复方五仁醇胶囊含药血清指纹图谱与保肝作用的谱效关系

・研究原著・文章编号:100022790(2008)022*******复方五仁醇胶囊含药血清指纹图谱与保肝作用的谱效关系窦志华1,罗　琳2,丁安伟3,王陆军1,张　兵1,李　民1　(1南通大学附属南通第三医院药剂科,江苏南通226006,2南通大学医学院药理教研室,江苏南通226001,3南京中医药大学药学院药物研究所,江苏南京210046)收稿日期:2007207211;　接受日期:2007209210基金项目:江苏省中医药局中医药科学技术研究专项课题(H05173);江苏省高校研究生科技创新计划项目(140)通讯作者:丁安伟.Tel:(025)85811523　Email:a wding105@ 作者简介:窦志华.博士,副主任中药师.Tel:(0513)85116027　Email:zhihuadou@Prof ile 2effect between f i n gerpr i n t andli ver protecti on of serum con t a i n i n g com pound W urenchun capsulesDOU Zhi 2Hua 1,LUO L in 2,D I N G A n 2W ei 3,WAN G L u 2Jun 1,ZHAN G B ing 1,L i M in11Depart m ent of Phar macy,Nant ong Third Affiliated Hos p ital,Nant ong University,Nant ong 226006,China,2Depart m ent ofPhar macol ogy,Medical School,Nant ong University,Nant ong226001,China,3I nstitute of Materia Medica,Phar macy School,Nanjing University of Traditi onal Chinese M edicine,Nanjing210029,China【Abstract 】A I M :To illu m inate the therapeutic basis of liverp r otecti onofcompound W urenchuncap sules(C WC ).M ETHOD S:N ine gr oup s of rat seru m were p repared after ig C WC,Fructus Schisandrae Chinensis (FC ),Radix et rhizo m a notoginseng (RN ),Radix bupleuri (RB ),Phyllanthus urinaria(P U ),and C WC without one of these 4constituents,res pectively .On the one hand,HP LC chr omat ogra m s of these 9gr oup s of seru m containing drug were detected .On the other hand,the i m pacts of these 9sa mp les on CC L 42induced hepat ocyte injury model were evaluated by indices of hepat ocyte incre ment (MTT method )and alanine am inotransferase (ALT )in cell culture me 2diu m.RESU L TS:HP LC chr omat ogra m s showed that the 13drug 2induced constituents in seru m containing C WC could be all found out in sera containing FC,as well as C WC without RN,RB,and P U,but none of the m could be f ound out in sera contai 2ning RN,RB,P U,and C WC without FC .The results of phar ma 2col ogical testing showed that the sera containing C WC,FC,and C WC without RN,RB,and P U possessed the evident effect of p r otecting liver,but sera containing RN,RB,P U,and C WC without FC hadn πt this effect .Further more,the effect distincti on bet w een FC and C WC wasn πt significant .It showed a significantrelativity bet w een chart and effect .CO NCL US I O N:The main therapeutic basis of liver p r otect in C WC is lignans fr om Fructus Schisandrae Chinensis ,which is the main compositi on in C WC .【Keywords 】compound W urenchun cap sules (C WC );seru mcontaining drug;finger p rint;liver p r otecti on;p r o 2file 2effect;chr omat ography,high p ressure liquid【摘　要】目的:阐明复方五仁醇胶囊保肝作用的药效物质基础.方法:将大鼠灌胃给药分别制备复方五仁醇胶囊及五味子、三七、柴胡、叶下珠4味药的阴性制剂和单味制剂含药血清,对获得的9组含药血清按已经建立的指纹图谱条件进行HP LC 测定,同时考察它们对CC L 4诱导的损伤肝细胞的增值(MTT 法)及丙氨酸氨基转移酶(ALT )泄漏的影响,最后进行谱效关系分析.结果:指纹图谱显示,单味五味子及三七、柴胡、叶下珠阴性制剂含药血清中均检测到大鼠灌服全方制剂后血液中产生的13个药源性成分,而五味子阴性制剂及单味三七、柴胡、叶下珠含药血清中均未检测到药源性成分;药效结果显示,全方、单味五味子及三七、柴胡、叶下珠阴性制剂含药血清对肝细胞损伤均具有明显的保护作用,而单味三七、柴胡、叶下珠含药血清及五味子阴性制剂含药血清作用不明显,且单味五味子与全方制剂含药血清组之间药效无显著差异.谱效之间具有很好的相关性.结论:复方五仁醇胶囊保肝作用的药效物质基础主要来自君药五味子所含有的木脂素类成分.【关键词】复方五仁醇胶囊;含药血清;指纹图谱;保肝作用;谱效关系;色谱法,高压液相【中图号】R961.1 【文献标识码】A0　引言中药血清药理学和血清药化学是一种很有发展前景的研究复方的新思路,两者的结合研究有助于中药药效物质基础的阐明[1].复方五仁醇胶囊由五味子、三七、柴胡及叶下珠等4味药组成,其中五味子为君药,是一种治疗慢性肝炎的科研制剂[2],我们以该制剂为对象进行血清药理学与血清药化学相结合探寻中药复方药效物质基础的方法学探讨.我们曾采用正交试验法优选了该制剂含药血清制备条件,建立了以CCL 4诱导的原代培养大鼠肝细胞损伤模型对含药血清进行药效评价的方法,并分别进行了体外制剂、含药血清的HP LC 指纹图谱研究[3-4].在此基础上,我们研究制备了全方制剂含药血清及拆方后的各组方药材阴性制剂和各单味制剂含药血清,分别对这9组含药血清按已经建立的指纹图谱条件进行HP LC 测定和药效评价,试图通过谱效关系分析初步阐明该制剂保肝作用的药效物质基础.1　材料和方法1.1　材料　S D大鼠,SPF级,雌雄各半,体质量(248.4±16.3)g,南通大学实验动物中心提供,许可证号SYKX(苏)200220022;Agilent1100Series高效液相色谱仪(美国Agilent公司,包括G1311A四元泵,G1379A脱气装置,G1313A自动进样器,G1314A VWD紫外检测器,HP Che mSati on工作站);HERA cell CO2培养箱(德国G mbH公司);B I O2TEK340酶标仪(美国Sig ma公司);日立7170全自动生化分析仪(日本日立公司);CKX41型倒置显微镜(日本奥林巴斯株式会社);X W280A微型旋涡混合仪(上海沪西分析仪器厂);羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES,香港F ARCO公司,批号L0024LJ0101M21);乙二醇双(22氨基乙醚)四乙酸(EGT A,美国AMRESCO公司,批号0732);胶原酶I V(美国Sig ma公司,批号0406);胰蛋白酶(美国Sig ma公司,批号030702);DME M培养基(美国Gibco公司,批号1255136);四氯化碳(宜兴市第二化学试剂厂,批号20010608);溴化32(4,52二甲基噻唑)22,52二苯基四氮唑蓝(MTT,美国AM2 RESCO公司,批号1324B37);新西兰新生小牛血清(美国HyCl one公司,批号DPEO166);复方五仁醇胶囊及其各组方药材阴性制剂、单味制剂(南通大学附属南通第三医院,批号050505);色谱纯甲醇(江苏汉邦科技有限公司);色谱纯乙腈(美国TED I A公司);纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司);其他试剂均为分析纯.1.2　方法1.2.1　含药血清和空白血清的制备　按文献[4]方法制备大鼠含药血清和空白血清.1.2.2　各组含药血清的HP LC测定　按文献[4]方法制备大鼠含药血清和空白血清供试品溶液,并分别吸取含药血清、空白血清供试品溶液20μL,注入高效液相色谱仪,记录70m in色谱图.1.2.3　原代肝细胞的分离培养、分组及处理　大鼠用30g/L戊巴比妥钠以1.5mL/kg腹腔注射麻醉,背位固定,开腹,门静脉插管,以37℃无钙灌流液(组成:HBSS500mL,HEPES1.19g,EGT A0.095g, NaHCO30.175g,pH7.4)灌流约20m in后,换用37℃的通氧胶原酶灌流液(组成:HBSS100mL, HEPES0.238g,CaCL20.07g,胶原酶I V0.075g,胰蛋白酶0.01g,NaHCO30.035g,pH7.4)继续灌流10m in后取下肝脏,剪开肝包膜,将肝细胞悬液过滤清洗后悬浮于含100mL/L新生小牛血清的DME M培养基中,并用台盼蓝染色法检测细胞活力达90%.将肝细胞随机分成11组,即正常对照组、模型对照组、全方制剂含药血清组、阴性制剂含药血清4组和单味药含药血清4组,每组设6个复孔,以1×105个/c m2接种于96孔及48孔板中,置CO2培养箱37℃培养.细胞培养24h后,弃上清液,模型对照组和各试验组更换为加入CCL410mmol/L的D ME M培养液,正常对照组用D ME M培养基,并在各试验组中加入终浓度为100mL/L各含药血清,正常对照组和模型对照组加入终浓度为100mL/L的空白血清,作用24h后,收集48孔板中培养上清液检测丙氨酸氨基转移酶(ALT).96孔板中每孔加入5g/L的MTT液20μL,继续孵育4h,每孔再加入D MS O200μL,振荡后用酶标仪测A570nm,其值越高说明细胞活力越强.统计学处理:数据以x±s表示,使用stata7.0统计软件包进行统计处理,样本数据比较采用单因素方差分析和HS D检验,以P<0.05为显著性判断界值.2　结果2.1　各组血清的HP LC检测　与空白血清色谱图比较,全方制剂含药血清中产生了13个药源性成分,单味五味子及三七、柴胡、叶下珠阴性制剂含药血清中均检测到了这13个成分,而五味子阴性及单味三七、柴胡、叶下珠制剂含药血清均未发现药源性成分(图1～4).图1　五味子(A)、五味子阴性(B)、全方(C)含药血清及空白血清(D)色谱图图2　三七(A)、三七阴性(B)、全方(C)含药血清及空白血清(D)色谱图图3　柴胡(A )、柴胡阴性(B )、全方(C )含药血清及空白血清(D )色谱图图4　叶下珠(A )、叶下珠阴性(B )、全方(C )含药血清及空白血清(D )色谱图2.2　各组含药血清对肝细胞活力及AL T 泄漏的影响　与正常对照组比较,模型对照组细胞MTT 值显著下降(P <0.01,表1),上清液中ALT 显著升高(P <0.01),表明造模成功;与模型对照组比较,全方、三七阴性制剂及柴胡阴性制剂含药血清组MTT 值显著提高(P <0.01),单味五味子MTT 值有下降趋势,但无统计学意义.全方、单味五味子及三七、柴胡、叶下珠阴性制剂含药血清组ALT 均明显降低(P <0.01),三七、柴胡及叶下珠在方中作用不明显;与全方含药血清组比较,单味三七、柴胡、叶下珠及五味子阴性制剂含药血清组MTT 值均明显降低(P <0.01),ALT 均明显升高(P <0.01),而单味五味子及三七、柴胡、叶下珠阴性制剂含药血清组MTT 值及ALT 则均没有差异.3　讨论关于动物或人服用药物后血液中产生的与药物因素有关的成分目前还没有统一的定义,有学者将其统称为“血中移行成分”[5],我们将其统称为“血中药源性成分”[6],包括药物原形成分及其代谢产物,也包括药物因素诱导体内产生的内源性成分.大鼠灌胃复方五仁醇胶囊后血液中产生13个药源性成分并且全部来自君药五味子经10批含药血清指纹图谱的检测证实,其中8个为制剂原形成分(色谱图中的6至13号峰),5个为代谢产物(色谱图中的1至5号峰)[4],8个原形成分中的7个分别被鉴定为五味子醇甲、戈米辛J 、五味子醇乙、五味子甲素、戈米辛N 、五味子乙素和五味子丙素,并且所有13个成分的紫外光谱均具有木脂素类成分的吸收特征(待发表).表1　肝细胞增殖及培养上清液中丙氨酸氨基转移酶测定(n =6,x ±s )组别A 570n mALT (U /L )正常对照 1.191±0.140df 9.67±1.63df 模型对照0.482±0.061bf 36.33±4.80bf 全方制剂0.734±0.091bd 21.33±1.75bd 单味五味子0.572±0.022b 24.50±3.02bd 单味三七0.450±0.010bf 32.00±2.61bf 单味柴胡0.491±0.016bf 36.83±5.04bf 单味叶下珠0.424±0.022bf 35.17±3.49bf 五味子阴性0.468±0.037bf 31.17±3.19bf 三七阴性0.756±0.077bd 23.83±2.32bd 柴胡阴性0.694±0.076bd 21.17±2.14bd 叶下珠阴性0.646±0.057b22.33±2.07bdbP <0.01vs 正常对照;d P <0.01vs 模型对照;f P <0.01vs 全方制剂. 本次药效研究结果显示,全方、单味五味子及三七、柴胡、叶下珠阴性制剂含药血清对肝细胞损伤均具有明显的保护作用,而单味三七、柴胡、叶下珠含药血清作用不明显,且单味五味子与全方制剂含药血清组之间药效无显著差异,谱效之间具有很好的相关性,提示复方五仁醇胶囊保肝作用的药效物质基础主要来自君药五味子所含的木脂素类成分.【参考文献】[1]潘卫松,刘美凤,石　钱,等.血清药理学、血清化学和中药药代动力学[J ].世界科学技术中药现代化,2002,4(3):51-55.[2]窦志华,施　忠,李伟红,等.复方五仁醇胶囊的研制[J ].时珍国医国药,2005,16(10):953,957.[3]窦志华,丁安伟,王陆军,等.复方五仁醇胶囊HP LC 指纹图谱研究[J ].山东中医药大学学报,2006,30(5):384-387.[4]窦志华,丁安伟,王陆军,等.复方五仁醇胶囊含药血清指纹图谱研究[J ].中国药学杂志,2007,42(12):892-895.[5]王喜军,张　宁,孙　晖,等.六味地黄丸的血清药物化学研究[J ].中国天然药物,2004,2(4):219-222.[6]窦志华,丁安伟,王陆军,等.复方五仁醇胶囊血清药化学研究[J ].中草药,2006,37(8):1137-1140.编辑　王　睿。