血液中微粒的流式检测及临床意义

血液中微粒的流式检测及临床意义

来源：中华检验医学杂志

关键词：流式微粒血液流式检测临床意义

各种血液细胞及血管内皮细胞受到刺激而活化或发生凋亡后，细胞膜磷脂酰丝氨酸由胞膜内层进入外层，以出芽方式形成小泡状结构而脱落，形成所谓的“微粒（microparticle，MP）”。正常人体血液中即存在少量MP，而在许多疾病中MP水平明显升高。MP具有促进血液凝固反应发生与血栓形成等多种重要生物学活性。越来越多的研究提示，检测血液MP水平与性质有助于监测病情、指导治疗与疗效判断。

一、血液中微粒的检测方法

1、流式细胞术（flow cytometry，FCM）

MP膜上表达与其来源细胞相同的表面标志分子，选取针对特异性标记分子的单抗，它可确定其细胞来源；MP体积远小于其来源细胞，流式细胞术检测中的前向散射光强度可反映颗粒大小；MP外露的磷脂酰丝氨酸可应用荧光标记AnnexinV显示，这些都为应用FCM检测MP提供了基础。

对细胞表面标志分子的确认与单克隆抗体制备技术的发展及完善，使FCM成为当今定量与定性检测MP最为广泛的方法。检测不同细胞来源的MP所使用的单抗如下：血小板微粒（platelet micorparticles，PMP）使用抗糖蛋白抗体，比如抗CD41、抗CD61与抗CIM2a等抗体；检测内皮细胞微粒（endothelial microparticles，EMP）使用的抗体包括抗CD31、抗CD51与抗CD144等抗体；检测单核细胞微粒（monocyte.derived microparticles，MDMP）使用的抗体包括抗CD14抗体；检测淋巴细胞微粒使用的抗体包括抗CD3、抗CD4与抗CD19等抗体。可见检测某种细胞来源的MP可有多种抗体供选择，而应用不同抗体检测结果不尽相同，比如应用抗CD41a抗体检测出的PMP水平高于抗CD61和抗CD42a抗体检测出的水平¨；应用抗CD31抗体检测冠心病患者EMP水平较正常对照升高10倍，而抗黏附分子抗体检测EMP仅增高1.5—2.0倍，这可能是由于不同抗体检测灵敏度不同所致。除表达来源细胞表面标志分子外，MP可表达某些来源细胞原来并不表达的蛋白分子，使MP获得新的生物学活性，比如PMP表达组织因子（tissue factor，TF），而在巨核细胞并未检测到此分子，TF使得PMP获得促凝活性，在许多疾病中发挥致病作用。

由于多步骤操作易导致细胞体外激活，尤其是血小板，从而影响检测准确性，因此，检测者除了要注意选择抗体之外，对FCM的具体操作也应作进一步改善，以提高准确性与灵敏度。比如在样本收集方面，有研究建议使用柠檬酸．茶碱．腺苷酸．双嘧达莫抗凝管，与枸橼酸钠抗凝相比，能更有效抑制血小板体外激活，保证了结果的可靠性¨；由于MP很小，有可能不能通过前向散射光强度来反映（能检测最小颗粒直径不小于0.1 p.m），此外MP表面积小导致标记的荧光强度小，使得荧光检测灵敏度与准确性降低，改良方法中使用已知直径的微球来校正流式细胞仪，从而提高准确性；应用3.0 m与0.8m乳胶微粒作为内参照检测PMP，0.8m乳胶微粒用于设门，3.0m乳胶微粒用于定量，此方法有效排除血小板的干扰，也有效地提高了准确性。

2、酶联免疫吸附试验（ELISA）

ELISA方法也可用于检测MP，但远不及FCM广泛。Osumi等选用多种抗血小板抗体以期建立检测PMP更优良的ELISA方法。结果发现以抗CD42a抗体作为捕获PMP的一抗，抗CD42b抗体作为二抗，可获得阳性率与特异性最高的检测结果，该方法与FCM检测结果具有一致性，提示应用ELISA检测MP的可行性。也有人先利用AnnexinV捕获血液中的MP，之后应用特异性抗体以确定MP的细胞来源，同样获得了有意义的研究结果。

二、血液中微粒检测的临床意义

1、冠心病

血小板活化聚集、血栓形成以及血管内皮损伤参与冠心病（coronary artery disease，CAD）的发生，这些病理变化均导致MP的生成；而随后发生的缺血缺氧与炎症刺激，进一步促进MP的产生。研究发现血液中EMP水平与CAD各临床亚型，包括心肌梗死（myocardial infarction，MI）、不稳定性心绞痛（unstable angina，UA）与稳定性心绞痛（stable angina，SA），存在如下的相关性：FCM检测结果显示，EMP在各亚型都显著升高；3种亚型中CD31（+）EMP水平高低顺序为：MI>UA>SA，而CD51（+）EMP无此规律；MI首发患者CD31（+）EMP显著高于MI复发者。由此可见，EMP水平，尤其是CD31（+）EMP水平，可提示冠脉缺血缺氧与炎症反应的严重程度，是反映CAD中内皮损伤的有用指标。冠心病术后治疗也导致血液中MP水平和性质的变化。经皮冠状动脉支架植入术后易发生血栓形成与血管再狭窄，此时PMP水平较术前升高，给予抗血小板糖蛋白gP II b／lUa药物治疗能有效预防血栓形成，同时也抑制了PMP的生成；主动脉．冠状动脉旁路移植手术后患者外周血液中TF（+）PMP水平高于正常者，促凝活性也明显增强。PMP可促进凝血反应与血栓形成，血液中PMP水平提示血栓形成的活动性，因此，治疗中检测PMP水平有助于监测病情与观察疗效。

2、高血压

研究发现血液中EMP与PMP水平可提示高血压患者血管内皮细胞损伤与血小板活化水平。未经治疗的高血压患者EMP水平明显升高，升高幅度与血压高低明显正相关。在同时伴有吸烟、糖尿病等其他导致内皮细胞损伤的危险因素的情况下，高血压患者EMP水平升高程度则更为明显，并仍与血压水平呈正相关；而与之相比，其他内皮细胞损伤的标志物可溶性VCAM-1与ICAM-1水平升高程度则与血压水平不呈现相关性，因此，血液中EMP水平可作为反映血压升高而导致内皮细胞损伤的特异性标志物。此外研究还发现PMP仅在恶性高血压患者明显升高，与血压水平正相关，而在缓和性高血压患者无升高。

3、糖尿病型糖尿病

患者血液中MDMP水平升高，伴有肾、神经或视网膜并发症的患者MDMP水平又高于无并发症者，尤其有神经并发症患者MDMP水平升高更为明显。与此同时，血液中PMP水平明显升高，提示血小板的活化，并与MDMP水平有相关性。Ⅱ型糖尿病患者常伴有高血脂症。研究发现，在Ⅱ型糖尿病高血脂症患者中，具有促凝活性的TF（+）PMP与MDMP 水平高于正常对照，而TF（+）MP水平与患者体重指数（body mass index，BMI）及血浆低密度脂蛋白水平有相关性。

4、妊娠病理

妊娠本身是一种高凝状态，某些妊娠并发症的发生可能与促凝变化有关。正常妊娠者MP水平即明显升高，而发生反复自然流产者的血液中EMP水平高于正常对照，提示存在血管内膜损伤，而导致血栓形成。先兆子痫的发生可能与血管内膜功能异常有关。与正常对照者相比，先兆子痫患者血浆可于体外刺激内皮细胞诱导更高水平EMP的产生；血液中CD31（+）与CD62（+）EMP水平也高于正常对照者水平，并且与病情严重程度和24 h蛋白尿水平有正相关性。因此，检测EMP有助于判断先兆子痫¨。

5、其他疾病

抗磷脂综合征（anti-phospholipid syndrome，APS）是由抗磷脂抗体引起的一组临床征象的总称，主要表现为血栓形成、血小板减少、习惯性流产等。研究发现APS患者血浆EMP水平增高，具有较强的促凝活性，体外实验显示APS患者血浆可于体外诱导EMP的生成。因此内皮细胞是抗磷脂抗体攻击的目标之一，导致其活化或损伤，促进促凝EMP释放，从而形成获得性的高凝状态¨。在许多其他疾病中也存在MP的变化，比如早已发现在免疫性血小板减少性紫癜患者血液中，PMP水平升高，与自身抗体导致血小板破坏相关；阵发性