绍兴地区铜绿假单胞菌亚胺培南耐药机制研究

收稿日期 : 2005201220 ; 修回日期 : 2005203219
耐药机制 ,我们进行了亚胺培南耐药相关的 IM P 、 V IM 基因和外膜通道蛋白 op rD2 基因等 3 种基因 检测与分析 ,现报道如下 。
1 资料与方法
1. 1 菌株来源 本院 2003 年 6～12 月临床分离的 耐亚胺培南 PA E 菌 5 株 ,分别为 :痰液 3 份 、创面分 泌物 1 份 、血液 1 份 。亚胺培南敏感 PA E 菌 4 株 , 分别为 : 创面分泌物 2 份 、痰液 1 份 、腹腔引流液 1 份 。用法国生物梅里埃公司 A TB 细菌鉴定仪鉴定 菌种 。药敏试验符合美国国家临床实验室标准化委 员会 ( Natio nal Co mmit tee for Clinical Laboratory Standards ,NCCL S) 2004 年版要求 [2] 。质控菌株 : 大 肠 埃 希 菌 A TCC25922 、铜 绿 假 单 胞 菌 A TCC27853 、肺炎克雷伯菌 A TCC700603 购自卫 生部临床检验中心 。 1. 2 产金属酶细菌表型的检测 利用纸片协同法 检测产金属酶细菌 。在 M H 平板上涂布受试细菌 , 贴上两 张亚 胺培 南纸 片 (30μg/ 片) , 两 纸 片 相 距
587bp 633bp 193bp
2 结 果
5 株亚胺培南耐药的 PA E 菌纸片协同法均检 出产金属酶 ,IM P 金属酶基因检测均阴性 ,而 V IM 型金属酶基因扩增均阳性 ,op rD2 基因扩增检测均 无缺失 。4 株亚胺培南敏感 PA E 菌株纸片协同法 未检测到产金属酶菌株 , IM P 、V IM 金属酶基因检 测均阴性 ,op rD2 基因扩增检测均无缺失 。对 5 株 PA E 菌 V IM 金属酶基因扩增产物测序 ,经 BL A S T 程序 分 析 ( www. ncbi. nlm. nih. gov) V IM22 型 , BL A S T 程序分析序列比对见图 1 。V IM 基因测序 见图 2 。本研究中 2 株 PA E 菌 V IM22 型基因序列 (菌 株 号 : SXPa12947 , SXPa129490 ) 已 成 功 注 册 GenBank ( www . ncbi. nlm. nih. gov/ nucleotide , 注 册号 :A Y861669 , A Y861670) 。op rD2 PCR 产物电 泳见图 3 。
Query : 1 AC GTC GT T T GA T GGC GCA GTC TACCC GTCCAA T GGTC TCA T T GTCC GT GA T GGT GA T GA G 60 Sbjct : 1966 CA GTC GT T T GA T GGC GCA GTC TACCC GTCCAA T GGTC TCA T T GTCC GT GA T GGT GA T GA G 1975 Query : 61 T T GC T T T T GA T T GA TACA GC GT GGGGT GC GAAAAACACA GC GGCAC T TC TC GC GGA GA T T 120 Sbjct : 1976 T T GC T T T T GA T T GA TACA GC GT GGGGT GC GAAAAACACA GC GGCAC T TC TC GC GGA GA T T 2035 Query : 121 GA GAA GCAAA T T GGAC T TCC T GTAAC GC GT GCA GTC TCCAC GCAC T T TCA T GAC GACC GC 180 Sbjct : 2036 GA GAA GCAAA T T GGAC T TCC T GTAAC GC GT GCA GTC TCCAC GCAC T T TCA T GAC GACC GC 2095 Query : 181 GTC GGC GGC GT T GA T GTCC T TC GGGC GGC T GGGGT GGCAAC GTAC GCA TCACC GTC GACA 240 Sbjct : 2096 GTC GGC GGC GT T GA T GTCC T TC GGGC GGC T GGGGT GGCAAC GTAC GCA TCACC GTC GACA 2155 Query : 241 C GCC GGCTA GCC GA GGTA GA GGGGAAC GA GA T TCCCAC GCAC TC TC TA GAA GGAC TC TCA 300 Sbjct : 2156 C GCC GGCTA GCC GA GGTA GA GGGGAAC GA GA T TCCCAC GCAC TC TC TA GAA GGAC TC TCA 2215 Query : 301 TC GA GC GGGGAC GCA GT GC GC T TC GGTCCA GTA GAAC TC T TC TA TCC T GGT GC T GC GCA T 360 Sbjct : 2216 TC GA GC GGGGAC GCA GT GC GC T TC GGTCCA GTA GAAC TC T TC TA TCC T GGT GC T GC GCA T 2275 Query : 361 TC GACC GACAAC T TA GT T GT GTAC GTCCC GTC T GC GA GT GT GC TC TA T GGT GGT T GT GC G 420 Sbjct : 2276 TC GACC GACAAC T TA GT T GT GTAC GTCCC GTC T GC GA GT GT GC TC TA T GGT GGT T GT GC G 2335 Query : 421 A T T TA T GA GT T GTCAC GCAC GTC T GC GGGGAAC GT GGCC GA T GCC GA TC T GGC T GAA T GG 480 Sbjct : 2336 A T T TA T GA GT T GTCAC GCAC GTC T GC GGGGAAC GT GGCC GA T GCC GA TC T GGC T GAA T GG 2395 Query : 481 CCCACC TCCA T T GA GC GGA T TCAACAACAC TACCC GGAA GCACA GT TC GT 530 Sbjct : 2396 CCCACC TCCA T T GA GC GGA T TCAACAACAC TACCC GGAA GCACA
靶基因
引物序列
产物长度
IMP P1 :5′2CGGCC( G/ T) CAGGAG(A/ C) G( G/ T) CTTT23′ 基因 P2 :5′2AACCAGTTTTGC(C/ T) TTAC (C/ T) AT23′ VIM P1 :5′2ATTCCGGTCGG(A/ G) GAGGTCCG23′ 基因 P2 :5′2GAGCAAGTCTAGACCGCCCG23′ OprD2 P1 :5′2GCGCATCTCCAAGACCATG23′ 基因 P2 :5′2GCCACGCGATTTGACGGAG23′
中华医院感染学杂志 2005 年第 15 卷第 7 期
·815 ·
·论 著 ·
绍兴地区铜绿假单胞菌亚胺培南耐药机制研究
钱小毛 , 赵仲农 , 王亚玲
(绍兴第二人民医院 , 浙江 绍兴 312000)
摘要 :目的 探讨绍兴地区耐亚胺培南铜绿假单胞菌的耐药机制 。方法 对 5 株亚胺培南耐药的铜绿假单胞菌 和 4 株亚胺培南敏感的铜绿假单胞菌进行 IMP 、V IM 和 op rD2 基因等 3 种基因检测和测序 。结果 5 株亚胺培 南耐药的铜绿假单胞菌均检出 V IM 基因 , 经比对分析为 V IM22 型 ; 无 IM P 基因检出 , op rD2 基因均无缺失 。 结论 绍兴地区耐亚胺培南的铜绿假单胞菌由 V IM22 型基因引起 。 关键词 :铜绿假单胞菌 ; 基因 中图分类号 : R969. 3 文献标识码 : A 文章编号 : 100524529 (2005) 0720815204
Abstract : OBJECTIVE To investigate t he resistance mechanism of imipenem2resistant Pseu domonas aeru gi nosa isolated in Shaoxing. METHODS To amplif y IM P , V IM and op rD2 genes f ro m genome DNA of P. aeru gi nosa (5 imipenem2resistant st rains , 4 imipenem2susceptible st rains) by PCR and t hen sequenced. RESUL TS The V IM genes were detected in 5 imipenem2resistant st rains which belonged to V IM22 type. No IMP was found in t hese 5 st rains and t here were op rD2 genes. CONCL USIONS The P. aerugi nosa resistance to imipenem (isolated in Shaox2 ing) is explained by a V IM22 gene. Key words : Pseu domonas aeru gi nosa ; Gene
2 mM , Tris2HCl (p H9. 0) 10 mM ,N P40 0. 5 % ,BSA 0. 02 %(w/ v) , Taq DNA pol 1 U 。总反应体积20μl (其中模板液 5μl) 。热循环参数均为 : 93 ℃预变性 2 min ,然后 93 ℃60 s →55 ℃60 s →72 ℃60 s , 循环 35 周期 ,最后一个 72 ℃延长至5 min 。产物经 2 %琼 脂糖凝胶电泳 ,出现与阳性对照分子相当的目的条 带判为阳性 ,并摄像保存 。阳性对照 DNA 均由无 锡市克隆遗传技术研究所微生物 DNA 收集与保存 室提供 。测序为双脱氧末端终止法在美国 AB I 公 司 377 仪上进行 。测得序列与美国 GenBank核酸库 已登录的序列作比对 (www. ncbi. nlm. nih. gov/ nu2 cleotide) 。基因检测试剂盒由无锡市克隆遗传技术 研究所提供 。IM P 、V IM 、op rD2 基因 PCR 扩增引 物序列见表 1[3] 。