菌种与种子扩大培养
(完整版)发酵工艺作业答案
第一章菌种与种子扩大培养1、能源问题是全球面临的问题，生物工程将如何解决？答：利用微生物或酶工程技术从生物体生产生物燃料，主要表现在沼气发酵、酒精发酵、氢燃料的研发、生物柴油等方面，另外在石油开发中，利用微生物作为二次采油、石油精炼等手段也是一定程度上缓解能源问题。
并且利用生物工程技术在能源资源的回收利用等方面也是可行的方法。
2、比较固体培养与液体培养的优缺点。
答：⑴固体培养（曲法培养）特点：酶活力高，但劳动强度大，曲层需翻动。
⑵液体培养特点：培养条件易控制，如温度，pH等，但易染菌，要求无菌。
3、菌种扩大培养的目的和意义是什么？答：目的：为每次发酵罐的投料提供相当数量的、代谢旺盛的种子意义：有利于缩短发酵时间，提高发酵罐的利用率，也有利于减少染菌的机会4、工业生产用菌种的基本要求有什么？答：①培养基原料来源广、廉价；②培养条件易控制；③发酵周期短；④菌株高产；⑤抗病毒（噬菌体）能力强；⑥菌株性状稳定，不易变异退化；⑦菌体本身不能是病原菌；5、种子罐级数的选择取决于那些因素？答：①种子的性质（生长繁殖性能）；②孢子瓶中孢子的密度（密度大则级数少）；③孢子发芽及菌丝繁殖速度；④发酵罐中种子的最低接种量（一般10%）；⑤种子罐与发酵罐的容积比；6、简述加大接种量的优缺点。
答：优点：缩短发酵周期；减少染菌机会；提高设备利用率缺点：种子培养费时；增加级数；代谢废物多7、简述防止菌种衰退的方法。
答：①尽可能满足其营养条件、培养条件，避免有害因素影响；②尽量减少传代次数；③采用幼龄菌种；第二章培养基及其制备1.微生物发酵培养基的碳源主要有哪几种？答：碳酸气、淀粉水解糖、糖蜜、亚硫酸盐纸浆废液等、醋酸、甲醇、乙醇等死哟偶化工产品功能：提供能量、构成菌体、代谢产物的物质基础；2.微生物发酵培养基的氮源主要有哪几种？答：豆饼或蚕蛹水解液、味精废液玉米浆、酒糟水等有机氮尿素、硫酸铵、氨水、硝酸盐等无机氮、气态氮功能：构成菌体、含氮代谢物；3.淀粉的水解方法主要有什么？试进行优缺点比较？答：（1）.酸解法：以酸为催化剂，高温高压转化优点：简单、设备少、时间短缺点：设备易腐蚀、要耐高温高压，有副反应；淀粉粒小、浓度不能太高。
发酵工程(2)第二章 工业微生物菌种的选育与扩大培养
华根霉 ( Rhizopus chinentis )
酿酒所必须的重要霉菌，也是 酸性蛋白酶和腐乳生产中的重要菌 种。
2、毛霉 ( Mucor )
鲁氏毛霉 ( Mucor rouxianus ) 能糖化淀粉且能生成少量酒精；能产生
6、醋酸菌 (Acetobacter)
➢ 不形成芽孢，G－，好气性 ➢ 可生产醋酸.
7、棒状杆菌 (Corynebacterium) ➢ 是谷氨酸和其他氨基酸的高产菌.
8、短杆菌 (Brevibacterium)
氨基酸、核苷酸工业生产中常用的菌种，也是酶法 合成生产辅酶A的菌种.
9、黄单胞菌 (Xanthomonas)
5、假丝酵母 (Candida)
➢能形成假丝，液体培养时能 形成浮膜。 ➢可生产SCP、甘油、脂肪酶。
6、红酵母 (Rhodotorula)
➢有明显的红色或黄色色 素，很多种因生荚膜而形 成粘质状菌落。 ➢可由菌体提取大量脂肪、 -胡萝卜素。
7、棉病针孢酵母 ( Nematspora gossypii )
2、葡萄汁酵母 (Saccharomyces uvarum)
与酿酒酵母相似，主要的区别在于葡萄汁酵母能发酵 棉子糖和蜜二糖。
3、汉逊酵母 (Hansenula)
此属酵母多能产生乙酸乙酯，从而增加产品的香 味，可用于酿酒和食品工业。
4、球拟酵母 (Toruiopsis)
此属酵母有些种能产生不同比例的甘油、赤藓 糖、阿拉伯糖；有的能利用烃类生产蛋白质。
复筛 不纯 第四次平板分离
第三次菌种保藏
第四次原种斜面
初步工艺条件摸索
再复筛
2021届高中生物竞赛理论辅导课件-微生物学(基础)04生物工业菌种与种子的扩大培养(共89张PPT)
▪ 二、菌种的复壮 ▪ ⑴ 纯种分离 ▪ 菌落纯 ▪ 细胞纯
单核细胞 枯草芽孢杆菌菌落
▪ ⑵ 通过寄主体进行复壮 ▪ 如杀螟杆菌
米曲霉菌落
▪ ⑶ 淘汰已衰退的个体 ▪ 如“5406”菌种
▪ 三、菌种的保藏
分叉中间体
青霉素
▪ (f) 筛选二价金属离子抗性突变株 ▪ (g) 筛选前体或前体结构类似物抗性突变
株 ▪ (h) 筛选自身所产的抗生素抗性突变株
▪ ㈤ 突变基因的表现 ▪ 菌种的发酵产量决定于菌种的遗传特性和
菌种的培养条件 ▪ 例如，诱变处理四环素产生菌得到的突变
株
第四节 生产菌种的改良
▪ 一、常规的杂交育种 ▪ 青霉菌的杂交过程实际上也是青霉菌准性生
2021届
高中生物竞赛理论辅导课件
微生物学
（基础部分）
第四章 生物工业菌种与种子的扩 大培养
第一节 工业生产常用的微生 物及要求 第二节 工业微生物菌种的衰 退、复壮与保藏
第四章 生物工业菌种与种子的扩 大培养
第三节 育 第四节 第五节
工业微生物菌种的选
生产菌种的改良 种子的扩大培养
第一节 工业生产常用的微生物 及要求
▪ ㈣ 筛选的方法 ▪ ⒈ 制定筛选方案 ▪ 整个流程可分为诱变和筛选两部分。 ▪ 筛选过程主要包括传种斜面、菌株保藏和
筛选高产菌株这三项工作。
▪ ⒉ 营养缺陷型的筛选方法 ▪ 比较：营养缺陷型（auxotroph）、原养型
（prototroph）、野生型（wild type） ▪ 比较：基本培养基（MM）、完全培养基
▪ (a) 利用营养缺陷型筛选
6 种子的扩大培养【发酵工程】
C、产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种：
可以用摇瓶液体培养法，孢子接入液体培养基，振荡 培养，获得菌丝体，作为种子。
例如：灰色链霉菌、卡那链霉菌。
D、不产孢子的细菌： 生产上一般采用斜面营养细胞保藏法。 斜面菌种于32C，培养18—24小时，即可移入250 mL
6 种子扩大培养
种子扩大培养概念：
指将保存在砂土管、冷凉干燥管中处休眠状态的生 产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子 耀逐级扩大培养，获得一定数量和质量的纯种过程。
目前发酵灌容积已达几十或几百立方米。如按10 ％的种子计算，就要投入几或几十立方米的种子，要 从试管中的菌种逐级扩大为生产用种子，是一个由实 验室制备到车间生产的过程。其生产方法与条件随不 同的生产品种和菌种种类而异。
MYPG培养基：3克麦芽浸出物，3克酵母浸出物，5克 蛋白胨、10克葡萄糖和20克琼脂于l升水中。
二、生产车间种子制备
种子罐培养原则： 采用易被菌利用的成分，如葡萄糖、玉米桨、磷酸盐
等，同时还需供给足够的无菌空气并不断搅拌，使菌丝体 在培养液中均匀分布，获得相同的培养条件。
接种方法：
孢子悬浮液：一般采用微孔接种法。 摇瓶菌丝体种子：可在火焰保护下接入种子罐或采用压 差法接入。 种子罐之间或发酵罐间的移种：主要采用压差法，由种 子接种管道进行移种，移种过程中要防止接受罐表压降 至零，否则会引起染菌。
1、生长快的细菌，种子用量少，种子罐相应也少。
例如：谷氨酸生产中，茄子瓶种子接入种子罐子 32C培养7一10小时，即可按入发酵罐作为种子，这称为 一级种子罐扩大培养，也称二级发酵。
2、生长较慢的菌种，种子用量大，种子罐相应也多。
菌种和扩大培养
过短：菌种数量不够，适应能力弱，生长 慢，发酵时间长，引起污染
（2）种量 接种种子量与发酵液比1:10左右,较大，长
得快，发酵周期短，开始占优势，不易 染杂菌，但不能过大，也不能过小
接种பைடு நூலகம்过大： 菌繁殖过快，营养成份消耗过快，供氧不足，
菌体生长不好，代谢产物下降 接种量过小： 生长繁殖速度慢，易染菌 接种量大小决定于种子生长、繁殖速度 细菌，繁殖快，接种量小 1％－10％ 霉菌、放线菌繁殖慢，接种量大7％－15％ 酵母菌两者之间，通风快，不通风慢，10％
子悬浮液→一级种子罐→发酵罐发酵
三、种子扩大培养旳质量要求
1、种子要纯粹，无杂菌和噬菌体 2、种子要壮
GA菌 V型分裂要多，整齐，代谢旺盛活力强 酒精 酵母要呈圆形或椭圆形，饱满，耗糖快，
出芽率20％以上，染色率1％下列，霉菌孢子 要丰满，色正常
3、要有足够旳菌数 GA生产 104 －109 个/ml O.D净增0.－0.5 酒精 0.8－1亿个
思索题
1、什么是发酵工程，应用范围有哪些？ 2、了解EMP TCA DCA 3、什么是烈性噬菌体，温和噬菌体，敏
感性细菌，溶原性细菌 4、双层琼脂法检验噬菌体 5、微生物工业对菌种有何要求？ 6、怎样预防菌种衰退？ 7、了解种子培养工艺过程。 8、影响种子质量旳原因有哪些？
静置培养——厌氧性微生物、酒精、乳酸 发酵
液体培养：摇瓶培养－种子三角瓶 深层通风培养
浅盘固定培养——米曲 厚层固定培养——厚层通风制曲、酒精、
酱油 载体培养（泡沫型料）——色素（红曲霉）
二、种子培养旳工艺过程
1、菌体接种法——多用于细菌、酵母菌 原菌种→斜面试管培养→液体试管培养→
三角瓶培养→一级种子罐培养→发酵 2、孢子接种法——用于霉菌、放线菌 原菌种→试管斜面培养→茄子瓶培养→孢
种子的扩大培养
培养条件
1）温度
量有较大影响。一般湿度小，生长快；湿度大， 如 ：土霉素生产种子，在高于37℃培养时，孢子接入 生长慢。 不同湿度对龟裂链霉菌（产土霉素）斜面生长的 3）通气量 发酵罐后表现出糖代谢变慢，氨基氮回升提前，菌丝过
2）湿度
影响
温度对多数品种斜面孢子质量有显著影响。温度对多数 微生物的斜面孢子质量有显著影响。温度过低生长缓慢； 温度过高孢子早熟，易老化，接入发酵后就会出现菌丝 对糖、氮利用缓慢，氨基氮回升，发酵产量降低等，甚 制备斜面孢子培养基的湿度对孢子的数量和质 至引起菌丝过早自溶。
发酵级数的确定
一般由菌丝体培养开始计算发酵级数，但有时，工厂从第一级 种子罐开始计算发酵级数。
种子的扩大培养
确定种子罐级数需注意的问题
种子级数越少越好，可简化工艺和控制，减 少染菌机会； 种子级数太少，接种量小，发酵时间延长， 降低发酵罐的生产率，增加染菌机会；
虽然种子罐级数随产物的品种及生产规模而 定。但也与所选用工艺条件有关。如改变种 子罐的培养条件，加速了孢子发芽及菌体的 繁殖，也可相应地减少种子罐的级数。
种子的扩大培养
孢子龄
• 过于年轻的孢子经不起冷藏，过于衰老的孢子 生产能力下降。孢子龄以控制在孢子量多、成 熟、效价正常的阶段为宜。
接种量
接种量过小斜面长出的菌落稀疏，太大则菌落 密度过大。传代用斜面孢子要求菌落稀疏，便 于挑选单个菌落传代；摇瓶或进罐用斜面孢子 要求菌落密度适中或稍密，孢子数达到要求标 准。
种子的扩大培养
移种方式：
种子罐1
②
①
发酵罐1
① ④
③
发酵罐2
种子罐2
1）单种 2）双种 3）倒种 4）混种
种子的扩大培养
菌种的扩大培养
菌种的扩大培养、污染的检测与判别种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质量的纯种过程。
这些纯种培养物称为种子。
微生物工业自从采用纯种发酵以来，产率有了很大的提高，然而防止杂菌污染的要求也更高了。
人们在与杂菌污染的斗争中，积累总结出很多宝贵的经验。
规范了管理措施，设计了一系列设备(例如密闭式发酵罐，培养基灭菌设备，无菌空气制备设备等)和管道，应用了无菌室甚至无菌车间，建立了无菌操作技术，因而大大降低了发酵染菌率。
但是某些发酵工业还遭受着染菌的威胁，染菌后轻者影响产率、产物提取收得率和产品质量，重者造成“倒罐” ，不但浪费大量原材料，造成严重的经济损失，还会对周围环境造成破坏。
凡是在发酵液或发酵容器中侵入了非接种的微生物统称为杂菌污染，及早发现杂菌并采取相应措施，对减少由杂菌污染造成的损失至关重要。
因此检查的方法要求准确、快速。
发酵污染可发生在各个时期。
种子培养期染菌的危害最大，因严格防止。
一旦发现种子染菌，均应灭菌后弃去，并对种子罐及其管道进行彻底灭菌。
发酵前期养分丰富，容易染菌，此时养分消耗不多，应将发酵液补足必要养分后迅速灭菌，并重新接种发酵。
发酵中期染菌不但严重干扰生产菌株的代谢，而且会影响产物的生成，甚至使已形成的产物分解。
由于发酵中期养分已被大量消耗，代谢产物的生成又不是很多，挽救处理比较困难，可考虑加入适量的抗生素或杀菌剂。
如果是发酵后期染菌，此时产物积累已较多，糖等养分已接近耗尽，若染菌不严重，可继续进行发酵;若污染严重，可提钱放罐。
染菌程度越重，危害越大;染菌少，对发酵的影响就小。
所以，实际生产中，应当根据污染程度和发酵时期区别对待。
器材与试剂1.器材高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、带摇床的培养箱、显微镜、天平、三角瓶、试管、移液管、培养皿、接种针、平板涂布器、酒精灯、载玻片2.试剂营养琼脂、葡萄糖、磷酸二氢氨、七水合硫酸镁、氯化钠、磷酸氢二钾、牛肉膏、蛋白胨、0.4%酚红溶液、蒸馏水、番红染液、香柏油、擦镜液3.培养基(1)营养琼脂培养基：直接称量营养琼脂粉4.5g，溶于100mL蒸馏水配制，pH 7.2，分装到试管中，灭菌后摆成斜面。
发酵工程第一章 种子扩大培养
培养温度
❖ 温度过低，菌种生长发育缓慢 ❖ 温度过高会使菌丝过早自溶
在制备土霉素生产种子过程中，高于37℃培养时， 孢子接入发酵罐后表现出糖代谢变慢，氨
基氮回升提前，菌丝过早自溶，效价降低等现象。
❖ 但考虑能否在一定时间内获得优质、足量的 种子以满足发酵的需求
一般由菌丝体培养开始计算发酵级数，但有时， 工厂从第一级种子罐开始计算发酵级数
谷氨酸：三级发酵 一级种子（摇瓶）→二级种子 （小罐）→发酵
青霉素：三级发酵 一级种子 （小罐）→二级种子（中罐）→发酵
发酵级数确定的依据
级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响
高的细胞。为了使细胞迅速进行分裂 或菌丝快速生长。
种子培养基特点
❖ 有较完全和丰富的营养物质，糖分少，需充足 氮源和生长因子，无机氮源比例大； ➢ 各种营养物质的浓度不必太高； ➢ 供孢子用的种子培养基，可添加易被吸收利 用的碳源和氮源；
➢ 应考虑与发酵培养基的主要成分相近。
pH
❖ 选择最适种子培养pH的原则是获得 最大比生长速率和适当的菌量
❖ 丝状微生物不宜剧烈搅拌。
斜面冷藏时间
❖ 对孢子的生产能力有较大影响 ❖ 冷藏时间越长，生产能力下降越多
链霉素生产中，斜面孢子在6℃冷藏两 个月后的发酵单位比冷藏一个月的降低18％， 比冷藏3个月的降低35％。
培养基
❖ 培养种子的目的：
➢ 扩大培养，增加细胞数量； ➢ 同时也必须培养出强壮、健康、活性
种子质量的判断方法
❖ 通常检测的培养液中参数 ➢ pH是否在种子要求的范围之内 ➢ 糖、氨基氮、磷酸盐的含量 ➢ 菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观 ➢ 有无杂菌污染
微生物发酵工艺流程
微生物发酵工艺流程主要包括以下步骤：
1.菌种选择与培养：根据生产需要，选择适合的微生物菌种，并进行培养，以获得大量活菌体。
2.种子扩大培养：将选择的菌种进行扩大培养，以获得足够数量的菌体。
3.发酵原料准备：根据生产需要，准备适量的发酵原料，如葡萄糖、淀粉、蛋白质等。
4.灭菌处理：对发酵原料进行灭菌处理，以消除杂菌和有害微生物。
5.接种与发酵：将培养好的菌种按照一定比例接入灭菌后的原料中，在适宜的发酵条件下进行发酵。
6.产物提取与精制：发酵结束后，通过适当的提取和精制方法，将目标产物从发酵液中提取出来并进行精制。
7.产品质量检测与质量控制：对提取的产物进行质量检测和质量控制，以确保产品质量符合相关标准和客户要求。
8.废水处理：对发酵过程中产生的废水进行处理，以消除有害物质和异味。
以上是微生物发酵工艺流程的一般步骤，具体的工艺流程可能会因不同的微生物、不同的原料和不同的产品而有所差异。
在实际生产中，需要根据具体情况进行选择和调整。
发酵生产的过程及控制
死亡期
2、补料分批培养
在分批培养过程中补入新鲜的料液，以克服营养不足而导致 的发酵过早结束的缺点。 在此过程中只有料液的加入没有料液的取出，所以发酵结束 时发酵液体积比发酵开始时有所增加。在工厂的实际生产中 采用这种方法很多。
简单的过程，培养基中接入菌种以后，没有物料的加入和取出， 除了空气的通入和排气。整个过程中菌的浓度、营养成分的浓 度和产物浓度等参数都随时间变化。
优点： 操作简单，周期短，染菌机会少，生产过程和产品质量 容易掌握 缺点： 产率低，不适于测定动力学数据
分批培养中微生物的生长
迟滞期 对数生长期
稳 定期
发酵级数确定的依据
级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响。
级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一 般2-4级。
在发酵产品的放大中，反应级数的确定是非常重要 的一个方面。
3、接种量的确定
移入种子的体积 接种量＝ —————————
接种后培养液的体积
过大过小都不好，最终以实践定，如大多数抗生素为7-15%。 但是一般认为大一点好。
7 种子的质量标准
• 菌丝形态、菌体浓度和培养基外观（色素、颗粒等）； • pH； • 糖氮代谢速度； • 其它参数,如接种前的抗生素含量、某种酶活等。
8 影响种子质量的因素：
1）原材料的质量:
一般选择一些有利于孢子发芽和菌丝生长的培养基，在营养 上容易被菌体直接吸收利用，营养成分要适当地丰富和完全， 氮源和维生素含量较高，这样可以使菌丝粗壮，并且具有较 强的活力。
另一方面，种子培养基中的营养成分要尽可能和发酵培养基 接近以适合发酵的需要，这样的种子移入发酵罐后能比较容 易适应发酵罐的培养条件如微量元素Mg、Ca、Ba能刺激孢子 的生长。 2）、培养温度：过低？过高？
菌种扩大培养技术
谷氨酸菌斜面
赖氨酸菌斜面
与
三角瓶培养
三角瓶培养
菌
种
特
30m3种子罐培养
3m3种子罐培养
性
有 关
300m3发酵罐发酵
30m3种子罐培养
300m3发酵罐发酵
（三）种子扩大培养的阶段
实验室种子制备阶段
生产车间种子制备阶段
实验室种子制备阶段一般包括斜面种子的培养、实验室内 进行的固体或液体培养基的种子扩大培养。 在无菌操作条件下，将试管斜面接种到摇瓶中，经恒温振 荡培养形成大量菌体的过程，称为摇瓶培养。
实例二： 葡萄糖 45g/L，MgSO4·7H2O 0.7 g/L ， 磷酸二氢钾 1.5 g/L ，糖蜜 125g/L ， 玉米浆 250g/L，纯生物素18.8 μg/L， 硫酸亚铁、硫酸锰 各2ppm ，实消， 121℃保温10min，实消前不需调节pH， 实消降温后用液氨调节至pH7.0。
2. 培养条件
接种量 培养温度
0.03~0.5% 32~34℃
种子罐有夹套或盘管或列管等装置。 采用循环冷却水进行降温。
搅拌转速
150~200 r/min
根据种子罐容积和搅拌叶径而定，通常容积大的种子罐 设计搅拌速度会小一些。
通气比
0.15~0.44 vvm
vvm ：1m3液体1min通入空气的体积。
OD 650 值
1.4 1.3 1.2 1.1 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4
1
3
5
7
9 11 13
培养时间（小时）
流加液氨培养 添加尿素培养
实例一与实例二的培养结果， 说明了什么问题？
无菌空气
5. 二级种子接入发酵罐的操作
种子的扩大培养
液体深层种子罐从底部通气，送入的空气由搅拌桨叶分散成 微小气泡以促进氧的溶解。该法容易按照生产菌种对于代谢 的营养要求一级不同生理时期的通气、搅拌、温度与培养基 中氢离子等条件，选择最佳培养条件。
四、种子质量的控制
（二）影响种子质量的因素及控制
培养基
（1）营养成•分种适龄合：种是子指培种养子的罐需中要培养的菌丝体开始移入
种子培养要求一定量的种子，在适宜的培养基中，控制一定的培养条 件和培养方法，从而保证种子正常生长。
工业微生物培养法分为静置培养和通气培养两大类型。
❖静置培养即将培养基盛于发酵容器中，在接种后，不通空气进行培养。 ❖通气培养法的生产菌种以需氧菌和兼性需氧菌居多，它们生长的环境必须供给 空气，以维持一定的溶解氧水平，使菌体迅速生长和发酵，又称好气培养法。
（1）放线菌孢子的制备
a) 放线菌的孢子培养一般采用琼脂斜面培养基，培养基中含 有一些适合产孢子的营养成分，如麸皮、豌豆浸汁、蛋白 胨和一些无机盐等。
b) 碳源和氮源不要太丰富（碳源约为1％，氮源不超过0.5 ％），干燥和限制营养可直接或间接诱导孢子形成。
c) 放线菌斜面的培养温度大多数为28℃，少数为37℃，培 养时间为5～14天。
菌种细胞的生长活力强，转种至发酵罐后能迅速生 长，延滞期短。
菌种生理状态稳定，如菌丝形态、菌丝生长速率和 种子培养液的特性等符合要求。
菌体浓度及总量能满足大容量发酵罐接种量的要求。 无杂菌污染，保证纯种发酵。 菌种适应性强，能保持稳定的生产能力。
二、种子制备的过程
从工业发酵的角度来说，种子制备分成两个 阶段：
摇瓶培养基配方和培养条件与种子罐相似。
常采用母瓶、子瓶两级培养。种子培养基要求比 较丰富和完全，易被菌体分解利用，氮源丰富有 利于菌丝生长。原则上各种营养成分不宜过浓， 子瓶培养基浓度比母瓶略高，更接近于种子罐的 培养基配方。
发酵工程知识点
发酵工程知识点发酵工程知识点一、名词解释1.种子：指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种经过种子扩大培养所获得的纯种培养物称为种子。
2.种子扩大培养：指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得发胶产量高、生产性能稳定、数量充足、不被杂菌和噬菌体污染的生产菌种的纯种制备过程。
3.淀粉糊化：淀粉在高温下溶胀、分裂形成均匀糊状溶液的特性，称为淀粉的糊化。
4.热阻：只为生物在某一特定条件下的致死时间。
5.抑制剂：阻滞或降低化学反应速度的物质。
6.促进剂：与催化剂或固定剂并用时，可以提高反应速度的一种用量较少的物质。
7.分批培养：简单的过程，培养基中接入菌种以后，没有物料的加入和取出，除了空气的通入和排气。
整个过程中菌的浓度、营养成分的浓度和产物浓度等参数都随时间变化。
8.染菌率总染菌率指一年发酵染菌的批（次）数与总投料批（次）数之比的百分率。
染菌批次数应包括染菌后培养基经重新灭菌，又再次染菌的批次数在内9.连续培养：发酵过程中一边补入新鲜料液一边放出等量的发酵液，使发酵罐内的体积维持恒定。
达到稳态后，整个过程中菌的浓度，产物浓度，限制性基质浓度都是恒定的。
二、填空题1、微生物发酵培养（过程）方法主要有分批培养、补料分批培养、连续培养、半连续培养四种。
2、微生物生长一般可以分为：调整期、对数期、稳定期和衰亡期。
3、发酵过程工艺控制的只要化学参数溶解氧、PH、核酸量等.4、发酵过程控制的目的就是得到最大的比生产率和最大的得率。
5、菌种分离的一般过程采样、富集、分离、目的菌的筛选。
6、富集培养目的就是让目的菌在种群中占优势，使筛选变得可能。
7、根据工业微生物对氧气的需求不同，培养法可分为好氧培养和厌氧培养两种。
8、微生物的培养基根据生产用途只要分为孢子培养基、种子培养基和发酵培养基。
9、常用灭菌方法：化学灭菌、射线灭菌、干热灭菌、湿热灭菌10、常用工业微生物可分为：细菌、酵母菌、霉菌、放线菌四大类。
第二章 种子扩大培养
2 固体培养（发酵）法(solid culturing)： 固体培养又分为浅盘(shallow pan)固体培养和深 层固体培养，统称曲法培养。它起源于我国酿造生产特 有的传统制曲技术。其最大特点是固体曲的酶活力高。
（二）生产车间种子制备
实验室制备的孢子或液体种子移种 至种子罐扩大培养，种子罐的培养基虽 因不同菌种而异，但其原则为采用易被 菌利用的成分如葡萄糖、玉米浆、磷酸 盐等，如果是需氧菌，同时还需供给足 够的无菌空气，并不断搅拌，使菌（丝） 体在培养液中均匀分布，获得相同的培 养条件。
1.摇瓶种子制备
一、种子扩大培养流程图
摇瓶液体培养
冷冻干燥孢子
茄子瓶斜面培养
斜面孢子 砂土孢子 固体培养基培养 一级种子罐 二级种子罐 发酵罐
实验室种子制备阶段 （一级种子培养）
生产车间种子制备阶段 （二级种子培养、 三级种子培养） 二级发酵 三级发酵
（一）实验室种子的制备
两种方式：在固体培养基上生产大量孢子的孢子制备过程
用哪一代的斜面孢子接入液体培养，视菌种特性而定。 母斜面孢子接入液体培养基有利于防止菌种变异， 子斜面孢子接入液体培养基可节约菌种用量。 菌种进入种子罐有两种方法： 孢子进罐法，即将斜面孢子制成孢子悬浮液直接接入种子 罐．此方法可减少批与批之间的差异，具有操作方便、工 艺过程简单、便于控制孢子质量等优点，孢子进罐法已成 为发酵生产的一个方向。 摇瓶菌丝进罐法，适用于某些生长发育缓慢的放线菌，此 方法的优点是可以缩短种子在种子罐内的培养时间
第五章种子的扩大培养
玉米淀粉双酶糖 4.0， 玉米浆 1.5 ，甘蔗糖 12 / 20 蜜 1.0, 液氨，复合维生素 01 mg/L， 无机 m3 盐等
玉米淀粉双酶糖 13-14， 玉米浆 0.06-0.08 ， 154 / 240 甘蔗糖蜜 1.0, 液氨，维生素 50 g， 无机盐 m3 等
三级种子的特点： ① 种量更大，生长速度快：
采用被孢霉进行Υ亚麻酸发酵时接种量可以明显影响菌丝体
采用被孢霉进行Υ亚麻酸发酵时接种量可以明显影响菌丝体 的形态，从而影响菌体干重和Υ亚麻酸产量。
不同接种量影响菌体的生长和发酵
发酵前期发酵液作为种子，发酵指数明显提高 发酵后期菌体自溶明显，影响提炼收率
20%种子罐＋10%发酵罐前期发酵液效果最好
活力旺盛
二、青霉素生产的种子制备
制备过程
安瓿管 → 斜面孢子 → 大米孢子 → 一级种子 → 二级种子
→ 发酵
1. 斜面孢子
培养基：甘油、 葡萄糖、 蛋白胨等 培养条件：25℃、7天，注意湿度50%左右
培养基特点：有利于长孢子，用量少而精细
2. 大米孢子
培养基：大米及氮源（玉米浆） 培养条件：25℃、7天，控制湿度
接种后培养液的体积
过大过小都不好，最终以实践定，如大多数抗生素 为7-15%。但是一般认为大一点好。
双种：两个种子罐接种到一个发酵罐中。
倒种：一部分种子来源于种子罐，一部分来源于发 酵罐。
接种量对菌体形态和产Υ亚麻酸的影响
杨博， 中国油脂，2002
Υ亚麻酸是人体必需多价不饱和脂肪酸，是人体前列 腺素的前体，在预防与治疗心脑血管疾病、糖尿病治 疗、增强免疫力、抗癌和保护皮肤等方面具有重要作 用。发酵法生产Υ亚麻酸成了当今研究的一个热点。
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性能测定
❖ 这一步是采用与生产相近的培养基和培养条件， 通过三角瓶的容量进行小型发酵试验，以求得适合 于工业生产用菌种。
❖ 这种直接从自然界分离得到的菌株称为野生型菌株 ，以区别于用人工育种方法得到的变异菌株。
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工业生产常用菌种
❖ 细菌 (Bacteria) ❖ 放线菌(Actinomycetes) ❖ 单细胞真菌 ---- 酵母(Yeast) ❖ 多细胞真菌 ---- 霉菌(Molds)
第一章 菌种与种子扩大培养
决定发酵工业生产水平三要素：
生产菌种性能； 发酵过程的工艺及设备； 产物提取过程的工艺及设备
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从自然界分离：目前土壤中已分离的微生物约为自然 界总数的1-5%，微生物的多样性仍然是以后若干年的研 究重点； 诱变育种：诱变是工业发酵稳产高产的重要保证； 基因重组：基因定向改造技术大大加快了生物产品开 发的进程。
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从自然界中分离菌种的一般过程
分离思路 ❖ 新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照
生产的要求、菌种的特性，采用各种筛选方法 ，快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。
❖ 实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌，也必 须重新进行分离纯化。
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新种分离与筛选的步骤
❖ 定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生 长培养特性。
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采样
1、采样对象 以采集土壤为主。一般园田土和耕作过的
沼泽土中，以细菌和放线菌为主；富含碳水 化合物的土壤（如一些野果生长区和果园内 ）和沼泽地中，酵母和霉菌较多；采样的对 象也可以是植物或动植物残体，腐败物品， 霉菌较多；某些水域厌氧菌含量较多。
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❖ 2、采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好 。
❖ 采样：有针对性地采集样品。 ❖ 增殖：人为地通过控制养分或培养条件，使所
需菌种增殖培养后，在数量上占优势。 ❖ 分离：利用分离技术得到纯种。 ❖ 发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性
包括形态、培养特征、营养要求、生理生化特 性、发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温 度、生长和发酵最适温度、最适pH值、提取工 艺等。
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2 放线菌(Actinomycetes)
❖ 形状和大小：细胞呈长丝状，菌落呈放线状， 介于细菌和真菌之间，菌丝直径0.2～1.2微米 ，与杆菌接近；
❖ 生长和繁殖： 低等的(如诺卡氏菌)通过菌丝断 裂繁殖； 高等的(如链霉菌)在孢子丝成熟后分 化成许多孢子，孢子在适宜的环境中吸收水分 ，膨胀、萌发，成为新的放线菌。
❖ 形状和大小：分支状，菌丝体盘结交错，形成浓密菌落，使 发酵液粘稠。比放线菌大，直径3～10μm
❖ 生长与繁殖：
❖
片段菌丝可以生长成新的菌丝体；
❖
有性和无性方式，产生孢子进行繁殖；
❖
无性繁殖是主要方式，生长中，菌丝伸长和分支，从菌
丝体顶端形成新的孢子，继而形成细胞。 新细胞具有菌龄，
典型的倍增时间为4～8小时；
❖ 3、采土方式：在选好适当地点后，用小铲子除去 表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁 的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样 时间、地点、环境条件等，以备查考。采好的样 应及时处理，暂不能处理的也应贮存于4℃下，但 贮存时间不宜过长。
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增殖培养
❖ 就是给混合菌群提供一些有利于所需菌株生 长或不利于其他菌型生长的条件，以促使目标菌 株大量繁殖，从而有利于分离它们。
❖ 例如碳源利用的控制，可选定糖，淀粉、纤 维素，或者石油等，以其中的一种为唯一碳源， 那么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常生 长，而其它微生物就可能死亡或淘汰。这样对下 阶段的纯种分离就会顺利得多。
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纯种分离
❖ 尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物的 混杂生长状态。因此还必须分离，纯化。
❖ 形状和大小：单细胞，卵圆形，圆形或圆柱形；比细菌大， 直径约1～5微米，长约5～30微米。
❖ 生长与繁殖：酵母分有性和无性繁殖，以无性繁殖为主。无 性繁殖分为芽殖和裂殖，以芽殖为主。
❖ 工业上重要的酵母菌
❖
啤酒酵母(酒精、啤酒等)
❖
假丝酵母(单细胞蛋白、柠檬酸、脂肪酸、石油脱蜡)
。
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4 多细胞真菌 ---- 霉菌(Molds)
包括：酿造业，酶制剂等 食品用的微生物需经过严格的毒理试验，目前已同意 使用的仅仅少数微生物能用于生产食品用酶。 α—淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草芽孢杆菌
和地衣芽孢杆菌
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诱变育种
❖ 以微生物的自然变异作为基础的生产选种的机率并 不很高，一个基因的自然突变频率仅10-6~10-10左右 。
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4 多细胞真菌 ---- 霉菌(Molds)
❖ 工业上重要的霉菌
❖ 曲霉属: 黑曲霉—淀粉酶、蛋白酶、柠檬酸
❖
和葡萄糖酸
❖
米曲霉—酱油
❖ 青霉属: 产黄青 — 制曲、乳酸
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抗生素生产有关的微生物
放线菌（链霉素四 环素；红霉素等）
真菌（青霉素、头孢等）
一些产芽孢的细菌 植物或动物来源
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氨基酸生产有关的微生物
氨基酸生产菌的要求：代谢途径比较清楚， 代谢途径比较简单
谷氨酸发酵的菌种： 棒杆菌属，短杆菌属、节杆菌属或小 杆菌属的棒型细菌
其它氨基酸生产菌： 常规菌种一般也是以谷氨酸生产菌 选育而成；工程菌，大肠杆菌，枯 草芽孢杆菌
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食品工业微生物
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2 放线菌(Actinomycetes)
❖ 工业上重要的放线菌 ❖ 龟裂链霉菌（土霉素） ❖ 金黄色链霉菌（金霉素） ❖ 灰色链霉素（链霉素） ❖ 红链霉菌（红霉素） ❖ 红小单胞菌（庆大霉素） ❖ 委内瑞拉链霉菌（氯霉素） ❖ 卡那链霉菌（卡那霉素）
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3 单细胞真菌 ---- 酵母(Yeast)
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1 细菌 (Bacteria)
❖ 形状和大小：单细胞微生物； 有球型、杆型和螺旋型；典 型直径0.5～1微米，长度～10微米；
❖ 繁殖方式：裂殖，倍增时间25～ 45分钟。 ❖ 工业上重要的细菌： G+：枯草芽孢杆菌、乳酸杆菌、北京
棒杆菌等。G-： 醋酸杆菌、大肠杆菌。 ❖ 产品：淀粉酶制剂，乳酸，乙酸，氨基酸等
❖ 诱变育种： 利用各种物理因素和化学试剂处理微生物细胞，提 高基因突变频率，再通过适当的筛选方法获得所需 要的高产优质菌种的育种方法。