利用Creloxp定位重组系统构建雄性不育基因 和恢复基因表达载体
Cre-loxP、CRISPR-Cas9技术与病毒载体在基因敲除中的联用
基因敲除技术在病毒感染性疾病治疗中的应用
基因敲除技术能够消除病毒复制所需的宿主细胞内基因从而阻止病毒的复制和感染。
基因敲除技术可以用于开发新型抗病毒药物通过抑制病毒复制或干扰病毒生命周期的关键环节 来治疗病毒感染。
基因敲除技术可以用于基因治疗通过将正常基因导入宿主细胞替代缺陷基因恢复细胞功能达到 治疗目的。
CRISPR-Cs9与病毒载体的联用
Cre-loxP技术用于控制基 因表达
CRISPR-Cs9技术用于编 辑基因
病毒载体在基因敲除中的重 要作用
Cre-loxP、CRISPR-Cs9 技术与病毒载体的联用原理
三者联用的优势与挑战
优势:Cre-loxP、CRISPR-Cs9技术与病毒载体在基因敲除中的联用可以实现高效、精准 的基因敲除有助于研究基因功能和疾病治疗。
基因敲除技术简介 Cre-loxP系统在基因敲除中的应用 CRISPR-Cs9系统在基因敲除中的应用 病毒载体在基因敲除中的联用
基因敲除技术在癌症治疗中的应用
基因敲除技术能够精准地编辑人类基因为癌症治疗提供了新的手段。
通过敲除致癌基因或激活抑癌基因基因敲除技术可以有效抑制癌症细胞的生长和扩散。 基因敲除技术在癌症治疗中具有个体化、精准化的特点可以降低治疗副作用和提高治疗 效果。 目前基因敲除技术在癌症治疗领域仍处于研究阶段但已取得了一定的成果和进展。
基因敲除技术还可以用于疫苗开发通过消除病毒基因中的关键位点降低病毒的毒力或致癌性从 而开发出更安全、更有效的疫苗。
06
未来展望与研究方向
Cre-loxP、CRISPR-Cs9技术与病毒载体联用技术的发展 前景
技术改进:随着 基因编辑技术的 不断进步CreloxP、 CRISPR-Cs9与 病毒载体的联用 技术将得到进一 步优化提高敲除 效率和应用范围。
cre-loxp系统在大脑特定区域进行基因敲除的原理
cre-loxp系统在大脑特定区域进行基因敲除的原理Cre-loxp系统是一种常用的基因敲除技术,用于特定区域的基因敲除。
该系统是通过两种转基因技术相互配合实现的,即Cre重组酶和loxp位点。
Cre重组酶是一种由细菌噬菌体产生的酶,能够识别和剪切含有loxp位点的DNA序列,从而实现特定区域的基因敲除。
Cre-loxp系统的原理如下:1. Cre重组酶的表达:首先,使用基因工程技术将Cre酶的编码基因嵌入到转基因小鼠的基因组中,使其能够在特定的组织或细胞类型中产生。
通过引入特定的启动子或组织特异性表达的促进子,可以实现Cre重组酶在目标组织或细胞中的表达。
2. 基因敲除载体:在目标基因的启动子或内含子区域,插入一对loxp位点。
loxp位点是一种特殊的DNA序列,约有34个碱基对,呈倒向重复,用于诱导Cre重组酶的作用。
3. Cre重组酶的介导:一旦Cre重组酶在目标组织或细胞中表达,它能够识别和结合含有loxp位点的DNA序列,并结合在loxp位点上。
Cre重组酶在loxp位点间发生酶活性,通过识别和切割这两个loxp位点间的DNA链,将目标基因位点裂解。
4. 基因敲除效应:一旦目标基因位点被裂解,无法继续正常转录和翻译,从而导致目标基因的敲除。
这样,就实现了在特定区域的基因敲除。
Cre-loxp系统具有以下特点和优点:1. 灵活性:Cre-loxp系统可以在不同的组织或细胞类型中实现基因敲除,由于Cre重组酶的表达是由特定启动子或组织特异性表达的促进子控制的,因此可以实现组织或细胞特定的基因敲除。
2. 高效性:Cre重组酶的催化作用很高效,能够在较短的时间内进行特定区域的基因敲除。
3. 精确性:Cre重组酶只能识别和剪切含有完整loxp位点序列的DNA链,因此能够实现精确的目标基因敲除,而不会对其他基因产生影响。
4. 可逆性:如果需要在特定的时期或特定的组织中恢复目标基因的表达,只需停止Cre重组酶的表达即可。
基因打靶 cre-loxp重组酶系统
基因打靶基因打靶包括:胚胎干细胞的获得和培养、打靶载体的构建、重组ES细胞的筛选、嵌合体小鼠的制备、基因敲除小鼠的建立、Cre-loxP系统、FLP/FRT系统和条件性基因敲除、基因敲入和大规模ES细胞突变库的建立。
基本概念:1.基因打靶:是利用同源重组技术来定点改变物种的基因组顺序和结构,从而在突变的个体内来研究基因及基因组的功能。
2.基因敲除:是使用基因组中某个/某几个基因或基因的顺式元件产生缺陷,从而在突变体内。
3.丧生正常的功能,来推测这些基因或元件原来在体内的功能。
基因敲入:在个体基因组中定点加入某个/某几个基因或顺式元件,使之表达或发挥作用,从而研究该基因或顺式元件在体内的功能。
4.基因打靶技术是一种定向改变生物活体遗传信息的实验手段。
它的产生和发展建立在胚胎干细胞技术和同源重组技术成就的基础之上,并促进了相关技术的进一步发展。
自1987年早期胚胎干细胞技术建立及第一例基因剔除小鼠诞生以来,基因打靶的研究进展迅速,给现代生物学和医学研究带来了革命性的变化,并直接引发了现代生物学和医学研究各个领域中许多突破性的进展,成为后基因组时代研究基因功能最直接和最有效的方法之一。
一、胚胎干细胞的获得和培养基因打靶中用的小鼠ES细胞系有:D3、E14、R1、J1、CCE,均来源于129小鼠品系和其杂交品系(因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向,是基因敲除的理想实验动物)。
ES 623和B6-IIIES细胞系,来源于C57BL/6小鼠品系。
BALB/c-I,来源于BALB/c小鼠品系。
常用的饲养层细胞为PMEF(小鼠原代胚成纤维细胞。
PMEF需6 Gy的X 射线照射或丝裂霉素C处理细胞抑制生长后才能用作饲养细胞)。
建立ES细胞的过程中,最好采用只传了2-3代的原代小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养细胞,所取得的ICM(内细胞团)只有10%-30%的几率建立ES细胞系。
一旦ES 克隆被确定,接下来应该考虑检查ES细胞的核型。
Cre-loxp系统
Cre-loxp系统Cre-lox系统介绍及使⽤汇总由于Cre-lox系统具有操作简单、重组率⾼的优点,如今已经成为体内外遗传操作的强有⼒⼯具。
利⽤Cre-lox系统,可以在特定细胞、组织或整个⽣物体,甚⾄在特定时间点敲除或表达某个基因,实现对特定基因的时空特异性操作,这对基因功能的研究和⼈类疾病动物模型的建⽴都具有深刻影响。
1.什么是Cre-lox系统?从名字就能知道这套系统的两个主要组成部分:(1)Cre重组酶环化重组酶(Cre,cyclizationrecombinase),是酪氨酸位点特异性重组酶之⼀,能催化两个DNA 识别位点之间的位点特异性重组。
Cre重组酶来源于P1噬菌体,由343个氨基酸组成,能特异性地识别Lox位点。
除Cre以外,此类重组酶还有Flp(flipase)和Dre(D6特异性重组酶)。
(2)Lox位点Cre重组酶识别的回⽂DNA位点,也叫loxP(locusofX-overP1)位点,长34bp,其特征结构为ATAACTTCGTATA?-NNNTANNN-TATACGAAGTTAT。
两边反向互补的13个碱基为Cre重组酶的识别序列,中间的8个碱基为重组发⽣位置,这也决定了loxP的⽅向。
N表⽰可变碱基,不同的碱基选择可形成不同的Lox位点,除了野⽣型loxP,常见的还有Lox2272,Lox511,Lox5171等等,这些突变Lox位点也能被Cre重组酶识别,但是只有两个序列相同的Lox位点之间才能发⽣重组。
在同⼀个DNA分⼦上,根据Lox位点的位置与⽅向,可能会发⽣3种不同的重组事件:(1)切除:当两个Lox位点在同⼀染⾊体上且⽅向相同时,将切除同向Lox位点之间的DNA序列(也叫Lox侧翼序列,Flox序列)。
(2)反转:当两个Lox位点位于同⼀染⾊体上且⽅向相反时,两个Lox位点之间的序列发⽣序列反转,即颠倒。
(3)易位:如果两个Lox位点位于不同的染⾊体上且⽅向相同,则易位事件将导致DNA ⽚段的交换。
cre-loxp原理
Cre-LoxP系统是一种基因编辑技术,其工作原理主要基于Cre重组酶和LoxP位点的相互作用。
Cre重组酶是一种由343个氨基酸组成的单体蛋白,由大肠杆菌噬菌体P1的Cre基因编码。
它具有催化活性,并能特异性识别LoxP位点。
LoxP位点是由两个13bp的反向重复序列和一个8bp的间隔区域组成的34bp序列,其中反向重复序列是Cre重组酶的特异识别位点,而间隔区域决定了LoxP位点的方向。
当基因组内存在LoxP位点时,一旦有Cre重组酶,便会结合到LoxP位点两端的反向重复序列区形成二聚体。
此二聚体与其他LoxP位点的二聚体结合,进而形成四聚体。
随后,LoxP 位点之间的DNA被Cre重组酶切下,切口在DNA连接酶的作用下重新连接。
重组的结果取决于LoxP位点的位置和方向,可能导致基因敲除、基因翻转、基因易位或基因插入等不同的基因编辑效果。
Cre-LoxP系统的这些特性使其在基因定点删除、外源基因定点整合、疾病动物模型建立、筛选高效表达基因座等方面得到了有效利用,成为体内外DNA重组的有力工具。
1。
植物无标记转化的诱导表达Cre_loxP重组系统的构建A
收稿日期:2007212207基金项目:国家自然科学基金项目(30460081);新疆维吾尔自治区高等学校科研计划资助项目(X J E DU2005S15)作者简介:段小瑜(19822),女,中山大学博士研究生,专业方向为植物基因工程;e 2mail :dxyu324@ 。
通讯作者:马兵钢(19722),男,副教授,博士,从事园艺生物技术的研究;e 2mail :mbg agr @ 。
第26卷 第1期2008年2月石河子大学学报(自然科学版)Journal of Shihezi University (Natural Science )V ol.26 N o.1Feb.2008文章编号:100727383(2008)0120030205植物无标记转化的诱导表达Cre/loxP重组系统的构建段小瑜,张录霞,马 超,郝青楠,马兵钢(石河子大学农学院,新疆石河子832003)摘要:应用Cre/loxP 系统位点专一性重组的特点构建诱导表达的定位重组系统,用以特异性的敲除转基因植物的标记基因。
为了获得诱导表达启动子,从大豆基因组DNA 中用pfu 酶克隆热激蛋白启动子gmhsp 17.5c ,将其克隆到pUC1182Hinc Ⅱ载体并测序。
结果表明,508nt 的gmhsp 17.5c 与已报道序列(G enBank ,AF544399)比较,核苷酸的同源性为99.8%。
利用该诱导启动子分别构建了含gmhsp 17.5c 2cre 基因组件和gmhsp 17.5c 2gus 基因组的诱导型植物表达载体pC23HC 和pC23HG 。
此外1个含有loxP 2gus 2loxP 组件的组成型植物表达载体pC23LG 被构建。
通过对3个植物表达载体做多重酶切及亚克隆后测序分析表明载体pC23HC 全长10947bp ,载体pC23HG 全长11396bp ,载体pC23LG 全长11900bp ,符合预期设计。
cre-loxp基因敲除系统
背景介绍
1981 年Evans 等首次在体 外分离和培养ES,成功建 立了小鼠胚胎干细胞系
1985 年Smithies最早在哺乳动 物细胞中发现并实现了同源重 组
同源重组
Homologus Recombination
同源重组是指发生在姐妹染色单体(sister chromatin) 之间或同 一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合 。在基因敲除小鼠制作过程中,需要针对目的基因两端特异性片 段设计带有相同片段的重组载体,将重组载体导入到胚胎干细胞 后外源的重组载体与胚胎干细胞中相同的片段会发生同源重组
三、Cre工具鼠的构建
DNA显微原核注射,是指将外源DNA通 过显微注射的方法注射到受精卵的原 核内,注射DNA整合到小鼠受精卵的 基因组中,并稳定遗传给后代。
诱导性组织特异性Cre工具鼠的载体构建
MHC (cardiac-specific a-myosin heavy chain) Mer (mutated murine estrogen receptor ligand-binding domain amino
MerCreMer融合蛋白
该系统将雌激素受体(Estrogen Receptor,ER)的 配体结合区(ligand-binding domain,LBD)和Cre 重组酶进行融合,产生一种嵌合重组酶,该嵌 合重组酶的表达被置于特异启动子的调节之下 ,从而使其在特定组织和器官或者特定发育阶 段产生。但是只有该嵌合重组酶并不能发挥 Cre重组酶的活性,因为雌激素受体结合区的 存在使其不能进入核内与loxP位点相结合。只 有加入雌激素后才能使其进入核内发挥作用。
基因敲除机理 (续)
Offspring: 25% homozygous knockout after 2 generation
creloxp重组酶系统原理
Cre-loxp重组酶系统是一种常用的基因编辑技术,它可以在特定的DNA序列上实现特异性的编辑和改变。
本文将从原理、应用和发展趋势等方面对Cre-loxp重组酶系统进行介绍。
一、Cre-loxp重组酶系统的原理1. Cre重组酶Cre重组酶是一种来源于大肠杆菌的酶,它能够识别和结合特定的DNA序列loxp,并在该序列上引发DNA的重组事件。
Cre酶最初是在嗜盐古细菌(Archaeoglobus fulgidus)中发现的,后来被用于基因编辑和遗传工程领域。
2. loxp序列loxp序列是Cre-loxp重组酶系统中的关键部分,它是一种DNA序列,长度为34个碱基对,其中包含了两个逆向定向重组位点。
这样的结构使得Cre酶可以选择性地将该序列分为两部分,并引发DNA片段的剪接和重组。
3. Cre-loxp重组酶系统的原理当Cre重组酶与loxp序列结合后,它将在该序列上诱导DNA的重组,使得该序列内的基因组成发生改变。
这种改变可以是插入、缺失、逆向或转向等,具体取决于Cre酶与loxp序列的相对定向。
Cre-loxp重组酶系统可以实现对特定DNA序列的编辑和改变。
二、Cre-loxp重组酶系统的应用1. 基因敲除通过Cre-loxp重组酶系统,可以实现对特定基因的敲除。
具体而言,首先需要在目标细胞中导入一个含有loxp序列的质粒,然后再导入Cre重组酶。
Cre酶与loxp序列结合后,将引发目标基因的敲除,从而实现对该基因的功能破坏或消除。
2. 基因激活除了基因敲除外,Cre-loxp重组酶系统还可以实现对特定基因的激活。
这种激活方式通常是通过插入或逆向调控目标基因的转录和翻译,从而增加目标基因产物的表达水平。
3. 细胞命运的调控在细胞生物学领域,Cre-loxp重组酶系统也被广泛应用于调控细胞的命运和功能。
通过敲除或激活特定基因,可以实现对细胞增殖、分化、凋亡等过程的调控,从而揭示细胞内部的生物学机制。
2023北京高三二模生物汇编:基因工程的基本操作程序
2023北京高三二模生物汇编基因工程的基本操作程序一、单选题1.(2023·北京房山·统考二模)草甘膦是无选择性除草剂的有效成分,施用时也会“误伤”作物致死,其机理是抑制与植物多种代谢途径有关的EPSP合酶的活性。
研究人员试图培育抗草甘膦作物,如图。
相关说法正确的是()A.①过程的目的基因是抑制EPSP合酶的基因B.①过程可利用农杆菌将重组DNA导入矮牵牛细胞C.①过程运用植物体细胞杂交技术培养成转基因矮牵牛D.转基因矮牵牛存活说明EPSP合酶表达水平下降有利于抗草甘膦2.(2023·北京西城·统考二模)医生可利用分子生物学技术检测受检人是否携带HIV。
下列叙述错误的是()A.可根据HIV的RNA序列合成小段DNA作为引物B.血液样品中HIV的RNA经逆转录后进行PCR检测C.可通过抗原-抗体杂交技术检测血液样品中HIV抗原D.与检测抗原、核酸相比,检测抗体能更早诊断HIV感染3.(2023·北京昌平·统考二模)转座子是基因组中可移动的DNA片段,玉米Ac转座子能编码转座酶而自主转座,Ds转座元件只有与Ac转座子同时存在时,才能从原位点切离并插入到新位点中。
研究者利用玉米转座子系统构建烟草突变体,下列叙述错误的是()A.推测Ds转座元件不具有编码转座酶功能B.可构建同时含有Ac/Ds的基因表达载体C.利用农杆菌转化法将基因表达载体导入烟草细胞D.Ds与其被插入的基因间发生基因重组4.(2023·北京朝阳·统考二模)下列生物学实验中,观察实验现象时需借助仪器的是()A.利用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物B.提取和分离菠菜叶片中光合色素(2)为协调菌体生长与产物生产之间的关系,将构建好的重组质粒转入经______处理后的枯草芽孢杆菌(D(4)对三种枯草芽孢杆菌进行培养,结果如图3,请选择适宜工业发酵生产的菌种并阐明理由________。
cre名词解释微生物
cre名词解释微生物CRE(的全称为Cre/loxP重组酶系统)是一种常用的遗传工程技术,被广泛应用于微生物学研究中。
本文将对CRE进行详细解释和探讨。
1. CRE的定义与原理CRE是一种重组酶系统,由Cre重组酶和loxP位点组成。
Cre重组酶是一种遗传物质(蛋白质),其功能是调控目标DNA分子上的重组反应。
loxP位点则是一种特定的DNA序列,它是CRE酶作用的靶标。
通过CRE和loxP的相互作用,可实现DNA分子的重组、插入或剪切等操作。
2. CRE的应用领域微生物学中,CRE被广泛用于基因组工程、基因表达调控、病毒病理研究等方面。
具体应用包括:- 基因敲除和基因突变:利用CRE的重组功能,可以靶向敲除或突变目标基因,从而实现研究该基因功能或解析其对生物体的作用。
- 基因表达调控:通过在目标基因上插入loxP位点,再利用CRE酶的活性,可以实现基因的激活或抑制,从而调控基因表达水平。
- 基因标记和追踪:结合荧光基因和CRE/loxP系统,可以标记特定细胞或组织,以追踪其在生物体内的分布和命运。
- 病原体研究:利用CRE/loxP系统,可以构建感染模型,研究病原体的致病机制、感染途径等,并探索相应的防治策略。
3. CRE的优势和局限性CRE/loxP系统在微生物学研究中具有以下优势:- 高度特异性:CRE酶对loxP位点的识别和结合具有高度特异性,因此可以实现准确的基因重组和操控。
- 灵活性:CRE/loxP系统可以在不同细胞类型和生物体中应用,且操作相对灵活,可以根据需要进行精细调整。
- 低毒性:CRE酶的表达对细胞或生物体的毒性较低,因此对被操作的生物体影响较小。
然而,CRE/loxP系统也存在一些局限性:- 依赖loxP位点:CRE/loxP系统必须在目标DNA上存在loxP位点才能发挥作用,因此需要在目标基因中进行插入或改造。
- 重组效率有限:CRE/loxP系统的重组效率受到多种因素的影响,包括CRE酶的表达水平、loxP位点的位置等,可能存在一定的不可控性。
rescue实验转染步骤
rescue实验转染步骤背景技术:在细胞中敲除靶基因并观察所得表型是生物学研究中确定一个基因功能最常用的方法。
然而,有一些基因是维持细胞存活必不可少的,称为必需基因。
直接敲除必需基因,将导致细胞死亡,无法研究敲除后对细胞功能的影响。
这类基因只能靠条件性敲除研究。
已有的几种条件性敲除方法总结如下:(1)cre/loxp重组系统是条件性敲除必需基因最常用的方法。
该技术需要在靶基因两侧插入一对34bp的loxp位点,在cre重组酶作用下,两个lox位点之间的序列会发生重组删除。
所用的cre重组酶一般为mer—cre—mer,加雌激素cre可以发挥重组功能。
cre 需要整合到基因组上表达。
(2)另一种常用的方法是利用tet—on/tet—off调控基因表达。
首先构建一个稳定表达转录激活因子tta的细胞系,然后将tre启动子插入到内源基因上游启动子序列中,这样就可以调控内源基因表达。
也可以先引入外源基因,再将内源基因敲除,外源基因启动子为tre 启动子,受dox调控表达。
然而这些方法都需要多个步骤来构建外源基因稳定整合的细胞系,耗时耗力。
研究突变对基因功能的影响时,往往需要将突变引入到内源基因上,工作量很大。
技术实现要素:为了克服现有技术的不足,本发明目的在于提供一种在细胞系中条件性敲除必需基因的方法及研究必需基因突变体功能的方法。
本发明方法简单、快速、有效。
本发明通过构建同时存在条件下细胞才能存活的一个双质粒系统,把crispr/cas9基因编辑系统、tet—off诱导调控系统和外源基因克隆到这个双质粒系统中,实现必需基因条件性敲除。
本发明的技术方案具体介绍如下。
本发明提供一种在细胞系中条件性敲除必需基因的方法,具体步骤如下:(1)构建双质粒系统,双质粒系统包含ko质粒(敲除质粒)和rescue质粒(营救质粒),ko质粒含有用于敲除内源基因的sgrna 和cas9基因,用于调控外源基因表达的tta基因和负责质粒在真核细胞中复制的ebna1和orip元件;rescue质粒含有补偿敲除的必需基因的外源补偿基因,用于筛选转染成功细胞的抗药基因和在ebna1蛋白的作用下可以使质粒在真核细胞中复制的orip元件;将靶向目的基因的sgrna克隆到ko质粒上,将外源补偿基因cdna克隆到rescue质粒上;(2)将双质粒系统转染到细胞中,在药物筛选下培养若干天,分选单克隆,测序鉴定,即筛选出必需基因纯合敲除的细胞系。
Cre_lox位点特异性重组系统在高等真核生物中的研究进展_龙定沛
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Cre/lox 位点特异性重组系统概述
1981 年 , Sternberg 和 Hamilton [5]在 P1 噬菌体中
发现了 Cre/lox 位点特异性重组系统。不同于 λ、P2 等其他温和型噬菌体 , P1 噬菌体浸染宿主之后 , 其 基因组 DNA 在通常情况下并不整合至宿主染色体 , 而是以单拷贝可自主复制的环状质粒形式存在于宿 主细胞中 [6]。 Sternberg 等 [5, 7]发现 P1 噬菌体基因组 末端的冗余序列包含多拷贝的 loxP(locus of crossing over(x), P1)位点 , 在 P1 噬菌体 cre(causes recombination)基因编码的环化重组蛋白 (Cyclization recombination protein, Cre)作用下 , 两个 loxP 位点之间发 生特异性重组 , 引起 P1 噬菌体基因组的环化。 1.1 Cre/lox 系统的重组酶和重组位点 Cre 重组酶是一种由 343 个氨基酸组成的多肽 单体蛋白 , 其分子量约为 38 kDa[8]。 Cre 重组酶的 343 个氨基酸折叠形成两个结构域 [9]:较小的 N-末 端结构域 (NTD, 由 110 个氨基酸残基组成 )和较大的 C- 末端结构域 (CTD, 由 210 个氨基酸残基组成 ) 。 NTD 由 5 个 α-螺旋 (α-helices: A-E)通过环 (Loops) 连接而成。 CTD 由 2 个 β-折叠 (β-sheet)和 9 个 α-螺 旋 (α-helices: F-N)组成 , 它包含 Cre 重组酶的活性中
关键词:
Cre/lox 重组系统 ; 基因操作 ; 位点特异性重组 ; 基因打靶
Progress in Cre/lox site-specific recombination system in higher eukaryotes
2023-2024学年江苏省苏州市高三1月期末生物试题
2023-2024学年江苏省苏州市高三1月期末生物试题1.肺炎支原体和肺炎链球菌均可能引发肺炎。
下列有关叙述正确的是()A.两者遗传物质彻底水解都能得到六种小分子物质B.两者均可利用宿主细胞的核糖体合成自身蛋白质C.两者引发的肺炎症状相似,都可用适量青霉素治疗D.两者均能引发特异性免疫,无法通过检测核酸区分2.当细胞接受到凋亡信号后,位于线粒体内膜上的细胞色素c(参与电子传递)会释放进而引发细胞凋亡。
研究人员用某种药物处理家蚕细胞不同时间后,用凝胶电泳法测定细胞不同结构中细胞色素c及微管蛋白的含量,结果如下图所示。
下列有关叙述错误的是()A.细胞色素c参与有氧呼吸第三阶段的化学反应B.在细胞中含量比较稳定的微管蛋白可作为实验参照C.该种药物可促使细胞色素c释放到细胞质基质D.凝胶电泳分离不同蛋白分子的关键是所带电荷性质3.生物实验的成败与实验的选材密切相关。
下列实验中材料或试剂选择不恰当的是()A.选用蝗虫精巢而非小白鼠卵巢,观察减数分裂的不同时期B.选用黑藻小叶而非洋葱鳞片叶外表皮,研究光合作用的放氧部位C.选用血细胞计数板而非载玻片,探究培养液中酵母菌种群数量变化D.选用淀粉酶而非过氧化氢酶,探究温度对酶活性的影响4.下列有关进化的叙述错误的是()A.物种之间的协同进化可以通过捕食、竞争及寄生等实现B.各种金鱼品种的获得与突变和基因重组、人工选择等有关C.种群数量低到一定程度可能会因近亲繁殖导致适应性降低D.生物的适应性主要体现在特定生物对其所生活环境的适应5.水体中氧浓度远远低于空气中的氧浓度,高海拔地区气压低、氧分压也低。
不同生物对缺氧环境的适应方式各异。
下列有关叙述错误的是()A.沉水植物通过增加气孔数量和开放程度来获得充足的氧气B.荷花的器官中具有发达的通气组织为地下茎和根提供氧气C.人初上高原,呼吸中枢对CO 2的敏感性会增高以适应低氧D.某些鱼类可通过增加流过鳃的水体积以提升氧气的获取量6.植物的生命活动调节受到多种生态因子的影响。
敲除小鼠常见问地的题目与回答
敲除小鼠常见问题与回答一、什么是ES细胞显微注射?答:胚胎干细胞显微注射是制作基因敲除小鼠的一个最常用的方法。
主要过程是将携带目的基因的胚胎干细胞注射到小鼠的囊胚腔中获得嵌合体小鼠。
所得嵌合体小鼠的组织,将同时含有来源于囊胚的细胞和胚胎干细胞。
嵌合体小鼠必须和野生型小鼠配种以决定遗传改变的生殖系能否传递,这样可能获得转基因或打靶基因(来源于胚胎干细胞)稳定的生殖系传递的小鼠。
一般情况下,大约能获得50%继承了目的基因的后代。
二、嵌合体遗传学上用以指不同遗传性状嵌合或混杂表现的个体。
免疫学上的涵义则指一个机体身上有两种或两种以上染色体组成不同的细胞系同时存在,彼此能够耐受,不产生排斥反应,相互间处在嵌合状态。
在基因敲除鼠中指通过向囊胚注射被外源基因转化了的胚胎干细胞,使得发育成为的个体中含有不同基因型的细胞,产生的个体也叫嵌合体,即该生物体中嵌合了两种不同遗传结构的细胞(一种是基因型被改变了的细胞,另一种是原来的基因型的细胞)。
三、条件性敲除的原理?答:Cre-LoxP系统是源于P1噬菌体的一个DNA重组体系,由Cre酶和相应的LoxP位点组成,它能导致重组发生在特定的DNA序列处(LoxP位点),该系统可以将外源基因定点整合到染色体上或将特定DNA片段删除。
基于Cre-LoxP的基因打靶要分两步来进行。
首先要在胚胎干细胞的基因组中引入LoxP序列,这一步可以通过打靶载体的设计和对同源重组子的筛选来实现。
下一步通过Cre介导的重组来实现靶基因的遗传修饰或改变。
Cre-LoxP系统既可以在细胞水平上用Cre重组酶表达质粒转染中靶细胞,通过识别LoxP位点将抗性标记基因切除,又可以在个体水平上将重组杂合子小鼠与Cre转基因小鼠杂交,筛选子代小鼠就可得到删除外源标记基因的条件性敲除小鼠。
四、如何鉴定和挑选嵌合体?答:动物只有部分组织细胞整合有外源基因,则称为嵌合体动物。
它的鉴定主要根据毛色去鉴定。
注射的ES和囊胚来源不同的小鼠品系。
loxp的基因序列 -回复
loxp的基因序列-回复什么是基因序列?基因序列是指生物体中基因的排列顺序。
基因是DNA分子的一部分,通过基因序列的不同组合和顺序,决定了生物的遗传特征和功能。
每个生物体都有自己独特的基因序列,它们在生物体内以特定的方式编码和指导蛋白质的合成。
基因序列的研究对于理解生物进化、遗传性疾病和个体差异非常重要。
loxp基因序列是什么?loxp基因序列是一种常用于基因组工程中的DNA序列。
它是一段50 bp (碱基对)长的DNA序列,含有两个直接重复的loxp位点。
loxp位点是由Cre酶识别和切割的特定序列,用于实现DNA的定点重组和基因缺失。
通过引入loxp位点,研究人员可以在特定组织或细胞类型中激活或关闭目标基因的表达,从而研究基因底物的功能。
loxp基因序列的应用1. 创造基因敲入模型:将含有loxp位点的目标基因导入到特定组织的细胞中,并通过激活Cre酶表达来实现目标基因的表达。
这种方法可以用于研究基因在特定组织中的功能和调控机制。
2. 创造基因敲除模型:将含有loxp位点的目标基因导入到胚胎干细胞中,然后通过表达Cre酶来切除目标基因。
这种方法可以用于研究基因缺失对生物体发育和功能的影响。
3. 创造条件性基因敲入或敲除模型:通常使用转基因鼠来实现条件性基因敲入或敲除。
通过制备含有条件性表达Cre酶的转基因鼠,并在特定诱导剂的存在下激活Cre酶的表达,可以实现目标基因的条件性表达或缺失。
这种方法可以研究基因在特定时间和环境条件下的功能。
4. 创造组织特异性基因表达模型:通过将含有loxp位点的目标基因导入到特定组织的细胞中,在Cre酶表达的存在下只激活目标基因的表达。
这种方法可以研究基因在特定组织中的功能和调控。
总结loxp基因序列是一种重要的DNA序列,在基因组工程中被广泛应用。
通过利用loxp位点和Cre酶的组合,研究人员可以创造各种类型的转基因模型,从而深入研究基因底物的功能和调控机制。
条件性基因敲除的基本原理Cre/loxP重组系统
条件性基因敲除的基本原理Cre/loxP重组系统条件性基因敲除的基本原理 Cre / loxP 重组系统条件性基因敲除主要是通过Cre/10xP或者Ftp/FRT重组系统来实现的。
这两个系统都是位点特异性重组酶系统,已发展成为在体内、外进行遗传操作的有力工具。
这两个系统的应用,可以使靶基因的表达或缺失发生在试验动物发育的某一阶段或某一特定的组织器官。
此外,若与控制Cre或Flp表达的其他诱导系统相结合,还可以对某一基因同时实现时空两方面的调控。
1.Cre/loxP系统的原理Cre/loxP系统来源于F1噬菌体,可以介导位点特异的DNA重组。
该系统含有两种成分:①一段长34bp的DNA序列,含有两个13 bp的反向重复序列和一个8 bp的核心序列。
这段34bp序列是重组酶识别的位点,被称为loxP位点(10cus of X―over in P1)。
②Cre重组酶(cyclizationrecombination),它是一种由343个氨基酸组成的单体蛋白,可以引发loxP位点的DNA重组。
任何序列的DNA,当其位于两个loxP位点之间的时候,在Cre重组酶的作用下要么被缺失(两个loxP位点的方向相同),要么方向发生倒转(两loxP位点的方向相反),如图所示。
Cre/loxP系统的作用机制2.Cre/loxP系统优点Cre/10xP系统之所以在基因敲除中获得了非常广泛的应用,是由该系统的诸多优点决定的:①Cre重组酶与具有loxP位点的DNA片断形成复合物后,可以提供足够的能量引发之后的DNA重组过程,因此该系统不需要细胞或者生物体提供其他的辅助因子;②loxP位点是一段较短的DNA序列,因此非常容易合成;③Cre重组酶是一种比较稳定的蛋白质,因此可以在生物体不同的组织、不同的生理条件下发挥作用;④Cre重组酶的编码基因可以置于任何一种启动子的调控之下,从而使这种重组酶在生物体不同的细胞、组织、器官,以及不同的发育阶段或不同的生理条件下产生,进而发挥作用,这一点也是该系统在应用过程中最为重要的一点。
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were constructed by combining the features of Cre/loxp site-specific recombination system and F1 hybrid breeding. The vector which contained the
terminator, was cut down and then inserted in between the two directly oriented loxp sites of pG the plasmid pCAM , which contained the gene. The
mmol/L) 0.5 滋L, MgCl2 2.0 滋L (25 mmol/L) , 回收的 DNA 聚合酶 0.3 滋L (5U/ 滋L), PCR 产物 10 滋L, 加灭菌双蒸水 9.7 滋 L 至 25 滋L 总体积。 72℃ 保温
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材料和方法
1.1 质粒、 菌株和试剂 质粒 PUCm-T 载体为上海生工公司产品; 质粒 为 西南 pGEM-7Z、 pUC19、 pBluescript SK、 pCaM 农业大学 蔬 菜 研究 室保存; 质粒 pSTA (含有 基因, 源于 豌豆卷须)由 中国农业大学 植物生 理生化实验室赵广荣、肖兴国博士赠送;大肠杆菌 ( .) 菌株 BM25.8 (细 菌基因组中含 重组酶基因) 和 DH5琢 为西南农业大学蔬菜研 究室保存。限制 性内切酶、 T4DNA 连接酶、 Pfu 酶、 X-gal、 IPTG 等购自 Promega 和 MBI 公司。DNA 胶 回收试剂盒和质粒提取试剂盒购自宝生物公司。其 它化学试剂为国产分析纯。 DNA 测序由上海生工公 司完成。 1.2 大肠杆菌菌株 BM25.8 基因组 DNA 的提取 挑 取 单 菌 落 接种 于 5 mL 液 体 LB 培养 基, 37 ℃ 振荡培养 过 夜 。 取 1.5 mL 培养 物 提 取 基因组 DNA。提取方法参考文献[3]。 1.3 重组酶基因 PCR 引物的设计及扩增 根据 已 发 表的 重组 酶 基因 序 列 [4], 同 时为 增加重组酶进入核内的能力, 在设计引物时, 起 始密码子前加一段 9 个氨基酸的 SV40 核定位信号 序列 (NLS) 。
4 条寡核苷酸链用 1× T4 DNA 连接酶缓冲液溶 于 1.5 mL 离心管中等 解成相同浓度 (50 滋mol/L) 。 摩尔浓度混合 P1 和 P2 两条互补寡核苷酸链 (各取 5 滋L) , 10 × T4 DNA 连接 酶 缓冲液 4 滋L, 加 水 36 滋L 补足 至总 体 积 50 滋L, 加 盖 灭 菌 石蜡 油后 置 于 95℃ 热水中保温 5 min,自然冷却到室温。将退火后 的 P1 和 P2 互补 寡核苷酸链 插入 pGEM7Z 玉 得到 pG 和 d芋位点, 。用同样方法将 P3 和
P1: 5'-CTAGAATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAA GTTATGGTACCGATATCA-3'; P2: 5'-AGCTTGATATCGGTACCATAACTTCGTATAGCAT ACATTATACGAAGTTATT-3'; P3: 5'-AGCTTATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAA GTTATGAGCT-3'; P4: 5'-CATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTA TA-3';
then inserted in between the CaMV
box was cut down and inserted into plasmid pBINPLUS to obtain the final fertility-restoring expression vector pBINPLUS Cre/loxp site-specific recombination system; construction
用 于 PCR 扩增 反应 总 体 积 为 25 滋L: 10 × Pfu 2+ buffer(Mg 20 mmol/L) 2.5 滋L, dNTPs (10 mmol/L) 0.5 滋L, 上、下游引物各 1 滋L (10 滋mol/L), 模板
DNA 1 滋L (50 ng/ 滋L),Pfu 酶 0.5 滋L (5 U/ 滋L),灭菌 双 蒸 水 18.5 滋L。 95℃ 预变性 5 min 后按下述程序进 72 行 PCR 扩增 : 94 ℃ 变 性 1 min,58 ℃ 退火 1 min, ℃ 延伸 2 min, 共 30 个循环, 最后 72 ℃ 延伸 10 min 结 束 反 应 。 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。 1.4 扩增产物的克隆和重组克隆的筛选 将 PCR 产物用生工的柱式 PCR 产物回收试剂 盒回收,去除残留于其中的 PfuDNA 聚合酶后做加 A 尾巴处理: 10 × PCR buffer 2.5 滋 L, dATP (10
农业生物技术学报
Journal of Agricultural Biotechnology 2004,12
(4): 396~400
· · 研究论文
利用 Cre/loxp 定位重组系统构建雄性不育基因 和恢复基因表达载体 *
宋洪元 1** 曹必好 2 丁建刚 1 雷建军 2 宋 明 1
重庆 400716; 2. 华南农业大学园艺系, 广州 510642) (1. 西南农业大学园艺园林学院, 摘要: 结合 Cre/lox 定位重组系统和杂种一代的育种特点, 构建了反义肌动蛋白雄性不育基因表达载体 pCABARTA 相应的恢复基因表达载体 pBINPLUS 向插入 启动子下游的 基因及 盒连同 lox 位点切下插入 pCAM 将位于质粒 pSTA (含 中的反义肌动蛋白雄性不育基因表达盒 终止子) 切下插入中间克隆载体 pG 和
(1. College of Horticulture and Landscape, Southwest Agricultural University, Chongqing 400716, China; 2. Department of Horticulture, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China) The antisense actin sterile gene expression vector pCABARTA pBINPLUS antisense actin sterile gene expression box in pSTA pCABARTA and the fertility-restoring gene expression vector promtor antisense actin gene and Nos . The final expression vector gene was .
将这 Cre 重组酶能特异性地识别 34 bp 的 lox 位点, 根据 lox 位点的方向性和分布, 一系统引入细胞后, 可以使转基因中设定的 DNA 片段从基因组中高效 地切除、 或产生倒位、 或整合到另外的位置上。如果 两个识别位点方向相反,中间的 DNA 片段会发生 倒位;两个识别位点取向相同则中间的 DNA 片段
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会被切除;如果两个识别位点 分别位 于两个 DNA 整个系统重组仅需 Cre 分子上, 则会发生整合反应。 和 lox 识别位点即可完成而无需其它辅因子的参加 结合植物 [2 ]。鉴于 Cre/lox 定位重组系统上述特性, 杂种一代的育种特点,将不育基因表达盒置于两个 同向 lox 位点之间,转化植物后形成不育系, 基 因则构建植物表达载体, 转化植物后作为恢复系, 在 开花时通过有性杂交的方式将 基因引入不育系 将位于同向 lox 位点间 的不育基因表达 盒被切除, 育性得到恢复。 因而, 不论通过何种途径所造成的雄 性不育, 均可通过这种办法恢复其育性。 针对通过反义技术手段诱导植物雄性不育后无 定位 法得到恢复系的问题,本研究拟分离克隆 以 重组酶基因后构建恢复基因植物表达载体, 反义 肌动蛋白基因为雄性不育目的基因构建雄性不育基 分别将其转化植物, 因表达载体, 研究该系统在基于 反义雄性不育基因工程杂种一代育种中的应用。
* 基金项目: .国家自然科学基金 (No.30200185) 和重庆市应用基础研究项目 (No. 200217) 资助。
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第4 期
宋洪元等: 利用 Cre/loxp 定位重组系统构建雄性不育基因和恢复基因表达载体
反 启动子、 。 终
两个同向 lox 位点之间, 再将上述表达 双启动子和 。
,获得以除草剂 Basta 为筛选剂的反义肌动蛋白雄性不育基因表达载体 pCABARTA 基因, 克隆测序验证无误后插入 PBI525 CaMV
PCR方法从溶原菌 BM25.8 基因组 DNA 扩增出
止子之间, 再将表达盒切下插入 pBINPLUS 质粒相应位点, 得到恢复基因植物表达载体 pBINPLUS 关键词: Cre/loxp 定位重组系统; 雄性不育基因; 恢复基因; 表达载体构建
Constructions of Male Sterility Gene and Fertility Restoring Gene Expression Vectors by Cre/loxp Site-specific Recombination System
SONG Hong-Yuan1** CAO Bi-Hao2 DING Jian-Gang1 LEI Jian-Jun2 SONG Ming1
P1:5'-GACCATGGCTCCCAAGAAGAAGAGAAAGGTAAT GTCCAATTTACTGACCG-3' (下划线为 NLS 序列) ; P2: 5'-GCCGGAGCTCCTAATCGCCATCTTCCAG-3'。