇ ｉ ｏ ｎ ｇ ｅ ｎ ｅ ｓ ｏ ｆ ｌ ｉ ｇ ｈ ｔ ａ ｎ ｄ ｈ ｅ ａ ｖ ｙ ｃ ｈ ａ ｉ ｎ ｓ ｗｅ ｒ ｅ ａ ｍｐ ｌ ｉ ｆ ｉ ｅ ｄ ｂ ｙ ｈ ｕ ｍａ ｎ Ｉ ｇ Ｇ ａ ｎ ｔ ｉ ｂ ｏ ｄ ｙ ｐ ｒ ｉ ｍｅ ｒ ｓ ｅ ｔ ｓ ，ａ ｎ ｄ ｔ ｈ ｅ ｅ ｘ ｐ ｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎ ｃ ａ ｓ ｓ ｅ ｔ ｔ ｅ ｓ ｆ ｏ ｒ Ｆａ ｂ ｆ ｒ ａ ｇ ｍｅ ｎ ｔ ｓ ｗｅ ｒ ｅ ｓ ｕ ｂ ｓ ｅ ｑ ｕ ｅ ｎ ｔ ｌ ｙ ｃ ｏ ｎ ｓ ｔ ｒ ｕ ｃ ｔ ｅ ｄ ｂ ｙ ｓ ｐ ｌ ｉ ｃ ｉ ｎ ｇ ｂ ｙ ｏ ｖ ｅ ｒ ｌ ａ ｐ ｅ ｘ ｔ ｅ ｎ ｓ ｉ ｏ ｎ ＰＣ Ｒ （ Ｓ ＯＥ — Ｐ ＣＲ） ．Ｉ ｔ ｗａ ｓ ｉ ｎ ｄ ｉ ｃ ａ ｔ ｅ ｄ ｂ ｙ ｓ ｅ ｑ ｕ ｅ ｎ ｃ ｅ ａ ｎ ａ ｌ ｙ ｓ ｉ ｓ ｏ ｆ ｏ ｂ ｔ ａ ｉ ｎ ｅ ｄ １ ５ ０ ０ ｂ ｐ ａ ｍｐ ｌ —
乙型脑炎病毒ELISA抗原检测方法的建立与应用
乙型脑炎病毒ELISA抗原检测方法的建立与应用梅 力，李么明，陈 龙，朱碧波，叶 静，陈焕春，曹胜波（华中农业大学动物医学院，武汉，430070）摘 要：乙型脑炎（乙脑）是一种严重的人畜共患性疾病，建立一套快速、灵敏并同时可用于多种临床样品中乙脑抗原检测的方法具有重要意义。
本文以乙脑E蛋白单克隆抗体为一抗，以乙脑兔源多克隆抗体为二抗，建立了一种可用于检测猪、人、蚊子中乙脑抗原的双抗体夹心ELISA诊断方法。
实验结果表明，该方法灵敏度高，特异性强，稳定性好，通过对60份临床样品的检测，显示出其与RT-PCR方法具有较高的符合率。
关键词：乙型脑炎病毒；ELISA；抗原乙脑是由乙型脑炎病毒（JEV）引起的一种危害严重的虫媒病毒性疾病，近年来其在东南亚的流行分布范围正在不断扩大。
该病毒主要经过蚊子进行传播，猪是该病毒的扩增宿主和传染源，感染后可引起母猪流产、死胎、木乃伊胎及公猪发生睾丸炎，对公众健康及畜牧业的发展都造成了严重的影响。
迄今，国内外用于乙脑检测的方法可以分为抗原检测和抗体检测两大类。
对抗原的检测主要包括病毒的分离鉴定、分子生物学方法如RT-PCR等。
该类方法检测周期长、操作繁琐、对实验条件要求严格，不适用于临床大规模检测。
针对抗体的诊断方法主要指血清学检测方法，如ELISA、乳胶凝集实验、补体结合试验、血凝抑制试验等，但这些传统的抗体检测方法也仅能用于疫苗免疫效果的评价，不能用于对病毒感染情况的监测。
因而建立一种快速、简便、特异、灵敏的病原检测方法，并能够同时应用于临床患者及感染动物的诊断，就成为了乙型脑炎防治技术研究中的一项重要课题。
已证实，利用乙型脑炎病毒囊膜E蛋白制备的单克隆抗体具有很高的中和活性，它可以与乙型脑炎病毒E蛋白抗原表位发生特异性的结合。
而利用病毒多个抗原表位制备的多克隆抗体则具有结合力更强、反应效果更好的特性，因此，本文利用这两种抗体建立了乙型脑炎双抗体夹心ELISA抗原诊断方法，并可用于猪、蚊子和人的临床样品检测，这将为乙型脑炎的诊断和防治提供有效的工具。
嗜水气单胞菌BA-ELISA的建立及其在病原检测中的应用
嗜水气 单胞 菌 引起 的 中华 鳖病 害 较 为 常 见 ｌ］ 已 Ｓ Ｎ０ ０ 、 豚 链 球 菌 （ ｔｅ ｔ ｏｃ ｓｉｉｅ Ｓ ２ ４。 ｓ ６８ 海 Ｓ ｒｐ ｏ ｃｕ ｎａ ） ０－、 ｃ
经报道 的 ２ 种 中华鳖疾 病 中 ， ５ 由嗜 水气单 胞 菌引起 大肠杆 菌 （ ｃｌ） Ｅ．ｏｉＤＨ５ ａ均为 浙 江 省 淡水 水 产 研 究
测 灵敏 度 为 Ａ ＣＥ Ａ（． ×１ ｃｕ 和 间接 Ｅ Ｓ ４ ０ １ ｃｕ 的 １ Ｂ ＿ Ｉ Ｓ ４ ０ ０ ｆ） Ｉ Ｕ Ａ（ ． × ０ ｆ） ６倍 ； 异 性试 验 结 果 表 明 ， 法 与鱼 特 本
类气单胞菌 、 拟态弧菌 、 海豚链 球菌 、 肠杆菌 等无 交叉反 应 。Ｂ － Ｌ Ｓ 大 Ａ Ｅ ＩＡ可不 经细 菌培养 直接检 测人 工感 染
Ｓ９ ７ １ ４． ２ 文 献标 识 码 Ａ 文 章 编 号 １０—４ １２ ０ ）１０ ８ —６ ０ ０２ ２ （０ ８０ —０ ００ 中 图 法分 类 号
嗜水气单胞菌 （ ｒｍ ｎ ｓ ｙ ｒｐ ｉ ） 气单胞 Ａｅｏ ｏａ ｄ ｏ ｈｌ 属 ｈ ａ 菌科 （ ｅｏ ｏ ａａｅｅ气单胞菌 属（ ｒ ０ ｎ）１， Ａ ｒｍ ｎ ｄｃａ） Ａｅ ” ｓ［ 广 ＿ ］ 动物 的主要致病 菌 ， 也可 引起畜 禽感 染 ， 同时是 重要
暴 发 的主要淡 水养 殖 鱼类 细 菌 性 败 血症 （ 发性 败 大 、 暴 咽喉 腮状 组织 的群 毛 突起 充 血 糜 烂 、 脏肿 大 、 肝 血症 ） 由致 病 性 嗜 水气 单 胞 菌 引 起ｌ 。随 着 中华 胃肠粘 膜 充 血 ， 离 菌 株 对 中 华 鳖 的 致 死 剂 量 为 即 ３ ］ 分 鳖集约 化养殖 规模 的发 展 ， 由气单 胞 菌 引 起 的 中华 ２ ７ ０ ｆ／ ； 水 气 单 胞 菌 （ ｒｍｏ ａ ｙ ． ×１ ｃｕ 只 嗜 Ａｅｏ ｎ ｓｈ — 鳖 疾病 也 日益 成 为 中华 鳖 养殖 的主 要 病 害 ， 中 以 ｄ ｏ ｈｌ ）Ｂ Ｋ一０ 其 ｒｐ ｉ ａ Ｓ １ 、拟 态 弧 菌 （ ｉｒｏ Ｖｂｉ ｍｉｉｕ ） ｎｃｓ
重组肠道病毒71型疫苗(汉逊酵母)抗原冻干参考品的制备及稳定性研究
国际生物制品学杂志2020年丨2月第43卷第6期Im J BiologicaLs，December 2020, Vol. 43, No. 6• 267 ••论著•重组肠道病毒71型疫苗（汉逊酵母)抗原冻干参考品的制备及稳定性研究张改梅陈磊赵丽丽谢学超李国顺肖海峰郭林徐颖之朱芮波刘建凯顾美荣北京民海生物科技有限公司研发中心1〇26()()通信作者：顾美荣，Email: 6088gmr@【摘要】目的制备重组肠道病毒71型(enterovirus71，EV71)疫苗（汉逊酵母）抗原冻干参考品，用于重组EV71疫苗(汉逊酵母)的抗原含量测定。
方法选取检定合格的重组EV71疫苗（汉逊酵母）原液.加人冻干保护剂，冷冻干燥制备重组EV71疫苗（汉逊酵母)抗原冻干参考品，对其进行保护剂抗原含量标定，并对其进行反复冻融试验，37 t、2〜8 X；和-20X；稳定性研究。
结果制备的抗原冻干参考品鉴别试验、无菌检査结果均符合规定，水分含量为1. 4%。
经标定，抗原含量的几何均值为2 146 U/ml,几何变异系数为7.2%。
10次反复冻融，抗原含量仍无明显变化;37 t放置3个月，抗原含量无明显变化;分别于2〜8 T：和-20C放置3<)个月，抗原含量仍较为稳定。
结论制备了一批稳定的、均一性良好的抗原冻干参考品，可以用于重组EV71型疫苗(汉逊酵母)抗原含量测定。
【关键词】肠道病毒71型；疫苗,合成；抗原参考品；稳定性D0I：10. 3760/cma. j. cn311962-20200831-00085Preparation and stability of freeze-dried recombinant enterovirus 71 vaccine (Hansenula)antigen referenceZhang Gaimei，Chen L ei，Zhao L ili, Xie Xuechao，Li Guoshun ♦Xiao H a ifen g，Guo L in, XuYingzhi, Zhu Ruibo, Liu Jiankai, Gu MeirongCenter o f Research and Development，Beijing Minhai Biotechnology Co.，L td.，Beijing 102600，ChinaCorresponding author ：Gu Meirong 9Email：****************【Abstract】Objective To prepare a lyophilized reference antigen of recombinant enterovirus 71(EV71) vaccine (Hansenula) for the determination of antigen content of recombinant EV71 vaccine{Hansenula).Methods Bulk of qualified recombinant EV71 vaccine (Hansenula)was selected as theraw material of reference, adding freeze-dried protective agent, then lyophilized to prepared freeze-driedrecombinant EV71 (Hansenula) vaccine antigen reference, after the calibration on the antigen content,the reference was carried on the freeze-thaw test, stored at 37 °C, 2-8 °C and _ 20 °C for the stabilitystudy. Results All the quality indexes of prepared reference met the relevant requirements, and themoisture content was 1. 4%. After calibration, geometry mean of reference antigen content was2 146 U/ml and geometric variation coefficient was 1.2%.There was no significant change in antigencontent after repeated freezing and thawing for 10 times. There was no significant change in antigencontent for 3 months at 37 °C. The antigen content remained stable at 2-8 and ~ 20 °C for 30 months,respectively. Conclusion A batch of stable and homogeneous reference antigens were prepared, whichcould be applied for the determination of antigen content in recombinant EV71 vaccine {Hansenula).【Keywords】Enterovirus 71; Vaccine，synthetic; Antigen reference; StabilityDOI ：10. 3760/cma. j. cn311962-20200831 -00085手足 口病（hand，foot,and mouth disease, HFMD)是一种由多种肠道病毒引起的传染性疾病，常见于5岁以下婴幼儿[14]。
ELISA法检测肠道病毒EV71抗体临床应用
神经系统疾 病 ， 甚至危及生命 。 本研究 采用 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ法 检测 了 ８ ６例手足 口病 患者血清 中 的Ｅ Ｖ ７ １ － Ｉ ｇ Ｍ 抗体 ， ７ ４例 阳性 ， 阳性率 ８ ６ ． １ ％ ，＜３岁 占 ７ ２ ． １ ％， 与文献报道相 近… ， ５例 重症 患儿 Ｅ Ｖ ７ １ － Ｉ ｇ Ｍ抗 体均 为阳性 。 发病第 １～ ２天检测率为 ７ ５ ％， 其余 ３—７天检 测率都在 ８ ４ ％ 以上 ， 可能与发病第 １ —２天 的病例少 有关 ， 发病 Ｉ周 内 血清 Ｅ Ｖ ７ １ － Ｉ ｇ Ｍ都在很 高 的水平 ， 一 周 内的抗 体水 平与 发病 天数差异无 统计 学意义。 目前 临床上 对 Ｅ Ｖ ７ １ 型手足 口病实验 室诊断主要 采用对
病原的核酸检 测 和对血 清 的 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ两种 方法 。核 酸法 对技 术 和设施条 件要求 高 、 操 作时 间长、 成本 高 ， 对 标本采集 和运 输保存要求 较高 ， 往往 因标本采集种类 、 采集方法 和运输保存 不当导致假 阴性 ， 不适合基层 医疗机构 的初筛 ， 不利于对婴幼 儿 特别 是重 症患 儿 的早发 现和早 治疗 。Ｅ ｖ ７ １ ． Ｉ ｇ Ｍ Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ法 操 作速度快 ， 技术和设施 条件要 求不高 ， 成本低 ， 标本要 求简 单， 敏感 性强 、 特 异性好 ， 临床应用 优于核 酸法 ］ ， 适合 绝大 多数基层 医疗机构检测 ， 可满足基层防控第一线的需求 ， 利于 肠 道病毒 Ｅ Ｖ ７ １型感 染的早 发现 、 Ｈ Ｆ ＭＤ的早治疗 和及 时 防 控， 特别是为重症患儿的发现和治疗赢得了时间 。
肠道病毒71型(EV71)的检测
肠道病毒71型（EV71）的检测作者：张宪华来源：《中国现代医生》2015年第20期[摘要] 目的探讨肠道病毒71型（EV71）的检测方法。
方法采用酶联免疫法（ELISA 法）、免疫胶体金法（胶体金法）、荧光定量PCR法（PCR法）对1399例手足口病患儿的样本进行检测，并对检测结果进行卡方检验。
结果 1399例手足口病患儿样本ELISA法、金标法、PCR法结果的阳性率分别为37.8%、36.0%、39.8%，三种方法检验结果无显著性差异（χ2=4.197，P>0.05）。
ELISA法与胶体金法及PCR法结果比较均无显著性差异（χ2=0.959，P>0.05；χ2=1.180，P>0.05）；胶体金法与PCR法两者之间差异有统计学意义（χ2=4.26，P[关键词] 肠道病毒；EV71；胶体金法； ELISA；PCR[中图分类号] R446.6；R450 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2015）20-0093-03Detection of enterovirus 71 （EV71）ZHANG XianhuaLaboratory Department， the Fifth People's Hospital of Anyang City in He'nan Province，Anyang 455000， China[Abstract] Objective To investigate the enterovirus 71 （EV71） detection methods. Methods Samples from 1399 children with hand， foot and mouth disease were detected by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）， immune colloidal gold method （colloidal gold method） and fluorescence quantitative PCR method （PCR method）， and the chi-square test was conducted on these detention results. Results The positive rates of samples from 1399 children with hand， foot and mouth disease by the ELISA method， the gold standard method and the PCR method were 37.8%，36.0% and 39.8%， respectively， without significant difference（χ2=4.197， P>0.05）. The colloidal gold method and the PCR method had no significant differences （χ2=0.959， P>0.05；χ2=1.180， P> 0.05）. The colloidal gold method and the PCR method， had significant difference between the two methods （χ2=4.26， P[Key words] Enterovirus； EV71； Colloidal gold method； ELISA； PCR肠道病毒71型（EV71）是一类常见的经呼吸道和消化道感染人体的病毒。
胶体金法和ELISA法联合检测手足口病肠道病毒71型-最新年文档
胶体金法和ELISA法联合检测手足口病肠道病毒71型手足口病（HFMD）是一种由多种肠道病毒感染引起的儿童常见的传染性疾病，传染性强，在世界范围内包括我国多省市都出现过多次暴发与流行。
鉴于我国目前手足口病发病的严峻形势，2008年5月HFMD被列入法定丙类传染病，要求各级卫生部门做到早发现、早报告、早隔离、早治疗。
引发手足口病的肠道病毒有20多种，其中以柯萨奇病毒A16型（CAl6）和肠道病毒71型（EV71）最为常见。
与其他肠道病毒引起的手足口病相比，由EV71型感染引起的疾病发生重症比例较大，病死率较高，且最易导致流行。
国内的数次暴发流行经卫生部证实均为EV7l引起的[1]。
我院每年收治手足口病患儿数百例。
为贯彻落实省政府要求的“四早”措施，建立手足口病流行动态监测与应急性检测方法具有非常重要的意义。
对EV71的早期诊断、早期治疗成为治愈该病的关键。
我科同时采用胶体金法和ELISA法检测EV71型病毒IgM抗体，结合两者优势，能够快速、准确的检测EV71型病毒。
1 材料与方法1.1 一般资料患者为我院儿科2012年3月至2013年3月收治的疑似HFMD 患者，男132例，女89例，年龄4月～12岁。
1.2 试剂与方法试剂由北京万泰生物药业XX公司生产：胶体金法（国食药监械（准）字2011第3401197号，京药监械生产许20040097号）；ELISA法（国食药监械（准）字2010第3400526号，京药监械生产许20040097号）。
标本为患者静脉血2mL，肝素钠抗凝。
当日标本采用胶体金法进行快速检测，检测完标本保存，第二日再采用ELISA法集中批量检测，操作均按试剂盒要求严格进行检测。
1.3 统计学分析采用Spss 19.0统计软件进行数据处理。
2 结果同时采用胶体金法和ELISA法检测EV71型病毒IgM抗体，胶体金法阳性率为27.15%（60/221），ELISA法阳性率28.05%（62/221），共同阳性标本60例，总符合率96.79% ，Kappa值为0.92。
EV71人源化特异性单克隆抗体分泌细胞筛选方法的建立及优化的开题报告
EV71人源化特异性单克隆抗体分泌细胞筛选方法的建立及优化的开题报告题目：EV71人源化特异性单克隆抗体分泌细胞筛选方法的建立及优化一、研究背景与意义肠道病毒71型（EV71）是一种致病性较强的RNA病毒，主要引起手足口病和脑炎等疾病，并在亚洲地区引发了较多的疫情。
目前尚无特效的治疗手段和预防疫苗，因此开发特异性、高效的EV71抗体对于疫情的应对和预防具有重要的意义。
单克隆抗体（mAb）是一种广泛应用于生物医学领域的分子工具，具有高特异性、高亲和力和高稳定性等优点，在免疫治疗、诊断、药物研发等方面有广泛应用。
目前，通过抗原免疫小鼠或兔子，然后通过细胞融合技术筛选出具有特异性的单克隆抗体是一种主要的制备方法。
但是，由于小鼠抗体在人体中会产生免疫原性反应，因此相对较为安全和经济的制备途径是通过人源化技术制备出特异性的单克隆抗体，这种制备方法成为了研究重点。
二、研究内容本项目旨在建立EV71人源化特异性单克隆抗体分泌细胞筛选方法的优化，主要包括以下研究内容：1. 筛选克隆细胞株在进行制备EV71特异性单克隆抗体的过程中，首先要从单克隆细胞株中筛选出具有较好的分泌效率和稳定性的细胞。
本项目将通过筛选、鉴定和优化不同细胞系，最终确定一种适合生产特异性EV71单克隆抗体的细胞系。
2. 优化培养条件在细胞培养的过程中，培养条件的优化对细胞的生长、分泌情况和抗体产量等有很大的影响，本研究将通过优化培养条件，达到提高细胞生长速度和细胞分泌抗体产量的目的。
3. 抗体筛选方法的建立与优化对于制备出的EV71特异性单克隆抗体，需要进行抗体筛选。
本项目将利用细胞分泌抗体的特性，建立快速、可靠的EV71特异性单克隆抗体筛选方法，以提高抗体纯度和稳定性。
三、研究方法1. 筛选克隆细胞株：利用单克隆细胞技术建立EV71特异性单克隆抗体细胞株，对不同细胞系进行筛选、鉴定和优化，最终确定适合生产的细胞系。
2. 优化培养条件：通过对细胞培养基的配方、温度、CO2浓度、培养周期、通气等培养条件的优化，调节细胞生长和抗体产量。
EV71型肠道病毒抗体的制备与鉴定的开题报告
EV71型肠道病毒抗体的制备与鉴定的开题报告1. 研究背景和意义EV71型肠道病毒（Enterovirus 71，简称EV71）是一种可引起手足口病、脑炎、肌肉无力等多种感染疾病的病毒。
在近年来的全球范围内，EV71感染病例逐年增多，已引起各国重视。
疫苗是预防EV71感染的最有效方法之一，本研究旨在制备EV71型肠道病毒抗体，为疫苗及其他相关药物的研发提供帮助。
2. 研究目的本研究旨在制备EV71型肠道病毒抗体，并通过鉴定其活性、特异性和稳定性等指标，为实现EV71相关病毒疫苗等药物的开发提供科学依据和技术支持。
3. 研究方法3.1 EV71毒株的制备采用EV71标准毒株作为病毒源，通过传代培养的方式在Vero细胞上进行扩增。
经过多次传代和检测，获得纯化的EV71毒株。
3.2 制备EV71型肠道病毒抗体将EV71毒株接种于动物（如小鼠、兔子等）体内，经过一定时间的免疫刺激，收集其血清并提取其中的抗体。
通过亲和层析、凝胶过滤、薄层扩散等技术，对抗体进行分离和纯化，得到EV71型肠道病毒抗体。
3.3 抗体鉴定对制备的EV71型肠道病毒抗体进行活性、特异性和稳定性等方面的鉴定。
其中，活性鉴定包括中和试验、免疫荧光试验等；特异性鉴定包括Western Blot检测、ELISA检测等；稳定性鉴定则包括制备抗体的贮存条件、冷冻条件等方面的监测。
4. 研究预期成果通过本研究，预计可成功制备EV71型肠道病毒抗体，并通过鉴定其活性、特异性和稳定性等指标，为疫苗及其他相关药物的研发提供技术支持和科学依据。
同时，本研究可为深入探究EV71病毒感染机制及其病理生理学特性等方面提供重要的实验数据和方法基础。
EV71人源基因工程抗体的制备及鉴定的开题报告
EV71人源基因工程抗体的制备及鉴定的开题报告本文将介绍EV71人源基因工程抗体的制备及鉴定方案。
EV71属于肠道病毒，是感染儿童的主要病原体之一，其主要症状为手足口病。
因此，制备与鉴定针对EV71的高效抗体将对研究EV71的发病机制及治疗方法具有重要意义。
一、实验目的1. 制备人源EV71基因工程抗体；2. 鉴定抗体的特异性和亲和力；3. 验证抗体的应用价值。
二、实验步骤1. 获得EV71VP1基因的全长序列并进行合成。
2. 将EV71VP1基因组插入pET28a(+)载体中，获取重组融合蛋白表达质粒。
3. 使用大肠杆菌表达系统在大规模培养条件下表达出重组融合蛋白。
4. 纯化重组蛋白，并使用Western blot鉴定重组蛋白。
5. 制备基因工程抗体，包括对重组蛋白的免疫和抗体的纯化及检测。
6. 鉴定抗体的特异性和亲和力，包括Western blot、ELISA、免疫荧光等方法。
7. 验证抗体的应用价值，包括用于免疫组织化学、免疫细胞化学和免疫印迹等应用领域。
三、实验结果及讨论本研究成功地制备了人源EV71基因工程抗体，并对其特异性和亲和力进行了鉴定。
实验结果表明，制备的抗体具有较好的特异性和亲和力。
其应用价值主要体现在免疫组织化学、免疫细胞化学和免疫印迹等领域。
在研究EV71的发病机制及治疗方法中，该抗体将发挥重要的作用。
四、实验总结制备和鉴定人源EV71基因工程抗体的实验是一项很有意义也很有挑战性的工作。
本研究成功制备了高效的抗体，并对其特异性和亲和力进行了鉴定。
该抗体的应用将在EV71研究领域发挥重要的作用。
肠道病毒71抗原ELISA检测方法构建及其应用
肠道病毒71抗原ELISA检测方法构建及其应用韩金乐;贾继宗;李川;杨亮;何德磊;李娟;由鹏飞;叶祥忠;李益民【期刊名称】《中华微生物学和免疫学杂志》【年(卷),期】2011(031)011【摘要】Objective To develop an ELISA method for quantitative determination of enterovirus 71 (EV71) antigen.The method can be applied to detect EV71 antigen contents and analyze the correlation between immunogenicity and immunoprotection.It also can be used for tissue culture infective dose( TCID50 ) assay.Methods A double antibody sandwich ELISA method was developed for quantitative determination of EV71 antigen on the basis of the high-affinity neutralizing monoclonal antibodies ( K8G2 and Y8H2-HRP).This method was compared with microscopic observation for the detection of EV71 TCID50.The correlation was analyzed between the specific activity of EV71 antigen and the EV71 neutralizing antibody titer in immune serum.Results The linear range of this method was 0.125-4.0 U/ml and the R2 value was 0.9911.The reagent did not react with other antigens except EV71 antigen.The recovery ratio of this method was 0.89-1.16.The coefficient of variation was less than 15％.The heat recovery rate was above 85％when the reagent was in 37℃ for 9 days.There was a good correlation in TCID50 of EV71 between this method and microscopic observation,r=0.990.The specific activity of EV71 antigen had positive correlation with the neutralization titer of immuneserum in 21 EV71 strains,r=0.930.Conclusion The quantitative ELISA method for EV71 antigen was developed,which could be used to detect EV71 antigen contents and analyze TCID50.The specific activity of EV71 antigen detected by the method could be used to evaluate the immunoprotection of the vaccine potency test.%目的建立肠道病毒71型(EV71)抗原的ELISA检测方法.用于EV71的抗原定量、TCID50试验及EV71免疫原性与免疫保护性的关系分析.方法以高亲和力的EV71中和单抗K8G2和Y8H2-HRP构建检测EV71抗原的双抗体夹心ELISA方法.比较本方法与显微镜观察法检测的EV71 TCID50.分析EV71抗原的特异比活与免疫血清中和抗体水平的关系.结果本试剂定量检测抗原的线性范围为0.125 ～4.0 U/ml,R2 =0.9911,试剂不与EV71之外的受试物反应,试剂的回收率为0.89 ～ 1.16,变异系数小于15％,37℃9 d的热回收率大于85％.本法与显微镜观察法检测的EV71 TCID50的相关系数r=0.990.21株EV71抗原的特异比活与免疫血清中和抗体水平的相关系数r=0.930.结论构建了EV71抗原ELISA检测试剂,可用于EV71的抗原含量检测、TCID50分析,为特异比活与免疫血清中和性关系研究提供了一些有价值的信息.【总页数】4页(P1031-1034)【作者】韩金乐;贾继宗;李川;杨亮;何德磊;李娟;由鹏飞;叶祥忠;李益民【作者单位】102206 北京万泰生物药业股份有限公司研发中心;102206 北京万泰生物药业股份有限公司研发中心;厦门大学生命科学学院国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心;102206 北京万泰生物药业股份有限公司研发中心;厦门大学生命科学学院国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心;102206 北京万泰生物药业股份有限公司研发中心;102206 北京万泰生物药业股份有限公司研发中心;102206 北京万泰生物药业股份有限公司研发中心;102206 北京万泰生物药业股份有限公司研发中心【正文语种】中文【相关文献】1.鸡传染性法氏囊病毒抗原捕获ELISA检测方法的建立及应用2.肺炎衣原体ELISA 抗原检测方法的建立和应用3.结核分枝杆菌抗体双抗原夹心ELISA检测方法的建立及初步应用4.猪瘟病毒E2蛋白主要抗原区的原核表达及其间接ELISA检测方法的建立与应用5.应用禽呼肠孤病毒σ_3融合蛋白为抗原的ELISA检测方法的建立因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
BA—DOT—ELISA方法的建立及其在空肠弯曲菌鉴定上的应用
BA—DOT—ELISA方法的建立及其在空肠弯曲菌鉴定上的应用韩文瑜;黎诚跃【期刊名称】《动物检疫》【年(卷),期】1990(000)003【摘要】通过对实验条件的筛选,建立了BA—DOT—ELISA的工作程序。
在该程序中,应用抗空肠弯曲菌共同抗原的单克隆抗体,对空肠弯曲菌进行了鉴定。
本方法具有较强的特异性。
在参试的15种其它细菌中,除与幽门弯曲菌出现弱阳性反应外,与其它细菌均为阴性反应。
其敏感性可达1.6×10~5cell/ml。
对不同地区、不同来源的148株空弯菌进行鉴定,结果均为阳性反应,与常规鉴定法的结果一致。
这为空肠弯曲菌的鉴定提供了一种特异、敏感、快速的方法。
DOT—ELISA是近几年发展起来的一项新技术,具有简便、经济、不需要特殊仪器、结果可长期保存的优点,自八十年代初期问世以来,已得到较广泛的应用。
将生物素一亲和素(BA)系统引入酶联免疫吸附试验,提高了ELISA的敏感性,但在DOT—ELISA中的应用效果如何,尚有待探讨。
本研究应用抗空肠弯曲菌共同抗原的单克隆抗体和BA系统,建立了BA—DOT—ELISA的工作程序,并应用这种方法对空肠弯曲菌进行快速鉴定,取得了较满意的结果,现简要报告如。
【总页数】3页(P13-15)【作者】韩文瑜;黎诚跃【作者单位】不详;不详【正文语种】中文【中图分类】S852.6【相关文献】1.检测新城疫抗体的Dot-ELISA方法的建立及其与HI方法的比较研究 [J], 黄艳艳;胡北侠;张秀美;沈志勇;刘玉庆;黄庆华;李俊2.McAb-Dot-ELISA对空肠弯曲菌快速鉴定的研究 [J], 韩文瑜3.检测EDS76病毒抗体Dot—ELISA方法建立的及应用 [J], 王雪敏;蔡宝祥4.空肠弯曲菌PEB1A蛋白的原核表达及间接ELISA方法的建立 [J], 王莉;沙洲;李诗语;梁佳茗;王兴龙5.快速检测致病性副溶血弧菌的Dot-ELISA方法的建立 [J], 王艳;何再平;黄忠荣;张磊萍;王权;蒋蔚因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
荧光恒温扩增技术检测肠道病毒71型方法的建立与评价
荧光恒温扩增技术检测肠道病毒71型方法的建立与评价曹凌峰;苏犁云;董妞妞;徐锦【期刊名称】《检验医学》【年(卷),期】2014(000)011【摘要】目的：利用荧光恒温扩增（SAT）技术建立一种快速可靠的肠道病毒71型（EV71）检测方法。
方法通过设计特异性的 EV71 RNA 扩增引物及优化探针技术，使用 M-MLV 反转录酶及 T7 RNA 多聚酶对 EV71 RNA进行核酸扩增，同时利用荧光定量聚合酶链反应（PCR）仪进行实时的荧光信号收集和检测。
检测复旦大学附属儿科医院儿童手足口病患儿粪便样本199例，以 EV71型核酸检测试剂盒作参比方法，DNA 测序为第三方验证方法，对研究数据进行 Kappa 一致性分析。
结果SAT 技术共检测到119例 EV71阳性样本，其中21例荧光探针法检测为阴性，经测序证实20例样本仍为阳性。
SAT 与荧光探针法检测结果的 Kappa 值为0．789。
SAT 方法的敏感性100％、特异性98．77％。
结论本研究建立的EV71型 RNA SAT 技术具有敏感性高、特异性强、准确、快速可靠等优点，适用于临床对 EV71感染的快速诊断。
【总页数】5页(P1115-1119)【作者】曹凌峰;苏犁云;董妞妞;徐锦【作者单位】复旦大学附属儿科医院临床检验中心，上海 201102;复旦大学附属儿科医院临床检验中心，上海 201102;复旦大学附属儿科医院临床检验中心，上海 201102;复旦大学附属儿科医院临床检验中心，上海 201102【正文语种】中文【中图分类】R446.1【相关文献】1.荧光环介导恒温扩增技术检测嗜肺军团菌方法的建立 [J], 李辉腾;郭旭光;陈瑞娟;柯茂彬2.荧光恒温扩增技术检测单纯疱疹病毒Ⅰ型 RNA 方法的建立 [J], 曹凌峰;苏犁云;施鹏;董妞妞;徐锦3.实时荧光环介导恒温扩增技术检测嗜麦芽窄食单胞菌方法的建立 [J], 郭旭光;黄美淦;刘庆锋;何淑君;吴健健;夏勇4.环介导恒温扩增技术快速检测幽门螺杆菌方法的建立及评价 [J], 齐诗蕊;陈俊;李环;栾哲;李丛勇;王聪;袁静;孙刚5.实时荧光环介导恒温扩增技术检测布鲁菌方法的建立与评价 [J], 郄春花;刘晔华;刘亚敏;李颖;崔军文因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
手足口病（Hand -foot -mouth disease ，HFMD ）是一种主要由肠道病毒71型（Enterovirus 71，EV71）或柯萨奇病毒A16型（Coxsackievirus A16，Cox A16）感染导致的流行性疾病，两种病毒常相伴造成手足口病的暴发流行，每次流行中两种病毒所占比例有所不同［1］。
感染后临床表现多样，从隐形感染、普通手足口病到中枢神经系统感染等重症，部分重症患者病情进展较快，甚至死亡。
患者主要为学龄前儿童，尤以3岁以下儿童发病率高。
与其他肠道病毒引起的手足口病相比，由EV71感染引起的疾病发生重症感染的比例相对较高。
同时，由于肠道病毒传染性强，易引起暴发或流行［2］。
2008年3～5月，在我国安徽省阜阳市出现了手足口病暴发流行，短短3个月内死亡数十例。
2008年，中国大陆共报告手足口病489073例，死亡126例［3］。
2008年5月，该病被纳入丙类传染病管理［4］。
2009年3～9月，我国手足口病发病人数高达962362例，死亡314例［5］，比上一年度增加1倍以上。
加强对EV71感染的防控，已成为我国病毒性传染病管理工作的目标之一。
而相关疫苗的开发及病毒抗原快速检测试剂盒的研制则是预防控制该病的关键。
本研究基于生物素-亲和素系统（Biotin -avidin sys －tem ，BAS ），建立了检测EV71抗原的BA -ELISA 方法，并进行了验证及初步应用，为临床检验及抗原分析提供了参考。
基金项目：国家科技重大专项———艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治“传染病新型疫苗研制”（2008ZX10004-014）.作者单位：中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所（昆明650118）.通讯作者：李琦涵，E -mail ：liqihan@ 中国图书分类号R373.2R392-33文献标识码A 文章编号1004-5503（2009）12-1230-03【实验技术】EV71抗原BA -ELISA 检测方法的建立及应用龙润乡谢忠平杨蓉李华白惠株董承红刘龙丁李琦涵【摘要】目的建立EV71抗原生物素-亲和素酶联免疫（BA -ELISA ）检测方法，并进行验证及初步应用。
方法以抗EV71抗体为包被抗体，利用生物素-亲和素系统建立双抗体夹心ELISA 法，并对其灵敏度、特异性、准确性及精密性进行验证。
采用该方法检测组织培养及临床样品中EV71抗原的含量。
结果所建立的BA -ELISA 法在EV71蛋白含量625～156.25ng ／ml 之间线性关系最佳，R 2达0.9976，灵敏度为78.125～156.25ng ；与包括Cox A16在内的42种肠道病毒及相关病毒均无交叉反应；检测10份EV71阳性样品和10份阴性样品，结果符合率均为100%；检测EV71原液和高、中浓度样品的变异系数分别为3.09%、6.69%和6.43％；可检出约103～104CCID 50的活病毒及手足口病患者的大便悬液和部分咽拭子悬液中的病毒。
结论用生物素标记EV71抗体与亲和素系统建立的双抗体夹心ELISA 法具有较高的特异性、灵敏度、准确性和精密性，为临床检验及抗原分析提供了参考。
【关键词】手足口病；EV71抗原；酶联免疫检测法；生物素-亲和素系统Development and Application of BA -ELISA Method for EV71AntigenLONG Run -xiang,XIE Zhong -ping,YANG Rong,et al （Institute of Medical Biology ,Chinese Academy of MedicalSciences and Peking Union Medical College ,Kunming 650118,China ）【Abstract 】ObjectiveTo develop,verify and preliminarily apply a BA -ELISA method for EV71antigen.MethodsA dou －ble antibody sandwich ELISA method was developed based on biotin -avidin system using antibody against EV71as coating antibody,and verified for sensitivity,specificity,accuracy and precision.The EV71antigen contents in tissue culture and clinical samples were determined by the developed method.ResultsThe developed BA -ELISA method showed good linearity at a EV71protein con －tent of 625~156.25ng ／ml,and its R 2value and sensitivity were 0.9976and 78.125~156.25ng respectively.The method showed no cross reactions with 42kinds of enteroviruses and the relevant viruses,including Cox A16.Both the coincidence rates of determination results of 10known EV71positive and 10known EV71negative samples were 100%.The coefficients of determination results of bulk EV71and EV71antigen positive samples at high and moderate concentrations were 3.09%,6.69%and 6.43%re －spectively.The detection limit of live EV71in tissue culture by the developed method was about 103～104CCID 50.The EV71in fe －cal suspension and a part of pharynx swabs of patients with hand -foot -mouth disease were detected by the developed method.Con －clusionThe developed BA -ELISA method showed high specificity,sensitivity,accuracy and precision,which provided a basis forclinical laboratory and antigen analysis of EV71.【Key words 】Hand -foot -mouth disease （HFMD ）;EV71antigen;ELISA;Biotin -avidin system1.材料与方法1.1样品28株肠道病毒株［Echo1～3、Echo5～9、Echo 11～13、Echo15～16、Echo18～26、Echo29～33、EV71国际标准株BrCr株（A基因型）］和9株柯萨奇病毒（Cox A7、Cox A9、Cox A16、Cox B1～B6）均为WHO标准株，由本所（WHO肠道病毒研究参考合作中心）免疫研究室保存；麻疹病毒、EV71FY-23K株组织培养病毒液、手足口病患者的大便悬液及咽拭子悬液均由本所免疫研究室提供；HAV H2株、HAV L8株、PolioⅠ～Ⅲ型病毒分别为本所生产甲型肝炎减毒活疫苗、甲型肝炎灭活疫苗及Polio疫苗用病毒株；临床样品来源于昆明市儿童医院。
1.2主要试剂蛋白A／G亲和纯化柱、生物素和HRP标记的亲和素为PIERCE公司产品。
1.3EV71抗原由本所免疫研究室制备。
系从安徽阜阳手足口病病例样本中分离，经核酸检测确认为EV71FY-23K株，经组织培养、灭活及纯化获得EV71纯化抗原，Lowry法测定蛋白浓度为1.0mg／ml。
1.4抗EV71抗体由本所免疫研究室制备。
系用FY-23K株EV71免疫家兔获得抗EV71血清，中和效价为1∶1000，经蛋白A／G亲和纯化柱纯化，SDS-PAGE显示为单一条带；Lowry法测定纯化抗体的蛋白含量为2.0mg／ml。
1.5生物素标记抗体的制备按生物素使用说明书进行生物素化抗体标记，分装后低温保存备用。
1.6BA-ELISA检测条件的优化采用棋盘滴定法，确定包被抗体和生物素标记抗体的使用浓度，优化EV71抗原的检测程序。
1.7BA-ELISA的验证1.7.1灵敏度检测：将纯化的EV71抗原系列稀释后，用建立的BA-ELISA法进行检测，绘制反应曲线，并确定检测限。
用组织培养法检测EV71活病毒感染性滴度（lgCCID50／ml），同步用建立的BA-ELISA法检测相同样品，分析两者之间的对应关系。
1.7.2特异性检测：用建立的BA-ELISA方法，对44种各型肠道病毒及相关病毒样品（28株肠道病毒株、9株柯萨奇病毒、麻疹病毒、EV71FY-23K株病毒液、HAV H2株、HAV L8株、PolioⅠ～Ⅲ型病毒）进行检测，验证该方法的特异性。
1.7.3准确性检测：用建立的BA-ELISA法检测包括EV71FY-23K株、EV71国际标准株BrCr株和临床样品在内的10份EV71阳性样品和包括Cox A16在内的10份EV71阴性样品，验证该方法的准确性。
1.7.4精密性检测：用建立的BA-ELISA法分别检测EV71原液、高浓度及中浓度的EV71抗原阳性样品，每个样品平行检测8孔，计算变异系数，验证该法的精密性。
1.8BA-ELISA的应用用建立的BA-ELISA法检测EV71组织培养病毒液、手足口病患者的大便悬液及咽拭子悬液，并与RT-PCR法及细胞培养分离法（Vero细胞）［6，7］的检测结果进行比较。
2.结果2.1BA-ELISA检测方法的建立经条件优化后,确定包被抗体的使用浓度为20μg／ml，生物素标记抗体的使用浓度为1∶800，检测程序为：待检样品按100μl／孔加入已包被抗EV71抗体的酶标板中，同时设阳性对照和阴性对照各2孔，空白对照1孔，湿盒37℃孵育2h；洗板，加入生物素标记抗体，湿盒37℃孵育1h；洗板，加入HRP标记的亲和素（1∶5000稀释），湿盒37℃孵育30min；洗板，TMB显色10min，终止反应。