1.2 基因工程的基本操作程序白齐
合集下载
1.2 基因工程的基本操作程序
（1）农杆菌转化法
拟核
①适用范围：
易感染双子叶植物和裸 子植物，对大多数单子叶植 物没有感染能力
②原理：
Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞， 并整合到受体细胞染色体的DNA上。
③转化过程:
Ti质粒
构建
表 达
转入
农 杆
导入
目的基因
载 体
菌
植 物 细 胞
插入
植物细胞 染色DNA
表达
新 性 状
（2）基因枪法
d.标记基因
本质
功能
启动子/终止子
特殊DNA片段
转录
起始密码子/终止密码子 mRNA上3个相邻碱基 翻译
三、将目的基因导入受体细胞
（一）转化：
目的基因进入_受__体__细__胞__内，并且在 受体细胞内维持_稳__定__和_表__达__的过程
（二）方法
1.将目的基因导入植物细胞
• 农杆菌转化法（最常用） • 基因枪法 • 花粉管通道法
转基因抗虫棉
2.将目的基因导入动物细胞
（1）方法：显微注射法（将基因表达载体 提纯，用显微仪注射到受精卵中）
（2）操作程序:
提纯含目的基因表达载体
显微注射
受精卵
移植到子宫或输卵管 受精卵发育 新性状动物
3.将目的基因导入微生物细胞
常用法：Ca2+处理
常用菌：大肠杆菌
微生物作受体细胞原因： 繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少
与目的基因互补的核酸序列。
2.检测目的基因是否转录出了mRNA
①方法: mRNA分子杂交 ②过程:用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,
若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA。
1.2 基因工程的基本操作程序
1.2 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序主要包括四个步骤：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定（图1-6)。
图1-6 基因工程的基本操作流程图►求异思维你能推测出由mRN反转录形成 cDNA的过程大致分为哪些步骤吗？查阅相关的书籍，看看书中所述是否与你的想法相似。
目的基因的获取获取目的基因是实施基因工程的第一步。
目的基因可以从自然界中已有的物种中分离出来，也可以用人工的方法合成。
目的基因主要是指编码蛋白质的基因，例如，与生物抗逆性相关的基因、与优良品质相关的基因、与生物药物和保健品相关的基因、与毒物降解相关的基因，以及与工业所需用酶相关的基因等，也可以是一些具有调控作用的因子。
随着科学技术的发展，获取目的基因的方法也越来越多，目前常用的方法有以下几种。
从基因文库中获取目的基因将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库（gene library)。
基因文库就像一座图书馆，每一个基因就是一本书。
如果一座“图书馆”中包含了一种生物所有的基因，那么，我们就可以说这个基因文库很大，就像国家图书馆，这种基因文库叫做基因组文库(genomic library)。
也有一些基因文库比较小，就像某个市或某个单位的图书馆，只包含了一种生物的一部分基因，这种基因文库叫做部分基因文库，如cDNA文库（图1 - 7)。
怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因呢？这还是一件比较复杂的事情，简单地说就是根据目的基因的有关信息，例如，根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA，以及基因的表达产物蛋白质等特性来获取目的基因。
►寻根问底为什么要构建基因文库？直接从含目的基因的生物体内提取不行吗？生物技术资料卡基因文库的构建将某种生物体内的DNA全部提取出来，选用适当的限制酶，将DNA切成一定范围大小的 DNA片段，然后，将这些DNA片段分别与载体连接起来，导入受体菌的群体中储存，每个受体菌都含有了一段不同的DNA 片段。
原创10：1.2 基因工程的基本操作程序
繁殖快、单细胞、遗传物质少、容易培养
用Ca2+处理细胞
转
感受态细胞
化
过 程
表达载体与感受态细胞混合
感受态细胞吸收DNA分子
典例分析
基因工程中科学家常采用细菌、酵母菌等微生物作为受体
细胞的主要原因是( B ) A．结构简单,操作方便
B．繁殖速度快
C．遗传物质含量少,易操作
D．性状稳定,变异少
目的基因的检测与鉴定
鉴
用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后
定
不出现中毒症状，说明未摄入
目的基因或摄入目的基因未表
达。如虫吃后中毒死亡，则说
明摄入了抗虫基因并得到表达。
典例分析 目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特
性，只有通过鉴定和检测才能知道。下列属于目的基因检测和鉴定
的是（ ） C
①检测受体细胞中是否有目的基基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群 体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因。基因组部分基因限制酶
连接在 载体上
导入 受体菌
基因组DNA DNA片段
运载体
受体菌
逆转录酶 DNA 聚合酶
目的基因
花粉管通道法
子房
将目的基因导入受体细胞
显微注射技术
将
目 的 基 因 导 入 动
提纯
操 含目 取 作 的基 受 程 因的 精
序 表达 卵
载体
显 微 注 射
胚 胎 早 期 培 养
胚 胎 移 植
新 性 状 动 物
物
细
胞
将目的基因导入受体细胞
将
目 原核生物特点
的
基
常用菌
因
导
入
微
1.2基因工程的基本操作程序(sk)
以目的基因的mRNA为模 板反转录成互补的单链DNA， 单链DNA (cDNA） 合成 然后在DNA聚合酶的作用下 合成双链DNA，从而获得所 双链DNA (即目的基因) 需的基因。
(2)根据已知的氨基酸序列合成DNA法 ：
结构基因 蛋白质 mRNA 的氨基 推测 的核苷 推测 的核苷酸 化学 合成 序列 酸序列 酸序列 目的 基因
割质粒，使其出现一个切 黏性末端 口，露出____________ 。
（2）用同一种限制酶 _____________切断
相同 目的基因，使其产生_____ 的黏性末端 ____________。 DNA连接酶 再加入适量___________ ，形成了一个重组 DNA分子（重组质粒）
2014-12-5 32
外显子
结构基因
内含子 转录、加工修饰
mRNA
原核细胞与真核细胞的基因结构比较
原核细胞 编码区是 _____的 连续 真核细胞 编码区是间隔的、 _____的 不连续
不同点 相同点
编码区 _ 和具 都由能够编码蛋白质的_____ 有调控作用的______ 非编码 区组成的
思 考
编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核 细胞与真核细胞基因结构一样长吗？
非编码区 编码区上游 启动子
原 核 细 胞 的 基 因 结 构 编 码 区
编码区
非编码区 编码区下游 终止子
：能转录相应的信使RNA，能 编码蛋白质 ①不能转录为信使RNA，不能 编码蛋白质。 ②有调控遗传信息表达的核 苷酸序列，在该序列中， 最重要的是位于编码区上 游的RNA聚合酶结合位点。
非 反转录
mRNA 反转录酶 cDNA
基因重组
cDNA
(互补DNA） DNA聚合酶 双链DNA
1.2基因工程的基本操作程序
练习
4.下列获取目的基因的方法中的基因 ③反转录法 ④通过DNA合成利用化 学方法人工合成DNA
A. ① ② ③ ④
C. ② ③ ④
B. ① ② ③
D. ② ③
基因的结构（补充知识） 一、原核细胞的基因结构 非编码区 编码区 启动子 与RNA聚合酶结合位点
启动子：位于基因的首端的一段特殊的核苷酸
序列，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了 它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质 终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片 断，能终止mRNA的转录
练习
2. 下列不属于获取目的基因的方法是（ B ） A.“鸟枪法” B.转录法 C.反转录法 D.根据已知氨基酸序列合成法
练习
3.用“鸟枪法”提取目的基因的步骤为（B ） ①用限制性内切酶将供体细胞DNA切成许多片段 ②将许多DNA片段分别载入运载体 ③选取目的基因片段插入运载体 ④通过运载体转入不同的受体细胞 ⑤让供体DNA片段在受体细胞内大量繁殖 ⑥找出带有目的基因的细胞，并分离出目的基因 A．①③④⑤⑥ B．①②④⑤⑥ C．①②③④⑤⑥ D．①②③④⑤
非编码区 终止子
①RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结 1、编码区：能转录相应的信使RNA，能编码蛋白质的序列。 合。
②转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并以DNA分子 2、非编码区 ：调控遗传信息表达的核苷酸序列(启动子、 的一条链为模板合成RNA。 终止子），不编码蛋白质。 ③转录完毕后，RNA链释放出来，紧接着RNA聚合酶也从 DNA模板链上脱落下来。
基因的结构（补充知识） 二、真核细胞的基因结构 编码区 非编码区 启动子 与RNA聚合酶结合位点
外显子
非编码区 终止子
1.2基因工程的基本操作程序
1.2基因工程的基本操作程序
的基因重组的过程。
2、目的：
①使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以复制遗传给下一代
②使目的基因能表达和发挥作用
3、组成：目的基因；启动子；终止子；
标记基因启动子终止子
目的基因
标记基因
表达载体模式图
三、目的基因导入受体细胞---转化
1、转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
常用的受体细胞：
有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。
将目的基因导入受体细胞的原理
借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。
将目的基因导入植物细胞
农杆菌转化法（感染双子叶植物和裸子植物，对大多单子叶植物没有感染力）
基因枪法（常用于单子叶植物）
花粉管通道法（转基因抗虫棉）。
1.2 基因工程的基本操作程序
[总结升华]
获取目的基因方法的比较
[对点演练]
1．下列不属于获取目的基因的方法是( A．利用 DNA 连接增目的基因 )
解析：
对目的基因 (DNA 片段 )进行复制需利用
DNA 聚合酶而不是 DNA 连接酶。
d．过程：
DNA 复制 解旋方 式 场所 区 别 酶 温度条 件 合成的 对象
PCR 技术 DNA 在 高温 作
解旋酶 催化
细胞
用下 变性 解旋 细胞
内
外
解旋酶、普通的 DNA 聚合酶等
耐热的 DNA 聚合酶 (Taq 酶)
细胞内 温和 需 控制温度 ，在较 条件 DNA 分子 高温度下进行 DNA 片段或基因
五、目的基因的检测与鉴定阅读教材P13～15 1．分子水平上的检测与鉴定
(2)抗原—抗体杂交技术： 用于检测目的基因是否翻译 出
蛋白质
。
2．个体生物学水平上的检测与鉴定 如一个抗虫或抗病的目的基因导入植物细胞后，是否 赋予了植物抗虫或抗病特性， 需要做抗虫或抗病的 接种 实 验。
[共研探究] 1．目的基因的获取 获取目的基因是实施基因工程的第一步，随着科学技术的发展， 目前获取目的基因的常用方法有以下几种。阅读教材相关内容，结合 提供的资料，完成下面的思考。
遗传
中稳定存在，并且可
给下一代。
表达
②使目的基因能够
和 发挥作用 。
(2)构建基因表达载体的过程：目的基因与载体结 合的过程，实质上是不同来源的 DNA 重新组合的过 程。其过程如下：
(3) 启动子和终止子与起始密码子和终止密码子相同 吗？
提示：不相同，启动子和终止子位于 DNA 上， 是基因表达必需的部分。起始密码子和终止密码子 位于 mRNA 上，决定翻译的开始和结束。
1.2 基因工程的基本操作程序(2)
3、检测目的基因是否翻译成蛋白质
方法: 抗原抗体杂交
（二）、鉴定（个体生物学水平） 抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
归纳: 基因工程的基本操作程序
1. 获取目的基因 从基因 利用PCR 化学方法人工合成
2. 构建基因表达载体
目的基因、启动子、终止子、标记基因
3. 将目的基因导入受体细胞
1.2 基因工程的基本操作程序
3、将目的基因导入微生物细胞
常用法：Ca2+处理 常用菌：大肠杆菌 微生物作受体细胞原因： 繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少 过程：
Ca2+处理
大杆菌
感受态 细胞
表达载体 与感受态 细胞混合
感受态细 胞吸收 DNA
将目的基因导入受体细胞
1.将目的基因导入植物细胞
如何把导入了目的基因的受体细胞筛选出来？
不存活
接种 培养 接种 培养
证明：
完全培养基
接种 培养 接种 培养
抗大 四肠 环杆 素菌 含有四环素的 基 不 完全培养基 因含 存 活
含有四环素的 完全培养基
四环素 抗性基因
导入
完全培养基
证明： 大肠杆菌 的受体细胞含 四环素 有目的基因 抗性基因
四大 环肠 证明： 素杆 基菌 因含 抗
练习1：(2008理综山东卷)为扩大可耕地面积，增 加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备 受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐 水稻新品系。 （2）将重组DNA分子导入水稻受体细胞的常用方 法有农杆菌转化法和 法。 （3）由导入目的基因的水稻细胞培养成植株需要 利用 技术，该技术的核心是 和 。 （4）为了确定耐盐转基因水稻是否培育成功，既 要用放射性同位素标记的 作探针进行分子杂交 检测，又要用 方法从个体水平鉴定水稻植株 的耐盐性。
原创3：1.2 基因工程的基本操作程序
PCR的特点
PCR的基本原理
Taq
Taq
Taq
PCR反应9条5℃件
PCR过程 PCR的特点
50℃ Taq
72℃
PCR的基本原理
PPCCRR反过应程7条2℃件
PCR的特点
第2轮结束
PCR技术扩增与DNA复制的比较
PCR技术
DNA复制
相 原理
碱基互补配对
同 原料 点 条件
四种脱氧核苷酸 模板、能量、酶
2、获取方法： （1）自然界分离技术扩增 目的基因
（3）通过DNA合成仪构
探针
15N
15N
转基因生物
14N
的mRNA
14N
变性
（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质
方法：抗原-抗体杂交
提取蛋白质
注射小鼠 体内
小鼠产生 免疫
从小鼠血 管抽出血 液分离出 抗体
抗原
抗体
出现 杂交带
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用_同__一__种__限__制__酶__切断目的基因， 使其产生_相__同__的__黏__性__末。端
将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，再加入适量 _D_N__A_连__接__酶__，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）
2、基因表达载体的组成： 启动子+目的基因+终止子+标记基因
它们各自的作用 是什么?
（2）操作程序:
3.将目的基因导入微生物细胞
常用法：Ca2+处理 常用菌：大肠杆菌
过程：
Ca2+处理大 肠杆菌
感受态细 胞
表达载体与 感受态细胞
混合
感受态细 胞吸收 DNA
四、目的基因的检测与鉴定
1.2基因工程的本操作程序
❖ PCR的特点
引物1
55-60℃
PCR的基本原理
❖ PCR反应条件
❖ PCR过程 70-75℃
❖ PCR的特点
Taq酶 引物1
引物2 Taq酶
PCR的基本原理
❖ ❖
PPCCRR反过应程条件70-75℃
❖ PCR的特点
第1轮结束 第2轮开始
PCR的基本原理
Taq
Taq
❖
Taq❖
PPCCRR反过应程条9件0-95℃
非编码区 启动子
编码区 转录
剪接
思考
翻译
如何让真核细胞的基因
在原核细胞中表达呢？
非编码区 终止子
mRNA前体 区 启动子
不含非编 码系列。 即不含非 编码区和
内含子
编码区
转录 剪接 逆转录
非编码区 终止子
mRNA前体 成熟的mRNA
1.2 基因工程的基本操作程序
基因工程培育抗虫棉的简要过程：
目的基因的获取 基因表达载体的构建 将目的基因导入受体细胞 目的基因的检测与鉴定
一、目的基因的获取
1、目的基因主要是指_能__够__编__码__蛋__白__质__的__结__构__基_因
2、获取目的基因的方法 （1）从基因中获取 （2）利用PCR技术扩增 （3）人工合成
1.目的 A. 使目的基因在受体细胞中稳定存在 并遗传给子代 B.同时使目的基因能表达和发挥作用
2.基因表达载体的组成： a、目的基因 b、启动子 c、终止子 d、标记基因 e、复制原点
3.基因表达载体的构建过程
质粒
重组DNA 限制酶
目的基因
DNA连接酶
（1）用__限__制__酶___切割质粒， 使其出现切口露出 ___黏__性__末__端___。
1.2基因工程的基本操作程序
三、将目的基因导入受体细胞
1.将目的基因导入植物细胞
转化
农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法
2.将目的基因导入动物细胞
显微注射技术
提纯基因表达载体
体外显微注射入受精卵
受精卵移植
受精卵发育
三、将目的基因导入受体细胞
1.将目的基因导入植物细胞
转化
农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法
2.将目的基因导入动物细胞 显微注射技术
然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子(抗 虫基因首端)，导入棉花受精卵，长成的棉花植株 还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫基 因的质粒中插入终止子(抗虫基因末端)，导入棉花 受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力。
2.基因表达载体的组成：
a、目的基因
b、启动子
位于基因的首端, 是RNA聚合酶识 别、结合位点
d.重复a.b.c步骤：每重复 一次，目的基因增加_一__倍
PCR技术与生物体内DNA复制的比较：
练习：下列属于PCR技术所需条件的是 （B）
①单链的核苷酸序列引物 ②目的基因所
在的DNA片段 ③脱氧核苷酸 ④核糖核 苷酸 ⑤DNA连接酶 ⑥DNA聚合酶 ⑦ DNA限制酶． A． ①②③⑤ B． ①②③⑥ C． ①②③⑤⑦ D． ①②④⑤⑦
基因工程的基本操作程序
一、目的基因的获取 二、基因表达载体的构建 三、将目的基因导入受体细胞
（得到转基因生物）
四、目的基因的检测与鉴定
一、目的基因的获取
主要是编码蛋白质的结构基因
初始目的基因的来源 从生物中直接获取 人的基因 3、化学方法人工合成
练习: 采用基因工程的方法培养抗虫棉，下列导入目
的基因的作法正确的是（ C ）
基因工程的基本操作程序
将ada(腺苷酸脱氨酶基因 )通过质粒 pET28b导入大肠 杆菌并成功表达腺苷酸脱氨酶。下列叙述错误的是( C )
A．每个大肠杆菌细胞至少含一个重组质粒
B．每个重组质粒至少含一个限制性核酸内切酶识别位点
C．每个限制性核酸内切酶识别位点至少插入一个ada
D．每个插入的ada至少表达一个腺苷酸脱氨酶分子
1.2 基因工程的基本操作程序
重点:
1、获取目的基因的方法；
2、构建基因表达载体的方法。（核心）
பைடு நூலகம்
难点：
3、将目的基因导入受体细胞的方法；
4、检测与鉴定目的基因的方法。
【问题导思】 ①要哪些条件？1．基因、基因组、cDNA：基因的构建
方法基因组部分基因 (如cDNA)
PCR技术扩 增
人工合成
过程
3.PCR技术与生物体内DNA复制的比较：
项目
PCR技术 DNA复制
DNA在高温下变 解旋方式 解旋酶催化 性解旋
不 同 酶 点
场所
体外复制
主要在细胞核内
热稳定的DNA聚 细胞内含有的DNA 合酶 聚合酶 细胞内温和条件
转化 过程
目的基因表 目的基因插 达载体提纯 入Ti质粒的T →取卵(受精 －DNA上→ 卵)→显微注 导入植物细 射→受精卵 胞→整合到 发育→获得 受体细胞的 具有新性状 DNA→表达 的动物
2.农杆菌转化法分析
(1) 完成基因表达载体的构建，需要限制性核酸 内切酶和DNA连接酶。
(2) 重组的基因表达载体 ( 重组质粒 ) 导入农杆菌
基因转录出mRNA。
(2) 目的基因：编码相关蛋白质，形成基因工程
产品或产生新的生物性状。
(3)终止子：一段有特殊结构的 DNA短片段，位
1.2基因工程的基本操作程序
55-60℃
Taq
70-75℃
Taq
PCR的基本原理
第2轮结束
PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点
PCR总结： PCR的基本反应步骤
变性
90-95˚C
延伸 70-75˚C
退火
55-60˚C
（3）人工合成目的基因：
蛋白质的氨基酸序列 推测 mRNA的核苷酸序列
推测
结构基因的核苷酸序列 合成 目的基因
变性、退火、延伸三步曲
变性 延伸
退火
⑤过程： a、变性（90℃-95℃）： 模板DNA受热变性解链为单链。 b、退火（55℃-60℃）： 引物与单链DNA模板结合。 c、延伸（70℃-75℃）： 在Taq酶的作用下，从引物延伸合成互补链。
90-95℃
模板DNA
PCR的基本原理
PCR反应条件 55-60℃ PCR过息
如：根据基因的核苷酸序列； 基因的功能； 基因在染色体上的位置； 基因的转录产物mRNA； 基因翻，受体菌中含基因。
（2）PCR技 术
① 概念：PCR全称为多聚酶链式反应，是一项 在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技 术。 ②原理：DNA双链的复制 ③原料： 模板DNA﹑引物﹑热稳定DNA聚合酶（taq酶） ﹑四种脱氧核苷酸 ④结果：目的基因的片段以指数方式增加，即 2n （n为扩增循环的次数）
细胞/个体
导入方法 农杆菌转化法
基因枪法
花粉管通道法
Ca2+处理法
（四）目的基因的检测与鉴定：
分子水平的检测: 是否插入目的基因 是否转录 是否翻译 个体水平的鉴定：
1.分子水平的检测：
（1）检测目的基因是否进入受体细胞
基因工程的基本操作程序(好用)1
5′端
•DNA聚合酶只能 将单个核苷酸加到 已存在的核酸片段 的3′端的羟基上， 形成磷酸二酯键
A T G A C G 5 ′端
C
3 ′端
一、目的基因的获取
2.获目的基因 ①PCR——聚合酶链式反应
②原理： DNA双链复制 ③前提： 模板DNA；引物；四 ④条件： 种脱氧核苷酸；热稳 定DNA聚合酶等。
Bt毒素蛋白
抗体
苏云金杆菌
组 织 培 养 脱 分 化
将Bt毒蛋白注 射小鼠体内
从小鼠血管抽出 血液分离出抗 Bt毒素的抗体
提 取
蛋白质
出现 杂交带
2.获目的基因 ①PCR——聚合酶链式反应
②原理： DNA双链复制 ③前提：一段已知的目的基因的核苷 酸序列 (合成引物)
5′端
3′端
A T
•DNA聚合酶只能 将单个核苷酸加到 已存在的核酸片段 的3′端的羟基上， 形成磷酸二酯键
非编码区 终止子
启动子：位于基因首端一段能与RNA聚合酶结合并能 起始mRNA合成的序列。没有启动子，基因就不能转录。 RNA聚合酶:能够识别启动子上的结合位点并与其结合 的一种蛋白质. 终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断， 它能阻碍RNA聚合酶的移动，并使其从DNA模板链上脱 离下来，使转录终止。
一、目的基因的获取
2.获、目的基因的获取
2.获的种类（1）原核生物基因结构
非编码区
编码区
非编码区
…A‥………ATGTGCACGTAGTTA………‥G… 启动子 终止子 …T‥………TACACGTGCATCAAT……… ‥C…
编码区上游 编码蛋白质 调控遗传信息的表达 （调控程序） 编码区下游
非编码区
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取可以吗？ 如果所需要的目的基因的序列完全不知，或 只知道目的基过 PCR等方式获得，则不需要构建基因。巩固训练思考与探究：
1.作为基因工程表达载体，只需含有目的 基因就可以完成任务吗？为什么？ 不可以，因为目的基因在表达载体中得到 表达并发挥作用，还需要有其他控制元件， 如启动子、终止子和标记基因等。
巩固训练
1.(多选)一个基因表达载体的构建应包括( ) A．目的基因 B．启动子 ABCD C．终止子 D．标记基因 2.下列关于基因表达载体的叙述不正确的是( A ) A．启动子是与RNA聚合酶识别和结合的部位， 是起始密码 B．启动子和终止子都是特殊结构的DNA短片段， 对mRNA的转录起调控作用 C．标记基因是为了鉴别受体细胞中是否有目的 基因从而便于筛选 D．基因表达载体的构建视受体细胞及导入方式 不同而有所差别
目的基因
表达载体
复制原点 标记基因
终止子
表达载体的模式图
注意：
①载体与表达载体的区别：二者都有标记基因 和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体 基础上增加了 目的基因 、 、 终止子 三 启动子 部分结构 ②用到的工具酶：既用到 限制酶 切割载体， 又用到 DNA连接酶 将目的基因和载体拼接， 两种酶作用的化学键都是 磷酸二酯键 。 ③启动子、终止子对于目的基因表达必不可少 ④目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表 达载体的方式携带进去。
外显子：能编码蛋白质的序列
真核生物的转录过程
非编码区 编码区
非编码区
外显子
转录
外显子对应 的RNA序列
内含子
末成熟的mRNA 内含子对应 的RNA序列 剪接内含子(有 关酶的作用下)
成熟的mRNA
1.逆(反)转录法 (以真核生物的逆转录过程为例)
非编码区 基因
启动子 转录 剪接 RNA聚合酶 编码区 非编码区 终止子
（3）人工合成
1.逆(反)转录法 2.化学合成法
补充：基因的结构
非编码区 原核细胞 启动子 真核细胞 终止子
编码区
非编码区
RNA聚合酶 结合位点
外显子
内含子
转录 终止
真核细胞的基因结构
非编码区
编码区 非编码区
编码区上游
启动子
编码区下游
终止子
与RNA聚合酶 结合位点
外显子
内含子
真核细 编码区 内含子：不能编码蛋白质的序列 胞的 基因结 非编码区 :有调控作用,上游有启动子，下 构 游有终止子 非编码序列： 包括非编码区和内含子
指数 方式扩增，即____ 2n （n为扩 5.方式：以_____ 增循环的次数）
6.结果：
使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增
7.过程：变性、复性、延伸三步曲
①变性：加热至90～95℃
双链DNA解链成为单链 DNA
②复性：冷却至50～60℃ 两种引物通过碱基互补 变性 配对与两条单链DNA结合 ③延伸：加热至70～75℃ 溶液中的四种脱氧核苷 酸在DNA聚合酶的作用下， 根据碱基互补配对原则 复性 合成新的DNA链。 延伸
重组DNA分子
(携带目的基因)导入受体细胞 (基因)1.基因组: ②种类
基因中包含了一种生物的所有基 因,这种基因文目的基因 优点： 操作简单 缺点：工作量大，盲目性强
PCR技术扩增与DNA复制的比较
DNA复制 PCR技术
体外
场所
解旋方式 温度条件 酶 特点 结果
细胞内(主要在细胞核内)
解旋酶催化解旋
细胞内温和的条件
DNA在高温下变性解旋
需控温,在较高温度下进行
DNA聚合酶、解旋酶等 耐热的DNA聚合酶(Taq酶) 半保留复制、 半保留复制、 边解旋边复制 全解旋再复制 形成整个DNA分子 大量的DNA片段(基因) ①模板:均需要脱氧核苷酸链 作为模板进行物质合成 ②原料:均为四种 脱氧核苷酸 . ③酶:均需要 DNA聚合酶 进行催化 ④引物:均需要引物，使DNA聚合酶从引物的3′端 开始连接脱氧核苷酸
标记基因
表达载体
复制原点
终止子
e、复制原点
表达载体的模式图
它们有什么作用？
启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是 RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录 出mRNA，最终获得蛋白质。 终止子：位于基因的尾端 的一段特殊的DNA片断， 使转录终止。 标记基因：为了鉴别受体 细胞中是否含有目的基因， 从而筛选出含有目的基因 的受体细胞。 启动子
1.将目的基因导入植物细胞
• 农杆菌转化法 • 基因枪法 • 花粉管通道法
（1）农杆菌转化法(常用)
①农杆菌：
思考与探究： 2.根据农杆菌可将目 植物的受伤组织会产生一些糖 的基因导入双子叶植物的机理,你能 类和酚类物质吸引根瘤农杆菌向受 分析出农杆菌不能将目的基因导入 伤组织集中 ，使植物形成肿瘤。 单子叶植物的原因吗 ? 此糖类和酚类物质主要在双子叶 植物细胞壁中合成，通常不存在于单 子叶植物中，农杆菌易感染双子叶植 物和裸子植物，对大多数单子叶植物
联系
巩固训练
1.下列有关PCR过程的叙述中不正确的是（C ） A．变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间 的氢键，也可利用解旋酶实现 B．复性过程中引物与DNA模板链的结合是依靠 碱基互补配对原则完成 C．延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP、四种核糖 核苷酸 D．PCR与细胞内DNA复制相比所需要酶的最适温 度较高
2.将目的基因导入动物细胞 （1）方法：显微注射法（将基因表达载体 提纯，用显微仪注射到受精卵中）
受精卵具有体积大,易操作,经培养可直接表达性状的 优点。而动物体细胞的全能性受限。
2.将目的基因导入动物细胞
（2）操作程序:
提纯含目的基因表达载体 显微注射
受精卵
早期胚胎培养 移植到子宫 新性状动物
2.化学合成法
——根据已知的氨基酸序列合成DNA
蛋白质的氨基酸序列 推测 mRNA的核甘酸序列 推测 基因的核苷酸序列 DNA合成仪合成 目的基因
DNA合成仪
课堂小结：
一、目的基因的获取1、从基因中获取（种类最多）种 类只
1.PCR——多聚酶链式反应
是一项生物体外复制特定DNA片段 的核酸合成技术。通过此技术，可以 在短时间内大量扩增目的基因。 2.原理： DNA复制
要有一段已知目的基因的核苷酸序 3.前提： 列，以便根据这一序列合成引物
4.条件：
模板DNA( 需含有目的基因 ) 四种脱氧核苷酸 耐热的DNA聚合酶(Taq酶） 一对引物： 与目的基因的起始段互补。
没有感染能力。
（1）农杆菌转化法
②原理：
Ti质粒上的T-DNA可以转 移到受体细胞，并整合到受 体细胞染色体的DNA上。
③转化过程:
表 植 农 插入 植物细胞 表达 新 Ti质粒 构建 达 转入 导入 物 杆 性 染色 DNA 载 细 菌 状 目的基因 体 胞
（2）基因枪法
适用于单子叶植物
基因枪法又称微 弹轰击法，是利用压 缩气体产生的动力， 将包裹在金属颗粒表 面的表达载体DNA打 入受体细胞中，使目 的基因与其整合并表 达的方法。
mRNA前体
不含非编 码系列。 即不含非 编码区和 内含子
有关的酶 mRNA 逆转录 逆转录酶
复制
单链DNA DNA聚合酶 cDNA
你能推测出由mRNA反转录形成cDNA 的过程大致分为哪些步骤吗？
求异思维
cDNA合成过程是： ①反转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的 DNA单链，形成RNA-DNA杂交分子。 ②核酸酶H使RNA-DNA杂交分子中的RNA链降解， 使之变成单链的DNA。 ③以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合 成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子。
切口 （3）将切下的目的基因片段插入质粒的______ 目的基因与运载体的结合过程，实际上 DNA连接酶 ，形成了一个重组 处，再加入适量___________ 是不同来源的基因重组的过程。 DNA分子(重组质粒)
3、基因表达载体的组成：
a、目的基因
启动子
目的基因
表 达 载 体
b、启动子 c、终止子 色体DNA B.线粒体DNA C.总mRNA （ ，导基因的许多DNA ①概念： 片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌
目的基因
分离
一定大小的许多DNA片段
与载体连接
筛选出产生特定 性状的受体细胞
外源DNA扩增
（3）花粉管通道法
适用于被子植物
我国科学 家独创的 一种方法, 我国的转 基因抗虫 棉就是用 这种方法 获得的
滴加目的基因溶液
（3）花粉管通道法
植物花粉在柱头上萌发 后，花粉管要穿过花柱直通 胚囊。花粉管通道法就是在 植物受粉后，花粉形成的花 粉管还未愈合前，剪去柱头， 然后，滴加DNA（含目的基 因），使目的基因借助花粉 管通道进入受体细胞。
2、利用PCR技术扩增 （数量最多） 3、人工合成:逆(反)转录法（针对性最强）
化学合成法
巩固训练
1、在已知氨基酸序列信息的情况下，获取 目的基因的最方便方法应
2、下列获取目的基因的方的基因 ③反转录法 ④通过 DNA合成仪利用化学方法人工合成 A．①②③④ B．①②③ C．②③④ D．②③
基因工程的基本操作程序
1、目的基因的获取 2、基因表达载体的构建 3、将目的基因导入受体细胞
4、目的基因的检测与鉴定
一、获取目的基因
1. 目的基因主要是指： 编码蛋白质的结构基因 _______________________
23.将目的基因导入微生物细胞
常用法： Ca2+处理细胞法 (Ca2+增加细菌细胞的通透性) 常用菌：大肠杆菌 微生物作受体细胞原因：
二、基因表达载体的构建
——基因工程的核心 1、目的： ①使目的基因在受体细胞中稳定存在，
1.作为基因工程表达载体，只需含有目的 基因就可以完成任务吗？为什么？ 不可以，因为目的基因在表达载体中得到 表达并发挥作用，还需要有其他控制元件， 如启动子、终止子和标记基因等。
巩固训练
1.(多选)一个基因表达载体的构建应包括( ) A．目的基因 B．启动子 ABCD C．终止子 D．标记基因 2.下列关于基因表达载体的叙述不正确的是( A ) A．启动子是与RNA聚合酶识别和结合的部位， 是起始密码 B．启动子和终止子都是特殊结构的DNA短片段， 对mRNA的转录起调控作用 C．标记基因是为了鉴别受体细胞中是否有目的 基因从而便于筛选 D．基因表达载体的构建视受体细胞及导入方式 不同而有所差别
目的基因
表达载体
复制原点 标记基因
终止子
表达载体的模式图
注意：
①载体与表达载体的区别：二者都有标记基因 和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体 基础上增加了 目的基因 、 、 终止子 三 启动子 部分结构 ②用到的工具酶：既用到 限制酶 切割载体， 又用到 DNA连接酶 将目的基因和载体拼接， 两种酶作用的化学键都是 磷酸二酯键 。 ③启动子、终止子对于目的基因表达必不可少 ④目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表 达载体的方式携带进去。
外显子：能编码蛋白质的序列
真核生物的转录过程
非编码区 编码区
非编码区
外显子
转录
外显子对应 的RNA序列
内含子
末成熟的mRNA 内含子对应 的RNA序列 剪接内含子(有 关酶的作用下)
成熟的mRNA
1.逆(反)转录法 (以真核生物的逆转录过程为例)
非编码区 基因
启动子 转录 剪接 RNA聚合酶 编码区 非编码区 终止子
（3）人工合成
1.逆(反)转录法 2.化学合成法
补充：基因的结构
非编码区 原核细胞 启动子 真核细胞 终止子
编码区
非编码区
RNA聚合酶 结合位点
外显子
内含子
转录 终止
真核细胞的基因结构
非编码区
编码区 非编码区
编码区上游
启动子
编码区下游
终止子
与RNA聚合酶 结合位点
外显子
内含子
真核细 编码区 内含子：不能编码蛋白质的序列 胞的 基因结 非编码区 :有调控作用,上游有启动子，下 构 游有终止子 非编码序列： 包括非编码区和内含子
指数 方式扩增，即____ 2n （n为扩 5.方式：以_____ 增循环的次数）
6.结果：
使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增
7.过程：变性、复性、延伸三步曲
①变性：加热至90～95℃
双链DNA解链成为单链 DNA
②复性：冷却至50～60℃ 两种引物通过碱基互补 变性 配对与两条单链DNA结合 ③延伸：加热至70～75℃ 溶液中的四种脱氧核苷 酸在DNA聚合酶的作用下， 根据碱基互补配对原则 复性 合成新的DNA链。 延伸
重组DNA分子
(携带目的基因)导入受体细胞 (基因)1.基因组: ②种类
基因中包含了一种生物的所有基 因,这种基因文目的基因 优点： 操作简单 缺点：工作量大，盲目性强
PCR技术扩增与DNA复制的比较
DNA复制 PCR技术
体外
场所
解旋方式 温度条件 酶 特点 结果
细胞内(主要在细胞核内)
解旋酶催化解旋
细胞内温和的条件
DNA在高温下变性解旋
需控温,在较高温度下进行
DNA聚合酶、解旋酶等 耐热的DNA聚合酶(Taq酶) 半保留复制、 半保留复制、 边解旋边复制 全解旋再复制 形成整个DNA分子 大量的DNA片段(基因) ①模板:均需要脱氧核苷酸链 作为模板进行物质合成 ②原料:均为四种 脱氧核苷酸 . ③酶:均需要 DNA聚合酶 进行催化 ④引物:均需要引物，使DNA聚合酶从引物的3′端 开始连接脱氧核苷酸
标记基因
表达载体
复制原点
终止子
e、复制原点
表达载体的模式图
它们有什么作用？
启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是 RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录 出mRNA，最终获得蛋白质。 终止子：位于基因的尾端 的一段特殊的DNA片断， 使转录终止。 标记基因：为了鉴别受体 细胞中是否含有目的基因， 从而筛选出含有目的基因 的受体细胞。 启动子
1.将目的基因导入植物细胞
• 农杆菌转化法 • 基因枪法 • 花粉管通道法
（1）农杆菌转化法(常用)
①农杆菌：
思考与探究： 2.根据农杆菌可将目 植物的受伤组织会产生一些糖 的基因导入双子叶植物的机理,你能 类和酚类物质吸引根瘤农杆菌向受 分析出农杆菌不能将目的基因导入 伤组织集中 ，使植物形成肿瘤。 单子叶植物的原因吗 ? 此糖类和酚类物质主要在双子叶 植物细胞壁中合成，通常不存在于单 子叶植物中，农杆菌易感染双子叶植 物和裸子植物，对大多数单子叶植物
联系
巩固训练
1.下列有关PCR过程的叙述中不正确的是（C ） A．变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间 的氢键，也可利用解旋酶实现 B．复性过程中引物与DNA模板链的结合是依靠 碱基互补配对原则完成 C．延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP、四种核糖 核苷酸 D．PCR与细胞内DNA复制相比所需要酶的最适温 度较高
2.将目的基因导入动物细胞 （1）方法：显微注射法（将基因表达载体 提纯，用显微仪注射到受精卵中）
受精卵具有体积大,易操作,经培养可直接表达性状的 优点。而动物体细胞的全能性受限。
2.将目的基因导入动物细胞
（2）操作程序:
提纯含目的基因表达载体 显微注射
受精卵
早期胚胎培养 移植到子宫 新性状动物
2.化学合成法
——根据已知的氨基酸序列合成DNA
蛋白质的氨基酸序列 推测 mRNA的核甘酸序列 推测 基因的核苷酸序列 DNA合成仪合成 目的基因
DNA合成仪
课堂小结：
一、目的基因的获取1、从基因中获取（种类最多）种 类只
1.PCR——多聚酶链式反应
是一项生物体外复制特定DNA片段 的核酸合成技术。通过此技术，可以 在短时间内大量扩增目的基因。 2.原理： DNA复制
要有一段已知目的基因的核苷酸序 3.前提： 列，以便根据这一序列合成引物
4.条件：
模板DNA( 需含有目的基因 ) 四种脱氧核苷酸 耐热的DNA聚合酶(Taq酶） 一对引物： 与目的基因的起始段互补。
没有感染能力。
（1）农杆菌转化法
②原理：
Ti质粒上的T-DNA可以转 移到受体细胞，并整合到受 体细胞染色体的DNA上。
③转化过程:
表 植 农 插入 植物细胞 表达 新 Ti质粒 构建 达 转入 导入 物 杆 性 染色 DNA 载 细 菌 状 目的基因 体 胞
（2）基因枪法
适用于单子叶植物
基因枪法又称微 弹轰击法，是利用压 缩气体产生的动力， 将包裹在金属颗粒表 面的表达载体DNA打 入受体细胞中，使目 的基因与其整合并表 达的方法。
mRNA前体
不含非编 码系列。 即不含非 编码区和 内含子
有关的酶 mRNA 逆转录 逆转录酶
复制
单链DNA DNA聚合酶 cDNA
你能推测出由mRNA反转录形成cDNA 的过程大致分为哪些步骤吗？
求异思维
cDNA合成过程是： ①反转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的 DNA单链，形成RNA-DNA杂交分子。 ②核酸酶H使RNA-DNA杂交分子中的RNA链降解， 使之变成单链的DNA。 ③以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合 成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子。
切口 （3）将切下的目的基因片段插入质粒的______ 目的基因与运载体的结合过程，实际上 DNA连接酶 ，形成了一个重组 处，再加入适量___________ 是不同来源的基因重组的过程。 DNA分子(重组质粒)
3、基因表达载体的组成：
a、目的基因
启动子
目的基因
表 达 载 体
b、启动子 c、终止子 色体DNA B.线粒体DNA C.总mRNA （ ，导基因的许多DNA ①概念： 片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌
目的基因
分离
一定大小的许多DNA片段
与载体连接
筛选出产生特定 性状的受体细胞
外源DNA扩增
（3）花粉管通道法
适用于被子植物
我国科学 家独创的 一种方法, 我国的转 基因抗虫 棉就是用 这种方法 获得的
滴加目的基因溶液
（3）花粉管通道法
植物花粉在柱头上萌发 后，花粉管要穿过花柱直通 胚囊。花粉管通道法就是在 植物受粉后，花粉形成的花 粉管还未愈合前，剪去柱头， 然后，滴加DNA（含目的基 因），使目的基因借助花粉 管通道进入受体细胞。
2、利用PCR技术扩增 （数量最多） 3、人工合成:逆(反)转录法（针对性最强）
化学合成法
巩固训练
1、在已知氨基酸序列信息的情况下，获取 目的基因的最方便方法应
2、下列获取目的基因的方的基因 ③反转录法 ④通过 DNA合成仪利用化学方法人工合成 A．①②③④ B．①②③ C．②③④ D．②③
基因工程的基本操作程序
1、目的基因的获取 2、基因表达载体的构建 3、将目的基因导入受体细胞
4、目的基因的检测与鉴定
一、获取目的基因
1. 目的基因主要是指： 编码蛋白质的结构基因 _______________________
23.将目的基因导入微生物细胞
常用法： Ca2+处理细胞法 (Ca2+增加细菌细胞的通透性) 常用菌：大肠杆菌 微生物作受体细胞原因：
二、基因表达载体的构建
——基因工程的核心 1、目的： ①使目的基因在受体细胞中稳定存在，