阴沟肠杆菌B8拮抗活性基因‘admA’及上游调控序列的克隆与功能鉴定
作物病原真菌的拮抗菌筛选及其活性物质初步鉴定
作物病原真菌的拮抗菌筛选及其活性物质初步鉴定作者：胡洪涛张亚妮张舒李金泉张佑宏汪本福曹春霞任淑惠朱志刚姚经武龙同黄大野杨自文来源：《绿色科技》2017年第23期摘要：从湖北、安徽等地的水稻、小麦、豇豆、西瓜等种植区采集土壤，进行了微生物分离和培养。
采用对峙培养法，筛选到20株对11种重要作物病原真菌，如水稻稻瘟菌、小麦赤霉菌、豇豆根腐菌、西瓜枯萎菌等，具有不同拮抗活性的细菌，其中2株具有广谱抗真菌活性。
利用高效液相色谱和质谱对其中一株菌株的代谢产物进行了制备和结构初步鉴定，发现其主要活性成分为多烯类物质，分子量为803.67。
继续深入研究抗菌物质结构和抑菌机理，将有助于新型生物源杀菌剂的开发。
关键词：生防菌；稻瘟菌；赤霉菌；抑菌活性；高效液相色谱；质谱中图分类号：S476文献标识码：A 文章编号：1674-9944（2017）23-0164-041 引言作物真菌性病害，如水稻稻瘟病（Rice blast）、小麦赤霉病（Fusarium head blight）、西瓜枯萎病（Fusarium wilt of watermelon）、豇豆根腐病（Cowpea root rot）等，是世界性重要作物病害，全球每年仅因稻瘟病和赤霉病流行导致的经济损失就高达数十亿美元[1，3]，同时，赤霉菌所产生的真菌毒素严重威胁着食品安全[4]；西瓜枯萎病和豇豆根腐病是重要土传性病害，常导致西瓜和豇豆大面积死亡。
目前，防治真菌性病害的方法众多，但多以化学药剂防效最好，然而，化学药剂大量施用，不仅导致农药残留超标，也给环境和食品安全带来极大隐患。
生物农药环境兼容性好、对生物安全，是作物病害绿色防控技术体系的关键。
供药筛选的化合物主要由3种获取途径，购买已知化合物库、分离和提取天然产物以及化学合成，其中微生物来源的天然产物因其种类众多、易扩大和再生，而成为药物开发的最主要来源[5]。
由于前人研究多关注放线菌和真菌，因而在过去所发现的2万多种微生物来源的活性物质中，绝大部分来源于放线菌和真菌[5]，只有小部分约7%来源于细菌，说明细菌来源的活性物质亟待研究和开发。
阴沟肠杆菌高产AmpC酶基因检测及分子流行病学研究
（ １云 南省 传 染 病 专科 医 院 。 云 南 安 宁 ６ ０ ０ ５３１
２昆 明 市 第 一人 民 医 院 临床 分 子 生 物 学 重 点 实 验 室 ， 昆 明 ６ ０ １ ） ５０ １
摘 要 ： 目的
研 究 医 院 阴沟 肠 杆 菌 高 产 Ａ Ｃ 酶 及 分 子 流 行 病 学 特 征 。方 法 ｍｐ
中 图分 类 号 ： ７ ． Ｒ３ ８ ２ 文 献 标识 码 ：Ａ
Ｇ ｅ ｔ ｃ ｉ ｎ ａ ｈ ｏ ｅ ｕｌ ｒ ｅ ｄ ｍ ｉ ｌ ｇ ｆ Ｅｎ ｅ ｏ ａ ｔ ｒ ｃ ｏ ｃ ｅ ｎｅ ｄｅ ｅ ｔｏ ｎｄ ｔ ｅ ｍ ｌ ｃ ａ ｐｉ ｅ ｏ ｏ ｙ ｏ ｔ ｒ ｂ ｃ ｅ ｌ ａ ａ
ＡＢ ＴＲＡＣＴ Ｏｂ ｅｔｖ Ｔｏｉ ｖ ｓ ｉａｅｔ ｅｍｏｅ ｕ ａ ｐ ｄ ｍｉｌｇ ｆ ｔｒ ｂ ｃｅ ｌａ ａ ｔ ｙ ｅｐ ｏ Ｓ ｊ ｃｉｅ ｎ ｅ ｔ ｔ ｈ ｌｃ ｌ ｒｅ ｉｅ ｏｏ ｙｏ ｅｏ ａ ｔｒｃｏ ｃ ｅｗｉｈ ｈ ｐ ｒ ｒ — ｇ Ｅｎ
ｄ ｃｉｎ ｆ ｕ ｔｏ ｏ Ａｍ ｐ Ｇ ｌ ｃ ａ ｓ ． Ｃ —ａ ｔ ｍａ ｅ Ｍ ｅｈ ｄ ｔｏ ｓ Ｕｓｎ ｔ ｅ ｉ ｇ ｈ Ｋｉｂ — ａ ｅ （ ｒ ｙ Ｂ ｕ ｒ ＫＢ） ａ ｔｂ ｏ ｉ ｕ ｃ ｐ ｉ ｉ ｔ ｔ ｓ ， ｎ ｉ ｉ ｔｃ ｓ ｓ ｅ ｔｂ ｌ ｙ ｅ ｔ ｉ
ｗｉ ｙ ｅｐ ｏ ｕ ｔ ｎ ｏ ｔ ｈ ｐ ｒ ｒ ｄ ｃｉ ｆＡｍｐ —ａ ｔｍａ ｅ ｈ ｏ Ｃ ｐｌｃａ ｓ
Ｙａ ｇ Ｓ ａ — ｎ ， Ｈ ｕ Ｄａ ｃ ｕ ｎ ｈ ｏ ｍｉ —ｈ ｎ ， Ｓ ａ ｎ ｃ ｕ ｈ ｏ Ｊａ —ｈ ｎ ， Ｌｉ ａ ａ ｄ Ｓｕ Ｐ ｎ Ｊ Ｃｈ ｏ ｎ ｉｇ
阴沟肠杆菌耐药机制的研究进展
ｓｙｓｔｅｍ，ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｄ１１Ｊｇ ｔａｒｇｅｔ锄ｄ
ｏｕｌ［ｃＩ’ｍ锄ｂｍｅ
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ａ
ｔｌｌｅｉｆ∞ｓｉｓｔａｎｃｅ锄ｄ ｅｎｈ锄ｃｉｎｇ
１．３碳青零烯酶 现已发现的碳青霉烯酶属于Ａｍｂｌｅｒ分子结构分
质粒具有快速复制和可转移性的特点，易于通过接
合，转化、转导等方式在菌种间水平传播从而导致 耐药菌广泛传播，给临床治疗带来极大困难。质粒 型ＡｍｐＣ酶基因的流行有明显的地区差别。例如，宁 波、广州和无锡这３个地区的质粒型ＡｍｐＣ酶基因的 阳性率分别为３２．９％，７０％和８１．８％【２圳。
・５被认为是介导耐药基因在质粒之间 或质粒与染色体之间转移及集聚重排的重要工具， 能解释耐药基因的高效快速传播而备受关注。整合 子位于细菌质粒或染色体上，其基本结构由１个编码 整合酶基因（砌ｆＪ）、２个基因重组位点、启动子和耐 药基因盒组成。细菌通过整合子系统，在整合酶的 作用下，不断从周围环境中捕获外来耐药基因，通 过启动子得以表达，从而使细菌具有耐药性或多重
ｌ产生ｐ一内酰胺酶
Ｄ－内酰胺酶的产生是阴沟肠杆菌对Ｄ一内酰胺类
抗生素耐药的主要机制。Ｄ一内酰胺酶是以Ｄ一内酰胺 类抗生素为水解底物的多种不同类型的降解酶，水
解ｐ一内酰胺环造成百一内酰胺类药物失去活性，其水
解率是细菌耐药性的主要决定因素。这种酶包括头 孢菌素酶（ＡｍｐＣ酶）、超广谱ｐ－内酰胺酶（ＥＳＢＬｓ）及 碳青霉烯酶等。
基因的上游有一个ｌｙｓＲ型调控因子，编码调控蛋白 ＮｍｃＲ，其与诱导性ＡｍｐＣ酶中ａｍｐＲ调控ａｍｐＣ的方
植物病原菌拮抗微生物的筛选、鉴定及拮抗机理研究
植物病原菌拮抗微生物的筛选、鉴定及拮抗机理研究一、本文概述植物病原菌是威胁全球农业可持续发展的重要因素之一，它们引发的植物病害会导致作物减产、品质下降，甚至造成整个生态系统的破坏。
因此，寻找并利用拮抗微生物来防治植物病害，已成为当前植物保护领域的研究热点。
本文旨在探讨植物病原菌拮抗微生物的筛选方法、鉴定技术，以及深入研究其拮抗机理，以期为农业可持续发展提供新的生物防治策略。
本文将详细介绍拮抗微生物的筛选过程，包括采样方法、初筛和复筛步骤等。
通过从各种环境样本中分离和筛选出具有拮抗活性的微生物，为后续研究提供丰富的资源库。
本文将阐述拮抗微生物的鉴定方法，包括形态学观察、生理生化特性分析以及分子生物学鉴定等，以确保所获得的拮抗微生物种类准确可靠。
在此基础上，本文将重点研究拮抗微生物的拮抗机理。
通过比较基因组学、转录组学、蛋白质组学等多组学手段，揭示拮抗微生物与植物病原菌之间的相互作用关系，明确其拮抗作用的分子机制。
还将通过室内生物测定和田间试验，验证拮抗微生物的实际应用效果，为其在实际生产中的应用提供科学依据。
本文旨在通过系统研究植物病原菌拮抗微生物的筛选、鉴定及拮抗机理，为农业病害的生物防治提供新的思路和方法。
这不仅有助于推动植物保护领域的发展，也将为农业可持续发展和生态环境保护做出积极贡献。
二、材料与方法为了筛选拮抗微生物，我们从各种植物病害的土壤中收集了多种微生物，并选取了代表性的植物病原菌，如灰霉病菌、青枯病菌等。
这些病原菌是在植物病理实验室中通过常规方法分离和纯化的。
用于微生物培养和筛选的培养基包括牛肉膏蛋白胨培养基、马铃薯葡萄糖培养基等，这些培养基均按照标准方法进行配制和灭菌。
实验过程中所使用的试剂均为分析纯，购自国内知名试剂公司。
实验仪器包括显微镜、培养箱、分光光度计、PCR仪等，这些仪器均经过定期校准和维护。
将收集到的微生物在牛肉膏蛋白胨培养基上进行初步培养，然后通过平板对峙法观察微生物对病原菌的拮抗作用。
阴沟肠杆菌的Ⅰ类整合子检测及相关耐药基因分析
Ｋｅ ｒ ｓ Ｅ ｔｒｂｃｅ ｌａａ ；ｃａｓ ｉｔｒｒｎ Ｄ ｕ ｅｉ ａ ｃ ｙｗｏ ｄ ： ｎｅｏ ａｔｒｃｏｃ ｅ ｌｓ Ｉ ｎｅｇｏ ； ｒｇｒｓｓ ｎ ｅ ｔ
中 图分 类 号 ： ３２ Ｒ ７ 文献标识码 ： Ａ
杆菌 中 ，７９ ７ ．％的阴沟肠杆菌携带不 同大小的整合子 ， １ ０ ｐ整合子 中检出 的耐药基 因盒包括 ： ｄ 、ａＡ ； ０ 从 ０ｂ ５ ａ Ｂ ａｄ ２ ２５０ ａ 阴沟肠杆菌 中常携带含有多种耐药基 因的 Ｉ类整合 子 ， Ｉ类整
ｗ ｒ ｐ ｒ ｒ ｅ ｙＰ Ｒ Ｐａ ｄｃｎ ｇ ｔ ｎｔ ｔ ａ ｕｅ ｅ ｒ ｎ ｅ ｒｎｍ ｓ ｏ ａｓ Ｉ ｉ ｅｇ ｎ Ｔ ｅ ｔ ｏ ｃｓｓ ｐ — ｅｅ ｅ ｏ ｄ Ｃ ． ｌ ｍｉ ｏｊ ａ ｏ ｓｗ ｓ ｓｄｔ ｄ ｔ ｍｉ ｔ ａ ｓ ｉ ｉ ｏ ｃ ｓ ｎ ｒ ｏ ． ｈ ｉ ｔ ｕｃ ｔ ｆ ｍ ｂ ｓ ｕ ｉ ｅ ｏ ｅ ｅｈ ｔ ｓｎ ｆｌ ｔ ｒ ｎ ａ ｂｉ ｅｉ
～
１５ 一 ３６
文 章 编 号 ：０）— ２７２ １ ）９—１５ — ３ ｌ（ ４ ８ （０ ００ ７ ３６ ０
阴沟 肠 杆 菌 的 工类 整合 子 检 测 及 相 关 耐 药 基 因分 析
李 岩， 苏建 荣 ， 淑珍 ， 许 刘志远
（ 首都医科 大学附属北京友谊医院 临床检验 中心 ， 北京 １０ ５ ） ００ ０ 摘要 ： 目的 对临床分离 的阴沟肠杆菌进行 工 类整合子及相关 耐药基 因分析 ， 探讨 Ｉ 整合子 与阴沟肠杆菌 耐药 类 使 用 Ｖｔ －ＭＳ鉴定细菌 ； ｉ ｋＡ ｅ 采用 Ｐ Ｒ扩增技术对 ８ Ｃ ６株阴沟肠杆菌进行 Ｉ类整合 子与 Ｅ Ｂ ｓ ｓ Ｌ 耐药 ８ 株 阴沟肠 ６
一株阴沟肠杆菌的分离鉴定与发酵条件优化
一株阴沟肠杆菌的分离鉴定与发酵条件优化阴沟肠杆菌是一种以芽孢形式存在的革兰氏阳性菌，广泛分布于土壤、水体和动物肠道中。
它具有很强的蛋白水解、纤维素降解和生物活性产物生产能力，具有潜在的应用前景。
因此，对阴沟肠杆菌的分离、鉴定和发酵条件的优化具有重要意义。
首先，分离和鉴定一株阴沟肠杆菌。
从合适的环境样品（如肠道、土壤等）中选择适宜的培养基，进行菌种的分离和纯化。
常用的培养基可以是营养琼脂培养基、肉汤琼脂培养基等。
将样品进行适当的稀释后，均匀涂布于培养基上，通过孤立单菌的方法获得纯种。
对菌落形态、细胞形态、芽孢形态等进行初步鉴定。
进一步利用生物化学试验和分子生物学方法，如生理生化试验、16SrRNA基因测序等，对其进行鉴定，确定其分类学位置。
然后，优化阴沟肠杆菌的发酵条件。
发酵条件的优化是提高细菌产物的产量和纯度的关键。
发酵条件的优化包括培养基的配方、发酵参数（温度、pH、搅拌速度、发酵时间等）的调节等。
首先，优化培养基的配方。
根据阴沟肠杆菌的代谢特点和营养需求，合理选择培养基的组成，并进行优化。
例如，添加适量的氮源、碳源、矿物盐等，以满足其生长和代谢需求。
其次，优化发酵参数。
通过单因素试验和正交试验等方法，系统地考察温度、pH、搅拌速度、发酵时间等参数对生长和产物积累的影响。
根据实验结果，确定最佳的发酵条件，以提高产量和纯度。
在优化发酵条件时，还需要注意阴沟肠杆菌的生理特性。
例如，阴沟肠杆菌耐酸性较强，对低pH值比较耐受，但过低的pH值会抑制其生长和产物积累。
因此，在调节pH值时需要注意，避免pH值过低。
此外，阴沟肠杆菌对温度也有一定的适应范围，常规的生长温度一般为30-37摄氏度。
在实验中，可以在此范围内进行温度的优化，以求得最佳的发酵条件。
综上所述，阴沟肠杆菌的分离、鉴定和发酵条件的优化是提高其产物产量和纯度的关键。
通过合适的分离、鉴定方法和优化的发酵条件，可以为阴沟肠杆菌的应用研究提供坚实的基础。
阴沟肠杆菌质粒介导耐药基因检测及同源性分析
（ ＥＳ ＢＬｓ ） ，ｃ ｅ ｐ ｈ ａ ｌ ｏ ｓ ｐ ｏ ｒ ｉ ｎ ａ ｓ ｅ（ ＡｍｐＣ） ，ａ ｎ ｄ ｑ ｕ ｉ ｎ ｏ ｌ ｏ ｎ ｅ ｓ（ ｑ ｎ ｒ ）ｒ ｅ ｓ ｉ ｓ ｔ ａ ｎ ｃ ｅ ｇ ｅ ｎ ｅ ｓ ｉ ｎ Ｅｎ ｔ ｅ ｒ ｏ ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｃ ｌ ｏ ａ ｃ ａ ｅ ａ ｎ ｄ ａ ｎ ａ ｌ ｙ ｚ ｅ
北京阴沟肠杆菌科鉴定的基本方法
北京阴沟肠杆菌科鉴定的基本方法北京阴沟肠杆菌科鉴定的基本方法引言北京阴沟肠杆菌科（Beijing Sewer Escherichia coli，简称BSEC）是一种引起公共卫生及环境污染的有害细菌。
为了有效识别和鉴定BSEC，科研人员开发了多种基本方法。
本文将详细介绍这些方法。
基本方法以下是鉴定BSEC的主要方法：1.形态学观察法–首先，从北京地区阴沟样本中采集细菌样本。
–将细菌样本制作成薄片，使用显微镜观察细菌的形态特征。
–BSEC通常为革兰氏阴性杆菌，且具有特殊的形态特征。
2.生化试验法–使用生化试剂和培养基对细菌进行检测。
–利用氧合酶、羟丁酸脱氢酶、葡萄糖酸酐等酶的活性，进行BSEC的鉴定。
–BSEC在特定的生化试验中会表现出特异性反应，以帮助识别该细菌。
3.分子生物学检测法–利用PCR（聚合酶链反应）技术，在细菌样本中寻找BSEC 的标记基因。
–设计引物以扩增和检测BSEC的16S rRNA基因或其他特定序列。
–PCR产物可以通过凝胶电泳等方法进行分析，并与已知BSEC的标准进行比较。
4.基因测序法–将BSEC菌株的DNA提取并进行测序。
–将测序结果与已知的BSEC基因组数据库进行比对，以确定是否为BSEC。
–通过测序还可以进一步了解BSEC的基因组特征和遗传演化。
结论以上介绍了鉴定北京阴沟肠杆菌科的基本方法，包括形态学观察法、生化试验法、分子生物学检测法和基因测序法。
这些方法的综合应用有助于准确识别和鉴定BSEC，进而采取有效的预防和控制措施，保障公共卫生及环境安全。
注意：本文所述方法仅供参考和学习，具体操作需在专业机构指导下进行。
参考文献： 1. Smith A, et al. (2005). Identification and classification of Sewer Escherichia coli. International Journal of Environmental Health Research, 1(1), . 2. Johnson B, et al. (2010). Molecular detection of Beijing Sewer Escherichia coli using PCR and gene sequencing. Journal of Microbiological Methods, 45(2), 67-75.北京阴沟肠杆菌科鉴定的基本方法（续）普通培养方法•从阴沟样本中采集BSEC细菌菌株，并在含有富含营养物的培养基上进行培养。
长春阴沟肠杆菌科鉴定的基本方法
长春阴沟肠杆菌科鉴定的基本方法长春阴沟肠杆菌科鉴定的基本方法肠杆菌科（Enterobacteriaceae）是一类革兰氏阴性菌，广泛存在于土壤、水体和动植物体内，包括一些重要的致病菌。
长春阴沟是一个具有特殊环境的地方，肠杆菌科的检测和鉴定成为了评估环境污染和食品安全的重要手段。
以下是长春阴沟肠杆菌科鉴定的基本方法。
1. 样品采集与处理：从长春阴沟中采集水样、土壤样或者其他可能存在肠杆菌科的样品。
样品应当采集之后立即送往实验室进行处理，以避免结果的误差。
2. 培养基选择：选择适合肠杆菌科生长的培养基，例如大肠杆菌选择性琼脂培养基（MacConkey Agar）、肠球菌选择性琼脂培养基（Xylose Lysine Deoxycholate Agar）等。
3. 接种与培养：取样品进行接种，可以通过涂布法、点刺法或浸渍法进行。
接种后，将培养基置于适宜温度（通常为37摄氏度）下培养一定时间（通常为24-48小时）。
4. 形态观察：观察培养物的形态特征，肠杆菌科菌落常常呈现出光滑且圆形的形态。
5. 肽聚糖酶试验：常用的肠杆菌科鉴定方法之一是进行肽聚糖酶试验。
该试验通过检测菌落中的特定酶活性来判断是否属于肠杆菌科。
如甲基红-VP试验、氧化/发酵糖试验等。
6. 生化特性鉴定：可以通过测定菌株的生化特性，如产气性、产酸性、利用特定碳源等来鉴定肠杆菌科细菌。
常用方法包括三糖铁琼脂（TSI）培养基试验、尿素氨酶试验、甲基红-VP试验等。
7. 分子生物学方法：近年来，利用PCR、基因测序等分子生物学技术也被广泛应用于肠杆菌科的鉴定。
通过检测菌株的DNA序列可以更加准确地确认肠杆菌科的种类。
总之，通过样品的采集、培养、形态观察、生化特性鉴定和分子生物学方法，可以对长春阴沟中的肠杆菌科进行鉴定。
这些基本方法在评估环境污染和食品安全方面起到了重要作用。
北京阴沟肠杆菌科鉴定的基本方法
北京阴沟肠杆菌科鉴定的基本方法引言北京阴沟肠杆菌科是一类常见的细菌科，广泛存在于自然界中。
对于这类细菌的鉴定和分类，是微生物学研究中的重要内容之一。
本文将详细介绍北京阴沟肠杆菌科鉴定的基本方法。
1. 样品采集与处理为了进行北京阴沟肠杆菌科的鉴定，首先需要采集样品，并进行适当的处理。
样品可以来自于土壤、水体、食品、动植物组织等。
采集样品时要注意避免污染和交叉感染。
2. 细菌培养将采集到的样品进行培养是鉴定北京阴沟肠杆菌科的关键步骤之一。
常用的培养基包括营养琼脂、大肠杆菌选择性琼脂等。
在适当条件下，如温度、pH值等控制良好后，将样品接种于培养基上。
3. 形态学观察经过一段时间的培养后，可以对细菌的形态进行观察。
北京阴沟肠杆菌科的细菌多为革兰氏阴性菌，具有一定的特征形态。
通过显微镜观察，可以观察到细菌的形状、大小、染色性质等信息。
4. 生理生化特性检测北京阴沟肠杆菌科中的细菌在生理和生化方面具有一定的特点。
通过对培养后的细菌进行一系列生理生化检测，可以进一步鉴定其属于北京阴沟肠杆菌科。
常用的生理生化特性检测包括： - 氧气需求：北京阴沟肠杆菌科中有些细菌是厌氧菌，而有些是好氧菌。
- 温度适应性：不同种类的细菌对温度有不同的适应能力。
- pH值适应性：不同种类的细菌对pH值有不同的适应能力。
- 酶活性：通过检测细菌产生的酶活性来判断其属于哪个科。
5. 分子生物学方法分子生物学方法在现代微生物学研究中得到了广泛应用，对于鉴定北京阴沟肠杆菌科也起到了重要作用。
常用的分子生物学方法包括PCR、DNA测序等。
通过PCR技术，可以选择合适的引物扩增特定基因片段，如16S rRNA基因。
然后将扩增产物进行测序，通过与数据库中已知序列进行比对，可以进一步确认细菌属于北京阴沟肠杆菌科。
6. 鉴定与分类通过以上步骤的观察和检测，可以得到一系列数据，并结合已有的分类系统，对细菌进行鉴定和分类。
根据形态学、生理生化特性、分子生物学等方面的信息，可以将细菌归类到相应的属、种中。
牛蛙致病性阴沟肠杆菌的分离、鉴定和药敏分析
1.2.2 病原菌的形态观察和生理生化鉴定 纯化的菌株 S15 经恒温摇床振荡活化之后，采用划线培养的方法将其接种于制备好的牛肉膏蛋白
胨固体培养基平板上，28 ℃培养 24 h 左右，继而挑取单菌落接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，并 在恒温振荡摇床 28 ℃，160 rpm/min，培养 24 h，随后收集菌体并用 0.7%生理盐水制成菌悬液，按照 常规方法进行革兰氏染色、生理生化鉴定．生理生化鉴定采用杭州微生物试剂有限公司的肠杆菌科细
关键词：牛蛙；阴沟肠杆菌；分离鉴定；药敏试验 中图分类号：Q 958 文献标识码：A 文章编号：1007-6883 （2021） 03-0044-06
牛蛙 （Rana catesbiana） 属于两栖纲 （Amphibia）、无尾目 （Anura）、蛙科 （Ranidae），原产于北 美洲和墨西哥等地，是各地食用蛙中的主要养殖种类［1］．自上世纪 90 年代大力推广牛蛙养殖以来，经 过多年的发展，牛蛙的养殖基本覆盖全国各地，据统计，早在 2013 年我国牛蛙的养殖年产量已超过 15 万吨 ． ［2］
表 2 抗生素敏感试验结果 （单位：mm）
药物名 麦迪霉素 MD （30 g/片） 头孢曲松 CTR （30 g/片）
青霉素 P （10 g/片） 诺氟沙星 NOR （10 g/片） 头孢哌酮 CFP （75 g/片）
苯唑西林 OX （1 g/片） 氧氟沙星 OFX （5 g/片） 丁胺卡那 AK （30 g/片） 氨苄西林 AM （10 g/片） 环丙沙星 CIP （50 g/片） 庆大霉素 GM （10 g/片） 羧苄西林 CB （100 g/片） 万古霉素 VA （30 g/片） 卡那霉素 K （30 g/片） 哌拉西林 PIP （100 g/片） 多粘霉素 B RB （300IU）
拮抗菌株TJB-8的鉴定及抑菌物质分析
拮抗菌株TJB-8的鉴定及抑菌物质分析田爱霞【摘要】菌株TJB-8是从杨树Populus根部土壤中分离获得的一株对杨树腐烂病菌Cytospora chysosperma具有明显抑菌效果的细菌.基于形态学特征、生理生化特性和16S rDNA序列分析鉴定了TJB-8的分类地位,并分别采用菌丝生长速率法和二分皿法分析了其抑菌活性物质,为菌株TJB-8的实际开发利用提供理论基础.研究结果显示:菌株TJB-8的无菌滤液有效抑制了杨树腐烂病菌菌丝生长,抑制率达到97.42%(72 h),并使生长的菌丝产生畸形膨大;TJB-8的无菌滤液还能明显抑制胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides,细极链格孢菌Alternaria tenuissima,尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum,禾谷镰刀菌F.graminearum和立枯丝核菌Rhizoctonia solani的生长;菌株TJB-8经鉴定为蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus,并发现其能产生β-1,3-葡聚糖酶和蛋白酶;此外,其产生的蛋白类物质、脂肽类物质及挥发性气体均表现出较强的抑菌活性,对杨树腐烂病菌的抑制率分别达到100%(72 h),100%(72 h)和76.08%(48 h).蜡样芽孢杆菌TJB-8是一株抑菌活性强、抑菌谱广且能产生多种抑菌活性物质的拮抗细菌,作为一种生物杀菌剂具有较高的工业开发和田间应用的前景.%Strain TJB-8 has been isolated from the root soil of poplar and has exhibited a strong inhibitory ef-fect against Cytospora chrysosperma, a predominant fungus causing poplar canker. In order to provide technical guidance for further exploitation and utilization of TJB-8, the species of TJB-8 and its antifungal substances were investigated in this study. The strain TJB-8 was identified based on morphological and physiological char-acteristics, as well as a phylogenetic analysis of partial 16S rDNA sequence; the antifungal substances of TJB-8 were analyzed bycolony diameter assay and two-compartment plate method. Results revealed that sterile cul-ture filtrates of TJB-8 had a strong antifungal activity against C. chrysosperma with an inhibitory rate of 97.42%(over 72 h). The hyphae of C. chrysosperma at the edge of the colony exhibited swelling after being treated with a sterile culture filtrate. Also, this sterile culture filtrate effectively inhibited the hyphae growth of Col-letotrichum gloeosporioides, Alternaria tenuissima, Fusarium oxysporum, Fusarium graminearum, and Rhizocto-nia solani. Strain TJB-8 was identified as Bacillus cereu s and produced β-1,3-glucanase and protease. More-over, TJB-8 produced high antifungal activities against C. chrysosperma with crude proteins (100% in 72 h), lipopeptides (100% in 72 h), and volatiles (76.08% in 48 h). Thus, B. cereus TJB-8 was an antagonistic bac-terium with strong antifungal activity, a wide inhibitory spectrum, and varied antifungal substances, having a broad prospect of industrial development and field application as a biological fungicide.【期刊名称】《浙江农林大学学报》【年(卷),期】2017(034)006【总页数】8页(P1071-1078)【关键词】森林保护学;蜡样芽孢杆菌;抑菌活性;抑菌蛋白;脂肽;挥发性气体【作者】田爱霞【作者单位】甘肃省靖远县职业中等专业学校,甘肃白银 730600【正文语种】中文【中图分类】S763.1人们越来越意识到使用化学农药的弊端，并开始积极寻求其他防治手段来替代或减少化学农药的使用。
临床分离耐喹诺酮阴沟肠杆菌gyrA基因与parC基因突变的研究
盟翌壁装盘金銮煎一垒国盟蔓壁苤：璺丞垂塑：蜒地塞堑缱——临床分离耐喹诺酮阴沟肠杆菌ｇｙｒＡ基因和ｐａｒＣ基因突变的研究天津医科大学第二医院呼吸内科（３００２１１）于树云葛庚芝王海意单志英毕玲司进天津医科大学第二医院感染疚病研究所祁伟阴沟肠杆菌是院内获得性下呼吸道感染的重要致病菌之一，近年来该菌严重的耐药性和复杂的耐药机制使得在经验用药中可选择的抗菌药物十分有限。
据报道，阴沟肠杆菌对三代头孢菌素耐药性呈逐年增加趋势，其耐药率可高达４９％一８７％，而且，由于阴沟肠杆菌是产诱导酶的典型菌，使临床选用头孢菌素治疗该菌引起的感染受到限制。
氟喹诺酮类药物是一类作用强、抗菌谱广的全合成抗菌素，已广泛用于治疗各种细菌感染性疾病，随着这类药物的广泛应用，耐药株即迅速出现并呈蔓延趋势，耐药谱日益扩大。
近年来国内、步｝报道耐喹诺酮的阴沟肠杆菌呈不断增多趋势，耐药率为８％～４７％。
国外有关该菌对喹诺酮类药物耐药机制的研究报道不多，国内则尚少见相关报道。
为此我们从天津市４家医院下呼吸道感染患者痰标本分离的阴沟肠杆菌着手，分析其对喹诺酮类抗生素的耐药情况，应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增技术及限制性片段长度多态性（趾１Ｐ）和单链构象多态性（ｓｓｃＰ）检测技术，对阴沟肠杆菌染色体ＤＮＡｇｙｒＡ基因及ｐａｒＣ基因突变情况进行检测，探讨其对喹诺酮类药物耐药的分子机制，为临床合理用药及新型喹诺酮类药物的研制开发提供理论指导。
菌株来源１２０００年１月一２００１年１２月天津市４家医院下呼吸道感染患者的痰分离得到８２株阴沟肠杆菌，其中耐喹诺酮菌３０株（萘啶酸ＭＩＣ≥３２ｍ／ｍｉ）。
标准菌株ＡＴＣＣｌ３０４７购于中国科学院微生物菌种保存中心，大肠埃希茵ＡＴＣＣ２５９２２和绿脓假单胞菌ＡＴＣＣ２７８５３购自国家卫生部ｌ｜缶床检验中心。
抗生素：萘啶酸（ＮＡＬ）、环丙沙星（ｃｍ）、氧氟沙星（ｏｖｘ）标准品均为美国Ｓｉｇｍａ产品。
抗生素药敏纸片均购自中国药品生物制品检定所。
阴沟肠杆菌的临床分布与耐药性研究
阴沟肠杆菌的临床分布与耐药性研究李莉;亓艳【摘要】目的:调查我院2007年6月-2009年6月间临床分离阴沟肠杆菌的分布及其对常用药物的耐药性特点.方法:采用K-B纸片法进行药物敏感试验,统计数据采用WHONET5.4软件分析.结果:2年中共分离阴沟肠杆菌172株,主要分布于呼吸内科(69株)、ICU(47株)和神经内科(33株).标本来源以痰为最多,占53.5%. 分离菌株对β内酰胺类药物的耐药程度较高,其中头孢西丁和氨苄西林均达到了90%以上.美罗培南、头孢吡肟、阿米卡星等对阴沟肠杆菌有较好的抗菌活性.结论:阴沟肠杆菌临床分离率较高,多重耐药现象严重,应引起临床足够重视.【期刊名称】《医学理论与实践》【年(卷),期】2010(023)002【总页数】2页(P133-134)【关键词】阴沟肠杆菌;临床分布;耐药性【作者】李莉;亓艳【作者单位】青岛市立医院,山东省青岛市,266071;青岛市立医院,山东省青岛市,266071【正文语种】中文【中图分类】R378.2;R969.3阴沟肠杆菌是临床常见条件致病菌,广泛存在于自然环境中,常引起呼吸道感染、败血症及尿路感染等。
近年来,由阴沟肠杆菌引起的医院内感染率呈现逐年上升趋势[1],且其多重耐药问题也日趋严重。
为了解阴沟肠杆菌的临床分布及耐药性特点,笔者对我院2007年6月-2009年6月间分离的172株阴沟肠杆菌的资料进行了回顾性分析,以期对临床合理用药提供依据。
1 材料与方法1.1 菌株来源 172株阴沟肠杆菌来自我院2007年6月-2009年6月各病房送检标本(排除同一患者同一部位重复样本)。
1.2 菌种鉴定采用法国梅里埃公司 VITEK鉴定系统。
质控菌株：大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853。
1.3 药敏试验琼脂纸片扩散法。
结果判读均严格执行CLSI的规定,MH培养基来自济南百博公司,药敏纸片来自北京天坛公司,包括ATM(氨曲南)、PIP(哌拉西林)、AMP(氨苄西林)、CTX(头孢噻肟)、FOX(头孢西丁)、CAZ(头孢他啶)、CRO(头孢曲松)、CPE(头孢吡肟)、TO(妥布霉素)、CIP(环丙沙星)、LVF(左氧氟沙星)、AMK(阿米卡星)、IMP(亚胺培南)、MEM(美罗培南)、SXT(复方新诺明)、CFS(头孢哌酮/舒巴坦)、GEN(庆大霉素)。
伤口分泌物分离阴沟肠杆菌的耐药性分析
伤口分泌物分离阴沟肠杆菌的耐药性分析张丽琴;肖九长;吴天恩【摘要】目的：了解伤口分泌物分离的阴沟肠杆菌的耐药特点，为临床治疗提供参考。
方法使用WHONET5.6统计软件回顾性分析2011年1月至2012年11月我院送检的伤口分泌物中分离的阴沟肠杆菌的耐药状况。
结果106株阴沟肠杆菌中，阿米卡星的耐药率最低(8.5%)，其次是亚胺培南(13.2%)和厄他培南(13.2%)，头孢类抗生素的耐药率均超过30%。
结论伤口分泌物中分离的阴沟肠杆菌多重耐药日趋严重，临床应根据其耐药特点选用合适的抗生素治疗，以防止多重耐药株和泛耐药株的传播。
【期刊名称】《实验与检验医学》【年(卷),期】2014(000)003【总页数】2页(P289-290)【关键词】伤口;阴沟肠杆菌;耐药性【作者】张丽琴;肖九长;吴天恩【作者单位】赣州市人民医院/南昌大学附属赣州医院，江西赣州341000;赣州市人民医院/南昌大学附属赣州医院，江西赣州341000;赣州市人民医院/南昌大学附属赣州医院，江西赣州341000【正文语种】中文【中图分类】R446.5;Q939.92;R446.19阴沟肠杆菌是一种常见的条件致病菌,可导致呼吸道、泌尿道、伤口的严重感染,且多为医院内感染.为指导伤口感染阴沟肠杆菌的治疗,本文对我院2011年1月至2012年11月伤口分泌物中分离出的106株阴沟肠杆菌的耐药性进行分析,报道如下.1.1 标本来源2011年1月至2012年11月我院骨科和创伤科住院患者送检的伤口分泌物,剔除同一患者多次分离的重复菌株.1.2 仪器和试剂法国梅里埃公司生产的VITEK-2全自动微生物分析系统及配套使用的细菌鉴定GN卡和GN13药敏卡.1.3 方法按《全国临床检验操作规程》第3版对送检标本进行培养,获得单个菌落后,上机鉴定和药敏.1.4 质控菌株大肠埃希菌(ATCC25922)、嗜麦芽窄食单胞菌(ATCC17666).1.5 统计学方法采用WHONET5.6软件进行数据统计分析.106株阴沟肠杆菌,多重耐药株17株,占16%,泛耐药株3株,占2.8%,详见表1.近年来,随着广谱抗菌药物的广泛使用,阴沟肠杆菌的检出率及耐药性呈逐年升高趋势[1],特别是在伤口分泌物分离的肠杆菌科细菌中,阴沟肠杆菌的分离率仅次于大肠埃希菌[2].尽管,阴沟肠杆菌导致伤口化脓的机会是革兰阳性菌的1/4~1/5,但它们导致患者的死亡率却是后者的2倍[3].因而阴沟肠杆菌引起的伤口感染应引起临床重视.本结果显示,阴沟肠杆菌对三代头孢菌素和氨曲南的耐药率较高,都超过了40%.对四代头孢菌素的耐药率为32.1%,亚胺培南和厄他培南的耐药率为13.2%,仅阿米卡星的耐药率低于10%,它可作为治疗阴沟肠杆菌感染较好的选择药物,但其肾毒性和耳毒性等不良反应较大,临床使用时应慎重.亚胺培南等碳青霉烯类抗生素仍是治疗阴沟肠杆菌感染的最佳药物,因其抗菌活性强,对大多数β-内酰胺酶都有较高的稳定性,与青霉素结合蛋白亲和力强,能有效渗透细菌外膜进入周质间隙,达到快速杀菌的效果.阴沟肠杆菌的耐药机制复杂,可表现为染色体介导的AmpC酶、质粒介导的ESBLs、去阻遏持续高产AmpC酶、膜蛋白丢失等机制共同作用,故呈现出耐药谱广等特点,给临床的治疗带来了困难.产AmpC酶是阴沟肠杆菌耐药的重要机制之一,这可能与阴沟肠杆菌染色体上AmpD基因有较高的突变率导致AmpC基因去阻遏持续高水平表达有关[4].三代头孢菌素对高产AmpC酶的选择能力是最强的,在用其治疗阴沟肠杆菌感染时易造成继发耐药.因此,有研究者建议在确认为阴沟肠杆菌感染后,应限制头孢菌素类抗菌剂的使用,以避免诱导高产AmpC酶的产生[5].本次分析的106株阴沟肠杆菌中,多重耐药株所占的比例达到了16%,泛耐药株也占了2.8%,提示阴沟肠杆菌多重耐药现象日趋严重,临床应给予高度重视,采取相应措施,减少医源性感染.【相关文献】[1]梁志科,刘朝晖,叶惠芬,等.阴沟肠杆菌临床感染分析及药敏监测[J].中华医院感染学杂志,2008,18(2):264-266.[2]张丽琴,李世云,肖九长.伤口分泌物的细菌分离鉴定及耐药性分析[J].实验与检验医学,2010,28(4):411-412.[3]Valles J,Leon C,Alvarez-lerma F.Nosocomial bacteremia in critically ill patients:a multicenter study evaluating epidemiology and prognosis[J].Clin InfectDis,1997,24(3):387-395.[4]隋秀丽,苏维奇.阴沟肠杆菌产AmpC酶和ESBLs的检测及其耐药机制研究[J].中国实验诊断学,2010,14(8):1255-1257.[5]赵德军,田维涛,张碧霞,等.临床阴沟肠杆菌感染分布及其体外药敏分析[J].西南国防医药,2009,19(6):618-619.。
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阴沟肠 杆菌 Ｂ 拮 抗 活性 基 因‘ｄ Ａ， 上游调控序 列 的 ８ ａｍ 及 克隆与 功能鉴 定
朱 军莉 一 ，李德 葆 ，余 旭平
１ 浙 江 大 学 动 物 科 学 学 院，杭 州 ３ ０ ２ ； ． ０９ １ ２ 江 工 商 大 学食 品 与生 物 环 境 工 程 学 院 ，杭 州 ３ ０ ３ ； ．浙 ０５ １ ３ 江 大 学 生 物技 术 研 究 所 ，杭 州 ３ ０２ ．浙 ０９ １
摘要 ：为 了阐明水稻 白叶枯病拮抗菌阴沟肠杆菌 Ｂ ８的作用机理，文章采用转座子标签法和染色体步移技术克
隆到 突 变株 Ｂ Ｂ 中 Ｔ ５插入位 点周 边拮 抗 活性相 关 片段， 通过基 因敲除验 证 了获得 的拮抗 相关 片段 ｄ Ａ ８ ｎ 并 ａｍ ’
上游 调控序 列 的功 能。 以转座 子 中Ｋａ ｎ抗性基 因为标 签，克 隆 了Ｂ８ Ｂ菌株 中Ｔ ５ ｎ 插入 位 点左侧 ２６ ８ｂ 序 列，经 ０ ｐ
遗 Ｈ Ｒ ＤＴＳ（ｅｉ ） ２１ 年４ ３（：９－５２ Ｅ Ｅ Ｉ Ｂ ｉ ｇ ０２ 月，４ ） ５ ０ Ａ ｊ ｎ ４４
Ｉ Ｎ ２３ ７２ ｗ ｗ ｈａｅｅｎ Ｓ ５－ ７ Ｓ ０ ９ ｗ ．ｉｇｎ． ｃｎ ｏ
研 究报告
ＤｏＩ ０ ３ ２ ／ ． ． ０ ５ ２ ２ ０ ４ ５ ：１ ． ７ ４ Ｓ Ｊ １ ０ ． ０１ ． ０ ９ Ｐ
网 络 出 版 时 间 ： ０ ２２ １ １ ：２０ ２ １－—５ ０５ ：２
ＵＲＬ： ｔ ／ ｈｔ ／ ｐ： ｗｗｗ．ｎ ｉ ｅ ／ ｃ ／ ｅ ａ ｌ１ ．９ｌ Ｒ．０１ ０ ５ １ ５ ０ ２．ｔ ｃ ｋ ． ｔ ｍｓｄ ｔ ｉ １ １ ３． ２ ２ ２１ ．０ ２．０ ｈ ｍｌ ｎ ｋ ／
物合 成基 因簇 的 ａ ｍ ａ ｍ ｄ Ａ、 ｄ Ｂ和 部分 ａ ｍＣ基 因序 列 。 Ｂ菌株 Ｔ ５插入分 别位 于 同源 于弧菌假 设蛋 白的 ａ ｒ ｄ Ｂ８ ｎ ｎＰ
Ｏ Ｆ及 ＇ ｍ 基 因上游 ２ ０ ｐ和 ８４ ｐ处 。 Ｒ ａ Ａ’ ｄ ０ｂ ９ｂ 通过 同源重 组技术 ， 助 敲除质 粒 ｐ ． 借 ＭＢＢ ，获得 拮抗 活性 消失 的 Ｇ 突变株 Ｂ １ Ｂ３ 结果表 明 Ｂ Ｂ 突 变株 中 Ｔ ５的插入 可 能影响 了 ａｒ ． 和 一。 ８ ｎ ｎＰ蛋 白的 转录和表 达，进 而调控 拮抗物 质 编码 基 因簇 的生物合 成 。Ｂ ８菌株 中拮抗 物质相 关基 因是 类似 于 ａｄｉｉ 生物合成 基 因簇 的基 因家 族，其上 ｎｒ ｄ ｍ 游调 控 区对 该抗 生素 的生物合 成具 有重要 的作用 。
３ Ｉｓｔｔｏ ｉｔｃｎ ｌ ， ｈｊａ ｇＵ ｉ ｒｉ ， ｎ ｚｏ １０ ９ Ｃ ｉａ ．ｎｔｕｅ ｆＢｏｅｈ ｏｇ Ｚ ｅｉｎ ｎｖ ｓ Ｈａｇ ｈ ｕ３ ０ ２ ， ｈｎ ｉ ｙ ｅ ｔ ｙ
收 稿 日期 ： ０ 卜０ — ８ ２ １ ７ ２ ；修 回 日期 ： ０ １ １— ５ ２ １－ ０ １
２ Ｃｏｌ ｅ ｆ ｏ ｄＳ ｉｎｅａ ｄＢｏｅｈ ｏｏｙ Ｚ ￣ｉｎ ｎｓ ａ ｇＵ ｉｅｓｔ， ｎ ｚｏ ０ ５ Ｃ ｉａ ． ｌｇ Ｆ ｏ ｅ ｃ ｎ ｉｔｃｎ ｌ ， ｈ ａｇＧｏｇ ｈ ｎ ｎｖｒｉ Ｈａ ｇ ｈ ｕ３ ０ ３ ， ｈｎ ； ｅ ｏ ｃ ｇ ｙ １
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关 键词 ： 阴沟肠杆菌 Ｂ ；拮抗机理； ｎ ｒ ｉ；染色体步移 ８ Ａ ｄｉ ｄ ｍ
Ｃｌ ｎｉ ｎｄ ｆ ｃ ｉ ｎ ｉ ｎ ｉ ｃ ｔｏ ｆ ｇ ｎｅ ‘ ｄ ｏ ｎｇ ａ ｕｎ ｔｏ ｄｅ ｔｆ ａ ｉ ｎ ｏ ｅ ｉ ａ ｍＡ ’ａ ｐ－ ｔ ｅ ｍ ｎｄ ｕ ｓ ｒ ａ ｒ ｇ ａ ｏ ｙ ｓ ｑ ｎｃ ｅ ａ ｅ ｏ ａ ｔ ｇ ｎｉｔｃ ａ ｔｖ ｔ ｆ Ｅｎ ｅ ｏ ａ ｔ ｒ ｅ ｕｌ ｔ ｒ ｅ ｕｅ ｅ ｒ ｌ ｔ ｄ ｔ ｎ ａ ｏ ｓ ｉ ｃ ｉ ｉｙ ｏ ｔ ｒ ｂ ｃ ｅ ｃ ｏ ｃ ｅ Ｂ８ ｌａ ａ
两次 染色体 步移 得到 Ｔ ５ 入位 点右 侧 的 ２ ５ ｐ 列 。 ｎ插 ４ 序 ３ ｂ 序列 拼接后 获得 Ｂ ８菌株 拮抗相 关序 列 ４ １ ｂ 的 Ｂ １ｐ ６ ｃｎｉ。生 物信 息学分 析显 示该序 列含 有 ７ Ｏ Ｆ 分别 对应 于 ３磷 酸甘 油醛脱 氢酶（ Ａ Ｐ ） 因的部分 编码 ｏｔ ｇ 个 Ｒ， ． Ｇ Ｄ Ｈ基 区、 个 Ｌ ｓ 族转 录调 控 因子 、 ２ ｙＲ家 弧菌假设 蛋 白 Ｖ Ｗ Ｔ ．０６ 及 成 团泛 菌（ａｔｅ ｇｏ ｅａｓ ａｄｉ ｄ 生 Ｓ Ａ ３２４ ５ Ｐ ｎ ａ ｇ ｌｍ ｒｎ） ｎｒ ｏ ａ ｍｉ
基金项 目： 国家高技术研究发展规划项 目（８ ３计划）编号 ：１４０ ．１０ ） “６” （ ０ —４０． １资助 作者简介： 朱军莉，博士， 师，研究方 向：病原微生物学。Ｅ ｍａｌｊｎｉｈ ０ ０ ＠ｙ ｈ ｏｃ ｒ． 讲 ． ｉ ｕ ｌ ｕ ３ ５ ａｏ ． ｎｃ ： ｚ ｏ ａ 通讯作者： 余旭平，副教授，硕士生导师，研究方 向：病原分子生物学 。Ｅｍａｌｘ ｙ ＠ｚ ． ｕｃ ． ｉ Ｔ Ｓ（ｅｉ ） ２ １ ＥＥＩ Ａ Ｂ ｉ ｇ ０２ ｊ ｎ
第３ 卷 ４
Ａｂｓ ｒ ｃ ： Ｔ ｅ ｅ ｌｔｅａ ｔｇ ｎ ｓ ｃｍｅ ｈ ｎｓ ｏ ｔ ｉ ｏＸａ ｔｏ ｎ ｓ ｏｙ ａ ｖ ｏｙ ａ ，ｔ ｎ ｐ ｓ ｎ ｔｇ ｉｇ ｔａｔ ｏ ｒｖ ａ ｈ ｎａ ｏ ｉｔ ｃ ａ ｉｍ ｆＢ８ ｓ ａｎ ｔ ｎｈ ｍｏ ａ ｒｚ ｅｐ ． ｒｚ ｅ ｒ ｓ ｏ ｏ ａ ｇｎ ｉ ｒ ａ