16S鉴定细菌的种属
菌种鉴定的分子生物学方法
菌种鉴定的分子生物学方法——16S rDNA 测序鉴定菌种一． 原理细菌中包括有三种核糖体RNA ，分别为5S rRNA 、16S rRNA 、23S rRNA 。
5S rRNA 虽易分析，但核苷酸太少，没有足够的遗传信息用于分类研究；23S rRNA 含有的核苷酸数几乎是16S rRNA 的两倍，分析较困难。
而16S rRNA 相对分子量适中，又具有保守性和存在的普遍性等特点，序列变化与进化距离相适应，序列分析的重现性极高，因此，现在一般普遍采用16S rRNA 作为序列分析对象对微生物进行测序分析。
16S rRNA 对应于基因组DNA 上的一段基因序列称为16S rDNA ，rRNA 基因由保守区和可变区组成。
在细菌的16SrDNA 中有多个区段保守性，根据这些保守区可以设计出细菌通用物，可以扩增出所有细菌的16SrDNA 片段，并且这些引物仅对细菌是特异性的，也就是说这些引物不会与非细菌的DNA 互补，而细菌的16S rDNA 可变区的差异可以用来区分不同的菌。
因此，16SrDNA 可以作为细菌群落结构分析最常用的系统进化标记分子。
随着核酸测序技术的发展，越来越多的微生物的16S rDNA 序列被测定并收入国际基因数据库中，只要将基因序列放入基因数据库进行对比，便可快速的鉴定所测定的细菌种属，这样用16Sr DNA 作目的序列进行微生物群落结构分析更为快捷方便。
二． 技术路线该方法包括细菌基因组DNA 提取、16S rDNA 特异引物PCR 扩增、扩增产物纯化、DNA 测序、序列比对等步骤。
具体技术路线如下：三． 方法步骤（一）细菌基因组DNA 提取（酶解法）1. 挑取单菌落接种到10 mL LB 培养基中37℃振荡过夜培养。
细菌培养液基因组DNADNA 提取PCR 扩增16S rDNA 片段片段回收连接克隆载体阳性克隆鉴定 测序2. 取2 mL培养液到2 mLEP管中，8000 rpm离心2分钟后倒掉上清液。
16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程
16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程1.适用范围本标准规定了通过特定引物对细菌的16SrDNA片段进行PCR扩增，然后对扩增片段进行序列分析比对，快速获得细菌种属信息的操作规程。
本标准适用于未知细菌的快速种属分析，以及为细菌的生化鉴定提供指导信息。
2.方法和原理16SrDNA鉴定是指用利用细菌16SrDNA序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。
包括细菌基因组DNA提取、16SrDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA测序、序列比对等步骤。
是一种快速获得细菌种属信息的方法。
细菌rRNA（核糖体RNA）按沉降系数分为3种，分别为5S、16S和23S rRNA。
16S rDNA是细菌染色体上编码16S rRNA相对应的DNA序列。
16S rDNA由于大小适中，约1.5Kb左右，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家接受。
在16S rRNA 分子中，可变区序列因细菌不同而异，恒定区序列基本保守，所以可利用恒定区序列设计引物，将16S rDNA片段扩增出来，利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定。
16SrDNA序列的前500bp序列变化较大，包含有丰富的细菌种属的特异性信息，所以对于绝大多数菌株来说，只需要第一对引物测前500bp序列即可鉴别出细菌的菌属。
针对科学论文发表或是前500bp无法鉴别的情况，需要进行16SrDNA的全序列扩增和测序，得到较为全面的16SrDNA的序列信息。
由于测序仪一次反应最多只能测出700bp的有效序列，为了结果的可靠性，通常将16SrDNA全长序列分成3部分进行测序。
3.设备和材料3.1器材移液器（1000μL、200μL 、100μL、10μL）；涡旋振荡器；Eppendorf MixMate；离心机；水浴锅；电泳仪；制冰机；低温冰箱；PCR仪：Veriti 96 Well Thermal Cycler；凝胶成像仪：VersaDoc MP 4000；基因分析仪：AB3500、AB31303.2试剂DNA快速提取试剂：PrepMan Ultra；琼脂糖；PCR试剂：Taq酶，10×Taq Buffer(Mg2+)，dNTPs，O等； ExoSAP-IT；测序试剂：BigDye Terminator，5×Sequencing Buffer；BigDye XTerminator ddH2Purification Kit；3.3耗材移液器吸头：1000μL、200μL、10μL；离心管：1.5mL、200μL；Micro Amp TM Optical 96-Well ReactionPlate；Micro Amp TM Optical Adhesive Film；3.4引物16SrDNA 名称序列扩增长度第1部分正向引物27F5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'500 bp左右反向引物519R5'- GWA TTA CCG CGG CKG CTG -3'第2部分正向引物357F5'- CTC CTA CGG GAG GCA GCA G-3'750bp左右反向引物1115R5'-AGG GTT GCG CTC GTT GC-3'第3部分正向引物926F5'- AAA CTY AAA KGA ATT GAC GG-3'560 bp左右反向引物1492R5'-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3'其中M=C:A, Y=C:T. K=G:T, R=A:G, S=G:C. W=A:T; all 1:1 4.操作流程5.实验方法5.1 核酸提取：挑取单菌落，然后置于装有100μLPrepMan Ultra 的离心管中，涡旋震荡混匀30s 左右，然后100℃水浴10min 后，以离心机最大转速离心3min ，取10μL 上清液与490μL ddH 2O （即稀释50倍），混匀作为下步PCR 的模板DNA 。
用16S rDNA方法鉴定细菌种属
用16S rDNA 方法鉴定细菌种属一、实验目的1. 掌握16S rDNA 对细菌进行分类的原理及方法；2. 掌握DNA 提取、PCR 原理及方法、DNA 片段回收等实验操作。
二、实验原理细菌rRNA （核糖体RNA ）按沉降系数分为3种，分别为5S 、16S 和23S rRNA 。
16S rDNA 是细菌染色体上编码16S rRNA 相对应的DNA 序列，存在于所有细菌染色体基因中。
16SrDNA 鉴定是指用利用细菌16SrDNA 序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。
包括细菌基因组DNA 提取、16SrDNA 特异引物PCR 扩增、扩增产物纯化、DNA 测序、序列比对等步骤。
是一种快速获得细菌种属信息的方法。
16S rDNA 是细菌的系统分类研究中最有用的和最常用的分子钟，其种类少，含量大（约占细菌RNA 含量的80％），分子大小适中，存在于所有的生物中，其进化具有良好的时钟性质，在结构与功能上具有高度的保守性，素有“细菌化石”之称。
在大多数原核生物中rDNA 都具有多个拷贝，5S 、16S 、23S rDNA 的拷贝数相同。
16S rDNA 由于大小适中，约1.5Kb 左右，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家接受。
16SrRNA 的编码基因是16SrDNA ，但是要直接将16SrRNA 提取出来很困难，因为易被广泛存在的RNase 降解，因而利用16S rDNA 鉴定细菌，其技术路线如下：细菌基因组的提取：PCR 的基本原理 ：PCR 技术的基本原理 类似于DNA 的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的 寡核苷酸引物。
PCR 由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA 的变性：模板DNA 经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA 双链或经PCR 扩增形成的双链DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA 与引物的退火(复性)：模板DNA 经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引 物与模板DNA 单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程
16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程1.适用范围本标准规定了通过特定引物对细菌的16SrDNA片段进行PCR扩增,然后对扩增片段进行序列分析比对，快速获得细菌种属信息的操作规程。
本标准适用于未知细菌的快速种属分析，以及为细菌的生化鉴定提供指导信息。
2.方法和原理16SrDNA鉴定是指用利用细菌16SrDNA序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。
包括细菌基因组DNA提取、16SrDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA测序、序列比对等步骤。
是一种快速获得细菌种属信息的方法。
细菌rRNA（核糖体RNA）按沉降系数分为3种，分别为5S、16S和23S rRNA.16S rDNA是细菌染色体上编码16S rRNA相对应的DNA序列。
16S rDNA 由于大小适中，约1。
5Kb左右，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家接受。
在16S rRNA分子中，可变区序列因细菌不同而异，恒定区序列基本保守，所以可利用恒定区序列设计引物，将16S rDNA片段扩增出来，利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定.16SrDNA序列的前500bp序列变化较大，包含有丰富的细菌种属的特异性信息，所以对于绝大多数菌株来说，只需要第一对引物测前500bp序列即可鉴别出细菌的菌属.针对科学论文发表或是前500bp无法鉴别的情况,需要进行16SrDNA的全序列扩增和测序，得到较为全面的16SrDNA的序列信息。
由于测序仪一次反应最多只能测出700bp的有效序列,为了结果的可靠性，通常将16SrDNA全长序列分成3部分进行测序.3.设备和材料3.1器材移液器(1000μL、200μL 、100μL、10μL）；涡旋振荡器；Eppendorf MixMate;离心机；水浴锅；电泳仪;制冰机;低温冰箱；PCR仪：Veriti 96 Well Thermal Cycler；凝胶成像仪:VersaDoc MP 4000；基因分析仪：AB3500、AB31303.2试剂DNA快速提取试剂：PrepMan Ultra;琼脂糖;PCR试剂：Taq酶，10×Taq Buffer(Mg2+），dNTPs，ddH2O等；ExoSAP-IT；测序试剂：BigDye Terminator,5×Sequencing Buffer；BigDye XTerminator Purification Kit;3.3耗材移液器吸头：1000μL、200μL、10μL；离心管:1.5mL、200μL；Micro Amp TM Optical 96-Well Reaction Plate；Micro Amp TM Optical Adhesive Film；3.4引物16SrDNA 名称序列扩增长度第1部分正向引物27F 5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG—3’500 bp左右反向引物519R 5’- GWA TTA CCG CGG CKG CTG -3'第2部分正向引物357F 5'- CTC CTA CGG GAG GCA GCA G—3'750bp左右反向引物1115R 5'-AGG GTT GCG CTC GTT GC—3’第3部分正向引物926F5'— AAA CTY AAA KGA ATT GAC GG-3'560 bp 左右反向引物1492R5’-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3'其中M=C:A ， Y=C:T. K=G:T ， R=A:G ， S=G ：C. W=A ：T ； all 1：14. 操作流程5. 实验方法5.1 核酸提取：挑取单菌落,然后置于装有100μLPrepMan Ultra 的离心管中，涡旋震荡混匀30s 左右，然后100℃水浴10min 后，以离心机最大转速离心3min,取10μL 上清液与490μL ddH 2O （即稀释50倍）,混匀作为下步PCR 的模板DNA 。
16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程
16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程1.适用范围本标准规定了通过特定引物对细菌的16SrDNA片段进行PCR扩增，然后对扩增片段进行序列分析比对，快速获得细菌种属信息的操作规程。
本标准适用于未知细菌的快速种属分析，以及为细菌的生化鉴定提供指导信息。
2.方法和原理16SrDNA鉴定是指用利用细菌16SrDNA序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。
包括细菌基因组DNA提取、16SrDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA测序、序列比对等步骤。
是一种快速获得细菌种属信息的方法。
细菌rRNA（核糖体RNA）按沉降系数分为3种，分别为5S、16S和23SrRNA。
16SrDNA是细菌染色体上编码16SrRNA相对应的DNA序列。
16SrDNA由于大小适中，约1.5Kb左右，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家接受。
在 16SrRNA 分子中，可变区序列因细菌不同而异，恒定区序列基本保守，所以可利用恒定区序列设计引物，将16SrDNA片段扩增出来，利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定。
16SrDNA序列的前500bp序列变化较大，包含有丰富的细菌种属的特异性信息，所以对于绝大多数菌株来说，只需要第一对引物测前500bp序列即可鉴别出细菌的菌属。
针对科学论文发表或是前500bp无法鉴别的情况，需要进行16SrDNA的全序列扩增和测序，得到较为全面的16SrDNA的序列信息。
由于测序仪一次反应最多只能测出700bp的有效序列，为了结果的可靠性，通常将16SrDNA全页脚内容1长序列分成3部分进行测序。
3.设备和材料1.1器材移液器（1000μL、200μL、100μL、10μL）；涡旋振荡器；Eppend orfMixMate；离心机；水浴锅；电泳仪；制冰机；低温冰箱；PCR仪：Veriti96WellThermalCycl er；凝胶成像仪：VersaDocMP4000；基因分析仪：AB3500、AB31301.2试剂DNA快速提取试剂：PrepManUltra；琼脂糖；PCR试剂：Taq酶，10×TaqBuffer(Mg2+)，dNTPs，d dH2O等；ExoSAP-IT；测序试剂：BigDyeTerminator，5×SequencingBuffer；BigDyeXTerminatorPurificationKit；1.3耗材移液器吸头：1000μL、200μL、10μL；离心管： 1.5mL、200μL；页脚内容2MicroAmp TM Optical96-WellReactionPlate；MicroAmp TM OpticalAdhesiveFilm；1.4引物16 SrDNA 名称序列扩增长度第1部分正向引物27F5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'500bp左右反向引物519R5'-GWATTACCGCGGCKGCTG-3'第2部分正向引物357F5'-CTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'750bp左右反向引物1115R5'-AGGGTTGCGCTCGTTGC-3'第3部分正向引物926F5'-AAACTYAAAKGAATTGACGG-3'560bp左右反向引物1492R5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'其中M=C:A,Y=C:T.K=G:T,R=A:G,S=G:C.W=A:T;all1:1页脚内容3页脚内容44. 操作流程1.5核酸提取：挑取单菌落，然后置于装有100μLPrepManUltra 的离心管中，涡旋震荡混匀30s 左右，然后100℃水浴10min 后，以离心机最大转速离心3min ，取10μL 上清液与490μL d dH 2O （即稀释50倍），混匀作为下步PCR 的模板DNA 。
16SrDNA方法鉴定细菌种属1
16SrDNA方法鉴定细菌种属116S rDNA方法鉴定细菌种属一．目的1. 掌握16S rDNA对细菌进行分类的原理及方法；2. 掌握DNA提取、PCR原理及方法、DNA片段回收等实验操作。
二、原理随着分子生物学的迅速发展，细菌的分类鉴定从传统的表型、生理生化分类进入到各种基因型分类水平，如(G+C)mol%、DNA杂交、rDNA指纹图、质粒图谱和16S rDNA序列分析等。
细菌中包括有三种核糖体RNA，分别为5S rRNA、16S rRNA、23S rRNA，rRNA基因由保守区和可变区组成。
16S rRNA对应于基因组DNA上的一段基因序列称为16S rDNA。
5S rRNA虽易分析，但核苷酸太少，没有足够的遗传信息用于分类研究；23S rRNA含有的核苷酸数几乎是16S rRNA 的两倍，分析较困难。
而16S rRNA相对分子量适中，又具有保守性和存在的普遍性等特点，序列变化与进化距离相适应，序列分析的重现性极高，因此，现在一般普遍采用16S rRNA作为序列分析对象对微生物进行测序分析。
在细菌的16SrDNA中有多个区段保守性，根据这些保守区可以设计出细菌通用物，可以扩增出所有细菌的16SrDNA片段，并且这些引物仅对细菌是特异性的，也就是说这些引物不会与非细菌的DNA互补，而细菌的16SrDNA可变区的差异可以用来区分不同的菌。
因此，16SrDNA可以作为细菌群落结构分析最常用的系统进化标记分子。
随着核酸测序技术的发展，越来越多的微生物的16SrDNA序列被测定并收入国际基因数据库中，这样用16SrDNA作目的序列进行微生物群落结构分析更为快捷方便。
1、16S rRNA 普遍存在于原核生物中。
rRNA 参与生物蛋白质的合成过程，其功能是任何生物都必不可少的，而且在生物进化的漫长历程中保持不变，可看作为生物演变的时间钟。
2、在16S rRNA 分子中，既含有高度保守的序列区域，又有中度保守和高度变化的序列区域，因而它适用于进化距离不同的各类生物亲缘关系的研究。
16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程
16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程1.适用范围本标准规定了通过特定引物对细菌的16SrDNA片段进行PCR扩增，然后对扩增片段进行序列分析比对，快速获得细菌种属信息的操作规程。
本标准适用于未知细菌的快速种属分析，以及为细菌的生化鉴定提供指导信息。
2.方法和原理16SrDNA鉴定是指用利用细菌16SrDNA序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。
包括细菌基因组DNA提取、16SrDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA测序、序列比对等步骤。
是一种快速获得细菌种属信息的方法。
细菌rRNA（核糖体RNA）按沉降系数分为3种，分别为5S、16S和23S rRNA。
16S rDNA是细菌染色体上编码16S rRNA相对应的DNA序列。
16S rDNA由于大小适中，约1.5Kb左右，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家接受。
在 16SrRNA 分子中，可变区序列因细菌不同而异，恒定区序列基本保守，所以可利用恒定区序列设计引物，将16SrDNA片段扩增出来，利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定。
16SrDNA序列的前500bp序列变化较大，包含有丰富的细菌种属的特异性信息，所以对于绝大多数菌株来说，只需要第一对引物测前500bp序列即可鉴别出细菌的菌属。
针对科学论文发表或是前500bp无法鉴别的情况，需要进行16SrD NA的全序列扩增和测序，得到较为全面的16SrDNA的序列信息。
由于测序仪一次反应最多只能测出700bp的有效序列，为了结果的可靠性，通常将16SrDNA全长序列分成3部分进行测序。
3.设备和材料3.1器材移液器（1000μL 、200μL 、100μL 、10μL ）；涡旋振荡器；Eppendorf MixMate ；离心机；水浴锅；电泳仪；制冰机；低温冰箱；PCR 仪：Veriti 96 Well Thermal Cycler ； 凝胶成像仪：VersaDoc MP 4000；基因分析仪：AB3500、AB3130 3.2试剂DNA 快速提取试剂：PrepMan Ultra ；琼脂糖；PCR 试剂：Taq 酶，10×Taq Buffer(Mg 2+)，dNTPs ，ddH 2O 等； ExoSAP-IT ；测序试剂：BigDye Terminator ，5×Sequencing Buffer ；BigDye XTerminator Purification Kit ； 3.3耗材移液器吸头：1000μL 、200μL 、10μL ；离心管：1.5mL 、200μL ；Micro Amp TM Optical 96-Well Reaction Plate ；Micro Amp TM Optical Adhesive Film ； 3.4引物第1部分 正向引物27F 5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3' 500 bp 左右 反向引物519R 5'- GWA TTA CCG CGG CKG CTG -3' 第2部分 正向引物357F 5'- CTC CTA CGG GAG GCA GCA G-3' 750bp 左右 反向引物1115R 5'-AGG GTT GCG CTC GTT GC-3'第3部分正向引物926F 5'- AAA CTY AAA KGA ATT GAC GG-3' 560 bp 左右反向引物1492R5'-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3'其中M=C:A, Y=C:T. K=G:T, R=A:G, S=G:C. W=A:T; all 1:14. 操作流程5. 实验方法5.1核酸提取：挑取单菌落，然后置于装有100μLPrepManUltra 的离心管中，涡旋震荡混匀30s 左右，然后100℃水浴10min 后，以离心机最大转速离心3min ，取10μL 上清液与490μLddH 2O （即稀释50倍），混匀作为下步PCR 的模板DNA 。
16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程
16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程1.适用范围本标准规定了通过特定引物对细菌的16SrDNA片段进行PCR扩增，然后对扩增片段进行序列分析比对，快速获得细菌种属信息的操作规程。
本标准适用于未知细菌的快速种属分析，以及为细菌的生化鉴定提供指导信息。
2.方法和原理16SrDNA鉴定是指用利用细菌16SrDNA序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。
包括细菌基因组DNA提取、16SrDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA测序、序列比对等步骤。
是一种快速获得细菌种属信息的方法。
细菌rRNA（核糖体RNA）按沉降系数分为3种，分别为5S、16S和23S rRNA。
16S rDNA是细菌染色体上编码16S rRNA相对应的DNA序列。
16S rDNA由于大小适中，约1.5Kb左右，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家接受。
在16S rRNA 分子中，可变区序列因细菌不同而异，恒定区序列基本保守，所以可利用恒定区序列设计引物，将16S rDNA片段扩增出来，利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定。
16SrDNA序列的前500bp序列变化较大，包含有丰富的细菌种属的特异性信息，所以对于绝大多数菌株来说，只需要第一对引物测前500bp序列即可鉴别出细菌的菌属。
针对科学论文发表或是前500bp无法鉴别的情况，需要进行16SrDNA的全序列扩增和测序，得到较为全面的16SrDNA的序列信息。
由于测序仪一次反应最多只能测出700bp的有效序列，为了结果的可靠性，通常将16SrDNA全长序列分成3部分进行测序。
3.设备和材料3.1器材移液器（1000μL、200μL 、100μL、10μL）；涡旋振荡器；Eppendorf MixMate；离心机；水浴锅；电泳仪；制冰机；低温冰箱；PCR仪：Veriti 96 Well Thermal Cycler；凝胶成像仪：VersaDoc MP 4000；基因分析仪：AB3500、AB31303.2试剂DNA快速提取试剂：PrepMan Ultra；琼脂糖；PCR试剂：Taq酶，10×Taq Buffer(Mg2+)，dNTPs，O等； ExoSAP-IT；测序试剂：BigDye Terminator，5×Sequencing Buffer；BigDye XTerminator ddH2Purification Kit；3.3耗材移液器吸头：1000μL、200μL、10μL；离心管：1.5mL、200μL；Micro Amp TM Optical 96-Well ReactionPlate；Micro Amp TM Optical Adhesive Film；3.4引物16SrDNA 名称序列扩增长度第1部分正向引物27F5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'500 bp左右反向引物519R5'- GWA TTA CCG CGG CKG CTG -3'第2部分正向引物357F5'- CTC CTA CGG GAG GCA GCA G-3'750bp左右反向引物1115R5'-AGG GTT GCG CTC GTT GC-3'第3部分正向引物926F5'- AAA CTY AAA KGA ATT GAC GG-3'560 bp左右反向引物1492R5'-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3'其中M=C:A, Y=C:T. K=G:T, R=A:G, S=G:C. W=A:T; all 1:1 4.操作流程5.实验方法5.1 核酸提取：挑取单菌落，然后置于装有100μLPrepMan Ultra 的离心管中，涡旋震荡混匀30s 左右，然后100℃水浴10min 后，以离心机最大转速离心3min ，取10μL 上清液与490μL ddH 2O （即稀释50倍），混匀作为下步PCR 的模板DNA 。
16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程
16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程1.适用范围本标准规定了通过特定引物对细菌的16SrDNA片段进行PCR扩增，然后对扩增片段进行序列分析比对，快速获得细菌种属信息的操作规程。
本标准适用于未知细菌的快速种属分析，以及为细菌的生化鉴定提供指导信息。
2.方法和原理16SrDNA鉴定是指用利用细菌16SrDNA序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。
包括细菌基因组DNA提取、16SrDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA测序、序列比对等步骤。
是一种快速获得细菌种属信息的方法。
细菌rRNA（核糖体RNA）按沉降系数分为3种，分别为5S、16S和23S rRNA。
16S rDNA 是细菌染色体上编码16S rRNA相对应的DNA序列。
16S rDNA由于大小适中，约1.5Kb左右，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家接受。
在 16S rRNA 分子中，可变区序列因细菌不同而异，恒定区序列基本保守，所以可利用恒定区序列设计引物，将16S rDNA片段扩增出来，利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定。
16SrDNA序列的前500bp序列变化较大，包含有丰富的细菌种属的特异性信息，所以对于绝大多数菌株来说，只需要第一对引物测前500bp序列即可鉴别出细菌的菌属。
针对科学论文发表或是前500bp无法鉴别的情况，需要进行16SrDNA的全序列扩增和测序，得到较为全面的16SrDNA 的序列信息。
由于测序仪一次反应最多只能测出700bp的有效序列，为了结果的可靠性，通常将16SrDNA 全长序列分成3部分进行测序。
3. 设备和材料1.1 器材移液器（1000μL 、200μL 、100μL 、10μL ）；涡旋振荡器；Eppendorf MixMate ；离心机；水浴锅；电泳仪；制冰机；低温冰箱；PCR 仪：Veriti 96 Well Thermal Cycler ； 凝胶成像仪：VersaDoc MP 4000；基因分析仪：AB3500、AB3130 1.2 试剂DNA 快速提取试剂：PrepMan Ultra ；琼脂糖；PCR 试剂：Taq 酶，10×Taq Buffer(Mg 2+)，dNTPs ，ddH 2O 等； ExoSAP-IT ；测序试剂：BigDye Terminator ，5×Sequencing Buffer ；BigDye XTerminator Purification Kit ； 1.3 耗材移液器吸头：1000μL 、200μL 、10μL ；离心管：1.5mL 、200μL ；Micro Amp TM Optical 96-Well Reaction Plate ；Micro Amp TM Optical Adhesive Film ； 1.4 引物16SrDNA名称 序列扩增长度第1部分正向引物27F5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'500 bp 左右 反向引物519R 5'- GWA TTA CCG CGG CKG CTG -3' 第2部分正向引物357F5'- CTC CTA CGG GAG GCA GCA G-3'750bp 左右反向引物1115R 5'-AGG GTT GCG CTC GTT GC-3' 第3部分正向引物926F5'- AAA CTY AAA KGA ATT GAC GG-3'560 bp 左右反向引物1492R5'-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3' 其中M=C:A, Y=C:T. K=G:T, R=A:G, S=G:C. W=A:T; all 1:14. 操作流程1.5 核酸提取：挑取单菌落，然后置于装有100μLPrepMan Ultra 的离心管中，涡旋震荡混匀30s 左右，然后100℃水浴10min 后，以离心机最大转速离心3min ，取10μL 上清液与490μL ddH 2O （即稀释50倍），混匀作为下步PCR 的模板DNA 。
细菌种属的分子鉴定
用16S rDNA方法鉴定细菌种属一、目的1. 掌握16S rDNA对细菌进行分类的原理及方法；2. 掌握DNA提取、PCR原理及方法、DNA片段回收等实验操作。
二、原理随着分子生物学的迅速发展，细菌的分类鉴定从传统的表型、生理生化分类进入到各种基因型分类水平，如(G+C)mol%、DNA杂交、rDNA指纹图、质粒图谱和16S rDNA序列分析等。
细菌中包括有三种核糖体RNA，分别为5S rRNA、16S rRNA、23S rRNA，rRNA基因由保守区和可变区组成。
16S rRNA对应于基因组DNA上的一段基因序列称为16S rDNA。
5S rRNA虽易分析，但核苷酸太少，没有足够的遗传信息用于分类研究；23S rRNA含有的核苷酸数几乎是16S rRNA的两倍，分析较困难。
而16S rRNA相对分子量适中，又具有保守性和存在的普遍性等特点，序列变化与进化距离相适应，序列分析的重现性极高，因此，现在一般普遍采用16S rRNA作为序列分析对象对微生物进行测序分析。
利用16S rDNA鉴定细菌的技术路线：三、操作步骤（一）细菌基因组DNA提取1. 挑单菌落接种到10 mL LB培养基中37℃振荡过夜培养。
2. 取2 mL培养液到2 mLEppendorf管中，8000 rpm离心2分钟后倒掉上清液。
3. 加140 μL TE打散细菌，再加入60 μL 10 mg/ml的溶菌酶。
37℃放置10分钟。
4. 加入400 μL Digestion Buffer，混匀。
再加入3 μL Protein K，混匀，55℃温育5分钟。
5. 加入260 μL乙醇，混匀，全部转入UNIQ-10柱中。
10000 rpm离心1分钟，倒去收集管内的液体。
6. 加入500 μL 70％乙醇（Wash Solution），10000 rpm离心0.5分钟。
7. 重复第六步。
8. 再10000 rpm离心2分钟彻底甩干乙醇。
吸附柱转移到一个新的1.5 mL的离心管。
16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程
16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程1.适用范围本标准规定了通过特定引物对细菌的16SrDNA片段进行PCR扩增，然后对扩增片段进行序列分析比对，快速取得细菌种属信息的操作规程。
本标准适用于未知细菌的快速种属分析，和为细菌的生化鉴定提供指导信息。
2.方式和原理16SrDNA鉴定是指用利用细菌16SrDNA序列测序的方式对细菌进行种属鉴定。
包括细菌基因组DNA提取、16SrDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA测序、序列比对等步骤。
是一种快速取得细菌种属信息的方式。
细菌rRNA（核糖体RNA）按沉降系数分为3种，别离为5S、16S和23S rRNA。
16S rDNA是细菌染色体上编码16S rRNA相对应的DNA序列。
16S rDNA由于大小适中，约1.5Kb左右，既能表现不同菌属之间的不同，又能利用测序技术较容易地取得其序列，故被细菌学家和分类学家同意。
在16S rRNA 分子中，可变区序列因细菌不同而异，恒定区序列大体保守，因此可利用恒定区序列设计引物，将16S rDNA片段扩增出来，利用可变区序列的不同来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定。
16SrDNA序列的前500bp序列转变较大，包括有丰硕的细菌种属的特异性信息，因此关于绝大多数菌株来讲，只需要第一对引物测前500bp序列即可辨别出细菌的菌属。
针对科学论文发表或是前500bp无法辨别的情形，需要进行16SrDNA的全序列扩增和测序，取得较为全面的16SrDNA 的序列信息。
由于测序仪一次反映最多只能测出700bp的有效序列，为了结果的靠得住性，通常将16SrDNA 全长序列分成3部份进行测序。
3.设备和材料3.1器材移液器（1000μL、200μL 、100μL、10μL）；涡旋振荡器；EppendorfMixMate ；离心机；水浴锅；电泳仪；制冰机；低温冰箱；PCR 仪：Veriti 96 Well Thermal Cycler ； 凝胶成像仪：VersaDoc MP 4000；基因分析仪：AB3500、AB3130 3.2 试剂DNA 快速提取试剂：PrepMan Ultra ；琼脂糖；PCR 试剂：Taq 酶，10×Taq Buffer(Mg 2+)，dNTPs ，ddH 2O 等； ExoSAP-IT ；测序试剂：BigDye Terminator ，5×Sequencing Buffer ；BigDye XTerminator Purification Kit ； 3.3 耗材移液器吸头：1000μL 、200μL 、10μL ；离心管：1.5mL 、200μL ；Micro Amp TM Optical 96-Well Reaction Plate ；Micro Amp TM Optical Adhesive Film ； 3.4 引物16SrDNA 名称 序列第1部分正向引物27F 5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3' 500 bp 左右反向引物519R 5'- GWA TTA CCG CGG CKG CTG -3' 第2部分 正向引物357F 5'- CTC CTA CGG GAG GCA GCA G-3' 750bp 左右反向引物1115R 5'-AGG GTT GCG CTC GTT GC-3' 第3部分 正向引物926F 5'- AAA CTY AAA KGA ATT GAC GG-3' 560 bp 左右反向引物1492R5'-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3'其中M=C:A, Y=C:T. K=G:T, R=A:G , S=G:C. W=A:T; all 1:14. 操作流程5. 实验方式5.1 核酸提取：挑取单菌落，然后置于装有100μLPrepMan Ultra 的离心管中，涡旋震荡混匀30s 左右，然后100℃水浴10min 后，以离心机最大转速离心3min ，取10μL 上清液与490μL ddH 2O （即稀释50倍），混匀作为下步PCR 的模板DNA 。
16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程
16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程1.适用范围本标准规定了通过特定引物对细菌的16SrDNA片段进行PCR扩增，然后对扩增片段进行序列分析比对，快速获得细菌种属信息的操作规程。
本标准适用于未知细菌的快速种属分析，以及为细菌的生化鉴定提供指导信息。
2.方法和原理16SrDNA鉴定是指用利用细菌16SrDNA序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。
包括细菌基因组DNA提取、16SrDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA测序、序列比对等步骤。
是一种快速获得细菌种属信息的方法。
细菌rRNA（核糖体RNA）按沉降系数分为3种，分别为5S、16S和23S rRNA。
16S rDNA是细菌染色体上编码16S rRNA相对应的DNA序列。
16S rDNA由于大小适中，约1.5Kb左右，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家接受。
在 16S rRNA 分子中，可变区序列因细菌不同而异，恒定区序列基本保守，所以可利用恒定区序列设计引物，将16S rDNA片段扩增出来，利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定。
16SrDNA序列的前500bp序列变化较大，包含有丰富的细菌种属的特异性信息，所以对于绝大多数菌株来说，只需要第一对引物测前500bp序列即可鉴别出细菌的菌属。
针对科学论文发表或是前500bp无法鉴别的情况，需要进行16SrDNA的全序列扩增和测序，得到较为全面的16SrDNA的序列信息。
由于测序仪一次反应最多只能测出700bp的有效序列，为了结果的可靠性，通常将16SrDNA全长序列分成3部分进行测序。
16SrDNA27F519R357F3对引物正反向测通后，拼接成1500bp左右的16SrDNA序列。
3.设备和材料3.1器材移液器（1000μL、200μL 、100μL、10μL）；涡旋振荡器；Eppendorf MixMate；离心机；水浴锅；电泳仪；制冰机；低温冰箱；PCR仪：Veriti 96 Well Thermal Cycler；凝胶成像仪：VersaDoc MP 4000；基因分析仪：AB3500、AB31303.2试剂DNA快速提取试剂：PrepMan Ultra；琼脂糖；PCR试剂：Taq酶，10×Taq Buffer(Mg2+)，dNTPs，ddH2O等；ExoSAP-IT；测序试剂：BigDye Terminator，5×Sequencing Buffer；BigDye XTerminator Purification Kit；3.3耗材移液器吸头：1000μL、200μL、10μL；离心管：1.5mL、200μL；Micro Amp TM Optical 96-Well Reaction Plate；Micro Amp TM Optical Adhesive Film；3.4引物16SrDNA 名称序列扩增长度第1部分正向引物27F 5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'500 bp左右反向引物519R 5'- GWA TTA CCG CGG CKG CTG -3'第2部分正向引物357F 5'- CTC CTA CGG GAG GCA GCA G-3'750bp左右反向引物1115R 5'-AGG GTT GCG CTC GTT GC-3'第3部分正向引物926F 5'- AAA CTY AAA KGA ATT GAC GG-3'560 bp左右反向引物1492R 5'-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3'1115R1492R926F其中M=C:A, Y=C:T. K=G:T, R=A:G, S=G:C. W=A:T; all 1:14. 操作流程5. 实验方法5.1 核酸提取：挑取单菌落，然后置于装有100μLPrepMan Ultra 的离心管中，涡旋震荡混匀30s 左右，然后100℃水浴10min 后，以离心机最大转速离心3min ，取10μL 上清液与490μL ddH 2O （即稀释50倍），混匀作为下步PCR 的模板DNA 。
16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程
16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程1.适用范围本标准规定了通过特定引物对细菌的16SrDNA片段进行PCR扩增，然后对扩增片段进行序列分析比对，快速获得细菌种属信息的操作规程.本标准适用于未知细菌的快速种属分析,以及为细菌的生化鉴定提供指导信息。
2.方法和原理16SrDNA鉴定是指用利用细菌16SrDNA序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。
包括细菌基因组DNA提取、16SrDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA测序、序列比对等步骤。
是一种快速获得细菌种属信息的方法。
细菌rRNA（核糖体RNA)按沉降系数分为3种，分别为5S、16S和23S rRNA。
16S rDNA是细菌染色体上编码16S rRNA相对应的DNA序列。
16S rDNA由于大小适中，约1.5Kb左右,既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家接受。
在16S rRNA分子中,可变区序列因细菌不同而异,恒定区序列基本保守，所以可利用恒定区序列设计引物，将16S rDNA片段扩增出来，利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定。
16SrDNA序列的前500bp序列变化较大，包含有丰富的细菌种属的特异性信息,所以对于绝大多数菌株来说，只需要第一对引物测前500bp序列即可鉴别出细菌的菌属。
针对科学论文发表或是前500bp无法鉴别的情况，需要进行16SrDNA的全序列扩增和测序,得到较为全面的16SrDNA的序列信息。
由于测序仪一次反应最多只能测出700bp的有效序列，为了结果的可靠性,通常将16SrDNA全长序列分成3部分进行测序。
3.设备和材料1.1器材移液器(1000μL、200μL 、100μL、10μL）；涡旋振荡器；Eppendorf MixMate；离心机；水浴锅；电泳仪；制冰机；低温冰箱；PCR仪：Veriti 96 Well Thermal Cycler；凝胶成像仪：VersaDoc MP 4000;基因分析仪:AB3500、AB31301.2试剂DNA快速提取试剂：PrepMan Ultra；琼脂糖；PCR试剂：Taq酶,10×Taq Buffer （Mg2+），dNTPs，ddH2O等；ExoSAP-IT；测序试剂：BigDye Terminator,5×Sequencing Buffer；BigDye XTerminator Purification Kit；1.3耗材移液器吸头：1000μL、200μL、10μL；离心管:1.5mL、200μL;Micro Amp TM Optical 96—Well Reaction Plate;Micro Amp TM Optical Adhesive Film；1.4引物16SrDNA 名称序列扩增长度第1部分正向引物27F 5’—AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG—3'500 bp左右反向引物519R 5’- GWA TTA CCG CGG CKG CTG —3’第2部分正向引物357F 5'—CTC CTA CGG GAG GCA GCA G—3’750bp左右反向引物1115R 5'-AGG GTT GCG CTC GTT GC—3’第3部分正向引物926F5'- AAA CTY AAA KGA ATT GAC GG —3’560 bp 左右反向引物1492R5'—TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T —3’其中M=C:A ， Y=C ：T 。
16S鉴定细菌的种属
84
Enterococcus avium ATCC 14025T (DQ411811) Enterococcus devriesei LMG 14595T (AJ891167) 98 Enterococcus pseudoavium ATCC 49372T (DQ411809) 99 Enterococcus hermanniensis LMG 12317T (AY396047) Enterococcus pallens ATCC BAA-351T (DQ411812) Enterococcus asini AS2T (Y11621) Enterococcus canintestini LMG 13590T (AJ888906) 99 Enterococcus dispar LMG 13521T (AJ301829) Enterococcus phoeniculicola JLB-1T (AY028437) Enterococcus thailandicus FP48-3T (EF197994) Enterococcus canis LMG 12316T (X76177) Enterococcus durans DSM 20633T (AJ276354) Enterococcus mundtii LMG 10748T (AJ301836) Enterococcus villorum LMG 12287T (AJ271329)2 03 04
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16SrＤＮＡ的定义及其应用于细菌 鉴定的原因 鉴定的一般步骤 文本目录
鉴定存在的不足及其解决办法
文本目录 16SrDNA 在细菌鉴定中的应用
１.16SrDNA的定义
16SrRNA为原核生物核糖体RNA的一个亚基，16SrDNA就是编码该亚基的基因。
用16S rDNA方法鉴定细菌种属
一、实验目的1. 掌握16S rDNA 对细菌进行分类的原理及方法；2. 掌握DNA 提取、PCR 原理及方法、DNA 片段回收等实验操作。
二、实验原理细菌rRNA （核糖体RNA ）按沉降系数分为3种，分别为5S 、16S 和23S rRNA 。
16S rDNA 是细菌染色体上编码16S rRNA 相对应的DNA 序列，存在于所有细菌染色体基因中。
16SrDNA 鉴定是指用利用细菌16SrDNA 序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。
包括细菌基因组DNA 提取、16SrDNA 特异引物PCR 扩增、扩增产物纯化、DNA 测序、序列比对等步骤。
是一种快速获得细菌种属信息的方法。
16S rDNA 是细菌的系统分类研究中最有用的和最常用的分子钟，其种类少，含量大（约占细菌RNA 含量的80％），分子大小适中，存在于所有的生物中，其进化具有良好的时钟性质，在结构与功能上具有高度的保守性，素有“细菌化石”之称。
在大多数原核生物中rDNA 都具有多个拷贝，5S 、16S 、23S rDNA 的拷贝数相同。
16S rDNA 由于大小适中，约1.5Kb 左右，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家接受。
16SrRNA 的编码基因是16SrDNA ，但是要直接将16SrRNA 提取出来很困难，因为易被广泛存在的RNase 降解，因而利用16S rDNA 鉴定细菌，其技术路线如下：细菌基因组的提取：PCR 的基本原理 ：PCR 技术的基本原理 类似于DNA 的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的 寡核苷酸引物。
PCR 由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA 的变性：模板DNA 经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA 双链或经PCR 扩增形成的双链DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA 与引物的退火(复性)：模板DNA 经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引 物与模板DNA 单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
16S鉴定细菌的种属
1.什么是 16S rDNA？ 16SrRNA为原核生物核糖体RNA的一个亚基，16SrDNA就是编码
该亚基的基因。 原核生物的rRNA含有3种类型：23S、16S、5S rRNA，它们分别
含有2900、1540和120个核苷酸。
2.用16S rDNA进行细菌鉴定的原因 16S rDNA在原核生物中普遍存在。 16 S rDNA的相对分子量大小适中，约1500 bp，便于序列分析。 在16S rRNA分子中， 既含有高度保守的序列区域，又有中度保
DNA的提取
挑取单菌落,然后置于装有100 μLPrepMan Ultra的离心管中, 涡旋震荡混匀30s左右，然后100℃水浴10min 后，以离心机 最大转速离心3min，取10μL上清液与490μL ddH2O（即稀 释50 倍），混匀作为下步PCR 的模板DNA 。提取的DNA 于-20℃保存。
2μL 0.2 μL 2 μL 1 μL 0.5 μL 0.5 μL 13.8 μL
1min30s
判断16Sr DNA序列扩增是否成功:经琼脂糖凝胶电泳在1500 bp附近 出现条带，说明16s rDNA已经扩增成功。
https:///
检测：核酸蛋白仪/琼脂糖凝胶电泳
1525R 5' AAG GAG GTG WTC CAR CC 3'
试剂使用量（ 20μL体系）
PCR 反应条件
模板DNA （10ng~100ng） Taq 酶(5U/μL) 10×Taq Buffer(Mg2+) dNTPs(2.5mM) 引物F(10 μM) 引物R(10 μM) ddH2O
守和高度变化的序列区域，因而它适用于进化距பைடு நூலகம்不同的各类生 物亲缘关系的研究。 bp=base pair
细菌种属的分子鉴定
用16S rDNA方法鉴定细菌种属一、目的1. 掌握16S rDNA对细菌进行分类的原理及方法；2. 掌握DNA提取、PCR原理及方法、DNA片段回收等实验操作。
二、原理随着分子生物学的迅速发展，细菌的分类鉴定从传统的表型、生理生化分类进入到各种基因型分类水平，如(G+C)mol%、DNA杂交、rDNA指纹图、质粒图谱和16S rDNA序列分析等。
细菌中包括有三种核糖体RNA，分别为5S rRNA、16S rRNA、23S rRNA，rRNA基因由保守区和可变区组成。
16S rRNA对应于基因组DNA上的一段基因序列称为16S rDNA。
5S rRNA虽易分析，但核苷酸太少，没有足够的遗传信息用于分类研究；23S rRNA含有的核苷酸数几乎是16S rRNA的两倍，分析较困难。
而16S rRNA相对分子量适中，又具有保守性和存在的普遍性等特点，序列变化与进化距离相适应，序列分析的重现性极高，因此，现在一般普遍采用16S rRNA作为序列分析对象对微生物进行测序分析。
利用16S rDNA鉴定细菌的技术路线：三、操作步骤（一）细菌基因组DNA提取1. 挑单菌落接种到10 mL LB培养基中37℃振荡过夜培养。
2. 取2 mL培养液到2 mLEppendorf管中，8000 rpm离心2分钟后倒掉上清液。
3. 加140 μL TE打散细菌，再加入60 μL 10 mg/ml的溶菌酶。
37℃放置10分钟。
4. 加入400 μL Digestion Buffer，混匀。
再加入3 μL Protein K，混匀，55℃温育5分钟。
5. 加入260 μL乙醇，混匀，全部转入UNIQ-10柱中。
10000 rpm离心1分钟，倒去收集管内的液体。
6. 加入500 μL 70％乙醇（Wash Solution），10000 rpm离心0.5分钟。
7. 重复第六步。
8. 再10000 rpm离心2分钟彻底甩干乙醇。
吸附柱转移到一个新的1.5 mL的离心管。
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16S rDNA在原核生物中普遍存在。
16 S rDNA的相对分子量大小适中，约1500 bp，便于序列分析。 在16S rRNA分子中， 既含有高度保守的序列区域，又有中度保
守和高度变化的序列区域，因而它适用于进化距离不同的各类
生物亲缘关系的研究。 bp=base pair
图 16S rDNA基因组成（灰色为保守区，绿色为可变区）
16S rDNA基因全长1542 bp，由9个可变区和10个保守区组成。其中保守区反 映了生物物种间的亲缘关系，而可变区则表明物种间的差异，且变异程度与细 菌的系统发育密切相关。
DNA的提取
挑取单菌落,然后置于装有100 μLPrepMan Ultra的离心管中, 涡旋震荡混匀30s左右，然后100℃水浴10min 后，以离心机 最大转速离心 3min ，取 10μL 上清液与 490μL ddH2O （即稀 释50 倍），混匀作为下步PCR 的模板DNA 。提取的DNA 于-20℃保存。
利用16S rDNA鉴定细菌 的种属
1.什么是 16S rDNA？ 16SrRNA 为原核生物核糖体 RNA 的一个亚基， 16SrDNA 就是编
码该亚基的基因。 原核生物的rRNA含有3种类型：23S、16S、5S rRNA，它们分别
含有2900、1540和120个核苷酸。
2.用16S rDNA进行细菌鉴定的原因
检测：核酸蛋白仪/琼脂糖凝胶电泳
525R 5' AAG GAG GTG WTC CAR CC 3'
试剂使用量（ 20μL体系）
模板DNA （10ng~100ng） 2μL
PCR 反应条件
Taq 酶(5U/μL)
10×Taq Buffer(Mg2+) dNTPs(2.5mM) 引物F(10 μM) 引物R(10 μM) ddH2O
0.2 μL
2 μL 1 μL 0.5 μL 0.5 μL 13.8 μL
1min30s
判断16Sr DNA序列扩增是否成功:经琼脂糖凝胶电泳在1500 bp附近 出现条带，说明16s rDNA已经扩增成功。
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