pMTBiPV5-His C昆虫表达载体说明

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pAc5.1a昆虫表达载体说明

pAc5.1a编号载体名称北京华越洋生物KCVECT126 pAc5.1apAc5.1a载体基本信息载体名称: pAc5.1a质粒类型: 昆虫细胞表达载体高拷贝/低拷贝: --启动子: --克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶载体大小: --5' 测序引物及序列: --3' 测序引物及序列: --载体标签: --载体抗性: --筛选标记: --备注: --稳定性: --组成型: --病毒/非病毒: --pAc5.1a其他昆虫表达载体：pMT/BioEase-DEST pVL1392 pVL1393 pXINSECT-DEST39 pXINSECT-DEST38 pBacPAK9 pBacPAK8 pIB/V5-His-TOPO pIEX/Bac-1 pFastBacHT B pFastBacHT A pFastBac1pMT/V5-His-TOPO pMT/BiP/V5-His A pCoHygro pAc5.1/V5-His C pAc5.1-V5-His A pAc5/V5-HisA pAc5-V5-HisB pAc5-V5-HisC pCoBlast pAc5.1/V5-His B pIZ/V5-His pIB/V5-HispIZT/V5-His pMIB/V5-His C pMIB/V5-His A pMT/BiP/V5-His C pMT/BiP/V5-His B pIEx/Bac-4 pIEx/Bac-3 pIEXBac-c-EGFP-3 pIEXBac-c-EGFP-1 pIEXBac-c-EGFP-4 pAc5.1B-EGFP pBlueBacHis2 A pBlueBacHis2 C pBlueBacHis2 B pFastBacHT C pMT-Bip-V5-HisA pFBDM pUCDM pFastBac Dual pMIB/V5-His B pMT/V5-His C pMT/V5-His B pMT/V5-His A pAcGP67ApAc5.1b pAc5.1a pVL1392-XyIE control vector pFastBac-c-His-TEV pFastBac-N-GST-TEV pFastBacI-Gus pFastBacHT-CAT pBADZ-His6Cre。

pcDNA4 myc-His C哺乳动物表达载体说明

pcDNA4/myc-His C编号载体名称北京华越洋生物VECT6123 pcDNA4/myc-‐His C pcDNA4/myc-‐His C载体基本信息载体名称: pcDNA4/myc-His C质粒类型: 哺乳动物表达载体；cDNA表达载体高拷贝/低拷贝: 高拷贝克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶启动子: CMV载体大小: 5071 bp5' 测序引物及序列: T7 Forward: 5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’ 3' 测序引物及序列: BGH Reverse: 5-TAGAAGGCACAGTCGAGG-3 载体标签: His Tag (C-端）, c-Myc Epitope Tag（C-端）载体抗性: 氨苄青霉素筛选标记: Zeocin克隆菌株: TOP10F´, DH5a, JM109, TOP10宿主细胞（系）: 常规细胞系，如293、Hela等备注: pcDNA4/myc-His C 载体是哺乳动物表达载体，适用于cDNA的表达与克隆；CMV启动子驱动目的基因的高水平表达；pcDNA4/myc-His A,B,C的区别仅在于多克隆位点处。

稳定性: 瞬表达或稳表达组成型/诱导型: 组成型病毒/非病毒: 非病毒pcDNA4/myc-‐His C载体质粒图谱和多克隆位点信息pcDNA4/myc-‐His C载体描述pcDNA4/myc-His A, B, and C are 5.1 kb vectors designed for overproduction of recombinant proteins in mammalian cell lines. Features of the vectors allow purification and detection of expressed proteins (see pages 11-12 for more information). High-level stable and transient expression can be carried out in most mammalian cells. The vectors contain the following elements:Human cytomegalovirus immediate-early (CMV) promoter for high-level expression in a wide range of mammalian cellsThree reading frames to facilitate in-frame cloning with a C-terminal peptide encoding the myc (c-myc) epitope and a polyhistidine (6xHis) metal-binding tagZeocin resistance gene for selection of stable cell lines (Mulsant et al., 1988) (see page 14 for more information).Episomal replication in cell lines that are latently infected with SV40 or that express the SV40 large T antigen (e.g., COS7).The control plasmid, pcDNA4/myc-His/lacZ is included for use as a positive control for transfection, expression, and detection in the cell line of choice.实验流程：Use the following outline to clone and express your gene of interest in pcDNA4/myc-His:1.Consult the multiple cloning sites described on pages 3-4 to determine which vector (A, B, or C) to use for cloning your gene in frame with the C-terminal myc epitope and the polyhistidine tag.2.Ligate your insert into the appropriate vector and transform into E. coli. Select transformants on 50 to 100 μg/mL ampicillin or 25 to 50g/mL Zeocin in Low Salt LB. For more information.3.Analyze your transformants for the presence of insert by restriction digestion.4.Select a transformant with the correct restriction pattern and use sequencing to confirm that your gene is cloned in-frame with the C-terminal peptide.5.Transfect your construct into the cell line of choice using your own method of transfection. Generate a stable cell line, if desired.6.Test for expression of your recombinant gene by western blot analysis or functional assay. For antibodies to the myc epitope or the C-terminal polyhistidine tag.7.To purify your recombinant protein, you may use metal-chelating resin such as ProBond. ProBond resin is available separatelypcDNA4/myc-‐His C载体序列ORIGIN1 GACGGATCGG GAGATCTCCC GATCCCCTAT GGTCGACTCT CAGTACAATC TGCTCTGATG61 CCGCATAGTT AAGCCAGTAT CTGCTCCCTG CTTGTGTGTT GGAGGTCGCT GAGTAGTGCG 121 CGAGCAAAAT TTAAGCTACA ACAAGGCAAG GCTTGACCGA CAATTGCATG AAGAATCTGC 181 TTAGGGTTAG GCGTTTTGCG CTGCTTCGCG ATGTACGGGC CAGATATACG CGTTGACATT 241 GATTATTGAC TAGTTATTAA TAGTAATCAA TTACGGGGTC ATTAGTTCAT AGCCCATATA 301 TGGAGTTCCG CGTTACATAA CTTACGGTAA ATGGCCCGCC TGGCTGACCG CCCAACGACC 361 CCCGCCCATT GACGTCAATA ATGACGTATG TTCCCATAGT AACGCCAATA GGGACTTTCC 421 ATTGACGTCA ATGGGTGGAC TATTTACGGT AAACTGCCCA CTTGGCAGTA CATCAAGTGT 481 ATCATATGCC AAGTACGCCC CCTATTGACG TCAATGACGG TAAATGGCCC GCCTGGCATT 541 ATGCCCAGTA CATGACCTTA TGGGACTTTC CTACTTGGCA GTACATCTAC GTATTAGTCA 601 TCGCTATTAC CATGGTGATG CGGTTTTGGC AGTACATCAA TGGGCGTGGA TAGCGGTTTG 661 ACTCACGGGG ATTTCCAAGT CTCCACCCCA TTGACGTCAA TGGGAGTTTG TTTTGGCACC 721 AAAATCAACG GGACTTTCCA AAATGTCGTA ACAACTCCGC CCCATTGACG CAAATGGGCG 781 GTAGGCGTGT ACGGTGGGAG GTCTATATAA GCAGAGCTCT CTGGCTAACT AGAGAACCCA 841 CTGCTTACTG GCTTATCGAA ATTAATACGA CTCACTATAG GGAGACCCAA GCTGGCTAGT 901 TAAGCTTGGT ACCGAGCTCG GATCCACTAG TCCAGTGTGG TGGAATTCTG CAGATATCCA 961 GCACAGTGGC GGCCGCTCGA GGTCACCCAT TCGAACAAAA ACTCATCTCA GAAGAGGATC 1021 TGAATATGCA TACCGGTCAT CATCACCATC ACCATTGAGT TTAAACCCGC TGATCAGCCT 1081 CGACTGTGCC TTCTAGTTGC CAGCCATCTG TTGTTTGCCC CTCCCCCGTG CCTTCCTTGA 1141 CCCTGGAAGG TGCCACTCCC ACTGTCCTTT CCTAATAAAA TGAGGAAATT GCATCGCATT 1201 GTCTGAGTAG GTGTCATTCT ATTCTGGGGG GTGGGGTGGG GCAGGACAGC AAGGGGGAGG 1261 ATTGGGAAGA CAATAGCAGG CATGCTGGGG ATGCGGTGGG CTCTATGGCT TCTGAGGCGG 1321 AAAGAACCAG CTGGGGCTCT AGGGGGTATC CCCACGCGCC CTGTAGCGGC GCATTAAGCG 1381 CGGCGGGTGT GGTGGTTACG CGCAGCGTGA CCGCTACACT TGCCAGCGCC CTAGCGCCCG 1441 CTCCTTTCGC TTTCTTCCCT TCCTTTCTCG CCACGTTCGC CGGCTTTCCC CGTCAAGCTC 1501 TAAATCGGGG CATCCCTTTA GGGTTCCGAT TTAGTGCTTT ACGGCACCTC GACCCCAAAA 1561 AACTTGATTA GGGTGATGGT TCACGTAGTG GGCCATCGCC CTGATAGACG GTTTTTCGCC 1621 CTTTGACGTT GGAGTCCACG TTCTTTAATA GTGGACTCTT GTTCCAAACT GGAACAACAC 1681 TCAACCCTAT CTCGGTCTAT TCTTTTGATT TATAAGGGAT TTTGGGGATT TCGGCCTATT 1741 GGTTAAAAAA TGAGCTGATT TAACAAAAAT TTAACGCGAA TTAATTCTGT GGAATGTGTG 1801 TCAGTTAGGG TGTGGAAAGT CCCCAGGCTC CCCAGGCAGG CAGAAGTATG CAAAGCATGC 1861 ATCTCAATTA GTCAGCAACC AGGTGTGGAA AGTCCCCAGG CTCCCCAGCA GGCAGAAGTA 1921 TGCAAAGCAT GCATCTCAAT TAGTCAGCAA CCATAGTCCC GCCCCTAACT CCGCCCATCC 1981 CGCCCCTAAC TCCGCCCAGT TCCGCCCATT CTCCGCCCCA TGGCTGACTA ATTTTTTTTA 2041 TTTATGCAGA GGCCGAGGCC GCCTCTGCCT CTGAGCTATT CCAGAAGTAG TGAGGAGGCT 2101 TTTTTGGAGG CCTAGGCTTT TGCAAAAAGC TCCCGGGAGC TTGTATATCC ATTTTCGGAT 2161 CTGATCAGCA CGTGTTGACA ATTAATCATC GGCATAGTAT ATCGGCATAG TATAATACGA 2221 CAAGGTGAGG AACTAAACCA TGGCCAAGTT GACCAGTGCC GTTCCGGTGC TCACCGCGCG 2281 CGACGTCGCC GGAGCGGTCG AGTTCTGGAC CGACCGGCTC GGGTTCTCCC GGGACTTCGT 2341 GGAGGACGAC TTCGCCGGTG TGGTCCGGGA CGACGTGACC CTGTTCATCA GCGCGGTCCA 2401 GGACCAGGTG GTGCCGGACA ACACCCTGGC CTGGGTGTGG GTGCGCGGCC TGGACGAGCT 2461 GTACGCCGAG TGGTCGGAGG TCGTGTCCAC GAACTTCCGG GACGCCTCCG GGCCGGCCAT 2521 GACCGAGATC GGCGAGCAGC CGTGGGGGCG GGAGTTCGCC CTGCGCGACC CGGCCGGCAA 2581 CTGCGTGCAC TTCGTGGCCG AGGAGCAGGA CTGACACGTG CTACGAGATT TCGATTCCAC 2641 CGCCGCCTTC TATGAAAGGT TGGGCTTCGG AATCGTTTTC CGGGACGCCG GCTGGATGAT2701 CCTCCAGCGC GGGGATCTCA TGCTGGAGTT CTTCGCCCAC CCCAACTTGT TTATTGCAGC 2761 TTATAATGGT TACAAATAAA GCAATAGCAT CACAAATTTC ACAAATAAAG CATTTTTTTC 2821 ACTGCATTCT AGTTGTGGTT TGTCCAAACT CATCAATGTA TCTTATCATG TCTGTATACC 2881 GTCGACCTCT AGCTAGAGCT TGGCGTAATC ATGGTCATAG CTGTTTCCTG TGTGAAATTG 2941 TTATCCGCTC ACAATTCCAC ACAACATACG AGCCGGAAGC ATAAAGTGTA AAGCCTGGGG 3001 TGCCTAATGA GTGAGCTAAC TCACATTAAT TGCGTTGCGC TCACTGCCCG CTTTCCAGTC 3061 GGGAAACCTG TCGTGCCAGC TGCATTAATG AATCGGCCAA CGCGCGGGGA GAGGCGGTTT 3121 GCGTATTGGG CGCTCTTCCG CTTCCTCGCT CACTGACTCG CTGCGCTCGG TCGTTCGGCT 3181 GCGGCGAGCG GTATCAGCTC ACTCAAAGGC GGTAATACGG TTATCCACAG AATCAGGGGA 3241 TAACGCAGGA AAGAACATGT GAGCAAAAGG CCAGCAAAAG GCCAGGAACC GTAAAAAGGC 3301 CGCGTTGCTG GCGTTTTTCC ATAGGCTCCG CCCCCCTGAC GAGCATCACA AAAATCGACG 3361 CTCAAGTCAG AGGTGGCGAA ACCCGACAGG ACTATAAAGA TACCAGGCGT TTCCCCCTGG 3421 AAGCTCCCTC GTGCGCTCTC CTGTTCCGAC CCTGCCGCTT ACCGGATACC TGTCCGCCTT 3481 TCTCCCTTCG GGAAGCGTGG CGCTTTCTCA ATGCTCACGC TGTAGGTATC TCAGTTCGGT 3541 GTAGGTCGTT CGCTCCAAGC TGGGCTGTGT GCACGAACCC CCCGTTCAGC CCGACCGCTG 3601 CGCCTTATCC GGTAACTATC GTCTTGAGTC CAACCCGGTA AGACACGACT TATCGCCACT 3661 GGCAGCAGCC ACTGGTAACA GGATTAGCAG AGCGAGGTAT GTAGGCGGTG CTACAGAGTT 3721 CTTGAAGTGG TGGCCTAACT ACGGCTACAC TAGAAGGACA GTATTTGGTA TCTGCGCTCT 3781 GCTGAAGCCA GTTACCTTCG GAAAAAGAGT TGGTAGCTCT TGATCCGGCA AACAAACCAC 3841 CGCTGGTAGC GGTGGTTTTT TTGTTTGCAA GCAGCAGATT ACGCGCAGAA AAAAAGGATC 3901 TCAAGAAGAT CCTTTGATCT TTTCTACGGG GTCTGACGCT CAGTGGAACG AAAACTCACG 3961 TTAAGGGATT TTGGTCATGA GATTATCAAA AAGGATCTTC ACCTAGATCC TTTTAAATTA 4021 AAAATGAAGT TTTAAATCAA TCTAAAGTAT ATATGAGTAA ACTTGGTCTG ACAGTTACCA 4081 ATGCTTAATC AGTGAGGCAC CTATCTCAGC GATCTGTCTA TTTCGTTCAT CCATAGTTGC 4141 CTGACTCCCC GTCGTGTAGA TAACTACGAT ACGGGAGGGC TTACCATCTG GCCCCAGTGC 4201 TGCAATGATA CCGCGAGACC CACGCTCACC GGCTCCAGAT TTATCAGCAA TAAACCAGCC 4261 AGCCGGAAGG GCCGAGCGCA GAAGTGGTCC TGCAACTTTA TCCGCCTCCA TCCAGTCTAT 4321 TAATTGTTGC CGGGAAGCTA GAGTAAGTAG TTCGCCAGTT AATAGTTTGC GCAACGTTGT 4381 TGCCATTGCT ACAGGCATCG TGGTGTCACG CTCGTCGTTT GGTATGGCTT CATTCAGCTC 4441 CGGTTCCCAA CGATCAAGGC GAGTTACATG ATCCCCCATG TTGTGCAAAA AAGCGGTTAG 4501 CTCCTTCGGT CCTCCGATCG TTGTCAGAAG TAAGTTGGCC GCAGTGTTAT CACTCATGGT 4561 TATGGCAGCA CTGCATAATT CTCTTACTGT CATGCCATCC GTAAGATGCT TTTCTGTGAC 4621 TGGTGAGTAC TCAACCAAGT CATTCTGAGA ATAGTGTATG CGGCGACCGA GTTGCTCTTG 4681 CCCGGCGTCA ATACGGGATA ATACCGCGCC ACATAGCAGA ACTTTAAAAG TGCTCATCAT 4741 TGGAAAACGT TCTTCGGGGC GAAAACTCTC AAGGATCTTA CCGCTGTTGA GATCCAGTTC 4801 GATGTAACCC ACTCGTGCAC CCAACTGATC TTCAGCATCT TTTACTTTCA CCAGCGTTTC 4861 TGGGTGAGCA AAAACAGGAA GGCAAAATGC CGCAAAAAAG GGAATAAGGG CGACACGGAA 4921 ATGTTGAATA CTCATACTCT TCCTTTTTCA ATATTATTGA AGCATTTATC AGGGTTATTG 4981 TCTCATGAGC GGATACATAT TTGAATGTAT TTAGAAAAAT AAACAAATAG GGGTTCCGCG 5041 CACATTTCCC CGAAAAGTGC CACCTGACGT C//其他哺乳动物表达载体：pCHO1.0 pBApo-CMV-Pur pOPRSVIpcDNA3.1/His C pcDNA5/FRT/V5-His-TOPO pREP4pcDNA3.1/His B pcDNA5/FRT/TO-TOPO pDual-GCpcDNA3.1/His A pcDNA5/TO pBK-RSVpIRESpuro3 pcDNA5/FRT/TO pBK-CMVpIRES2-EGFP pcDNA5/FRT pBI-CMV4pTT5 pFLAG-CMV2 pcDNA4/TO/Myc-His/LacZ pNFkB-DD-tdTomato pcDNA3.1/CT-GFP-TOPO pOPI3CATpBI-CMV5 pcDNA3.1/NT-GFP-TOPO pGene/V5-His B pSEAP2-Basic pOptiVEC-TOPO pSwitchpSEAP2-Control pCMV-MEKK1 pCMVLacIpBI-CMV3 pCMV-MEK1 pVgRxRpBI-CMV2 pCMV-PKA pINDpBI-CMV1 pcDNA6.2/nTC-Tag-DEST pTRE3G-LucpNFκB-MetLuc2-Reporter pcDNA6.2/cTC-Tag-DEST pTRE3GpCRE-MetLuc2-Reporter pcDNA3.2/V5/GW/D-TOPO pTRE2-hygropAcGFP1-Actin pcDNA6.2/V5/GW/D-TOPO pTRE-TightpAcGFP1-N In-Fusion Ready pcDNA6.2/nGeneBLAzer-GW/D-TOPO pTK-hygpAcGFP1-C3 pcDNA6.2/C-YFP-DEST pTet-OnpAcGFP1-C pcDNA6.2/cGeneBLAzer-DEST pTet-OffpAcGFP1-p53 pcDNA6/V5-His A pTet on advanced pAcGFP1-Mito pcDNA6/V5-His B pRevTREpAcGFP1-Mem pcDNA6/V5-His C pRevTet-OnpAcGFP1-Lam pcDNA6/myc-His C pRevTet-OffpAcGFP1-Golgi pcDNA6/myc-His A pCMV-Tet3GpAcGFP1-F pcDNA6/myc-His B pTRE2pAcGFP1-Hyg-C1 pcDNA6.2/nGeneBLAzer-DEST pBD-NF-κBpAsRed2-N1 pcDNA4/HisMax-TOPO pCMV-ADptdTomato-N1 pcDNA6.2/nLumio-DEST pCMV-BDpCMV-tdTomato pcDNA6.2/cLumio-DEST pBIND-Id ControlpCRE-DD-tdTomato pcDNA4/myc-His C pBINDpCMV-DsRed-Express2 pcDNA4/HisMax C pG5 luciferasepEF1α-tdTomato pcDNA4/HisMax A pACT-MyoDpCRE-hrGFP c-Flag pcDNA3 pACTptdTomato-C1 pcDNA4/HisMax B pCMV-SPORT6 pAsRed2-C1 pcDNA4/myc-His B pGL4.13pGL3-Promoter pcDNA4/myc-His A pGL4.19pGL3 basic pcDNA4/His C pGL4.26pAcGFP1-C2 pcDNA4/His B pGL4.20pAcGFP1-C1 pcDNA4/His A pGL4.29pAcGFP1-N3 pcDNA6/TR pGL4.30pAcGFP1-N2 pcDNA4/TO/Myc-His A pGL4.27pAcGFP1-N1 pcDNA4/TO pGL4.75pAcGFP1-C In-Fusion Ready pcDNA4/TO/Myc-His B pGL4.10pCRE-DD-AmCyan1 pcDNA4/TO/Myc-His C pGRN145pNFkB-DD-AmCyan1 pcDNA3.3-TOPO pSecTag2 A pDsRed2-Bid pBudCE4.1 pEBVHis B pDsRED2-Mito pFLAG-CMV-4 pEBVHis ApDD-AmCyan1 Reporter pFLAG-CMV-3 pCMV-Tag 3C pAmCyan1-N1 pFLAG-CMV-2 pCMV-Tag 3A pAmCyan1-C1 pFLAG-CMV-5a pCMV-Tag 3BpEF1α-IRES-DsRed-Express2 p3XFLAG-CMV-9 pCMV-Tag 5CpEF1α-DsRed-Monomer-N1 p3xFLAG-CMV-10 pCMV-Tag 5A pDsRED-Monomer-N1 p3XFLAG-CMV-8 pCMV-Tag 4A pDsRed-Express-N1 p3XFLAG-CMV-7.1 pCMV-Tag 5Bp3XFLAG-CMV-7 pDsRed-Monomer-N In-Fusion Ready pCMV-Tag 4B pDsRed-Express-C1 p3XFLAG-CMV-13 pCMV-Tag 2C pIRES2-ZsGreen1 p3XFLAG-CMV-14 pCMV-Tag 2B pDsRed-Express2-C1 plRES2-ZsGreen1 pCMV-Tag 2A pDsRed-Express2-N1 pBApo-EF1α-pur pCMV-LacZpEF1α-DsRed-Express2 pBApo-EF1α-neo pCMV-MycpIRES2-DsRed-Express pBApo-CMV pEF1α-IRES-AcGFP1 pIRES2-DsRed-Express2 pBApo-CMV-neo pEF1α-IRES-ZsGreen1 pIRES-hrGFP-1a pIRES-EGFP pEF1α-AcGFP1-N1 pIRESneo2 pIRESneo3 pIRES2-DsRed2 pIRESneo pDsRed-Monomer pIRES2-AcGFP1 pIREShyg3 pIRES。

贻贝足蛋白fp-5在大肠杆菌中的表达、修饰与功能分析

贻贝足蛋白fp-5在大肠杆菌中的表达、修饰与功能分析姚林;谢紫莎;王瑞;张鲁嘉;李莎
【期刊名称】《生物加工过程》
【年(卷),期】2024(22)1
【摘要】将地中海贻贝足蛋白fp-5与不同细菌来源的酪氨酸酶在大肠杆菌中共表达,通过体内修饰获得性能改善的贻贝足蛋白。

在对序列分析和密码子优化的基础上,分别构建包含酪氨酸酶与贻贝足蛋白基因的单载体和双载体共表达系统,以实现其在大肠杆菌中表达。

纯化后的蛋白通过NBT/Gly染色试验和酸-硼酸盐差异光谱法分析,表明fp-5发生了不同程度的羟基化修饰,其中fp-5与来源于多刺疣微菌(Verrucomicrobium spinosum)的酪氨酸酶(TyrVs)共表达得到的5-Vs质量浓度为18.6 mg/L,修饰率达到55.20%,黏附力约为未修饰fp-5的4.6倍。

与体外修饰贻贝足蛋白相比,TyrVs体内修饰得到的5-Vs具有广泛的羟基化水平以及优秀的附着力和黏附力,为生物医药等领域提供了一种有潜力的生物胶材料。

【总页数】8页(P25-32)
【作者】姚林;谢紫莎;王瑞;张鲁嘉;李莎
【作者单位】南京工业大学食品与轻工学院;南京工业大学材料化学工程国家重点实验室;华东师范大学化学与分子工程学院
【正文语种】中文
【中图分类】Q812
【相关文献】
1.人成骨蛋白—1成熟肽基因5‘端的修饰及其在大肠杆菌中的表达
2.蓝藻橙色类胡萝卜素蛋白的基因克隆及在大肠杆菌中的异源表达和功能分析
3.厚壳贻贝足丝盘黏附蛋白mcofp-3的重组真核表达
4.厚壳贻贝转凝蛋白类贝壳基质蛋白的重组表达与功能分析
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211126690_中国毛虾活性肽对免疫抑制小鼠免疫调节作用的影响

杨志艳，惠婷婷，祝宝华，等. 中国毛虾活性肽对免疫抑制小鼠免疫调节作用的影响[J]. 食品工业科技，2023，44（9）：380−386. doi:10.13386/j.issn1002-0306.2022080148YANG Zhiyan, HUI Tingting, ZHU Baohua, et al. Effects of Peptides from Acetes chinensis on Immunoregulation in Immunocompromised Mice[J]. Science and Technology of Food Industry, 2023, 44(9): 380−386. (in Chinese with English abstract).doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2022080148· 营养与保健 ·中国毛虾活性肽对免疫抑制小鼠免疫调节作用的影响杨志艳1，惠婷婷1，祝宝华1，徐晨晨1，李　燕1,2,3，李晓晖1,2,3,*（1.上海海洋大学食品学院，上海 201306；2.上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，上海 201306；3.农业部水产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室（上海），上海 201306）摘　要：本文以毛虾为原料，采用蛋白酶酶解获得毛虾活性肽，通过建立免疫抑制小鼠模型探究了毛虾活性肽对免疫抑制小鼠的免疫调节功能。

小鼠随机分为六组：正常对照组、模型组、阳性对照组以及低、中、高剂量组，其中剂量组分别灌胃0.25 g·kg −1 BW 、0.5 g·kg −1 BW 、1.0 g·kg −1 BW 毛虾活性肽。

结果表明，剂量组免疫抑制小鼠体重明显增加（P <0.05），免疫器官指数中的胸腺指数显著提高（P <0.05），此外，毛虾活性肽还促进了小鼠血清中免疫球蛋白（IgA 、IgG 和IgM ）以及细胞因子（IL-2、IL-6和TNF-α）水平的提升（P<0.05），外周血白细胞总数基本恢复至正常水平，NK 细胞活性也显著增强（P <0.05）。

pFastBac-c-His-TEV昆虫表达载体说明

pFastBac-c-His-TEV编号载体名称北京华越洋生物KCVECT154 pFastBac-‐c-‐His-‐TEVpFastBac-‐c-‐His-‐TEV载体基本信息载体名称: pFastBac-c-His-TEV质粒类型: 昆虫细胞表达载体高拷贝/低拷贝: --启动子: --克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶载体大小: --5' 测序引物及序列: --3' 测序引物及序列: --载体标签: --载体抗性: --筛选标记: --备注: --稳定性: --组成型: --病毒/非病毒: --其他昆虫表达载体：pMT/BioEase-DEST pVL1392 pVL1393 pXINSECT-DEST39 pXINSECT-DEST38 pBacPAK9 pBacPAK8 pIB/V5-His-TOPO pIEX/Bac-1 pFastBacHT B pFastBacHT A pFastBac1pMT/V5-His-TOPO pMT/BiP/V5-His A pCoHygro pAc5.1/V5-His C pAc5.1-V5-His A pAc5/V5-HisA pAc5-V5-HisB pAc5-V5-HisC pCoBlast pAc5.1/V5-His B pIZ/V5-His pIB/V5-HispIZT/V5-His pMIB/V5-His C pMIB/V5-His A pMT/BiP/V5-His C pMT/BiP/V5-His B pIEx/Bac-4 pIEx/Bac-3 pIEXBac-c-EGFP-3 pIEXBac-c-EGFP-1 pIEXBac-c-EGFP-4 pAc5.1B-EGFP pBlueBacHis2 A pBlueBacHis2 C pBlueBacHis2 B pFastBacHT C pMT-Bip-V5-HisA pFBDM pUCDM pFastBac Dual pMIB/V5-His B pMT/V5-His C pMT/V5-His B pMT/V5-His A pAcGP67ApAc5.1b pAc5.1a pVL1392-XyIE control vector pFastBac-c-His-TEV pFastBac-N-GST-TEV pFastBacI-Gus pFastBacHT-CAT pBADZ-His6Cre。

真核细胞常见表达载体

真核细胞罕见表达载体之马矢奏春创作真核细胞, 表达载体1、pCMVp-NEO-BAN载体特点:该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对, 主要由CMVp启动子、兔β-球卵白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成, 在年夜大都真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因.更重要的是, 由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在, 转染细胞后, 用G418筛选, 可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株.拔出外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点.注意在此载体中有二个EcoR1位点存在.2、pEGFP, 增强型绦色荧光卵白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector)特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光卵白, 在PCMV启动子驱动下, 在真核细胞中高水平表达.载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制.Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成, 能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株.另外, 载体中的pUC origin 能保证该载体在年夜肠杆菌中的复制, 而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在年夜肠杆菌中的表达.用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点, 将外源基因扦入这些位点, 将合成外源基因和EGFP的融合基因. 借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位.亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1). 3、pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光卵白/人肌动卵白表达载体特点:pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光卵白和人胞浆β-肌动卵白基因, 在PCMV启动子驱动下, 在真核细胞中高水平表达.载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制.Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成, 能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株.另外, 载体中的pUC origin 能保证该载体在年夜肠杆菌中的复制, 而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在年夜肠杆菌中的表达.用途: pEGFP-Actin载体在真核细胞表达EGFP-Actin融合卵白, 该卵白能整合到胞内正在生的肌动卵白, 因而在活细胞和固定细胞中观察到细胞内含肌动卵白的亚细胞结构.4、pSV2表达载体特点：该表达质粒是以病责SV40启动子驱动在真核细胞目的基因进行表达的, 克隆位点为Hind111.SV40启动子具有组织/细胞的选择特异性.此载体不含neo基因, 故不能用来筛选、建立稳定的表达细胞株.5、CMV4 表达载体特点:该真核细胞表达载体由CMV启动子驱动, 多克隆区域酶切位点选择性较多.含有氨苄青霉素抗性基因和生长基因片段以及SV40复制原点和fl单链复制原点.但值得注意的是, 该表达载体不含有neo基因, 转染細胞后不能用G418筛选稳定的表达细胞株. 其他经常使用克隆Vector：pBluscript II KS DNA 15 ugpUC18 DNA 25 ugpUC19 DNA 25 ug说明: pBluescript II kS、pUC18 &Puc19载体适合于DNA片段的克隆、DNA测序和对外源基因进行表达等.这些载体由于在lacZ基因中含有多克隆位点, 当外源DNA片段扦入, 转化lacZ基因缺乏细胞, 并在含有IPTG和X-gal的培养基上培养时, 含有外源DNA 载体的细胞将为白色菌落, 而无外源DNA片段载体的细胞则为兰色菌落, 由此易于筛选有无外源DNA片段的载体.另外, 这些载体中有便于测序的M13、T7和T3的通用引物进行DNA测序. 保管液: TE BufferTE Buffer组成: 10mM Tris.HCL(Ph 8.0) 1mM EDTA用途:克隆外源DNA片断. 进行基因表达. 使用M13、T7和T3引物进行测序. 存在的问题细胞的生命活动是一个复杂的调控过程, 有些生命活动的机理还不完全清晰, 由于插人的目的基因分歧, 载体构建栗用的顺式组件分歧, 组装的空间位置分歧, 采纳的表达系统分歧, 目的基因表达水平和阳性克隆筛选率城市有很年夜不同.另外, 由于所有的顺式元件存在种属和组织特异性, 所构建的高效表达载体纷歧定在所有细胞株中均高效表达.再者, 细胞生长状态的不同, 转染方法的分歧培养时阉的长短, 筛选药物浓度的高低, 对表达量都有很年夜影响.所以, 需要综合评价一个表达载体和表达系统, 排除一些不定因素, 筛选出最佳组合真核表达载体趋向于既有利于扩增目的基因又有利于筛选阳性克隆的载体的构建.许多有效的应用范围广的强启动子和增强子被人发现并应用于载体中, 年夜年夜提高了目的基因的表达量, 另外一些强的组成型启动子, 如 SV40早期启动子+PHTLv, 已应用于年夜规模生产的细胞系中. 应用以GS为筛选标识表记标帜的表达载体可兼有筛选和扩增目的基因两种功能, 是目前研究的重点.以IRES连接的双顺反子表达载体已成为核表达载体的主体.在同一启动子操纵下, 筛选基因或陈说基因与目的基因转录在同一mRNA上通过IRES的作用, 表达出两种卵白, 因而在理论上可认为, 通过了筛选或表达了陈说基因的克隆必为阳性克隆, 即表达目的基因的克隆, 有报道说这种双顺反子的共表达率为90％.这就年夜年夜提高了筛选率, 简化了实验过程. 将强启动子、增强子和可扩增的筛选标识表记标帜组装在同一载体上, 构建高效表达和筛选的表达载体并将其运用于最合适的表达系统中, 是现今真核表达载体构建研究发展方向.。

猪氨基肽酶在昆虫细胞的分段表达及鉴定

第４卷第９３期
２１年９０２月
东
北
农
业
大
学学
报
４ｅ．１
ＪｕａｆＮｏｔｅｓＡｇｉｕｔｒｌＵｎｖｒｉｏｒｌｏｒａｔｒｃｌａｉｅｓｔｎｈｕｙ
猪氨基肽酶在昆虫细胞的分段表达及鉴定
单智夫，唐丽杰，乔薪媛，葛俊伟，李一经
（东北农业大学动物医学学院，哈尔滨１０３５００）
摘
要：为研究猪的氨基肽酶（ｏｃｅｍｉｏｅｔａｅｐＰ的特异性功能区域及作用机制，将除去信号肽的Ｐｒｉｎｐｐｉｓ，ＡＮ）ｎａｄ
ｐＰＡＮ分为ＳＡ，ＳＢ和ＳＣ三段，利用一对同尾酶ｆ和Ｓｌ将信号肽分别与ＳＡ，ＳＢ和ＳＣ连接后再构建ＰＰＰＩａＩＰＰＰ相
Ａｂｓｒｃ：ｏｉｖｓｉａｅｗｈｃａｔｆｏｃｎｍｉｏｅｔａｅ（Ａ）ｉｔｅｆｎｔｎｌｏｉｏｔａｔＴｅｔｔｉｈｐｒｏｒｉｅａｎｐｐｉｓｐＰＮｓｈｕｃｉａｍａｎｆｎｇｐｄｏｄ
ｒｃｐｏｅｅｔｒｆＰＥＤＶ，ｅｍｏｖｄｔｅｓｇａｌｅｐｉｄｄｖｄｄｐｏｒｗｅｒｅｈｉｎｐｔａｎｉｉｅＡＰＮｉｔｈｅｅｃｉｎ：ＳＰＡ，ｄｅｎｏｔｒｅｓｔｓｏＳＰＢｄａｎ
到杆状病毒表达载体ｐａｔａＴ上，通过杆状病毒一ＦｓｃＭ１Ｂ昆虫细胞表达体系进行蛋白表达。结果表明。￣ＳＳＰＧ￣Ｄ—ＡＥ分析可见获得的目的蛋白与预期大小相一致，即ＳＡ约为４ｕＰ和ＳＣ相同，约为５ｕＰ２ｋ，ＳＢＰ６ｋ的分泌蛋白：经

变铅青链霉菌高效异源表达宿主SBT5的构建_白亭丽1俞燕飞1徐钟1陶美凤1_2

第33卷第1期2014年 1月华中农业大学学报J o u r n a l o fH u a z h o n g A g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t yV o l .33 N o .1J a n .2014,1~6收稿日期:2013-05-21基金项目:国家自然科学基金项目(31170084)白亭丽,硕士研究生.研究方向:链霉菌分子生物学.E -m a i l :b a i t i n gl i @g m a i l .c o m 通信作者:陶美凤,博士,研究员.研究方向:链霉菌分子生物学.E -m a i l :t a o _m e i f e n g @s jt u .e d u .c n 变铅青链霉菌高效异源表达宿主SBT5的构建白亭丽1 俞燕飞1 徐钟1 陶美凤1,21.华中农业大学农业微生物学国家重点实验室,武汉430070;2.上海交通大学微生物代谢国家重点实验室,上海200030摘要以变铅青链霉菌T K 24为出发菌株,依次敲除钙依赖抗生素(C D A )㊁放线紫红素(A C T )和十一烷基灵菌红素(R E D )这3个内源抗生素的生物合成基因簇,同时在钙依赖抗生素基因簇原位整合了来自棒状链霉菌的全局性调控基因a fs R S c l a ,构建得到变铅青链霉菌菌株S B T 5㊂将来自天蓝色链霉菌的放线紫红素生物合成基因簇导入S B T 5中,接合子产生大量蓝色的放线紫红素,而出发菌株T K 24只产微量蓝色抗生素;S B T 5接合子的A C T 产量也显著高于导入了额外a c t 基因簇拷贝的出发菌株接合子㊂S B T 5菌株次级代谢背景清晰,不产色素类抗生素和抗细菌抗生素,可作为高效宿主用于次级代谢产物基因簇的异源表达和筛选㊂关键词变铅青链霉菌;异源表达宿主;次级代谢产物;抗生素生物合成基因簇;基因敲除;a fs R S c l a 中图分类号 Q785 文献标识码 A 文章编号 1000-2421(2014)01-0001-06天蓝色链霉菌(S t r e p t o m yc e s c o e l i c o l o r )是链霉菌分化发育和遗传学研究的模式菌株,可以产生色素类抗生素放线紫红素(A C T ,中性及偏碱性下呈蓝色)㊁十一烷基灵菌红素(R E D ,中性及偏碱性下呈红色)以及抗细菌抗生素钙依赖抗生素(C D A ),天蓝色链霉菌也常被作为宿主菌用于次级代谢基因簇的异源表达[1]㊂天蓝色链霉菌对甲基化D N A 具有限制作用,妨碍了它作为宿主的广泛应用㊂变铅青链霉菌(S t r e p t o m yc e s l i v id a n s )是天蓝色链霉菌近缘种,对甲基化D N A 没有限制作用,常被用作单基因或基因簇异源表达的宿主[2]㊂野生型变铅青链霉菌T K 24的基因组含有A C T ㊁R E D 和C D A 这3种抗生素的生物合成基因簇,对外源基因簇的表达筛选可能会造成干扰;这些基因簇只在特定条件下才会表达,表明该菌株合成次级代谢产物的能力较低㊂根据变铅青链霉菌的这些特点,本研究拟敲除这些内源基因簇,同时加入一个全局性调控基因a f s R S ,用以激活次级代谢基因簇,旨在构建适用于次级代谢产物基因簇异源表达和筛选的高效宿主菌㊂1 材料与方法1.1 菌株及质粒大肠杆菌(E s c h e r i c h i ac o l i )D H 5α为克隆宿主[3];大肠杆菌E T 12567/pU Z 8002为大肠杆菌-链霉菌属间接合转移供体菌[4]㊂蕈状芽胞杆菌(B a -c i l l u sm yc o ide s )为钙依赖抗生素(C D A )生物活性测定的指示菌[5]㊂变铅青链霉菌T K 24[6]为野生型链霉菌,出发菌株㊂天蓝色链霉菌K 7为M 145衍生菌株,由徐钟构建(未发表),在其C D A 生物合成基因簇(c d a )的下游有T n 5微型转座子(m i n i -T n 5-a a c (3)Ⅳ)插入,但C D A 的合成不受影响,m i n i -T n 5-a a c (3)Ⅳ序列中含有阿泊拉霉素抗性基因a a c (3)Ⅳ以及大肠杆菌质粒p U C 18的复制子,本研究利用K 7菌株的这些特点克隆c d a 基因簇部分序列,并用于构建c d a 基因置换质粒㊂质粒p S E T 152[7]包含接合转移起始位点o r i T R K 2㊁阿泊拉霉素抗性基因a a c (3)Ⅳ㊁放线菌噬菌体F C 31整合位点a t t P 以及整合酶基因i n t ㊂p MM 1为p S E T 152衍生质粒,含有放线紫红素生物合成基因簇,由王业民构建(未发表)㊂p H L 737为放线紫红素生物合成基因簇敲除载体,由徐钟构建(未发表);p H L Y 32为十一烷基灵菌红素基因簇敲除载体,由俞燕飞构建(未发表);pH L 851携带来自棒状链霉菌的全局性调控基因a fs R S c l a [8]㊂1.2 引物及试剂本研究应用的引物序列如表1,由上海生工生物技术有限公司合成㊂网络出版时间：2013-12-13 14:26网络出版地址：/kcms/detail/42.1181.S.20131213.1426.001.html华中农业大学学报第33卷表1 本研究所涉及引物及其用途T a b l e 1 P r i m e r s u s e d i n t h i s s t u d y a n d i t s a p pl i c a t i o n 名称N a m e 序列S e qu e n c e 用途A p pl i c a t i o n o r i T -FG G A T C C G G T T T C A T C A G C C A T C C G 扩增o r i T 片段A m pl i f i c a t i o no f o r i T o r i T -R A G A T C T T G C C A A A G G G T T C G T G T A GK 7-B K FT G C T G C T G C T C A T C C A C C A C A T C G 筛选含c d a 序列的p H L T 2S c r e e n i n g fo r p H L T 2w h i c h c o n t a i n i n g c d a s e qu e n c e K 7-B K RC G T C A T C C G G G T C G C G T T C AK 7-L N -FG A G C C T C C G T C C A C C G T C G T T T K 7-L N -RC C A G C T T C C T G T T C G G C G T C AK 7-L e f t -F G C A G G T C G G T G A G C A C G A A G G TK 7-L e f t -R T G G T G G A T G A G C A G C A G C A G G A C s jh C h e k 1F C G A C T G G C T G G A C G T G C T G G A A 筛选c d a 基因簇中断菌株(P C R 1)S c r e e n i n g fo r c d a g e n e c l u s t e r r e p l a c e m e n tm u t a n t (P C R 1)s jh C h e k 1R A C G A C G A C A T G C G G G A G G T G C Tt n -7-2047-F G G G G A T A A C G C A G G A A A G A A筛选c d a 基因簇中断菌株(P C R 2)S c r e e n i n g fo r c d a g e n e c l u s t e r r e pl a c e m e n tm u t a n t (P C R 2) 限制性内切酶和碱性磷酸酶购自F e r m e n t a s 公司;连接酶S o l u t i o n Ⅰ㊁D N A 聚合酶r T a q 等试剂购自T a K a R a 公司;琼脂糖回收试剂盒购自OM E -G A 公司;高保真D N A 聚合酶K O D p l u s 购自T O Y O B O 公司;抗生素购自S i g m a 公司;其余试剂均购自国药集团和O x o i d 公司㊂1.3 培养基L B 培养基用于培养大肠杆菌[8]㊂2ˑY T 培养基[9]用于接合转移时链霉菌孢子的热激处理㊂M S 培养基用于链霉菌的培养㊁产孢和接合转移[10]㊂营养琼脂培养基用于生测涂布培养蕈状芽胞杆菌[11]㊂S MM S 培养基用于链霉菌产素观察[12]㊂N A 培养基用于链霉菌固体发酵产抗生素[13]㊂1.4 DNA 的抽提、转化及克隆大肠杆菌质粒D N A 和链霉菌总D N A 抽提参照标准操作方法[9-10]㊂质粒酶切和连接方法参照酶的使用说明书㊂D N A 片段的回收参照琼脂糖回收试剂盒的使用说明书㊂D N A 片段的P C R 扩增参见文献[9]㊂大肠杆菌转化参照标准钙转方法[9]㊂D N A 序列由上海美吉生物医药科技有限公司测定㊂1.5 大肠杆菌和链霉菌属间接合转移大肠杆菌和链霉菌属间接合转移参照文献[10]进行,将待转穿梭质粒转化到大肠杆菌E T 12567/pU Z 8002,挑单克隆转化子于L B 中活化过夜;活化后按1ʒ100(V /V )的比例转接到新鲜L B 中培养到D 600n m =0.4~0.6,收集菌体,用新鲜L B 洗涤2次,0.1倍体积L B 悬浮备用㊂同时将新鲜链霉菌孢子悬浮于2ˑY T 培养基中,50ħ水浴10m i n,自然冷却㊂1ʒ1(V /V )混合大肠杆菌和孢子,涂布在M S 无抗平板上,30ħ培养14~18h ,用抗生素和三甲氧苄啶覆盖筛选接合转移子㊂1.6 cda 基因簇敲除质粒的构建从天蓝色链霉菌K 7菌株中克隆c d a 生物合成基因簇的部分序列,然后用来自p H L 851的a f s R -S c l a 替换c d a 基因簇内部分片段,获得c d a 基因簇敲除质粒㊂具体构建过程如下:1)c d a 基因簇部分序列的克隆㊂抽提K 7菌株的总D N A ,S a u 3A I 部分酶切,回收大约20k b 的片段,自连后转化大肠杆菌D H 5α,获得具有阿泊拉霉素抗性㊁含有完整的m i n i -T n 5-a a c (3)I V 微型转座子的克隆,最后从这些克隆中P C R 筛选到含有较长c d a 基因簇序列的克隆,命名为p H L T 2㊂2)a f s R S c l a D N A 片段的结构改造㊂用P C R 方法从p S E T 152上扩增含o r i T R K 2的D N A 片段,用B a m HⅠ和B gl Ⅱ双酶切P C R 产物,插入到pH L 851上a f s R S c l a 下游的B a m HⅠ位点,得到质粒p H L T 1㊂3)c d a 基因簇敲除质粒的构建㊂用P s t I 和E c o RⅠ双酶切p H L T 1,回收含有a f s R S c l a -o r i T 的4685b p 片段,与P s t Ⅰ和E c o RⅠ双酶切p H L T 2得到的约14k b 片段连接,得到p H L T 3,再用K pn Ⅰ酶切p H L T 3,自连以抹掉过长的一段基因组D N A ,得到p H L T 4,在该质粒中用全局性正调控基因a f s R S c l a 替换掉了7.1k b 的c d a 基因簇部分D N A 片段,可用作c d a 基因簇基因置换质粒㊂1.7 抗生素基因簇敲除突变菌株的筛选通过同源重组删除基因簇的部分序列来失活抗生素合成基因簇,为便于今后菌株的应用,不采用抗生素抗性基因来替换待中断的基因,因此,基因中断菌株没有抗生素抗性,筛选必须分为两步进行㊂首先,接合转移得到整合了中断载体的链霉菌,P C R筛选并且验证单交换;其次,正确的单交菌株在抗性2第1期白亭丽等:变铅青链霉菌高效异源表达宿主S B T 5的构建 M S 平板培养至产孢,孢子稀释涂布到无抗的M S平板上培养,用影印的方法将长好的菌落转印到抗生素平板上培养,对照2个平板挑选无抗性的克隆,然后抽提总D N A ,通过P C R 筛选双交换突变株㊂1.8 抗生素生物活性测定将待测链霉菌接种到N A 培养基上,30ħ培养7d 进行固体发酵㊂指示菌芽胞杆菌于L B 培养基中37ħ㊁200r /m i n 活化过夜,然后转接培养至D 600n m =0.4~0.6,取200μL 培养物均匀涂布到营养琼脂平板上,接着用打孔器取相同大小的链霉菌发酵菌块放置到上述营养琼脂平板上,37ħ培养12~16h 后观察抑菌圈㊂2 结果与分析2.1 cda 基因簇敲除1)c d a 基因簇敲除质粒p H L T 4的构建㊂从天蓝色链霉菌k 7菌株的总D N A 中克隆得到p H L T 2,P C R 验证m i n i -T n 5-a a c (3)I V 一侧含有约14k b 的c d a 基因簇部分序列,在此基础上构建p H L T 4(图1)㊂p H L T 4与p H L T 2相比:c d a 基因簇D N A 序列中从P s t Ⅰ到E c o R Ⅰ位点的7.1k b 部分片段被a f s R S c l a -o r i T 所取代;且p H L T 4中a f s R S c l a -o r i T 两侧可用于同源交换的染色体D N A 片段分别为4544和2312b p,可用于c d a 基因簇的基因置换㊂图1 c d a 生物合成基因簇基因置换质粒p H L T 4的构建流程F i g .1 C o n s t r u c t i o no f p H L T 4,t h e c d a g e n ec l u s t e r g e n e r e p l a c e m e n t pl a s m i d 3华中农业大学学报第33卷2)c d a 基因簇敲除菌株的构建㊂将p H L T 4接合转移到变铅青链霉菌T K 24中,筛选阿泊拉霉素抗性(A p r R)的接合转移子,用o r i T R K 2特异性引物进行P C R 验证菌株基因型为单交换菌株㊂从A pr R的单交换菌株后代中通过影印筛选得到阿泊拉霉素敏感(A p r S )菌株,设计2个P C R 反应从A pr S菌株中筛选㊁验证双交换菌株,双交换只有P C R 1可以有阳性条带产生,野生型没有阳性条带,而单交换则2个P C R 反应都有阳性条带(图2)㊂图2中5㊁13和14号为正确的双交换菌株,命名为S B T 2㊂与T K 24出发菌株相比,S B T 2明显产生更多的蓝色色素(图3)㊂ M :1k b 标准(对照)1k b m a r k e r ;WT :野生型S .l i v i d a n sS .l i v i d a n s w i d e t y pe ;2~16:来源于p H L T 4接合转移子的衍生菌株S t r a i n s d e r i v e df r o ma nA p r R p H L T 4e x c o n j u ga n t .图2 c d a 基因簇置换菌株的P C R 筛选与鉴定F i g .2 P C Rs c r e e n i n g an dc o n f i r m a t i o no f t h e c d a g e n ec l u s t e r r e pl a c e m e n t s t r a i n s 2.2 放线紫红素和十一烷基灵菌红素基因簇的基因敲除将放线紫红素基因簇a c t 敲除载体p H L 737转入大肠杆菌E T 12567/pU Z 8002,接合转移到S B T 2中,得到A p r R接合转移子,再用P C R 方法筛选验证单交换菌株㊂通过影印筛选,从A pr R后代得到A pr S菌株,其中正确的双交换菌株不再产生蓝色的放线紫红素,菌株命名为S B T 4;同时观察到S B T 4大量合成红色的十一烷基灵菌红素(图3)㊂将十一烷基灵菌红素基因簇r e d 敲除载体p H L Y 32接合转移到S B T 4中,得到A p r R接合转移子,先进行单交换菌株筛选,再筛选双交换菌株,得到既不产蓝色A C T 也不产红色R E D (图3)㊁且不产钙依赖性抗生素C D A 的菌株(图4),命名为S B T 5㊂2.3 放线紫红素在SBT5中的表达质粒p MM 1上含有来自天蓝色链霉菌的放线紫红素生物合成基因簇,将p MM 1引入S B T 5和出发菌株T K 24中,以空载体p S E T 152作为对照,2个菌株均具有较高接合转移效率(数据未给出)㊂观察比较2个菌株表达次级代谢基因簇能力(图5)㊂结果显示野生型菌株加入空载体(T K 24ɨp S E T 152,含有A C T 和R E D 两个色素类抗生素基因簇)呈淡红色;用p MM 1引入额外拷贝a c t 基因簇后,含有2个a c t 基因簇拷贝的菌株T K 24ɨpMM 1产蓝色色素有所提高,而含p MM 1的S B T 5菌株大量产生放线紫红素,根据深蓝色判断其产量远远高于含有1个或2个拷贝a c t 基因簇的野生型菌株㊂超量表达A C T 的S B T 5接合转移子经过多次传代仍保持较高产量㊂在N A 培养基上培养T K 24及其突变株S B T 2㊁S B T 4和S B T 5,30ħ4d (平板背面)㊂T K 24a n di t s m u t a n tS B T 2,S B T 4a n dS B T 5w e r e c u l t u r e do nN Aa ga r p l a t e s f o r 4d ,30ħ.图3 T K 24及其抗生素基因簇敲除菌株产色素的表型观察F i g .3 P i g m e n t s p r o d u c t i o nb y TK 24a n d i t s g e n ec l u s t e r s r e pl a c e m e n tm u t a n t s 链霉菌在N A 培养基上发酵,发酵平板上的琼脂块用于生物测定㊂T K 24产生抑菌圈,S B T 5不产生㊂S t r e p t o m yc e s s t r a i n sw e r e f e r m e n t ed o nN Aa g a r ,t he n t h e a g a r p l u g sf r o mf e r m e n t a t i o n ag a r w e r eu s e d f o r th ebi o a s s a y.T K 24p r o d u c e daz o n eo f i n h i b i t i o n ,w h i l eS B T 5d i dn o t .图4 T K 24和S B T 5合成钙依赖抗生素的生物测定F i g .4 B i o a s s a y o f C D A p r o d u c t i o nb y TK 24a n dS B T 54第1期白亭丽等:变铅青链霉菌高效异源表达宿主S B T 5的构建在S MM S 培养基上接种链霉菌,30ħ培养4d ;S B T 5ɨp MM 1产生深蓝色的放线紫红素㊂S t r e p t o m yc e s s t r a i n sw e r e f e r m e n t e do n S MM Sa ga r ,30ħ,4d .S B T 5ɨp MM 1p r o d u c e dd a r kb l u e ac t i n o r h od i n .图5 S B T 5过量表达放线紫红素F i g .5 O v e r pr o d u c t i o no f a c t i n o r h o d i n i nS B T 53 讨论基因组和宏基因组测序表明,自然界中的可培养或未培养微生物基因组中蕴含着丰富的次级代谢途径资源,是天然产物筛选的宝库㊂然而,由于大部分基因簇常处于沉默状态,采用传统方法很难继续从微生物中有效地分离到新的化合物㊂如何激活这些沉默或隐藏的基因簇以获得相应的化合物,是新药先导化合物发掘领域亟待解决的瓶颈问题[14-15],开发高效的异源表达方法无疑是其中重要的备选方案㊂变铅青链霉菌遗传背景清晰㊁遗传操作简单高效,是异源表达筛选技术的首选宿主菌,缺点是其含有内源色素和抗生素基因簇,且天然次级代谢能力不强㊂本研究针对这些特点,改造变铅青链霉菌,敲除了A C T ㊁R E D ㊁C D A 等3个内源抗生素的基因簇,同时为了激活或者高表达异源基因簇,还加入了一个多效性正调控基因a f s R S c l a ㊂来源于棒状链霉菌的a f s R S c l a 能够激活沉默的放线紫红素㊁钙依赖性抗生素和全霉素的生物合成,并大幅度提高棒酸的产量[8]㊂在本研究中也发现,在c d a 基因簇原位加上a f s R S c l a 后,菌株S B T 2大量合成放线紫红素;在进一步敲除a c t 基因簇后,由于没有蓝色色素干扰,在菌株S B T 4中又观察到十一烷基灵菌红素R E D 大量合成㊂这些结果表明,新引入的a fs R S c l a 可以促进不同类型抗生素的大量合成㊂无疑,高效表达宿主S B T 5菌株的成功构建和应用将为我们大量快速发掘新的天然产物提供很好的工具㊂参考文献[1] K I E S E R H M ,K I E S E R T ,H O P WO O D D A.Ac o m b i n e d g e -n e t i c a n d p h y s i c a lm a p o f t h e S t r e p t o m yc e s c o e l i c o l o r A 3(2)c h r o m o s o m e [J ].JB a c t e r i o l ,1992,174:5496-5507.[2] 郑华亮,白亭丽,陶美凤.大肠杆菌乙酰-C o A 羧化酶基因异源表达对变铅青链霉菌次级代谢的影响[J ].华中农业大学学报,2013,32(4):12-18.[3] HA N A HA N D .S t u d i e so nt h e t r a n s f o r m a t i o no f E .c o l i w i t h pl a s m i d s [J ].JM o l B i o l ,1983,166(4):557-580.[4] F L E T TF ,M E R S I N I A SV ,S M I T H CP .H i g h e f f i c i e n c y i n t e r -g e n e r i c c o n j u g a l t r a n s f e r o f p l a s m i dD N Af r o m E s c h e r i c h i a c o -l i t om e t h y l D N A -r e s t r i c t i n g S t r e p t o m y c e t e s [J ].F E M SM i c r o -b i o l L e t t ,1997,155:223-229.[5] K E M P T E R C ,K A I S E R D ,H A A GS ,e t a l .C D A :c a l c i u m -d e -p e n d e n t p e p t i d ea n t i b i o t i c sf r o m S t r e p t o m y c e s c o e l i c o l o r A 3(2)c o n t a i n i n g u n u s u a l r e s i d u e s [J ].A n g e w a n d t e C h e m i e I n t e r -n a t i o n a l E n gl i s hE d i t i o n ,1997,36:498-501.[6] HO P WO O DD A ,H I N T E RMA N N G ,K I E S E R T ,e t a l .I n t e -g r a t e dD N A s e q u e n c e si nt h r e es t r e p t o m yc e t e sf o r m r e l a t ed a u t o n o m o u s p l a s m i d sa f te r t r a n sf e r t o S t r e p t o m y c e s l i v i d a n s [J ].P l a s m i d ,1984,11:1-16.[7] B I E R MA N M ,L O G A N R ,O B R I E N K ,e t a l .P l a s m i d c l o n i n gv e c t o r s f o r t h e c o n j u ga l t r a n s f e r o fD N Af r o m E s c h e r i c h i a c o l i t o S t r e p t o m y c e s s p p .[J ].G e n e ,1992,116(1):43-49.[8] C H E NL ,WA N GY ,G U O H ,e t a l .H i g h -t h r o u g h p u t s c r e e n i n g f o r S t r e p t o m yc e s a n t i b i o t i cb i o s y n t h e s i sa c t i v a t o r s [J ].A p p l E n v i r o n M i c r o b i o l ,2012,78(12):4526-4528.[9] S AM B R O O KJ ,R U S S E L L D.M o l e c u l a r c l o n i n g :a l a b o r a t o r ym a n u a l [M ].3t h e d .N Y :C o l d S p r i n g H a r b o r L a b o r a t o r yP r e s s ,C o l dS p r i n g Ha rb o r ,2001.[10]K I E S E R T ,B I B B MJ ,B U T T N E R M J ,e t a l .P r ac t i c a l S t r e p -t o m y c e s g e n e t i c s [M ].2n ded .N o r w i c h :T h eJ o h nI n ne sF o u n -d a t i o n ,2000.[11]F A R N E T C M.S y s t e m ,k n o w l e d g er e p o s i t o r y a n dc o m p u t e r -r e a d a b l em e d i u mf o r i d e n t i f y i n g a s e c o n d a r y m e t a b o l i t e f r o ma m i c r o o r ga n i s m :U S A ,U S 2008/0010025A 1[P ].2008-01-01.[12]B E N T L E YSD ,C H A T E RKF ,C E R D E N O -T A R R A G AA M ,e ta l .C o m p l e t e g e n o m es e q u e n c eo ft h e m o d e la c t i n o m yc e t e 5华中农业大学学报第33卷S t r e p t o m y c e s c o e l i c o l o r A3(2)[J].N a t u r e,2002,417(6885): 141-147.[13]W I N T E RJ M,B E HN K E N S,H E R TW E C K C.G e n o m i c s-i n-s p i r e dd i s c o v e r y o f n a t u r a l p r o d u c t s[J].C u r rO p i nC h e m B i o l, 2010,15(1):22-31.[14]H E R TW E C KC.H i d d e nb i o s y n t h e t i c t r e a s u r e s b r o u g h t t o l i g h t[J].N a tC h e m B i o l,2009,5(7):450-452.[15]S C HWA R Z E RD,F I N K I N GR,MA R A H I E L M A.N o n r i b o s o-m a l p e p t i d e s:f r o m g e n e s t o p r o d u c t s[J].N a tP r o dR e p,2003, 20:275-287.C o n s t r u c t i o no f S t r e p t o m y c e s l i v i d a n s S B T5a s a n e f f i c i e n th e t e r o l o g o u s e x p r e s s i o nh o s tB A IT i n g-l i1 Y U Y a n-f e i1 X UZ h o n g1 T A O M e i-f e n g1,21.S t a t eK e y L a b o r a t o r y o f A g r i c u l t u r a lM i c r o b i o l o g y,H u a z h o n g A g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y,W u h a n430070,C h i n a;2.S t a t eK e y L a b o r a t o r y o f M i c r o b i a lM e t a b o l i s m,S h a n g h a i J i a o t o n g U n i v e r s i t y,S h a n g h a i200030,C h i n aA b s t r a c t T h r e e g e n e c l u s t e r s c o n t r o l l i n g t h eb i o s y n t h e s i so f t h ea n t i b i o t i c s a c t i n o r h o d i n(A C T), u n d e c y l p r o d i g i o s i n(R E D)a n dc a l c i u m-d e p e n d e n ta n t i b i o t i c(C D A)w e r es e q u e n t i a l l y k n o c k o u t e db y g e n e r e p l a c e m e n t s f r o mt h e c h r o m o s o m eo f S t r e p t o m y c e s l i v i d a n s T K24t od e r i v eSB T5.I nS B T5,t h e g l o b a l r e g u l a t o r yg e n e s a f s R S c l a f r o m S t r e p t o m y c e s c l a v u l i g e r u s w a s i n t e g r a t e d i nt h e p l a c eo f t h e c d a g e n e c l u s t e r.T h e a c t g e n e c l u s t e r f r o m S t r e p t o m y c e s c o e l i c o l o r w a s i n t r o d u c e d i n t oS B T5t o t e s t i t s c a-p a b i l i t y o f e x p r e s s i n g s e c o n d a r yg e n e c l u s t e r.T h e r e s u l t i n g S B T5e x c o n j u g a n t s o v e r p r o d u c e dAC Tc o m-p a r i n g w i t hw i l d-t y p e s t r a i n sh a r b o r i n g d o u b l ec o p i e so f t h e a c t g e n ec l u s t e r.S B T5i sa ne f f i c i e n th o s t w i t ha c l e a n s e c o n d a r y m e t a b o l i s mb a c k g r o u n d s u i t a b l e f o r h e t e r o l o g o u s l y e x p r e s s i n g a n d s c r e e n i n g s e c-o n d a r y m e t a b o l i c g e n e c l u s t e r s.K e y w o r d s S t r e p t o m y c e s l i v i d a n s;h e t e r o l o g o u s e x p r e s s i o nh o s t;s e c o n d a r y m e t a b o l i t e s;a n t i b i o t-i c b i o s y n t h e t i c g e n e c l u s t e r s;g e n ek n o c k o u t;a f s R S c l a(责任编辑:张志钰) 6。

昆虫细胞色素P450基因的表达与调控及P450介导抗性的分子机制

昆虫细胞色素P450基因的表达与调控及P450介导抗性的
分子机制
邱星辉;冷欣夫
【期刊名称】《农药学学报》
【年(卷),期】1999(1)1
【摘要】本文综述了在杀虫剂抗性中起重要作用的 P4 50酶系研究的最新进展。

内容包括 :细胞色素 P4 50酶系基因及其基因的表达与调控 ,P4 50介导抗性的分子基础。

细胞色素 P4 50表达表现出发育期、组织、品系特异性及可诱导性。

P4 50表达的调控机制复杂 ,可能受顺式调控元件 (如 CYP6 B1)或反式作用因子 (如CYP6 A1)或顺式、反式因子的共同调控 (如 CYP6 D1)。

调控可能涉及转录增强的转录机制或 m RNA稳定性增加的转录后机制。

P4 50的超量表达是 P4 50酶系介导抗性的主要机制 ,P4
【总页数】8页(P7-14)
【关键词】细胞色素P450;基因表达;抗药性分子机制;基因调控;介导抗性;杀虫剂;农药;昆虫
【作者】邱星辉;冷欣夫
【作者单位】中国科学院动物研究所
【正文语种】中文
【中图分类】Q961.3;TQ450.12
【相关文献】
1.细胞色素P450介导的昆虫抗药性的分子机制 [J], 邱星辉
2.昆虫细胞色素P450基因的多样性、进化及表达调控 [J], 郭亭亭;姜辉;高希武
3.昆虫细胞色素P450研究：P450基因 [J], 邱星辉;冷欣夫
4.昆虫细胞色素P450的研究：P450基因的进化 [J], 邱星辉;冷欣夫
5.昆虫抗药性相关细胞色素P450基因的表达调控机制 [J], 朱江;邱星辉
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