循环内皮细胞及内皮细胞微粒的临床应用及其进展

循环内皮细胞及内皮细胞微粒的临床应用及其进展摘要循环内皮细胞（circulating endothelial cells，CECs）是30多年前在外周血涂片标本中发现的，自此陆续出现了很多关于CECs的提取、计数及应用的研究，特别是免疫磁珠分离法及荧光激活细胞分离技术的应用促进了对CECs进一步的了解。

内皮细胞微粒（endothelial microparticles，EMPs）是在1990年Hamilton等将补体蛋白C5b-9和钙离子载体A23187作用于脐静脉内皮细胞的实验中第一次通过流式细胞仪检测出一种的微粒，至此开始陆续有很多实验对EMPs的特征进行了描述并证实在多种疾病中有明显升高。

本文中，我们通过总结CECs及EMPs的计数方法及临床意义，深入了解循环CECs及EMPs的临床应用发展。

关键词循环内皮细胞内皮细胞颗粒检测方法临床应用循环内皮细胞（circulating endothelial cells，CEC）是指能够在外周血中测得的血管内皮细胞VEC（vascular endothelial cell），VEC具有多种生理功能，参与机体血管的舒缩、凝血、炎症、免疫、物质转运和生物活性物质释放等多种生命活动。

正常状态下，内皮细胞的更新率很低（0–1%），正常人体内的CECs数量非常少（0-10个/ml），血管损伤或新血管形成时，CECs会显著增多，因此CECs可以评估血管的病变程度，可直接反映血管内皮损伤。

内皮细胞微粒（endothelial microparticles，EMPs）是活化或凋亡的内皮细胞释放的直径﹤1微米级大小的囊泡，在反映内皮细胞的功能及血管生理中有重要的生物学意义，介导血管炎症、血栓形成，血管舒缩反应、血管生成等过程。

EMPs是评价内皮细胞功能紊乱的标志物，在不同的疾病中有着不同的反映。

1、CECs及EMPs的来源CECs是继发于血管损伤后血管内皮脱落的成熟内皮细胞，然而细胞脱落的机制有多种可能，目前尚未有统一结论。

不同的实验模型研究报道主要考虑可能由于机械损伤、内皮细胞粘附性能缺失、蛋白酶或细胞因子介导、细胞程序性凋亡等触发内皮细胞的抗原暴露，从而逐步进展至内皮细胞损伤与功能障碍，直至细胞凋亡或坏死脱落[1; 2]。

CECs在活化或凋亡时释放EMPs，关于EMPs的形成机制至今仍未明确阐明，可能与细胞骨架的破坏、膜磷脂不对称分布消失等原因有关。

EMPs表面表达多种内皮细胞膜表面的蛋白抗原，包括成熟内皮细胞表达的特异性黏附分子，如ICAM-1 (CD54)、选择素 E (CD62E)、选择素P(CD62P)、PECAM (CD31)、VE钙粘蛋白(CD144)等，以及其他特异性抗原，如endoglin (CD105)、S-endo1 (CD146)等。

不同EMPs所表达的膜抗原会因其产生原因的不同(活化或凋亡)而有所不同[3]。

2、CECs及EMPs的测定最早CECs的测定是在显微镜下对其形态学检测来分离及计数，但是这些方法都存在着血小板或其他细胞的干扰、对检测人员的要求较高、且缺乏特异性等问题，近年来逐渐出现了新的检测方法，如免疫磁珠法、荧光激活细胞分离技术，这些技术准确性高，特异性强。

2.1 CECs的测定2.1.1免疫磁珠法（Immunomagnetic isolation）免疫磁珠法最早是在用于检测外周血中的罕见细胞（例如转移性癌细胞），CECs也是外周血中的罕见细胞，免疫磁珠法能较好的检测CECs的存在。

此技术现将抗内皮细胞抗体包被于顺磁性微粒（Dynabead TM）上，然后再从全血中分离这些顺磁性微粒结合的内皮细胞[1]。

由于CD146分子在活化淋巴细胞、滋养层细胞、间充质干细胞、牙周组织及恶性肿瘤中均有一定程度的表达，所以为了纯化CECs的提取，必须对细胞进行二次标记，即结合荆豆凝集素（Ulex Europaeus lectin1，UEA-1）标记，其在多种疾病的内皮细胞中有着稳定的阳性表达，例如，肝窦内皮细胞UEA-1标记阳性而vWF则鲜少或缺失，类似的情况在甲状腺肿瘤中亦有发现。

在免疫磁珠法应用中，需注意内皮祖细胞（EPCs）的存在，CECs及EPCs代表了血液中不同的两组非造血细胞，有着不同的来源，CECs来源于成熟内皮细胞，而EPCs来源于骨髓。

CD146、UEA-1在EPCs中均有表达，且Delorme等[4]在CD146标记的免疫磁珠法分离细胞中证实了有EPCs的存在，虽然他们的结果有待进一步的确证，且近年来已发现了EPCs的部分特异性分子表达[5; 6]（如CD 34 +, FGFR+, VE-Cad he rin +, c-k it+ , KDR+ , CD1 33 +）但是仍希望有新的免疫磁珠分离法的方案来纯化CECs的提取及计数。

2.1.2 荧光激活细胞分离技术（fluorescence-activated cell sorting，FACS ）荧光激活细胞分离技术，亦称多参数流式细胞术，主要用于在附有重叠抗原的细胞中区分出内皮细胞。

因CD133不能再CECs及成熟内皮细胞内表达，所以其可用来鉴别EPCs，此外碘化丙啶、7-AAD也可用来识辨EPCs。

近期有很多研究发现了活化内皮细胞的标记物，如细胞粘附分子-1、选择素E、血管细胞粘附分子-1及促凝活性标记物（如组织因子）。

Cortelezzi 等[7]及Mancuso等[8]在癌症患者中应用了四色流式细胞术方案来区分CECs及EPCs。

，FACS的细胞技术结果相较于免疫磁珠法有显著差异，这可能与不同的方法学及没有统一的方案密切相关。

2.2 EMPs的测定近年来，EMPs作为诊断及研究工具受到越来越多关注，目前有多种方法用于检测EMPs，包括显微镜计数、流式细胞术（Flow Cytometry）、酶联免疫吸附剂测定（ELISA）、固相捕获（Solid-phase capture）。

2.2.1显微镜计数通常只能在激光共聚焦显微镜及电子显微镜下能辨别到直径﹤1微米的微粒，目前已可以在富含血小板的血浆中发现微粒[9]，而在电子显微镜下，也可检测到微粒的存在，其内在的形态学特征是与其祖细胞相似的，但有着更复杂的细胞膜结构，在形态和大小方面与循环脂蛋白微粒相异[10]。

2.2.2 流式细胞术（Flow Cytometry）由于流式细胞术的使用周期快、可以同时检测EMPs上的多种抗原、计数方法简便，目前此技术已跃然成为微粒检测中非常重要的方法，但是我们仍应了解它的不足之处，如直径﹤0.5微米的微粒在大多数流式细胞仪中很难被检测到，且不同的流式细胞仪存在不同的检测敏感性，对于标本处理中离心速度的要求目前没有统一的标准[11]。

2.2.3 酶联免疫吸附剂测定（ELISA）/固相捕获（Solid-phase capture）相较于流式细胞术，ELISA用于检测EMPs的实验开展较少，主要是通过annexin V 或细胞特异性抗体捕获微粒，固相捕获的优势在于可以检测任意大小的微粒，但局限性是可能会受到部分可溶性抗体或非特异性外切体(exosomes)的干扰，而且仅仅对于能表达磷脂酰丝氨酸的微粒有捕获作用[11]。

3、CECs及EMPs的临床应用进展3.1 与心血管系统疾病关系3.1.1 冠状动脉疾病EMPs作为血管内皮细胞损伤货凋亡后脱落的，可以一定程度上反映血管损伤的程度，2010年Sinning等[12]研究提出了CD31+/Annexin V+微粒对冠状动脉疾病的预后有重要价值。

他们通过对200例稳定及不稳定冠状动脉疾病的患者的血浆微粒进行测定，发现了微粒的升高与临床不良事件（包括心血管和神经系统不良事件）的发生率升高相关。

2013年Chuanyin Li等[13]对CECs与急性心肌梗死（AMI）的关系进行了研究，检测61例AMI患者、45例健康志愿者、19例接受一个月治疗的AMI患者相应的血浆中CECs的水平，得出结论AMI患者中CECs的水平较健康志愿者明显升高，且经过一个月治疗后的AMI患者的CECs水平下降明显。

3.1.2 先天性心脏病肺动脉高压2009年Smadja等[14]研究发现循环中的内皮细胞计数可以做为区分可逆性肺高压（RPH reversible pulmonary hypertension）和不可逆性肺高压（IRPH irreversible pulmonary hypertension）的血清标志物。

该研究组共选取26例先天性心脏病合并PH患者，其中16例为RPH患者（平均年龄2岁），10例为IRPH患者（平均年龄9岁）。

结果RPH组CECs 的计数是RPH组的十倍多，明显高于IRPH组及正常对照组。

因此作者认为CECs计数有希望成为术前判断PH是否可逆的生化指标。

2010年该研究组继续对血栓调节蛋白、可溶性内皮细胞蛋白C受体、IL-6、血管内皮生长因子和胎盘生长因子进行了研究[15]，但发现这些因子的水平在RPH组和IRPH组无显著差异，因此目前只有CECs计数可用来评估内皮细胞的损伤程度。

不过该实验的样本计数不够多，亟待有大样本实验进一步确定CECs及EMPs对肺动脉高压的诊断及区分可逆性及不可逆性肺动脉高压的作用。

3.1.3 心力衰竭2005年李春盛等[16]在研究测定37例充血性心力衰竭（CHF）患者中CECs、乳酸、NO的变化中发现，CHF患者的CECs含量明显高于对照组，由于心输出量的绝对或相对不足，组织缺氧淤血，VEC进一步损伤，使CECs升高更明显。

CECs可以作为CHF发生时VEC损伤的标志物，而CECs的数量变化可反映血管内皮细胞受损的程度。

2011年Martínez-Sales V等[17]研究CECs与心力衰竭的关系，通过比较32例心力衰竭患者及32例健康人血浆中的CECs计数及急性期与稳定期的心力衰竭患者的CECs计数，作者认为在心力衰竭患者中，CECs较健康人明显升高，且急性期时CECs计数升高更明显，此结果提示CECs可作为评价心力衰竭恶化进展的指标。

3.1.4 周围血管性疾病2011年门剑龙等[18]在研究闭塞性周围动脉粥样硬化(ASO)患者中发现ASO的CECs 水平高于正常人群，该研究组选取82例ASO患者，80例健康人，结果ASO患者的CEC 计数(176±62×103/L)明显高于正常人群（115±33×103/L）。

故作者认为CECs对于ASO有一定诊断意义。

3.1.5 瓣膜性疾病2013年Hong-Bo Ci等[19]对81名患有二尖瓣疾病的患者测定EMPs水平，发现与健康人对比，二尖瓣疾病患者的EMPs水平明显升高，且严重二尖瓣反流的患者的EMPs水平明显高于轻或中度二尖瓣反流患者的EMPs水平。