流式细胞仪上机培训手册
流式细胞仪培训(ppt42张)
PMT用于检测较弱的SSC信号和荧光信号 ，光电二
极管用于检测较强的FSC信号
阈值
阈值：信号放大过程会产生不需要的脉冲信号，通常
来自于碎片。通过设定某一信号的最低强度值，可将 不需要的脉冲信号去除，这一设定值称为阈值。
荧光补偿
采用合适的方法校正荧光染料之间叠加所造成的误差
荧光补偿
补偿调整的实验过程
流式细胞仪的检测对象
藻类细胞
染色体
血细胞
原生动物细胞
任何存在于悬液中的直径为0.2-50微米的粒子或细胞都适用于流式分析
流式细胞仪工作原理示意图
流式的基本组 成： 1.流动室和 液流系统 2.光路系统 3.电系统
流式细胞仪可提供的信息
物理信息：通过散射光信号反映
相对细胞大小 相对细胞颗粒密度和内部复杂度
流式细胞仪原理与应用
陈玉婵
提
要
流式细胞仪简介 流式细胞仪工作原理 流式实验流程 流式细胞术的应用
流式细胞术的发展史
1930s~1950s:开始出现自动细胞分析技术（细 胞的计数，是通过光电仪记录流过一根毛细管 的细胞,用结合了荧光素的抗体去标记细胞内 的特定蛋白，应用分层鞘流原理，成功的设计 红细胞光学自动计数器。） 1960s晚期发展：荧光检测细胞计 、细胞分选 器检测细胞的荧光信号 、单克隆抗体技术 1973年，BD公司与美国斯坦福大学合作，研制 开发并生产了世界第一台商用流式细胞仪FACS I。
DNA含量分析-PI染色
细胞凋亡
细胞膜分析-PS外翻
PS（磷脂酰丝氨酸）正常暴露在胞膜的内表 面，凋亡时，PS外翻向细胞外表面。重组蛋白 Annexin-V可与PS结合
Get清风BDFACSCalibur流式细胞仪培训手册
BD-FACSCalibur流式细胞仪培训手册BD FACSCalibur流式细胞仪FACS101 Handbook二、开机、关机标准操作2.1 FACS Calibur 开机1. 开启细胞仪电源。
2. 开启其它周边配备电源，如打印机及MO机。
3. 开启计算机。
4. 确认鞘流液筒有八分满的FACSFlow，确实旋紧(鞘液筒容量为4L)。
5. 将废液倒掉，并在废液筒中参加200ml 家用漂白水(废液筒容量为4L)。
6. 将减压阀方向调在加压〔Pressurize〕位置。
7. 排除液流管路与过滤器中的气泡。
8. 取下样品管，执行PRIME 功能两次。
9. 使用1ml PBS，HIGH RUN 两分钟。
10. 可开始分析样品。
2.2 FACS Calibur 关机关机前必要动作：清洗进样管和外套管，防止进样管堵塞、或有染料残留。
1. 将样品支持架左移，取2 mlFACSClean〔10%Bleach〕上样品，让仪器的真空系统抽取约 1 ml 的液体。
2. 将样品支持架回正，按HI RUN，然后让FACSClean 清洗管路10分钟。
3. 按Standby，取下样品管，执行PRIME功能两次。
4. 取2 ml dH2O，重复上述步骤1-3。
5. 注意最后只留约1 ml dH2O 在试管中。
6. 按STANDBY 五分钟，使风扇冷却雷射后，关闭细胞仪〔必要动作，以保护雷射光源。
〕7. 倒掉废液，并回填200 ml漂白水。
8. 将减压阀放在「VENT 漏气」位置。
将鞘流液筒充填至八分满。
9. 退出软件“File〞→“Quit〞(如有对话选项，选择“Don‘t save〞)。
确认退出计算机中所有BD应用软件，所有数据数据已储存备份。
10. 关闭计算机。
“Special〞→“Shutdown〞。
三、上机分析流程建议首次试机防止进行大量试验，仅需准备以下样品。
〔1〕Negative Control〔不加任何抗体〕。
EPICS-XL流式细胞仪培训资料
注意： 1.
2. 4. 5. 6.
即使每天工作 24 小时，也至少要关机一次 重新启动激光必须在仪器关闭 30 分钟之后 每 2 周~4 周清洗一次空气滤膜 每月清洗鞘液盒一次 每 60 天清洗清洁液盒一次
- 28 -
XL 培训教程
建立方案(PROTOCOL)的方法
• 方案(PROTOCOL)的定义
FL2-X%FL1
放大 放大
- 19 -
分析
XL 培训教程
颜色补偿判断标准： 未作颜色补偿
补偿后
- 20 -
XL 培训教程
- 21 -
XL 培训教程
颜色补偿总结
- 22 -
XL 培训教程
单细胞悬液
标本制备
外周血 骨髓 培养细胞 组织：机械法、酶法
标本浓度
单细胞悬液
106/ml 正常全血
抗凝剂
第五课时
7，ListMode, Multigraph, PCX, Color_Tracker, AutoGate, Logical Gate 等软件功能介绍及练习 (1~2hr)
8，免疫荧光(三标记)，示范及练习(1~2hr)
第六课时 9，质控品、自动质控程序及质控数据库介绍：
FlowCheck，FlowSet，CytoTrol，ImmunoTrol， FlowCount，StemTrol
操作步骤：1. 2.
将漂白水(建议使用花王漂白液)与双蒸水 1:1 稀 释，放入 12X75 的试管内 准备 3ml 双蒸水放入 12X75 试管内
- 26 -
XL 培训教程
3. 在 Acquisition 状 态 栏 下 选 择 PANEL-Cleaning Panel
流式细胞仪使用方法说明书
流式细胞仪使用方法说明书1. 概述流式细胞仪是一种用于细胞分析和排序的先进仪器。
本方法说明书旨在向用户介绍如何正确操作流式细胞仪以及最佳的使用方法。
请用户在使用前仔细阅读本说明书并遵循相关的安全操作规程。
2. 仪器组成流式细胞仪主要由以下几个组成部分构成：- 流体传送系统：用于将样本引入仪器并排除废弃物。
- 激光系统：产生激光束以激发样本中的荧光染料。
- 光学系统：收集样本产生的荧光信号并进行检测。
- 数据分析系统：用于解析和分析收集到的数据。
3. 使用准备在进行流式细胞仪实验之前，请确保以下几个步骤已经完成：- 仪器校准：根据仪器的使用手册进行仪器校准，确保仪器工作在最佳状态。
- 样本准备：按照实验需求，对待测样本进行合适的处理，例如细胞培养、染色等。
- 试剂准备：准备好所需的荧光染料、缓冲液等试剂。
4. 仪器操作以下是流式细胞仪的一般操作步骤：- 打开仪器电源，并等待仪器启动完成。
- 将样本装入合适的样本管，并在样本管中加入适量的荧光染料或其他试剂。
- 将样本管放入仪器中的样本槽，并调整流速和其他参数。
- 启动激光系统，并调整激光强度和波长以适应实验需求。
- 开始数据采集，根据仪器界面指示收集所需数据。
- 数据分析：根据实验需要，使用相应的数据分析软件对采集到的数据进行解析和处理。
5. 安全注意事项在使用流式细胞仪时，务必注意以下安全事项：- 佩戴个人防护装备，包括实验手套和护目镜。
- 遵循实验室的生物安全规程，确保样本处理符合相关的安全要求。
- 避免直接暴露于激光束下，以免损伤眼睛和皮肤。
- 在清洁仪器时使用合适的溶剂，并按照仪器清洁的标准程序进行操作。
6. 故障排除在实际操作中，有时可能会遇到仪器故障或其他问题。
以下是一些常见问题及其排除方法：- 仪器无法启动: 检查电源连接是否正常，重启仪器。
- 数据质量差: 检查样本制备和染色的质量，调整参数和仪器校准。
- 清洗困难: 检查是否有阻塞，按照清洁程序进行清洗。
bdfacscalibur流式细胞仪培训手册
BD FACSCalibur流式细胞仪FACS101 Handbook本课程介绍「表面抗原流式分析」有关之基础工作原理。
如希望进一步了解流式细胞技术应用，请至本公司网站订阅FACSinformation电子报。
如需要本课程手册，欢迎至本公司网站下载。
如需要免疫荧光染色方法，请至本公司网站下载。
一、BD FACSCalibur基本结构仪器本体：1. 电源开关：在BD FACSCalibur仪器右侧下方，先启动仪器本体，再打开计算机。
2. 光学系统：BD FACSCalibur 基本配有一支波长488 nm 的氩离子雷射以BD FACSCalibur 基本型为例FSC Diode 只收488 nm波长散射光SSC PMT 只收488 nm波长散射光FL1 PMT 荧光光谱峰值落在绿色范围（波长515-545 nm）FL2 PMT 荧光光谱峰值落在橙红色范围（波长564-606 nm）FL3 PMT 荧光光谱峰值落在深红色范围（波长 >650 nm）3. 仪器面板：仪器前方面板的右下方有三个流速控制键、及三个功能控制键。
流速控制：LO：样品流速：12 l /minMED：样品流速：35 l /minHI: 样品流速：60 l /min功能控制：RUN：此时上样管加压，使细胞悬液从进样针进入流动室。
（正常显示绿色；黄色时表示仪器不正常，请检查是否失压。
）STANDBY：无样品或暖机时之正常位置，此时鞘液停止流动，雷射功率自动降低。
PRIME：去除流动室中的气泡，流动室施以反向压力，将液流从流动室冲入样品管，持续一定时间后，以鞘液回注满流动室。
PRIME 结束，仪器恢复STANDBY状态。
4. 储液箱抽屉：在主机左下方之储液箱抽屉。
可向前拉开，内含鞘流液筒、废液筒、鞘液过滤器Sheath Filter，及空气滤网 Air filter。
请注意气路减压阀VENT TOGGLE之位置。
鞘液筒：位于抽屉左侧，容积4升。
流式细胞仪操作流程(单标)
流式细胞仪操作流程(单标)一、开机(务必按照此顺序开机)1、打开下面的小门，推上电源2、打开插线板电源开关3、开电脑4、打开流式细胞仪开关二、软件准备1、打开软件2、点击菜单栏的Cytometer，待流式细胞仪与电脑自动连接后会自动出现startup 和shutdown选项，点击startup，系统提示按确定。
（等待5～6min startup 完成后再继续）2、在出现的Browser栏中依次选择new folder——new experiment——new specimen——new tubes，按照实验组数给new specimen编号，按照每一组实验试管数给new tubes 编号。
3、在右边显示屏中拽出Global sheet，点击Dot Plot绘制散点图，点击Histogram绘制直方图。
以FITC单标抗体为例，首先绘制FSC-A为横坐标、SSC-A为纵坐标的散点图（图1），然后绘制以FITC-A为横坐标、SSC-A为纵坐标的散点图（图2），最后绘制以FITC-A为横坐标、count为纵坐标的直方图（图3）。
4、点击菜单栏中的populations，选择create statistics view。
三、上机操作1、将试管放置在流式细胞仪上，在左侧显示屏的Acquisition Dashboard中点击acquire data，此时流式细胞仪开始工作。
2、根据图1中细胞的位置，在Cytometer FACScanto 栏中的parameters标签中调节FSC和SSC的电压大小，使主群细胞在图1上处于居中的位置。
3、点击右侧显示屏的Polygon Gate按钮，在图1中选择要求测量的主群细胞，可见图1中出现P1，并且其中的细胞变成红色。
4、选择图2、图3，分别在左侧显示屏的Inspector-Dot Plot栏中点击P1的复选框，可见图2、3中的图象均变成红色，即要求细胞仪检测选定的细胞P1。
BD-FACSCalibur流式细胞仪操作手册
BD FACSCalibur流式细胞仪一、BD FACSCalibur基本结构1.1仪器本体：1. 电源开关：在BD FACSCalibur仪器右侧下方，先启动仪器本体，再打开计算机。
2. 光学系统：BD FACSCalibur 基本配有一支波长488 nm 的氩离子雷射以BD FACSCalibur 基本型为例➢FSC Diode 只收488 nm波长散射光➢SSC PMT 只收488 nm波长散射光➢FL1 PMT 荧光光谱峰值落在绿色范围（波长515-545 nm）➢FL2 PMT 荧光光谱峰值落在橙红色范围（波长564-606 nm）➢FL3 PMT 荧光光谱峰值落在深红色范围（波长 >650 nm）3. 仪器面板：仪器前方面板的右下方有三个流速控制键、及三个功能控制键。
流速控制：LO：样品流速：12 l /minMED：样品流速：35 l /minHI: 样品流速：60 l /min功能控制：•RUN：此时上样管加压，使细胞悬液从进样针进入流动室。
（正常显示绿色；黄色时表示仪器不正常，请检查是否失压。
）•STANDBY：无样品或暖机时之正常位置，此时鞘液停止流动，雷射功率自动降低。
•PRIME：去除流动室中的气泡，流动室施以反向压力，将液流从流动室冲入样品管，持续一定时间后，以鞘液回注满流动室。
PRIME 结束，仪器恢复STANDBY状态。
4. 储液箱抽屉：在主机左下方之储液箱抽屉。
可向前拉开，内含鞘流液筒、废液筒、鞘液过滤器Sheath Filter，及空气滤网 Air filter。
请注意气路减压阀VENT TOGGLE之位置。
•鞘液筒：位于抽屉左侧，容积4升。
装八分满鞘液筒，仪器可以运行大约 3小时。
筒上装有液面感应器，鞘液用完时，仪器软件上会有显示。
鞘液筒盖上有金属环扣，保证鞘液筒密闭。
•废液筒：位于抽屉右侧，容积4升。
筒上装有液面感应器，废液盛满时，仪器软件上会有显示。
流式细胞仪操作指南手册BD_FACSCalibur中文培训手册
目 录第一章流式细胞仪简介 (1)1.1 流式细胞术发展史 (1)1.2 流式细胞仪构造和工作原理 (2)1.2.1 概述 (2)1.2.2 流式细胞仪构造 (2)1.3 流式细胞仪的主要技术指标 (10)第二章 FACSCalibur 的日常操作 (12)2.1 FACSCalibur系统 (12)2.2 FACSCalibur开机程序 (15)2.3 FACSCalibur关机程序 (16)2.4 FACSCalibur的维护与保养 (17)2.4.1 FACSCalibur的每月维护 (17)2.4.2 FACSCalibur的定期维护 (18)2.5 常见故障排除 (20)第三章 FACSComp软件 (22)3.1 FACSComp简介 (22)3.1.1 FACSComp运行条件 (22)3.1.2 FACSComp的文件类型 (23)3.2 FACSComp的功能 (24)3.2.1 光电倍增管（PMT）电压的调节 (24)3.2.2 荧光补偿的调节 (24)3.2.3 灵敏度的测试 (24)3.2.4 时间延迟的校准（对于双激光，配有FL4 PMT） (25)3.2.5 HLA-B27的校准 (25)3.2.6 LeucoCOUNT (25)3.2.7 优化 (25)3.3 FACSComp的运行 (25)3.3.1 CaliBRITE Beads的准备 (25)3.3.2 软件环境的设置 (26)3.3.3 Beads的检测 (26)3.3.4 Optimization (28)第四章 FACStation 数据管理系统 (30)4.1 FACStation 数据管理系统组成 (30)4.2 FACStation文件组成 (31)4.2.1 如何建立文件夹 (31)4.2.2 FACStation文件的类型 (31)4.2.3 如何管理文件 (32)4.3 实用的Macintosh OS X功能 (34)4.3.1 菜单栏 (35)4.3.2 Dock (37)4.3.3 查找窗口 (37)4.3.4 键盘快捷键 (38)4.4 如何设置模版 (39)4.5 实验练习：如何将ModFit LT的别名添加到Dock菜单下 (40)4.6 可选性存储装置 (40)4.6.1 可选性存储装置的基本工作原则 (40)4.6.2 光驱的维护 (41)4.6.3 光盘的维护 (41)第五章 CellQuest Pro软件 (42)5.1 概述 (42)5.1.1 获取(Acquisition） (42)5.1.2 分析(Analysis) (42)5.1.3 从获取到分析(Acquisition Analysis) (42)5.2 工具栏 (42)5.3 CellQuest Pro 的文件 (43)5.3.1 FCS数据文件 (43)5.3.2 实验文件 (44)5.3.3 仪器条件文件 (44)5.3.4 统计文件 (44)5.4 CellQuest Pro 的仪器控制 (44)5.4.1 探测器 (45)5.4.2 放大器 (45)5.4.3 阈值 (46)5.4.4 补偿 (46)5.6.1 质控－运行FACSComp (48)5.6.2 优化 (50)5.6.3 调出储存的由FACSComp 生成的仪器条件 (52)5.6.4 调节FSC/SSC探测器（电压）及FSC阈值 (53)5.6.5 设置淋巴细胞Region (53)5.6.6 调节FL1、FL2、FL3的探测器（电压） (53)5.6.7 调节荧光补偿 (55)5.7 实验练习：3色/4色预获取 (55)5.7.1 设置Acquisition & Storage 窗口 (56)5.7.2 设置Parameter Description (57)5.7.3 编辑Reagent Panel (58)5.8 实验练习：数据获取 (59)5.9 储存、恢复仪器设置 (60)5.9.1 储存仪器设置 (60)5.9.2 恢复仪器设置 (60)5.10 储存实验模板文件 (60)5.11 练习：数据分析 (60)5.11.1 画Region (61)5.11.2 限定象限marker (61)5.11.3 分析四色 (63)5.11.4 批分析其余数据 (63)5.11.5 分析数据 (64)5.11.6 将分析文件以模板形式保存 (64)5.11.7 创建文具簿（stationery pad） (64)5.11.8 将统计改为电子表格 (65)5.12 Regions 和Gating（画门） (65)5.12.1 设置Region (65)5.12.2 改变Region (65)5.12.3 用Region 统计来分析数据 (66)5.12.4 门 (66)5.12.5 多色门 (66)5.12.6 组合门 (67)5.12.7 在直方图上使用组合门分析 (68)收集系统6.1.2 分选模式 (70)6.2 分选窗口 (71)6.2.1 Sort Setup (71)6.2.2 Sort Counters (72)6.3 准备收集管 (72)6.4 分选 (73)6.4.1 清洗分选管线 (73)6.4.2 准备 (73)6.4.3 收集分选前数据 (74)6.4.4 分选条件设置 (74)6.4.5 分选目的细胞 (74)6.4.6 清洗分选管路 (75)6.4.7 浓缩样本 (76)6.5 检验分选纯度 (76)6.6 分选问题讨论 (77)6.7 FACSCalibur无菌分选 (79)6.8 分选细胞浓缩系统 (80)6.8.1 系统简介 (80)6.8.2 细胞培养基嵌入物和滤膜的制备 (81)6.8.3 确定气压参数 (82)6.8.4 如何用细胞浓缩系统进行分选 (82)6.8.5 分选浓缩细胞 (84)6.8.6 从分选管路中回收细胞 (84)6.8.7 回收细胞做进一步分析 (85)6.8.8 清洗分选管路 (85)6.8.9 清洗浓缩器 (85)第七章 DNA分析 (87)7.1 概述 (87)7.2 细胞周期 (87)7.3 DNA检测的常用术语 (87)7.3.1 Coefficient of Variation（CV）：变异系数 (87)7.4.1 分辨率（CV） (88)7.4.2 线性度 (88)7.4.3 碎片 (88)7.4.4 细胞双粘体 (89)7.5 DNA质量控制（DNA QC Particles） (89)7.5.1 样本制备 (89)7.5.2 上机检测 (89)7.5.3 常见错误排除 (90)7.6 用CellQuest Pro软件获取DNA 数据 (91)7.6.1 样本制备 (91)7.6.2 用CellQuest Pro软件上机获取数据 (92)7.6.3 质量控制 (95)7.7 用ModFit 软件分析DNA数据 (95)7.7.1 运用ModFit 进行自动分析 (96)7.7.2 运用ModFit 进行手动分析 (96)7.7.3 运用ModFIT进行同步化分析 (98)7.7.4 运用ModFIT 进行增殖分析 (98)第八章 HLA-B27分析 (99)8.1 检测HLA-B27的意义 (99)8.2 HLA-B27的检测方法 (99)8.2.1 传统方法 (99)8.2.2 流式细胞术 (100)8.2.3 试剂盒介绍 (100)8.2.4 实验原理 (100)8.2.5 样本的收集和准备 (101)8.2.6 流式检测 (102)8.3 质量控制 (110)附录1：组织相容性抗原和疾病的关系 (111)附录2：强直性脊柱炎——一个常见但易被忽略的疾病 (112)第九章 MultiSET软件 (113)9.1 简介 (113)软件内容9.4.1 MultiSET界面功能分区 (116)9.4.2 MultiSET命令菜单 (116)9.4.3 MultiSET实验报告 (117)9.4.4 MultiSET运行程序 (117)9.5 利用Multiset软件的Tools和Preferences (126)9.6 Control Panels (绝对计数质控) (128)9.7 MultiSET画门及Attractor方案 (128)9.8 注意事项及常见问题处理 (129)第十章练习题 (135)10.1 补偿 (135)10.2 流式简介 (135)10.3 CellQuest 获取与分析 (136)10.4 分选 (139)第一章流式细胞仪简介1.1 流式细胞术发展史纵观历史，几乎没有哪一门科学技术象流式细胞术这样凝结了众多不同学术背景、不同科研领域的科学家的心血。
BD FACSCalibur流式细胞仪培训手册
BD ＦAＣSＣalibur流式细胞仪FＡＣS1０1 Hａｎdbook本课程介绍「表面抗原流式分析」有关之基础工作原理。
如希望进一步了解流式细胞技术应用,请至本公司网站订阅FACSinfｏｒｍatioｎ电子报。
如需要本课程手册,欢迎至本公司网站下载。
如需要免疫荧光染色方法,请至本公司网站下载。
一、BD FＡCＳCａｌibｕr基本结构1、1仪器本体:１。
电源开关:在BD FAＣSCalｉｂｕｒ仪器右侧下方,先启动仪器本体,再打开计算机。
2。
光学系统:BD FＡCＳＣａｌibur基本配有一支波长4８8 ｎm 得氩离子雷射以BD FACSCａｌｉｂｕｒ基本型为例➢ＦSC Diode 只收48８ nｍ波长散射光➢SSCＰMT 只收488 nm波长散射光➢ＦL１PMＴ荧光光谱峰值落在绿色范围(波长51５—545 nｍ)➢FＬ2PMT 荧光光谱峰值落在橙红色范围(波长564—60６ｎm)➢ＦＬ3 ＰＭT 荧光光谱峰值落在深红色范围(波长>６5０nm)3. 仪器面板:仪器前方面板得右下方有三个流速控制键、及三个功能控制键。
流速控制:ＬO: 样品流速:12 μl/mｉnＭEＤ:样品流速:35 μl /ｍiｎHI: 样品流速:6０μl /ｍｉn功能控制:•ＲUN:此时上样管加压,使细胞悬液从进样针进入流动室。
(正常显示绿色;黄色时表示仪器不正常,请检查就是否失压、)•STAＮDBＹ:ﻩ无样品或暖机时之正常位置,此时鞘液停止流动,雷射功率自动降低、•ＰRIME:去除流动室中得气泡,流动室施以反向压力,将液流从流动室冲入样品管,持续一定时间后,以鞘液回注满流动室。
ＰRＩME结束,仪器恢复STAＮDBY状态。
4、储液箱抽屉:在主机左下方之储液箱抽屉。
可向前拉开,内含鞘流液筒、废液筒、鞘液过滤器Sheath Filter,及空气滤网 Aiｒｆiｌter、请注意气路减压阀VENTＴOGGLE之位置、•鞘液筒:位于抽屉左侧,容积4升、装八分满鞘液筒,仪器可以运行大约３小时。
流式细胞仪培训手册(完成版)_图文
流式细胞仪培训手册序论学习仪器的最好方法是操作仪器,然而在理解原理的基础上进行仪器操作无疑会起到事半功倍的作用。
本书介绍了流式细胞仪的基本知识,并从不同角度详尽阐述了各种台式机(FACScanTM , FACSortTM , FACSCaliburTM ,和 BD LSR与大型机(FACS VantageTM, FACSVantageTM SE, 和 FACStarPLUSTM 之间的不同。
阅读本书有助于增强读者操作仪器的动手能力和经验。
目录第 1章综述…………………………………………………………………… 4 第 2章液流系统………………………………………………………………第 3章散射光信号及荧光信号………………………………………………3.1 散射光信号………………………………………………………3.2 荧光信号…………………………………………………………3.3 荧光补偿第 4章光电系统………………………………………………………………4.1 光平台……………………………………………………………4.2 光学滤片………………………………………………………4.3 信号探测器……………………………………………………4.4 阈值………………………………………………………………第 5章数据分析………………………………………………………………5.1 数据采集及显示…………………………………………………5.2 设门………………………………………………………………5.3 细胞亚群的数据分析…………………………………………5.4 流式细胞仪其它应用的数据分析………………………………5.5 CellQuest软件使用……………………………………………5.6 MutiSet 软件使用………………………………………………5.7 Simultest 软件使用……………………………………………5.8 B27软件使用…………………………………………………5.9 WinMDI软件使用…………………………………………5.10 FACSPress软件使用…………………………………………5.11 System II软件使用…………………………………………5.12 MultiCycle软件使用…………………………………………5.13 Modfit使件使用……………………………………………第 6章流式基本检测项目6.1淋巴细胞亚群检测 (双色、三色、四色,三种软件分析6.2 B27的检测………………………………………………………6.3 血小板抗体检测………………………………………………6.4 网织血小板及红细胞分析……………………………………6.5 干细胞检测……………………………………………………6.6 DNA倍体分析……………………………………………………6.7 凋亡检测…………………………………………………………第 7章分选6.1 分选………………………………………………………………第 8章激光器及光路校正……………………………………………………7.1 激光器的工作原理………………………………………………7.2 光路校正…………………………………………………………第 9章答案………………………………………………………………第一章综述流式细胞术是一项快速检测分析单个粒子多物理特性的高技术,通常指细胞通过激光束时在液流中的特性,即粒子的大小,密度或是内部结构,以及相对的荧光强度。
FACSCalibur流式细胞仪中文操作手册
5. 上樣區： 上樣區是樣本管的上樣位置。它包括三個部 分，一個是進樣針 Sample Injection Tube，將 樣本輸入流動室，還有就是支撐架 Tube Support Arm、和液滴存留系統 Droplet Containment System。 進樣針：是一根不鏽鋼管，將細胞從樣本針中吸入流動室。進樣管外有一套管， 是液滴保留系統的一部分。 支撐架：用於支撐樣本管、並負責啟動液滴存留系統。支撐架有三個位置：位於 樣本管之下的中位，樣本管左側或右側。 液滴存留系統：系統由支撐架、真空幫浦和外套 管組成。當支撐架位於左側或右側位置時，真空 幫浦就會啟動，將液體從外管吸入廢液桶內。上 樣時，須注意將支撐架位於中位，以避免過多樣 品被抽吸到廢液筒內（當支撐架位於中位，真空 幫浦停止工作）。更換樣品時，讓儀器保持 RUN 的模式，使得進樣針可以反沖；切換到 STANDBY 模式前，確保液路已沖洗徹底以免碎片沈積到流 動室中。
FACS101 Handbook Pro
-7–
4. 從 Acquire 功能表中選擇 Connect to Cytometer，建立儀器和電腦之間通訊。此時 會出現 Browser 方框。將之移至適當位置。
5. 從工具板中點擊散點圖圖示。在實驗文件的空白區點擊，拖曳對角線至適當大小， 然後放開滑鼠。此時應可以在右方看到 Inspector：Dot Plot 對話框。
FACS101 Handbook Pro
-8–
6. 從螢幕上方 Edit 功能表中選擇 Duplicate 功能，可複製一個同樣大小的散點圖，完 成後可將重製圖移至原圖右方。
7. 從螢幕上方 Edit 功能表中選擇 Select All 功能，文件中所有圖譜的四角會出現黑色 方塊，表示被選取。可在出現之 Inspector：2 Objects 方框中將 Plot Type 改成 Acquisition。 8. 因應實驗需求來修改所有圖譜中顯示之參數。第一圖 X 和 Y 軸參數分別設為 FSC-H 1024、SSC-H 1024；第二圖 X 和 Y 軸參數分別設為 FL1-H 1024、FL2-H 1024。 修改動作為輕擊圖譜，並在出現之 Inspector 方框依需要選擇。 FSC：細胞大小 SSC：細胞顆粒性 FL1：FITC 綠色螢光 FL2：PE 橙色螢光 FL3：PerCP 紅色螢光 儀器設定 注意：實驗數據品質，取決於最適化儀器設定。儀器設定文件不能在數據收取後再更 改，研究人員必須在第一次就使用正確的儀器設定。 儀器設定（Instrument settings），含偵測器電壓（Detector/ Amps），閾值 （Threshold），螢光補償（Compensation）等儀器條件的組合。一般而言，儀器設 定的順序為 Detector/Amps -- Threshold -- Compensation。
流式细胞仪上机培训手册
流式细胞仪上机操作培训手册一、样本处理以PBMC表面抗原的流式检测步骤为例1)取样。
取新鲜提取或冻存后复苏的PBMC；2)编号。
根据实验设计，标记好流式管，如每份PBMC设两管：a)1号管：相应同型对照；b)2号管：CD3,CD4,CD8,CD56四标管；3)加样。
用移液器取100ul细胞/管（约1×106个细胞/管），分别加到已经标记好的流式管底部；4)洗涤。
加入1ml PBS/管，涡旋1600rpm/min，离心6min；5)染色。
弃上清，加入100 μl PBS/管涡旋混匀细胞，并根据实验设计，向各流式管中加入相应的荧光素标记抗体，混匀，室温避光孵育30min（操作尽量保持在避光条件下进行。
）6)洗涤。
加入1ml PBS/管，涡旋1600rpm/min，离心6min；7)重悬。
弃上清，加入0.5ml PBS/管，混匀，上机检测(可选择BD FACSCantoII或BD Accuri C6)。
（注：若不能及时上机，应加入4%多聚甲醛固定，并于4℃避光保存。
）8）试验结果分析。
（注：实验过程中如果进行多色标记，需要调节荧光补偿）。
参考值：二、上机检测BD FACSCanto II简要操作流程启动流式细胞仪1 打开流式细胞仪电源2 启动计算机，打开软件登录3 确保软件连接到流式细胞仪必要时，点击Cytometer > connect检查液体水平1 启动流式细胞仪后，检查液体水平低液面水平或者废液桶满都用红色指示。
2 如果液流车未自动开启，选择Cytometer > Fluidics Startup。
3 当液流启动完成后，点击OK关闭对话框。
检查气泡1 在检查完液体水平后，开启流动室门，检查流动室中是否有气泡。
2 如果没有看到气泡，进行第5步。
如果看到气泡，点击Cytometer > Cleaning Modes >De-gas Flow Cell.3 当完成信息出现后，点击OK。
BDFACSCalibur流式细胞仪操作手册
BD FACSCalibur流式细胞仪FACS101 Handbook本课程介绍「表面抗原流式分析」有关之基础工作原理。
如希望进一步了解流式细胞技术应用，请至本公司网站订阅FACSinformation电子报。
如需要本课程手册，欢迎至本公司网站下载。
如需要免疫荧光染色方法，请至本公司网站下载。
一、BD FACSCalibur基本结构1.1仪器本体：1. 电源开关：在BD FACSCalibur仪器右侧下方，先启动仪器本体，再打开计算机。
2. 光学系统：BD FACSCalibur 基本配有一支波长488 nm 的氩离子雷射以BD FACSCalibur 基本型为例➢FSC Diode 只收488 nm波长散射光➢SSC PMT 只收488 nm波长散射光➢FL1 PMT 荧光光谱峰值落在绿色范围（波长515-545 nm）➢FL2 PMT 荧光光谱峰值落在橙红色范围（波长564-606 nm）➢FL3 PMT 荧光光谱峰值落在深红色范围（波长 >650 nm）3. 仪器面板：仪器前方面板的右下方有三个流速控制键、及三个功能控制键。
流速控制：LO：样品流速：12 μl /minMED：样品流速：35 μl /minHI: 样品流速：60 μl /min功能控制：•RUN：此时上样管加压，使细胞悬液从进样针进入流动室。
（正常显示绿色；黄色时表示仪器不正常，请检查是否失压。
）•STANDBY：无样品或暖机时之正常位置，此时鞘液停止流动，雷射功率自动降低。
•PRIME：去除流动室中的气泡，流动室施以反向压力，将液流从流动室冲入样品管，持续一定时间后，以鞘液回注满流动室。
PRIME 结束，仪器恢复STANDBY状态。
4. 储液箱抽屉：在主机左下方之储液箱抽屉。
可向前拉开，内含鞘流液筒、废液筒、鞘液过滤器Sheath Filter，及空气滤网 Air filter。
请注意气路减压阀VENT TOGGLE之位置。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
流式细胞仪上机操作培训手册
一、样本处理
以PBMC表面抗原的流式检测步骤为例
1)取样。
取新鲜提取或冻存后复苏的PBMC；
2)编号。
根据实验设计，标记好流式管，如每份PBMC设两管：
a)1号管：相应同型对照；
b)2号管：CD3,CD4,CD8,CD56四标管；
3)加样。
用移液器取100ul细胞/管（约1×106个细胞/管），分别加到已经标记
好的流式管底部；
4)洗涤。
加入1ml PBS/管，涡旋1600rpm/min，离心6min；
5)染色。
弃上清，加入100 μl PBS/管涡旋混匀细胞，并根据实验设计，向各流
式管中加入相应的荧光素标记抗体，混匀，室温避光孵育30min（操作尽量保持在避光条件下进行。
）
6)洗涤。
加入1ml PBS/管，涡旋1600rpm/min，离心6min；
7)重悬。
弃上清，加入0.5ml PBS/管，混匀，上机检测(可选择BD FACSCanto
II或BD Accuri C6)。
（注：若不能及时上机，应加入4%多聚甲醛固定，并于4℃避光保存。
）8）试验结果分析。
（注：实验过程中如果进行多色标记，需要调节荧光补偿）。
参考值：
二、上机检测
BD FACSCanto II简要操作流程启动流式细胞仪
1 打开流式细胞仪电源
2 启动计算机，打开软件登录
3 确保软件连接到流式细胞仪
必要时，点击Cytometer > connect
检查液体水平
1 启动流式细胞仪后，检查液体水平
低液面水平或者废液桶满都用红色指示。
2 如果液流车未自动开启，选择Cytometer > Fluidics Startup。
3 当液流启动完成后，点击OK关闭对话框。
检查气泡
1 在检查完液体水平后，开启流动室门，检查流动室中是否有气泡。
2 如果没有看到气泡，进行第5步。
如果看到气泡，点击Cytometer > Cleaning
Modes >De-gas Flow Cell.
3 当完成信息出现后，点击OK。
4 如果还可以看到气泡，重复上述操作。
注意：如果打开流动室细胞进口门时出现错误信息，通过关闭进口门，并等待30秒关闭该信息。
5 当您完成上述操作后，在往下进行之前请先检查激光预热是否已经完成。
创建实验
1 按照需要，在工作区工具栏中点击相应的按钮来显示浏览器、细胞仪、检测器、工作表、获取控制板和双指数编辑器窗口。
2 创建文件夹：
A 在浏览器中选择数据库图标，并点击浏览器工具栏上的New Folder。
B 对该文件夹命名。
3 选择该文件夹，点击New Experriment来创建一个新实验。
4 对该实验进行重命名。
5 选择实验级别的细胞仪设置，然后点击Inspector(检测器)中的Parameters(参数)选项卡。
6 按照需要变更，添加或者删除参数。
运行样本并记录数据
1 将样品管安装到流式细胞仪中并点击Aquire Data(获取数据)。
A 把抽吸臂向左侧推。
B 把流式管放置到SIT上，确保试管竖直，并用力向上推试管直到试管完个停止并完个就位。
C 把抽吸臂放置到试管下的中心位置。
抽吸臂上有3个传感器引脚。
试管底部应定位在这些引脚的中心位置内。
2 调节FSC和SSC电压以正确显示细胞的散射光特征。
3 必要时，点击阈值图标并对FSC阈值进行调节。
4 调节P1门仅围绕目的细胞群体。
5 调节好后，点击Record Data(记录数据)以记录数据。
6 获取停止，取出试管。
建立全局工作表
1 如果用户参数中启用了Default global worksheet(默认个局工作表)(默认选项)，则全局工作表已经存在。
展开全局工作表文件夹来定位和重命名工作表。
（注：如果Default global worksheet被禁用，则通过点击浏览器工具栏中的New Global Worksheet(新个局工作表)按钮创建个局工作表。
）
2 使用设计对话框定义参数标记并指定各个试管要记录的细胞颗粒数。
标记会出现在点图轴上和所有的统计结果图中。
A 选择Experiment(实验)>Experiment Layout(实验布局)。
B 在Labels(标签)选项卡中，为试管输入适当的标签。
例如，在FITC域中输入CD3。
使用Tab键移动到下一个域。
3 在该全局工作表中，创建用预览数据的点图。
例如:创建PerCP-Cy5.5对SSC,FITC对APC, FITC对PE, FITC对PE-Cy7和F ITC对APC-Cy7点图。
设门
通过设门的方法可以定义细胞亚群的区域。
如：PBMC样本是混合细胞群，如果想单独分析淋巴球细胞，可根据FSC或细胞大小，在FSC，SSC的散点图中设门，其数据结果只
反映淋巴细胞亚群的荧光特性。
关机
1选择Cytometer(细胞仪)>Fluidics Shutdown(液流关闭)，并遵循所有的提示。
2关闭细胞仪电源。
3退出BD FACSDiva软件。
C6简要操作流程
开机
1.打开电脑，上样处放置一管双蒸水
2.打开C6仪器，其自动执行“startup”，时间约5min，期间禁止开盖
3.当软件显示仪器状态为“Cytometer Connected and ready”并亮绿灯时，则可以上样
4. （推荐用质控微球上机，FL1-H和FL2-H直方图中必须有八个峰，FL3-H中必须有6-8个峰，即仪器分辨率CV值满足标准）
采集样品
1.样品震荡混匀后置于上样二档处
2.设置流速，采样数目或时间或体积
3.点击“Dot Plot”或“Histogram”或“Density Plot”，选择需要的图形
4.点击坐标轴参数，从下拉菜单中选择需要的参数（如：“FL1-A”“FSC-A”）
5.点击“Plot Spec”，选择“linear”或者“log”，设置坐标轴显示范围
6.右击坐标轴参数，选择“Rename Parameters”，进行坐标轴重命名
7.选择“Display”中的“Events Display Settings”，选择显示的细胞数
8.选择样品位置，点击“run”，进行采样
9.取下样品
10.取新的流式细胞管置于上样针处，点击“backflush”，清洗上样针
11.样品命名
12.点击“Zoom In”，放大指定区域，设置阈值。
点击“Zoom Out”，返回放大
设门
1.在图像下方点击设门工具，圈定指定区域，设置为门
2.点击相应图像上方的“Gate”，选择该图像需要应用的门
设置补偿
若样本是双荧光或三荧光检测，则实际图像显示中会用到荧光补偿
1.点击“Set Color Compensation”
2.选择需要补偿的荧光参数，输入补偿值，点击“Save & Close”
分析统计
点击“Statistic”
可选择预览选择的样品图形，所有的Plot列表。
所有的Plots，Gates以及统计学的列表，从中选择需要显示的信息
关机清洗
1.放置一管去离子水，运行2min，清洗时＜10 Events/sec 才算干净
2.放置一管0.5%-1%有效氯的清洗液，运行2min
3.放置一管去离子水，运行2min，运行结束后去离子水保留在上样处
4.退出软件，关闭电脑
5.关闭电源键（按住时间小于5秒钟），仪器自动Shutdown，时间约为13min，完成后仪
器电源键自动关闭
三、数据分析
略。