淋病奈瑟菌耐药性的分子基础初探

・论著・

作者单位:扬州大学医学院微生物学及免疫学教研室,扬州,225001

淋病奈瑟菌耐药性的分子基础初探

季明春　陈红菊　严　华　申厚凤

[摘要]　目的:　研究染色体介导淋病奈瑟菌耐药的机制。方法:　应用抑制性消减杂交技术构建和筛

选耐药淋病奈瑟菌差异DNA 消减文库。结果:　从削减文库中随机挑取的96个克隆,发现其中有47个

克隆仅能与tester DNA 探针杂交,而不能与driver DNA 探针杂交。结论:　这些克隆中载有特异基因片段,它们为RS M292C4基因组DNA 所特有,可能代表某些淋病奈瑟菌新基因。[关键词]　淋病奈瑟菌;　耐药性;　差异基因

Molecular b ase of antimicrobial resistance of Neisseria Gonorrhoeae

Ji Mingchun ,Chen Hongju ,Yan Hua ,et al .Department o f Microbiology and Immunology ,Yangzhou Univer sity ,Yangzhou 225001

[Abstract ]　Objective :T o study the mechanism of chrom os ome -mediated antimicrobial resistence of Neisseria gon 2orrhoeae (NG ).Methods :Using a technique kn own as suppressive subtractive hybridization to construct and screen the

library which contains the differential genes between antimicrobial resistance strain and standard strain of NG,and then ,the antimicrobial resistance related genes were cloned.R esults :Antimicrobial resistance of NG subtractive library with high subtractive efficiency was set up success fully.T he am plified library contained 2500positive clones.T he 47clones that hybridized only to the subtracted probe were strong candidates for differential genes of antimicrobial resis 2tance NG .Conclusion :T he constructed DNA subtractive library of antimicrobial resistance NGis a highly efficient one and lays s olid foundation for screening and cloning relational genes of drug resistance of NG .[K ey w ords ]　Neisseria gonorrhoeae ;antimicrobial resistence ;genes

淋病奈瑟菌对抗生素曾经十分敏感,由于淋病奈瑟菌的变异和适应,以及抗生素的广泛不规则使用,淋

病奈瑟菌逐步产生对抗生素的耐药性1

。为较全面的探索淋病奈瑟菌对抗生素耐药性的分子基础,我们首先采用抑制性消减杂交技术对淋病奈瑟菌耐药的机制从基因组水平上进行研究。1　材料和方法1.1　细菌菌株　淋病奈瑟菌WH O 标准参考菌株A (WH O -A )和RS M292C4菌株由Hafizah 博士惠赠。RS M292C4菌株为一临床分离耐药菌株,分离自南非德班ST D 诊所就诊的一名重复感染男性急性尿道炎患者。淋病奈瑟菌菌株分离、鉴定的方法按文献方法进行2

。两株淋病奈瑟菌均不产生β-内酰胺酶,不含有质粒,它们的最小抑菌浓度见表1。

表1　细菌菌株及其最小抑菌浓度(MIC ,μg Πml )WH O -A RS M292C4青霉素　0.008>4.0四环素　0.25 4.0头孢曲松<0.00050.004环丙沙星0.01616.0大观霉素

128

256

1.2　主要生化试剂　PCR -Select Bacterial G en ome Subtraction 试剂盒为Clontech 公司产品,Rsa I 等限制性内切酶为R oche 公司产品,p GE M -T easy 线性化质粒载体为Prom oga 公司产品,Megaprimer DNA labelling sys 2

tems 和dCTP -32

P 为Amersham 公司产品。测序采用Pharmarcia Biotech 公司的A LFT M DNA Sequencer 系统。1.3　细菌培养及抗药性测定　细菌株培养采用G C 琼脂平板(Oxiod ,England )含10%Is oVitale X (Becton Dickin 2s on ,C ockeysville ,M D ),37℃6%C O 2培养24小时。抗生

素敏感性实验采用平板稀释法测定最小抑菌浓度(MIC )2。1.4　细菌染色体DNA 的制备　将淋病奈瑟菌菌株转种于G C 琼脂平板,6%C O 2、37℃培养24小时后,收集菌苔于1.5ml 无菌离心管内,以CT AB ΠNaCl 法抽提细

菌染色体DNA ,测定基因组DNA 浓度3

。

1.5　抑制性消减杂交4

　以WH O -A 参考标准菌株基因组DNA 为参照(driver ),RS M292C4菌株基因组DNA 为样本(tester )。(1)基因组DNA 经RsaI 酶切后与两种

接头连接:将样本与参照基因组DNA 2μg 与30单位

Rsa I 及酶切缓冲液组成总体积40μl 反应体系,37℃8小时后,用M inE lute K it 提纯,并溶于5μl 水中。以1.8μl 水稀释1.2μl 样本基因组DNA 后,分为两组,分别

444China J Lepr Skin Dis.Oct 2003,V ol.19,N o.5