花生FAD2_RNAi载体基因AFLP标记的克隆及序列分析

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分子标记——AFLP原理和操作步骤

分子标记——AFLP原理和操作步骤一、原理AFLP也是通过限制性内切酶片段的不同长度检测DNA多态性的一种DNA分子标记技术。

但AFLP是通过P CR反应先把酶切片段扩增，然后把扩增的酶切片段在高分辨率的顺序分析胶上进行电泳，多态性即以扩增片段的长度不同被检测出来。

实验中酶切片段首先与含有与其共同粘末端的人工接头连接，连接后的粘末端顺序和接头顺序就作为以后PCR反应的引物结合位点。

实验中，根据需要通过选择在末端上分别填加了1～3个选择性核苷的不同引物，可以达到选择性扩增的目的。

这些选择性核苷酸使得引物能选择性地识别具有特异配对顺序的内切酶片段，进行结合，导致特异性扩增。

二、实验试剂Taq酶、EcoRI/ MseIEcoRI/ MseI接头、E+A引物M+C引物、T4DNALigaseE和M引物、琼脂、过硫酸胺、丙烯酰胺、尿素、硝酸银、甲酰胺、dNTPs、二甲苯青、冰醋酸、玻璃硅烷、50bpMark三、操作步骤（一）基因组DNA提取和纯化A、参考实验一的大量提取DNA实验方法，B、DNA的纯化：用0.8%琼脂糖凝胶（含EB0.5μg/ml）电泳检测片段大小，取出其中的1/3已提取的基因组D NA进行纯化，首先用TE缓冲液补满至总体积50ul，再等体积苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）、氯仿/异戊醇（2 4∶1）各抽提一次，离心吸上清液于Eppendorf管中，加入1/10体积的NaAC和二倍体积预冷的无水乙醇，－20℃放置2h以上，10000g离心10min，用70%的乙醇漂洗DNA沉淀2次，风干后溶于30μlTE缓冲液中，U V-2401PC（岛津）紫外分光光度计检测A260、A280值并定量，再用0.8%琼脂糖凝胶（含EB0.5μg/ml）电泳检测片段大小。

注：0.1-0.2g组织可用100ul溶液E溶，0.5g组织，溶液E可增加至300ul，此时DNA浓度大约为100ng/ul。

（二）限制性酶切及连接在0.2ml离心管中加入：模板量约为250ng，2.5μl 10×酶切缓冲液， 2.5μl 10×T4DNA连接酶切缓冲液，5U EcoRⅠ，5U MseⅠ，2U T4连接酶，50pmol MseⅠ接头（序列见表2），双蒸水补至25μl。

FAD2和γ-TMT基因双价种子特异表达载体的构建及对花生的转化

ＢｎｅｕｎｅＡＦ０２０２ｒｍｏｅｓｉｏａｅｏｒｓｉａｎｐｓＤＮａｃｒｉｇｔ０７８ｓｑｅｃ，ａｋｓｑｅｃ１４２．ＳｐｏｔｒｗａｓｌｔｄｆｍＢａｓａｕＡｃｏｄｎｏＪ２９ｅｕｎｅｒｃ
到一基因，聊根据已发表的油菜（ｒｓｃａｕ）Ｂａｓａｎｐｓ种子贮藏蛋白基因特异表达的２ｉｓ启动子（登录号Ｊ２９）０７８序列，
从油菜ＤＡ中分离得到２启动子。为了同时提高花生中维生素Ｅ和油酸含量，Ｎｓ构建得到了双价种子特异表达载
ＳＩｉｇｏＨＮＨａＨＮＸａｇ— ｕＺＵＮｉｊｎＨｎ— ｕ，ＣＥｕ，ＣＥｉＸｎｙ，ＨＡＧＷｅ — ｉａ
（ｕａｅａｌｎＭｏｅｕｒａｄＣｌＢｏｏｙＦｚｏ５０２ｈｎ）ＦｊｎＫｙＬｂｏＰａｔｌｌｎｅｉｇ，ｕｈｕ３００，Ｃｉａｉｆｃａｌｌ
石新国，陈华，陈湘瑜，庄伟建
（福建省作物分子与细胞生物学重点实验室，福建福州３００）５０２
摘要：根据已发表的一
基因序列（ｅＢｎＦ０２０，ＧｎａｋＡ１４２）从拟南芥（ｒｂｏｓａｉｎ）ｃＮＡａｉｐｉｔｌａ的ＤＡ中分离得ｄｓｈａ
ＦＤ．ＩｗｓｕｅｃｅｓｏｈｔｏｈｒｌｎｌｉａｉｃｎｅｔｎｐａｕｔｏｇｇｏａｔｉｍｔｆｃｎＡ２ｔａｓｄｔｉｒａｅｂｔｏｐｅｏａｄｏｃｃｄｏｔｎｅｎｔｈｕｈＡｒｂｃｒｍｅｉｓｏｎｃｅｉｒｅｕｕａｅ

AFLP标记技术及其在花生上的应用研究

AFLP标记技术及其在花生上的应用研究
郭静佩;王晓林;周鹏;周延清
【期刊名称】《河南农业科学》
【年(卷),期】2011(040)002
【摘要】AFLP是检测DNA多态性的一种分子标记技术.综述了该技术原理、方法、特点及其在花生遗传多样性、抗性相关分子标记、根瘤菌、指纹图谱等方面应用的研究进展.
【总页数】4页(P12-15)
【作者】郭静佩;王晓林;周鹏;周延清
【作者单位】河南师范大学,生命科学学院,河南,新乡,453007;驻马店农业科学研究所,河南,驻马店,463000;河南师范大学,生命科学学院,河南,新乡,453007;河南师范
大学,生命科学学院,河南,新乡,453007
【正文语种】中文
【中图分类】S565.2
【相关文献】
1.DNA分子标记技术在花生品种鉴定上的应用研究 [J], 王传堂;杨新道;于翔;张建成;刘光臻;徐建芝
2.DNA分子标记技术在花生品种鉴定上的应用研究 [J], 王传堂;杨新道;于翔;张建成;刘光臻;徐建芝
3.分子标记技术在花生上的应用研究 [J], 李洁;马金娜;谷献锋;荆建国
4.AFLP技术在花生品种鉴定上的应用研究 [J], 张建成;王传堂;江玉萍;李群;李汝玉
5.DNA分子标记技术在花生上的应用研究 [J], 王传堂
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CRISPR/Cas9编辑花生FAD2基因研究

作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2021, 47(8): 1481-1490 / ISSN 0496-3490; CN 11-1809/S; CODEN TSHPA9 E-mail: zwxb301@本研究由国家自然科学基金项目(31671766)和深圳市科创委基础研究项目(JCYJ20190808143207457, JCYJ20180305124101630, JCYJ20170818094958663)资助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31761766) and the Shenzhen Commission of Science and Technology Innovation Projects (JCYJ20190808143207457, JCYJ20180305124101630, JCYJ20170818094958663).*通信作者(Corresponding author): 于为常, E-mail: wyu@第一作者联系方式: E-mail: zahngwang@Received (收稿日期): 2020-09-19; Accepted (接受日期): 2021-01-13; Published online (网络出版日期): 2021-02-25. URL: https:///kcms/detail/11.1809.S.20210225.1139.002.htmlDOI: 10.3724/SP.J.1006.2021.04214CRISPR/Cas9编辑花生FAD2基因研究张旺冼俊霖孙超王春明石丽于为常*深圳大学生命与海洋学院 / 广东省植物表观遗传学重点实验室, 广东深圳 518071摘要: 油酸脱氢酶(∆12FAD 或FAD2)是催化油酸(OA)的C12位上脱氢生成双不饱和亚油酸(LA)的关键酶, 它控制油酸、亚油酸的含量及其比值(O/L)。

等位基因特异PCR法鉴定花生FAD2B新突变

[11]
。完成后, 电泳检测
引物0.
2
5μL、无菌双蒸水8.
7
5μL。 PCR 程序:9
4℃
1 mi
n,9
4℃ 3
0s,5
3℃ 3
0s,7
2℃ 3
0s,3
0 个循环;
7
2℃ 5 mi
n。在东胜龙 EDC
8
1
0型 PCR 仪上完成。
2 结果与分析
2.
1 FAD2B 基因编码序列比较
用引物对 b
花生高油酸育种具有重要意义。本研究对普通油酸的野生型花生 15L46 和本团队创制的高油酸
突变型花生 15L46HOFAD2B 基因进行克隆测序和序列比对,证实 FAD2B 基因存在 G558A 突变。
在此基础上设计两套 AS
-PCR(等位基因特异性 PCR)引物检测该突变位点,效果良好。该方法操作
肪、蛋白质、糖类、矿物质及多种维生素等,对促进
发现,FAD2A 和 FAD2B 即 o
l1 和 o
l2 两对隐性
2
2[1]
1752 万t,单产 3781kg/hm 。花生籽仁富含脂
人体新陈代谢和改善记忆力等都有所裨益,是一种
集益智、抗衰、延寿等功效于一体的农产品[2] 。
油酸和亚油酸是花生两种主要脂肪酸,两者之
ypeFAD2 mu
gh
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,
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anc
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o
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i
o
l
e
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花生Clp蛋白酶基因(AhClpP)的克隆与序列分析

２００）５１０
摘要：ｌＣｐ蛋白酶通过蛋白质水解作用来清除细胞内由逆境引起的异常和具有潜在毒性的蛋白或多肽，而保证从细胞正常的生理功能。从优质大花生鲁花ｌ子不同发育时期混合ｅＮ４种ＤＡ文库中发现一条序列，长为１２２ｂ，全１ｐ３
ＩｒｖｍｅｔａｄＢｏｅｈｏｏｙＨｕｎｈａｈｉＭｉｉｒｆＡｒｕｔｒ，ｉａ２００Ｃｉａｍｐｏｅｎｎｉｔｃｎｌｇ，ａｇｕｉａ，ｎｓｏｇｉｌｅＪｎｎ５１０，ｈｎ）ｔｙｃｕ
ＡｂｓｒｔＣｌｒｔａｅｃｎｒｌｒｉａｙｍｅａｏｉｒｃｓｅｙｒｍｏｉｇａｎｒａｎｏｉｒｔｉｓｏｅｔｄｓｔａｃ：ｐｐｏｅｓｏｔｏｓｏｄｎｒｔｂｌｃｐｏｅｓｓｂｅｖｎｂｏｍｌａｄｔｘｃｐｏｅｎｒｐｐｉｅ
clp蛋白酶参与错误折叠蛋白降解短命蛋白调控和错误功能蛋白移除调节代谢途径中限速酶的水平来控制代谢过程的进行从而保证细胞正常生理功能在生物蛋白质代谢调控中发挥重要作用在逆境条件刺激下细胞会产生一些不可逆损伤的蛋白或多肽而这种不可逆损伤的蛋白会对细胞产生某种毒害作用或者干扰正常代谢过程的进行在这种情况下会有许多clp蛋白酶产生通过蛋白质水解作用清除非正常和具有潜花生是我国重要的油料和经济作物之一种植面积约502花生在其生长过程中经常会遭受到不同程度的生物和非生物逆境胁迫这些胁迫严重影响植物的生长发育并对农业生产造成极大的负面影响研究发现在长期的生物进化过程中植物自身已经发展了多种抵抗胁迫的机制以通过调节自身生理和代谢变化来抵御逆境

花生FAD2-RNAi载体基因AFLP标记的克隆及序列分析

．
ＷｅｏａｎｅｗｅｖＡＦＬＰｍａｋ— ｂｔｉｄｔｎｔｒ
．
１＿ａｔｃｄｄｅａｕａｅＲＮＡｉｖｃｏｒＦｉ２ｆｔｙａｉｓｔｒｓ－ｅｔｖｅ
ｓｑｕｎｃｓａｅｏｂａｎｄａｔｒｒｃｖｒｓｇｅｃｌｎｅａｅｓｒｎｄｗｅｅｃｍｐａｅｌｓｎｉｈｅｅｅｒｔｉｅｆｅｅｏｅ，ｉｏｎｉ，ｃｏｎｄｍａｕｅａｒｏｒｄｂｙｂａｔｎｔｅ
中图分类号：５５２２４￥６．０．文献标识码：Ａ
ＭｏｅｕａｏｉｇａｄＳｑｅｃａｙｉｏｌｃｌｒＣｌｎｎｎｅｕｎｅＡｎｌｓｓｆ△ １＿ａｔｉ２ｆｔｙＡｃｄ
‘
ＤｅａｕａｅＲＮＡｉＶｅｔｒＢａｅｓｔｒｓ－ｃｏｓｄＡＦＬＰｎＰｅｎｕｉａｔ
ＧｅＢｎｎａｋ．Ｔｈｎｌｔｅｕｔｓｏｅｈｉｅｓｑｅｃｒａｅｅｅｗｅｎ３．７ｍｎ．９ｍｔｅａａｙｉｒｓｌｈｗｄｔｅｆｅｕｎｅｗｅｅｌｂｌｄｂｔｅ８ｃａｄ６５ｃｃｖｈｅ
花生ＦＡＤ２ＲＮＡｉ体基因ＡＦＰ一载Ｌ标记的克隆及序列分析
张宁洁，国庆熊发前高，
（．西大学，西南宁５００；．西农业科学院生物实验室，西南宁５００１广广３０３２广广３０３）

玉米FAD2基因的克隆及序列分析

玉米FAD2基因的克隆及序列分析
玉米FAD2基因的克隆及序列分析
高等植物中的△12脂肪酸脱饱和酶是将油酸转化为亚油酸的酶.根据已发表的其他高等植物的FAD2基因的保守序列设计同源引物,通过RT-PCR从玉米幼胚中扩增得到一个特异的cDNA基因片段.通过生物信息学分析,从玉米幼胚cDNA和基因组中均扩增得到1 164 bp FAD2基因(GenBank登陆号:DQ496227),它编码387个氨基酸,含有完整的ORF框,在ORF框内无内含子.序列联配与树状分析结果表明,FAD2推导的氨基酸序列与其他物种的△12脱饱和酶基因具有同源性.它含有3个组氨酸保守域和2段很长的疏水区,是一个跨膜4次的膜结合蛋白.半定量RT-PCR分析显示FAD2基因在玉米幼胚中表达量最高,在叶、茎、根中亦有低水平表达.
作者：陶芳朱苏文范军程备久 TAO Fang ZHU Su-Wen FAN Jun CHENG Bei-Jiu 作者单位：安徽农业大学生命科学院生物物理实验室,合肥,230036 刊名：植物生理与分子生物学学报ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF PLANT PHYSIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY 年，卷(期)：2006 32(6) 分类号：Q94 关键词：玉米 FAD2基因半定量RT-PCR maize FAD2 gene semi-quantitative RT-PCR。

花生ahFAD2B基因反义表达载体构建与基因转化影响因素的研究的开题报告

花生ahFAD2B基因反义表达载体构建与基因转化影响因素的研究的开题报告一、研究背景花生是全球重要的粮食作物之一，其油脂含量较高，因此在食用和工业生产中都扮演着重要角色。

然而，催化花生油脂酯化反应的过程中，传统方法中催化剂的使用量较大，同时还会产生一些有害物质。

基于环境保护和经济效益的考虑，开发一种新型的低催化剂使用量、高效的方法是十分必要的。

AHFAD2B基因是花生中脂肪酸代谢途径中的一个重要基因，反义表达该基因可能会对花生的油脂代谢产生影响。

因此，本文将研究花生中AHFAD2B的反义表达载体构建及其转化，并探究基因转化中的影响因素。

二、研究内容1. 构建花生反义表达载体本研究将设计用于反义表达AHFAD2B基因的载体，其中将包括siRNA和shRNA的设计与构建。

建立反义表达载体后，将进行体外转化实验，以测试反义表达载体的实际效果。

2. 确定基因转化条件对反义表达载体转化花生过程中的重要参数进行优化试验，以获得最佳反义表达载体转化效果。

这些参数将包括：细胞密度、电量、电极间距、治疗时间等。

3. 研究反义表达基因对花生油脂代谢的影响将获得的反义表达花生进行磷脂酰胆碱基因结合蛋白（PCD）酶活性分析和油脂分析，以寻求反义表达对花生油脂代谢的影响。

三、研究意义本研究通过抑制AHFAD2B基因表达来探索其对花生油脂代谢的影响，并提出了一种新型的低催化剂使用量、高效的方法。

本研究还将探究基因转化中的重要参数，为该领域的研究提供重要参考。

这些研究成果对于花生油脂代谢研究和工业化生产具有一定的指导意义。

花生AhFAD2A基因启动子的克隆与序列分析

，
（１．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，ＳｈａｎｄｏｎｇＮｏｒｍａｌ ‘ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，如ｎ２５００１４，Ｃｈｉｎａ；２．Ｈｉ —ＴｅｃｈＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｒｅ，ＳｈａｎｄｏｎｇＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｃｃｉａｌＫｅｙ
ＡｂｓｔｒａｃｔＵｓｉｎｇｔｈｅｍｅｔｈｏｄｏｆｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｗａｌｋｉｎｇ，ａ７１６ｂｐｆｒａｇｍｅｎｔｏｆＡｈＦＡＤ２Ａｇｅｎｅｗａｓｃｌｏｎｅｄ
ＣｌｏｎｉｎｇａｎｄＳｅｑｕｅｎｃｅＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＡｈＦＡＤ２ＡＧｅｎｅＰｒｏｍｏｔｅｒｆｒｏｍＡｒａｃｈｉｓｈｙｐｏｇａｅａ
ＺｈａｏＸｕｅＢｉｎ一，ＺｈｏｕＬｉＸｉａ一，ＴａｎｇＧｕｉＹｉｎｇｚＳｈａｎＬｅｉ ’
ＫｅｙｗｏｒｄｓＰｅａｎｕｔ（ＡｒａｃｈｉｓｈｙｐｏｇａｅａＬ．）；ＡｈＦＡＤ２Ａｇｅｎｅ；Ｐｒｏｍｏｔｅｒ；Ｅｌｅｍｅｎｔａｎａｌｙｓｉｓ．
（１．山东师范大学生命科学学院，山东济南２５００１４；

花生锈病抗性的AFLP标记

花生锈病抗性的AFLP标记侯慧敏;廖伯寿;雷永;任小平;王圣玉;李栋;姜慧芳;黄家权;陈本银【期刊名称】《中国油料作物学报》【年(卷),期】2007(029)002【摘要】利用抗、感锈病花生品种为亲本配制杂交组合远杂9102 ×ICGV86699,以其F2分离群体为研究材料, 利用BSA法和AFLP技术,获得了与锈病抗性连锁的2个分子标记,与抗性基因间的遗传距离分别为10.90cM和7.86cM.利用获得的分子标记对其F3进行了验证,分子标记与抗性鉴定结果具有较高的一致性.【总页数】4页(P195-198)【作者】侯慧敏;廖伯寿;雷永;任小平;王圣玉;李栋;姜慧芳;黄家权;陈本银【作者单位】中国农业科学院油料作物研究所,湖北,武汉,430062;中国农业科学院油料作物研究所,湖北,武汉,430062;中国农业科学院油料作物研究所,湖北,武汉,430062;中国农业科学院油料作物研究所,湖北,武汉,430062;中国农业科学院油料作物研究所,湖北,武汉,430062;中国农业科学院油料作物研究所,湖北,武汉,430062;中国农业科学院油料作物研究所,湖北,武汉,430062;中国农业科学院油料作物研究所,湖北,武汉,430062;中国农业科学院油料作物研究所,湖北,武汉,430062【正文语种】中文【中图分类】S435.652【相关文献】1.SSR标记与花生青枯病、锈病抗性的相关性研究 [J], 洪彦彬;温世杰;钟旎;李杏瑜;朱方何;梁炫强2.花生种间杂交衍生系对晚期叶斑病和锈病的抗性组成和在叶部病害抗性育种中的重要性 [J], SangamLalDwived;SureshPande;邱敦莲3.花生锈病和晚斑病抗性筛选方法 [J], Subra.,P;苗华荣4.花生晚斑病抗性AFLP标记 [J], 夏友霖;廖伯寿;李加纳;雷永;姜慧芳;崔富华;曾孝平5.花生黄曲霉侵染抗性的AFLP标记 [J], 雷永;廖伯寿;王圣玉;李栋;姜慧芳因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

花生FAD2基因CRISPRCas9多靶点敲除载体构建

花生FAD2基因CRISPR/Cas9多靶点敲除载体构建作者：李柯赵昆昆宁龙龙马倩李忠峰马兴立张幸果殷冬梅来源：《山东农业科学》2019年第09期摘要：ω-6脂肪酸脱氢酶控制花生中油酸向亚油酸的转化，该酶由AhFAD2基因编码。

为了研究AhFAD2基因的功能，本研究根据前期已经克隆得到的AhFAD2基因序列，设计了gRNA前导序列，并构建了CRISPR/Cas9基因编辑载体，通过双酶切和Sanger测序确定载体构建成功。

AhFAD2基因CRISPR/Cas9载体的构建为接下来的遗传转化及研究该基因的功能奠定了基础。

关键词：花生;FAD2;CRISPR/Cas9;基因敲除中图分类号：S565.2：Q782 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2019）09-0056-08Construction of CRISPR/Cas9 Multi-TargetKnockout Vector of FAD2 Gene in PeanutLi Ke， Zhao Kunkun， Ning Longlong， Ma Qian， Li Zhongfeng， Ma Xingli， Zhang Xingguo， Yin Dongmei（College of Agronomy， Henan Agricultural University， Zhengzhou 450002， China）Abstract The omega-6 fatty acid dehydrogenase controls the conversion of oleic acid into linoleic acid in peanut， which is encoded by the AhFAD2 gene. In order to research the function of AhFAD2gene， the gRNA leader sequence was designed based on the sequence of AhFAD2 gene cloned in previous stage， and the CRISPR/Cas9 gene editing vector was constructed in this study. The vector was successfully constructed after determined by double enzyme digestion and Sanger sequencing. The construction of AhFAD2 gene CRISPR/Cas9 vector laid foundations for the subsequent genetic transformation and function study of the gene.Keywords Peanut; FAD2; CRISPR/Cas9; Gene knockout基因编辑技术是利用DNA断裂及其修复机制[1]，使其产生碱基的突变、DNA片段的缺失和插入等现象，达到使基因不能正常行使功能或改变其功能的目的。

花生FAD2基因RNAi载体转化及转基因籽粒脂肪酸分析

2008年9月2008,30(3):290-293中国油料作物学报Chinese journal of o il crop sciences花生FAD 2基因RNA i 载体转化及转基因籽粒脂肪酸分析黄冰艳,张新友3,苗利娟,严　玫,海　燕,易明林,徐　静,陈占宽(河南省农作物新品种重点实验室,河南郑州450002) 摘要:在构建了以花生△12脂肪酸去饱和酶(FAD 2)基因自身启动子驱动、有内含子间隔的该基因编码序列反向重复片段的RNA 干扰载体的基础上,对上述干扰载体进行了农杆菌介导的花生胚小叶的遗传转化,以期特异调控花生籽粒中油酸、亚油酸含量。

在2个受体品种中获得105株抗性再生植株,用两对引物对其进行了PCR 扩增,其中32株初步证实为转基因植株。

采用近红外分析仪对转基因T 1籽粒油酸和亚油酸含量的检测结果表明,转基因株系内油酸/亚油酸比值的变异高于对照,多数转基因株系油酸亚油酸比值平均数也显著高于对照。

关键词:花生;FAD 2基因;RNA 干扰;遗传转化;油酸;亚油酸中图分类号:S565.203 文献标识码:A 文章编号:1007-9084(2008)03-0290-04RNA i tran sfor ma ti on of Ah FAD 2gene and fa tty ac i d ana lysis of tran sgen i c seedsHUANG B ing -yan,Z HANG Xin -you 3,M I A O L i -juan,Y AN Mei,HA I Yan,YIM ing -lin,XU J ing,CHE N Zhan -kuan(Henan P rovincial Key L abora tory for C rop I m prove m ent,Z hengzhou 450002,China )Abstract :An RNA i vect or f or peanut FAD 2gene can be activated by its own p r omoter and containing its in 2verted repeat coding sequence frag ments s p liced by an intr on .This gene was transfor med int o leaflet fr om ger m ina 2ting peanut seeds by the mediati on of A gribacterium in order t o mani pulate the content of oleic acid and linoleic acid in the seeds s pecifically .A t otal of 105p lants t olerant t o PPT were regenerated fr om t w o reci p ient cultivars,in which 32p lants were confir med by PCR t o be tansgenic p lants .Every seed p r oduced by the transgenic p lants was tested for its oleic and linoleic content by I nfratec 1255Food&Feed Analyzer .It was shown that the variati on of oleic /lin 2oleic rati o (O /L )within transgenic p lants were greater than that within the wild type .T -test revealed that the av 2erage O /L values of seeds in most transgenic lines were significantly higher than that of the wild type,i m p lying the efficiency of RNA i vect or .Key words :A rachis hypogaea L.;FAD 2gene;RNA interference;Genetic transf or mati on;O leic acid;L inoleic acid收稿日期:2008203203基金项目:国家863计划(2006AA10A114)、国家科技支撑计划(2006BAD01A04)作者简介:黄冰艳(1965-),女,河南新乡人,副研究员,硕士,主要从事作物细胞和基因工程研究。

实验推荐分子标记技术AFLP

实验推荐分子标记技术AFLP 引言：分子标记技术是现代遗传学和分子生物学研究中不可或缺的工具之一。

由于其高度多态性和高分辨率的特点，AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphism，扩增片段长度多态性）技术在种质资源评价、基因组构建和进化生态学研究等领域得到广泛应用。

本文将介绍AFLP 技术的基本原理、实验步骤及数据分析方法，旨在为研究人员提供一种高效、准确的分子标记技术。

一、AFLP技术的原理AFLP技术利用限制性内切酶对基因组DNA进行特异性切割，然后通过PCR扩增和电泳分离等步骤，获得多态性的DNA序列。

其原理流程如下：1. DNA提取：从不同样本（如植物、微生物等）中提取总DNA，保证所需的DNA质量和浓度。

2. 酶切反应：选择适当的限制性内切酶对DNA进行切割，生成特定的DNA片段。

3. 适配体连接：将适配体序列连接到DNA片段的末端，使其成为PCR扩增的起始模板。

4. 扩增反应：利用引物对连接的DNA片段进行PCR扩增，生成大量的AFLP产物。

5. 电泳分离：将扩增的AFLP产物进行电泳分离，根据片段的大小而呈现不同的迁移距离。

6. 成像和数据分析：利用凝胶图像获取AFLP分析结果，并进行数据分析和解读。

二、AFLP实验步骤AFLP实验的具体步骤如下：1. 样本准备：选择适当数量的样本，根据研究目的确定样品的种类和数量，并进行相应的预处理。

2. DNA提取：采用合适的DNA提取方法提取样本中的总DNA，并进行质量和浓度检测。

3. 酶切反应：选择合适的限制性内切酶对DNA进行酶切反应，生成DNA片段。

4. 适配体连接：将适配体序列连接到DNA片段末端，以便进行扩增反应。

5. 扩增反应：利用PCR技术对连接的DNA片段进行扩增，生成大量的AFLP产物。

6. 电泳分离：将扩增的AFLP产物进行凝胶电泳分离，根据片段大小进行排序，形成AFLP图谱。

7. 图谱分析：根据AFLP图谱进行数据分析，解读样品之间的遗传关系。

山东花生主栽品种AFLP指纹图谱的构建

ｍｏｇ１ｅｎｔｃｌｉａｓ６ａｄｒｍｐｉｉｄｂｈｒｍｅｏｉａｉｎ。５ｍｏｇｔｅｗｅｅｐｌｍｏｎ０ｐａｕｕｔｖｒ．１９ｂｎｓｗｅｅａｌｅｙｔｅ９ｐｉｒｃｍｂｎｔｏｓ５ａｎｈｍｒｏｙｒｆ
＊收稿日期ｔ０６０ —２２０－１１
基金项目；青岛市自然科学基金（３ｊ一０）０ —２ｚ５和国家科技部重大基础研究前期项目（０２ｃ０２０２０ｃｅ３０）
作者简介；李双铃（９卜）男。１７，湖南澧县人，山东省花生研究所助理研究员，大学，圭要从事花生科研和管理工作。
组合共扩增产生１９条带，中５６其５条为多态性的，其多态性带比率为３．４２５％。至少两对引物组合的配
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AFLP技术的基本原理

AFLP技术的基本原理
AFLP 技术的基本原理与实验方法
AFLP 技术的基本原理:
AFLP 技术是一项新的分子标记技术，其原理是：基因组DNA经过二种酶不同的限制性内切酶酶切后，产生粘性末端，再使用连接酶将人工合成的双链接头连接在酶切位点的粘性末端。

接头一端具有与内切酶同样的识别粘性末端，互补连接后成为DNA模板进行预扩增。

接头和与接头相邻的酶切片断的几个碱基序列作为引物的结合位点。

引物由3部分组成: ①核心碱基序列，该碱基序列与人工接头互补；②特异性酶切序列；③引物3’端选择性碱基。

选择性碱基延伸到酶切片段区，这样就只有那些两端序列能与选择碱基配对的限制性酶切片段被扩增。

另外，通过选择在末端分别添加了1～3个选择性核苷酸的不同引物，可以达到选择扩增的目的。

这些选择性核苷酸使得引物选择性地识别具有特异配对序列的内切酶酶切片段。

并与之结合，实现特异性扩增。

实验方法:
(1)DNA 酶切
AFLP技术成功的关键在于DNA的充分酶切,所以对模板质量要求较高,在DNA完全溶解后利用紫外分光光度仪测定DNA浓度，将DNA 浓度用双蒸水调整到50ng/ul,应避免其他DNA污染和抑制物质的存在。

表1：E-M酶切体系
表2：P-M酶切体系
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山东花生主栽品种AFLP指纹图谱的构建

山东花生主栽品种AFLP指纹图谱的构建
李双铃;任艳;陶海腾;禹山林;袁美
【期刊名称】《花生学报》
【年(卷),期】2006(35)1
【摘要】利用MseⅠ和EcoRⅠ酶切和9对引物组合对10个山东花生主栽品种进行AFLP分析, 9对引物组合共扩增产生169条带,其中55条为多态性的,其多态性带比率为32.54%.至少两对引物组合的配合如E-ACT/M-CAA//E-AAG/M-CAC 和E-ACC/M-CAA//E-AAG/M-CAC可将这10个品种完全区分开.
【总页数】4页(P18-21)
【作者】李双铃;任艳;陶海腾;禹山林;袁美
【作者单位】山东省花生研究所,山东,青岛,266100;山东省花生研究所,山东,青岛,266100;山东省花生研究所,山东,青岛,266100;山东省花生研究所,山东,青
岛,266100;山东省花生研究所,山东,青岛,266100
【正文语种】中文
【中图分类】Q812;S565.203
【相关文献】
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AFLP实验操作指南

AFLP实验操作指南AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphism）是一种基因组DNA的指纹分析技术，通过PCR扩增DNA片段，并利用限制性内切酶消化DNA，然后使用特异引物扩增消化后的DNA片段，最后使用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析扩增产物的长度差异，从而得到样品间的遗传多样性信息。

一、实验前准备1.获得研究对象的DNA样品。

2.购买AFLP实验所需的试剂和设备，包括PCR试剂盒、限制性内切酶、DNA聚合酶、聚丙烯酰胺凝胶电泳设备等。

3.根据实验需要设计合适的引物序列并订购。

二、DNA提取1.根据样品的特点选择合适的DNA提取方法，如CTAB法、酚/氯仿法等。

2.提取的DNA需经过质量检测，确保浓度和纯度。

三、限制性内切酶消化1.根据实验需要选择适当的限制性内切酶，并遵循其使用说明书中的操作要求。

2.准备两个PCR管，一个用于对照组胶样品，另一个用于实验组样品。

3.在每个PCR管中分别加入限制性内切酶、DNA样品、缓冲液和适量的水，混匀后进行酶切反应，酶切时间和温度根据限制性内切酶的要求进行调整。

四、连接接头的制备和连接反应1.根据实验需要设计并合成合适的连接接头，接头一般包括PCR引物序列和一段固定的序列。

2.制备连接反应的混合液，包括连接接头、连接酶、连接缓冲液和适量的水，混匀后加入限制性内切酶消化产物。

3.进行连接反应，反应温度和时间根据连接酶的要求进行调整。

4.连接反应后，可进行酶切反应以去除未连接的连接接头。

五、PCR扩增1.准备两组PCR反应体系，一组为对照组，另一组为实验组。

2.根据实验需要选取合适的扩增引物，对每个引物序列进行扩增反应。

3.准备PCR反应体系，包括PCR引物、扩增缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶和适量的水。

4.进行PCR扩增反应，反应温度和周期根据引物的要求进行调整。

5.扩增产物可以经过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测，或者通过测量DNA浓度进行定量分析。

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文章编号:100224093(2008)0120007207花生FA D22RNAi载体基因A FL P标记的克隆及序列分析3张宁洁1,2,高国庆2,熊发前2(1.广西大学,广西南宁530003;2.广西农业科学院生物实验室,广西南宁530003)摘要:以花生高油酸品种Sunolic95R和低油酸品种汕油162杂交组合的F1为试验材料,采用AFL P分子标记,用100对AFL P引物筛选出20个与△122脂肪酸脱氢酶2RNAi载体基因遗传连锁距离为3.87～8.91cm的差异片段,并回收纯化、克隆测序及NCBI上进行序列比对,最终获得了5个FA D22RNAi载体基因的全序列(长度为589～763bp),通过分析得出:所获得的5个FA D22RNAi载体基因的遗传连锁距离为3.87～6.59cm,序列间同源性达到88%～97%,与G enBank中已知的FA D22RNAi载体基因序列相似性均达到85%以上,分别包含一个起始密码子与一个终止密码子,结果表明本试验采用AFL P技术获得的5个序列均为△122脂肪酸脱氢酶2RNAi载体基因。

关键词:花生;油酸;FA D22RNAi载体;序列分析中图分类号:S565.202.4文献标识码:AM o l e c ul a r Cl o n i n g a n d Se q ue n c e A n a l y s i s o f△122f a t t y A c i dD e sa t ur a s e2R N A i Ve c t o r Ba s e d A F L P i n P e a n utZ H A N G Ning2jie1.2,GA O Guo2qing2,XION G Fa2qian2(1.T he U ni versi t y of Guan g x i,N anni n g530003,Chi na;2.T he B i ol o g y L aborator yof Gu an g x i A ca dem y of A g ricul t u ral S cience,N anni n g530003,Chi na)Abstract:The F1of high oleic acid Sunolic95R and lo w oleic acid San162was used as experi metal material.Nearly o ne hundred of p ri mer s are boltinged wit h A FL P.We o btained t went y A FL P mar k2 ers which have labeled bet ween3.87cm and8.91cm wit h△122fat t y acid desat urase2RN Ai vecto r.Five sequences are o btained after reco ver,iso genic,clo ne and measure and were co mpared by blast n in t he GenBank.The analytic result sho wed t he five sequence were labeled bet ween3.87cm and6.59cm.t he identit y a mo ng t hem was88%～97%and abo ve87%wit h cited sequences.These analyses revealed t he o btained sequence were△122fat t y acid desat urase2RN Ai vector.K ey words:peanut;oleic acid;FA D22RN Ai vector;sequence analysis 花生脂肪酸中的油酸具有重要医疗保健功能,它能降低有害胆固醇、减缓动脉粥样硬化、预防冠心病等心血管疾病的发生等,而亚油酸为多不饱和脂肪酸,虽能降低有害胆固醇但也能降低有益胆固醇的含量,因此油酸与亚油酸比值的高低成为判断花生油品质是否优良的一个主要标准,而控制花生高油酸性状的逻辑候选基因已确定为FA D2(存在植物内质网和叶绿体中)[1,2],它　花生学报　2008,37(1):7～13　J ou rnal of Peanut S cience,Vol.37,No.1,20083收稿日期:2008201206基金项目:广西自然科学基金项目(桂科自0342003)作者简介:张宁洁(19762),女,贵州黔西人,广西大学作物遗传育种专业在读硕士,主要从事花生脂肪酸的分子研究。

编码产生多聚不饱和脂肪酸的关键酶-油酸脱氢酶(EC1.3.1.35,12酰基222油酰基2s n2甘油232磷酸胆碱脱氢酶),是亚油酸合成的关键酶,能催化油酸(18:1)脱去第12碳位上的氢形成亚油酸(18∶2)[3～5],因此,阻止或减缓该酶基因的表达可控制后续的脱饱和过程,减少亚油酸的形成。

花生△122脂肪酸去饱和酶基因的RNA i载体可抑制对该酶基因的表达,在花生中转录,形成发夹RNA(hp RNA),发夹臂形成的双链RNA (ds RNA)诱导花生的内源同源RNA的降解,从而调控花生脂肪酸代谢途径[6～8],降低花生种子亚油酸含量,提高油酸含量及油酸/亚油酸比值。

目前以分子标记为基础进行目的基因的克隆及序列分析的相关报道甚少,本文采用步骤较为繁锁的AFLP技术,经过克隆、测序、序列比对筛选到花生中5个与F A D2紧密连锁的△122脂肪酸去饱和酶基因的RNA i载体基因,得到全长c DNA 序列并进行核苷酸序列分析,以期为将复杂的AFLP标记转化成稳定简单的SCAR标记和高油酸花生育种提供基础。

1　材料与方法1.1　试验材料花生品种为Sunolic95R(美国品种,高油酸)和汕油162(广西地方品种,低油酸)杂交F1后代的高低油酸个体,取自广西农科院试验田。

ECORⅠ、MseⅠ酶切酶、T4DNA连接酶、A FL P 随机引物、dN TP、Taq DNA聚合酶、λHindⅢDNA Marker、PMD182T载体均购自大连Ta Ka2 Ra公司,Silver Beads DNA胶回收试剂盒购自上海Sango n公司,CBS2Scientific Company,Inc.的DASG2500233型电泳槽及配套的电泳仪。

1.2　试验方法1.2.1　花生叶片总DNA的提取及纯化提取:采用改良CTAB法,取1.5g叶片于液氮中研磨成粉,加入3.8mL预热的C TAB提取液(2% CTAB,100mol/L Tris-HCl,20mol/L ED TA, 1.4M NaCl,2%PV P)和15μLβ-巯基乙醇,65℃水浴2h,晃摇3次;加4.0mL氯仿/异戊醇(24∶1),40℃、12000×g离心10mim,取上清液,加入1/10体积的10%C TAB,65℃水浴10min,重复抽提2～3次;上清液中加入0.7倍体积的预冷异丙醇,-20℃放置30min,移液枪轻挑絮状物,75%酒精洗涤两次。

纯化:1mL含RNAa的TE溶解DNA,37℃水浴1h;加等体积的酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1),混匀,40℃、12000×g离心10mim;取上清液,加1/10体积的3mol/L NaAC和2倍体积的预冷无水乙醇混匀,-20℃放置30min;弃上清液, 75%的酒精洗沉淀,倒立放置5～8h,充分干燥, 200μL TE缓冲液溶解DNA,-20℃保存备用。

1.2.2　A FL P操作流程 (1)双酶切。

反应体系:8.0μL基因组DNA(25ng/μL),2.0μL10×buffer(r+/T ango T M),1.0μL EcoRⅠ(10U/μL), 0.5μL MseⅠ(10U/μL),加dd H2O至20μL。

4500×g稍离心混匀,在37℃水浴保温8h,转至65℃保温5h。

80℃保温20min终止酶切反应。

(2)连接。

接头连接反应体系:10.0μL酶切DNA产物,2.0μL10×buffer T4DNA ligase(含ATP), 1.0μL ECORⅠadaptor pairs(5p mol/μL), 1.0μL MseⅠadaptor pairs(50p mol/μL), 0.5μL T4DNA ligase(5U/μL),加dd H2O至20μL。

4500×g稍离心混匀,16℃保温8～16h, 65℃10min终止连接反应。

(3)预扩增。

4.0μL 稀释连结产物DNA,2.0μL10×Taq buffer, 2.0μL dN TP(2.5mol/L),3.0μL Eco RIPrimer (10ng/μL),2.0μL MseIPrimer(10ng/μL), 0.2μL Taq polymerase(5U/μL),加dd H2O至20μL。

94℃预变性5min,94℃变性30s,56℃退火30s,72℃延伸1min,30个循环,72℃再延伸5min,4℃保存。

(4)选择性扩增。

选择性扩增除模板换成稀释预扩增产物,引物换成A FL P 通用引物外,其余反应物同预扩增反应体系, 94℃5min,94℃30s,65℃30s,72℃60s,35个循环(前12个循环每循环降0.7℃,最后退火温度保持56.6℃),72℃再延伸5min,4℃保存。

(5)聚丙烯酰胺变性胶的制作。

洗玻璃板-玻璃板的硅化-装玻璃板-配胶:(6%工作胶溶液配制如下:水17.0mL,尿素22.5g,40%丙烯酰胺7.5mL)—灌胶—预电泳—扩增产物的变性及上样—电泳—银染(脱色,水洗,染色,显影,终止)—干燥及保存[9]。

1.2.3　克隆测序在聚丙烯酰胺变性胶上割取高低油酸个体有差异的片段,TE溶解24h,煮8 花　生　学　报 37卷　沸10m i n ,离心取上清进行PCR 扩增,利用DNA 快速纯化回收试剂盒回收PCR 产物,与克隆载体P MD18-T 连接。

按Sa mbr ook [6]的方法制备E.coil DH10B 感受态细胞并进行转化,取100μL 转化产物涂布于含10μL 的I P T G 和40μL 的X -gal 的LB 平板上,37℃倒置培养12～16h 。

挑选培养基上的白色菌落,接种于含Amp 的LB 液体培养基上于37℃摇床上培养12h ,穿刺培养15h 送于上海鼎安生物技术有限公司进行测序。