第八章 核酸的理化性质 - 复制

mRNA的提取 磁珠吸附法
4.核酸的含量测定
紫外吸收法：
定磷法：在浓H2SO4作用下将有机P转化成无机P， 酸性条件下与钼酸作用氧化成磷钼酸，最终被还 原成钼蓝，660nm测定紫外吸收。 定糖法： 1）核糖与浓盐酸和苔酚蓝共热呈绿色， 在 670nm处可测RNA； 2）2-脱氧核糖与酸和二苯胺共热呈蓝 紫色，在595nm处可测DNA。
3.判断DNA是否变性
在DNA的变性过程中，摩尔吸光系数增大（增色效应） 在DNA的复性过程中，摩尔吸光系数减小（减色效应）
四 核酸的变性、复性、分子杂交
1、变性（Denaturation）
1）定义：双螺旋DNA的 有序结构或具双螺旋 区的RNA，在外界因 素的作用下，碱基间 的氢键断裂，形成无 规则单链线团结构的 过程。
DNA的Tm一般在82— 95℃之间
3.影响Tm的因素：
1）DNA的均一性
均一性高，变性温度范围越窄，据此可分析DNA均 一性。
2）G-C含量：Tm与G-C含量成正比。 （G+C)%=(Tm-69.3)X2.44
3）介质的离子强度：离子强度低，Tm低，
熔解温度范围窄。
大肠杆菌DNA在不同浓度KCl溶液下的熔融温度曲线
32P
*ACTTCGACAG 肼/Nacl（C）： *AC *ACTTC *ACTTCGA C *ACTTCGACAG 肼（C+T）： *AC *ACT *ACT T *ACTTC *ACTTCGAC *ACTTCGACAG
硫酸二甲酯（G）： *ACTTCG *ACTTCGACAG
甲酸（G+A）： *A *ACTTCACAG
应用 于克 隆、 测序、 检测 DNA 等
碱基的解离 p504 核苷的解离 P505 核苷酸的解离 P505 核酸的滴定曲线 P506
三、紫外吸收性质
碱基的轭双键共使核酸在260-290nm波长范 围内有紫外吸收，最大吸收峰在260nm附近。
1. 确定核酸纯度 1）DNA： OD260/OD280
Sanger
原理： 碱基配对； 聚合酶催化合 成与模板互补 的 DNA新链； 双脱氧核苷酸 无3’-OH，合成 到此终止； 可电泳分离随 机得到的大小 不等的片段。
2 化学裂解法的原理
利用特异性的化学裂解法，制备出长度只差一个核苷酸的 片段群，然后将此片段群经侧序胶电泳和放射自显影得到 侧序图谱。 G反应： 硫酸二甲酯 G+A反应：甲酸/哌啶 C反应： 肼/NaCl/哌啶 C+T反应： 肼/哌啶 哌啶：促使修饰化碱基脱落，并使脱碱基的磷酸二酯键断裂
核酸探针（nucleic acid probe）:某
一具有特定序列并且用同位素或其他 化学方法标记的DNA或RNA片段。通 常是人工合成的。
分子杂交技术的应用
通过同源性比较,研究不同物种或个体DNA之间的亲缘
关系；
通过杂交的严紧性,发现基因的缺失或突变；
通过标记信号的强度,测定某种遗传信息量的多少；
2）特征：������ 增色效应. 变性的核酸 260nm的紫外吸收值升高. 比旋下降. ������ 粘度下降. ������ 浮力密度升高. ������ 酸碱滴定曲线改变. ������ 生物活性丧失.
3）引起变性的因素： 温度、pH、尿素、 甲醛等。
2.熔解温度 Tm
Tm：DNA的双螺旋结构失 去一半时对应的温度称 该DNA的熔解温度 （melting temperature,Tm);又称 热解链温度。
列多少、离子浓度。 ※分子量越大复性越难。 ※浓度越大，复性越容易。 ※DNA的复性也与它本身的组成和结构有关。
5.核酸的杂交（hybridization）
当两条不同来源的DNA（或RNA）链或
DNA链与RNA链之间存在互补的碱基序列 时，在一定条件下可以通过互相配对形成 双螺旋分子，这种分子称为杂交分子。形 成杂交分子的过程称为分子杂交 （molecular hybridization） 。
证明某种疾病是否与某种基因有关。
以分子杂交为基础的分子生物学技术
用于鉴定DNA的Southern印迹技术 用于鉴定RNA的Northern印迹技术
原位杂交技术
基因芯片技术等
Northern blot：用于检测RNA Western blot：用于检测蛋白质
上：探针标记
右：放射自显影
以聚丙烯酰胺作支持物，这种凝胶的孔径 比琼脂糖胶要小，所以可用于分析相对分子质 量小于1000bp的DNA片段和RNA的电泳。
聚丙烯酰胺凝胶强度较好，常用垂直板电泳。
PAGE
Agrose Gel Electrophoresis
Marker
（四）核酸序列测定（Sequencing）
双脱氧法 Sanger 1975 化学法 Maxam-Gilbert ， 1977
≈1.8 纯品 ＞ 1.8 RNA 污染 ＜ 1.8 pro 污染
2）RNA： OD260/OD280 ≈2.0 纯品 2. 定量 不同核苷酸有不同吸收特性，可用紫外分光光度计进行定性、 定量测定。 DNA μg/ml= [OD260/L*0.02]*稀释倍数 RNAμg/ml= [OD260/L*0.024]*稀释倍数 1 OD相当于：50μg/ml DNA 40μg/ml RNA 20μg/ml Nt(核苷酸）
二 核酸的水解
（一）酸水解：
对酸的敏感性：糖苷键＞磷 酸酯键 嘌呤糖苷键＞嘧啶糖苷键 利用酸水解可以研究核酸的 碱基组成
（二）碱水解：
♣ RNA的磷酸酯键对碱敏感。 DNA抗碱水解。 ♣ 生理意义： DNA更稳定，遗传信息。 RNA是DNA的信使，完成任务后迅速降解
核酸水解产物的颜色反应
核酸完全水解的产物为：戊糖、碱基和磷酸 1）核糖与浓盐酸和苔酚蓝共热呈绿色，在 670nm处可测RNA； 2）2-脱氧核糖与酸和二苯胺共热呈蓝紫色， 在595nm处可测DNA。 3）磷酸与钼酸作用生成磷钼酸，在还原剂的作用下被还 原成钼蓝，660nm处有最大吸收峰。
（三）酶水解：
非特异的磷酸二酯酶： 蛇毒磷酸二酯酶水解DNA（RNA）得5’-核苷酸 牛脾磷酸二酯酶水解DNA（RNA）得3’-核苷酸 特异的磷酸二酯酶： 核酸酶
限制性内切酶（Restriction endonuclease RE）
在核苷酸链内特定序列切开DNA双链的酶。
产生两种产物：粘性末端；平头末端
4.核酸的复性（Renaturation）
复性：变性DNA分开的两股链在适当条件下重新生成双链结构 的过程
退火（annealing）:热变性的DNA经缓慢冷却复性的过程。
复性机制：10-20bp成 拉链 热变性DNA在缓慢冷 却时可以 复性，快速冷却不能复 性。
影响因素：温度、DNA片段大小、DNA浓度、碱基重复序
第八章 核酸的性质及研究方法
主讲教师：王希东
新疆农业大学农学院生物技术系
一 一般理化性质
1、DNA固体一般为白色纤维状，RNA为白色粉末 状。 2、两性电解质：pI
核酸的磷酸基具有酸性，碱基具有碱性，因此，核酸 具有两性电离的性质。但核酸中磷酸基的酸性大于碱基的 碱性，其等电点偏酸性。DNA的pI约为4～5，RNA的pI约 为2.0～2.5，在pH7～8电泳时泳向正极。
菌落的原位杂交
五 核酸的研究方法
（一）核酸的提取
1.核酸提取的原则
������ ♥ 尽可能保持其天然状态，防止降解和变 性。 ������ ������ ♥ 条件温和，防止过酸、过碱、剧烈搅拌。 ♥ 抑制核酸酶。
2.DNA分离纯化
真核DNA以核蛋白（DNP）形式存在，DNP溶于水或 高盐溶液（ 1mol/L NaCl ） ， 但不溶于低盐溶0.14mol/L NaCl），据此，采用高盐提取，低盐沉淀，可将DNP与 RNA核蛋白分开，提取出DNP。
（二）核酸的超速离心
(三) DNA凝胶 电泳
琼脂糖凝胶电 泳 PAGE
溴乙锭 （BtBr ）染 色
Agrose Gel Electrophoresis
用于大片段DNA的分 离，精度低，但分离 范围广
EB
0.5ug/ml EB 染色
RNA的琼脂糖凝胶电 泳一般要加入甲醛或 戊二醛制成变性胶
PAGE
3、粘度高：一般DNA比RNA粘度高。 4、水解性：可被酸、碱或酶水解，DNA比 RNA对稀碱稳定。
5、溶解性：微溶于水，不溶于一般有 机试剂（乙醇沉淀核酸），钠盐易溶 于水。 DNA与蛋白质结合生成DNP，易溶于 水和高盐溶液（1M NaCl），不溶于 生理盐水I（0.14M NaCl）。可用于制 备DNA 。 000
从下往上读：CTACGTA，末端G不能读出。
（五）DNA聚合酶链式反应——PCR
1985年 K.Mullis
体系组成：
①模板DNA（单链） ②引物 ③DNA聚合酶(Taq） ④dNTP ⑤Mg2+
（六） DNA的化学合成
5’-OH用二对甲氧三苯甲基（DMT）保护。 3’-OH用氨基亚磷酸化合物活化。 碱基上氨基用苯甲酸保护。
测序要解决的主要问题
获得具有相同末端的DNA片断，然后通过PAGE电 泳，比较不同末端的泳道，读出序列。
1. 双脱氧法——末端终止法、酶法
1955 确定牛胰岛素结构， 1958 获诺贝尔化学奖。 1975 设计出DNA测序法， 1980 获诺贝尔化学奖。 合成一段与待测DNA序列互补的DNA片段群。
DNP可用水饱和酚抽提，去除蛋白质。还可用氯仿-异戊 醇去除蛋白质。 水相中的DNA可被0.3M NaAC-70%乙醇沉淀。
3.RNA的制备
RNase 的灭活：
玻璃器皿：140-200 ℃，8小时； 塑料器皿：0.1%DEPC，37 ℃ （RT）过夜 提取液加盐酸胍或异硫氰酸胍 反应体系中加RNasin等特异的RNase抑制剂