斑马鱼jak2a载体构建及其对红系造血功能影响的初步研究

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(细胞生物学专业优秀论文)斑马鱼新基因KLP的克隆、分析及功能研究

结果１、异种同源基因的血清学筛选及鉴定以人脐静脉内皮细胞免疫获得的抗血清为筛选血清，采用ＳＥＲＥＸ方法筛选斑马鱼心脏ｅＤＮＡ文库。

噬菌斑内的重组蛋白转移到硝酸纤维素膜上经显色反应后背景呈浅紫色，阴性噬菌斑呈较淡的噬菌斑影，阳系的噬菌斑呈紫红色：筛选过程重复２—３次以排除假阳性结果。

通过斑马鱼心脏ｅＤＮＡ文库的两轮筛选获得了２２个阳性克隆，然后通过内部剪切使噬菌体转变呈噬粒以鉴定。

琼脂糖凝胶电泳结果显示，插入片断大小大部分集中于１０００ｂｐ左右。

图１左图箭头所指为ＳＥＲＥＸ阳性克隆，右图为ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ噬菌粒经ＥｃｏＲＩ和ＸｈｏＩ双酶切表２基因号人同源基因名称阳性频率功能注释ＤＬｌ６３２９Ｈｓ．３５０９６４ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｚｉｎｃｆｉｎｇｅｒａｎｄＢＴＢｄｏｍａｉｎｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ４Ｄｒ３５ｃｒ７２Ｈｓ．２２７６０２２ｒｅｇｕｌａｔｅｏｆｎｕｃｌｅｒ删＾—ｂｉｎｄｇｉｎｇｐｅｒ－姝Ｎ＾ｍｏｔｉｆｐｒｏｔｅｉｎ１６未知基因（６个克隆。

２个基因）图２阳性克隆基因的功能分类３、新基因全长的克隆获得完整的ＯＲＦ是基因功能研究的第一步。

我们选择了一个基因作为重点研究对象：斑马鱼ＫＬＰ（ＫａｉＳＯＬｉｋｅ）基因，我们采用的电子克隆策略。

直接测序得到的斑马鱼ｅｓｔ序列长６４７ｂｐ，我们采用了基于基因组序列的直接预测策略。

通过与斑马鱼基因组序列的对比，可知该基于位于１２染色体的ＮＷ－－６３３３８０（共２３２５３７ｂｐ）的４６１６１－－４７０７９ｂｐ处。

选取该序列前后各３ｋｂ序列，运用ＧＥＮＥＳＣＡＮ和ＴＷＩＮＳＣＡＮ测序其中可能包含的基因，包含已知ＥＳＴ序列的预测结果即为可能的基因，长４７２５ｂｐ，编码１５７４个氨基酸。

再与Ｄｒ．１６３２９中的ＥＳＴ序列对比，通过与Ｃ０９２３１４７的序列拼接获得一长５１７１ｂｐ的基因序列，５’端延长３９５ｂｐ，编码区不变。

起始密码子周围序列为ｃｃｈａｔｇＡ，符合ｋｏｚａｋ规则，－－５７位存在终止密码予ＴＧＡ，据此可以确定已得到该基因完整的编码区。

一种转基因斑马鱼在制备特异标记原始红系造血过程的动物模型中的应用[发明专利]

专利名称：一种转基因斑马鱼在制备特异标记原始红系造血过程的动物模型中的应用
专利类型：发明专利
发明人：马宁,卢荆澳,黄春燕,林芷茵,彭昱轩,唐政,林宇
申请号：CN202111355654.2
申请日：20211116
公开号：CN114350705A
公开日：
20220415
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种转基因斑马鱼在制备特异标记原始红系造血过程的动物模型中的应用。

本发明发现斑马鱼cd99l2基因具有与斑马鱼原始红系造血相一致的时空表达谱，仅在斑马鱼原始造血阶段的红细胞中高表达。

本发明通过构建Tg(cd99l2‑4.7kpromotereGFP)转基因斑马鱼进一步发现，利用cd99l2作为标记时标记的细胞类型为未成熟的红系前体细胞，且不影响红细胞生成。

因此，可将该转基因斑马鱼用于制备特异标记原始红系造血过程的动物模型，用于研究原始造血过程以及原始红细胞发育过程，还可用于制备用于筛选治疗红细胞增多或者减少性疾病药物的模型。

申请人：南方医科大学
地址：510515 广东省广州市白云区沙太南路1023号-1063号
国籍：CN
代理机构：广州粤高专利商标代理有限公司
代理人：赵崇杨
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基因编辑技术斑马鱼模型应用的进展及展望

基因编辑技术斑马鱼模型应用的进展及展望近年来，基因编辑技术在生命科学领域中得到广泛应用。

其中斑马鱼模型作为常用的实验动物，被用于研究大量生物学问题。

本文将介绍基因编辑技术在斑马鱼模型中的应用情况、取得的进展以及未来的展望。

一、基因编辑技术在斑马鱼中的应用情况基因编辑技术主要包括CRISPR/Cas9系统、TALENs 和 zinc finger nuclease (ZFN)等。

这些技术以不同的方法，实现基因的精确编辑，可广泛应用于生命科学中的基础和应用研究。

在斑马鱼中，基因编辑技术已经广泛应用。

CRISPR/Cas9系统是其中最常用的一种技术。

利用这种技术，可以在斑马鱼中实现通过调整基因的表达，使其具有特定的生物学特性，例如，身体颜色、免疫系统等的改变。

此外，基因编辑技术还能用于研究斑马鱼的基因功能，并为我们了解人类疾病的基因突变打下基础。

二、基因编辑技术在斑马鱼中的进展近年来，随着基因编辑技术不断发展，对斑马鱼进行基因编辑的方法也得到了迅速发展。

在斑马鱼的基因研究中，利用基因编辑技术进行基因敲除是最常用的实验手段之一。

通常，利用CRISPR/Cas9系统对斑马鱼进行基因突变，使其缺失某些关键基因，以此来研究基因的功能。

除此之外，近年来，研究人员还利用基因编辑技术在斑马鱼中构建了个别基因纯合或杂合体系，以研究基因对斑马鱼生长和发育的影响，最终揭示了许多新的基因功能和调节机制。

例如，研究人员利用CRISPR/Cas9系统在斑马鱼中进行了Pten基因的单基因纯合敲除，结果发现这种突变引起了蛋白质合成和细胞存活代谢通路等方面的变化。

此外，研究人员还拓展了基因编辑技术的应用，在斑马鱼模型中实现了人类基因的表达。

例如，利用基因编辑技术，在斑马鱼中构建人类肝脏和肾脏，以探究疾病发生的机制。

三、基因编辑技术在斑马鱼中的未来展望在未来，随着基因编辑技术的不断发展，基于斑马鱼模型的研究也将有更深入的探索。

预计斑马鱼模型将被广泛应用于遗传疾病的研究、药物筛选和神经科学研究。

文献综述-斑马鱼及其应用

斑马鱼及其研究应用作者：杜颖指导老师：张源淑摘要：斑马鱼作为一种新兴的重要模式动物之一，体外受精、胚胎透明，因此可在显微镜下直接观察发育过程及检测药物引起的内脏组织变化，在生命科学领域中应用前景十分广阔。

斑马鱼体型小,适合高通量研究,还具有生长繁殖周期短及其与人类高度相似的基因组等优点，已经广泛用于人类疾病模型的建立、新药研发和药物的筛选，此外，斑马鱼还被应用于毒理学、发育生物学和遗传学等的研究。

因为斑马鱼对污染物反应灵敏，现已用于监测环境污染物及污水检测。

本文主要从几个方面对斑马鱼的研究进展进行了整理和归纳。

关键字：斑马鱼模式动物科学研究发育感染药物Zebrafish and Its ApplicationAbstract:Zebrafish as an important model animal emerging, its in vitro fertilization, transparent embryo, internal organs can be directly observed during the development and testing organ change caused by drugs under the microscope, has very broad application prospects in the field of life sciences. zebrafish also has a live, high-throughput, growth and short reproduction cycles and highly similar to the human genome, etc., it is widely used in modeling human diseases, drug screening, and secondly, zebrafish also is applied in toxicology research, developmental biology and genetics, etc.. Because of its sensitivity, it has been used to monitor environmental pollutants and water testing.This paper mainly from several aspects of zebrafish research progress has been collated and summarizedKey words:zebrafish Animal models Scientific research Development Infection Drug斑马鱼(Danio rerio)又名蓝条鱼、花条鱼、蓝斑马鱼、印度鱼、印度斑马鱼,产于孟加拉、印度东部、巴基斯坦、缅甸、尼泊尔等地,是一种常见的热带淡水硬骨鱼。

斑马鱼造血调控因子的研究进展

斑马鱼造血调控因子的研究进展
钟敏
【期刊名称】《国际输血及血液学杂志》
【年(卷),期】2011(034)001
【摘要】斑马鱼由于其独特的生物学优势,使其成为研究造血发育过程及调控机制的良好的生物模式.目前已经利用斑马鱼建立了若干和人类极为类似的血液疾病模型,如T淋巴细胞白血病和骨髓增殖性疾病(myeloproliferative diseases,MPD)等.由于其胚胎透明便于观察,并且可以结合大规模的前向遗传学筛选,从而利于发现造血过程中的未知因子,进一步了解斑马鱼的造血过程及其调控方式.
【总页数】5页(P70-74)
【作者】钟敏
【作者单位】200127,上海,上海交通大学医学院附属仁济医院血液科
【正文语种】中文
【相关文献】
1.斑马鱼造血系统发育与人类血液系统疾病研究进展
2.斑马鱼造血干细胞研究进展及其在人类白血病治疗中的应用
3.造血负调控因子研究进展
4.中科院上海分院科学家发现斑马鱼中β-Arrestin1蛋白是胚胎造血系统发育的重要调控因子
5.造血干细胞调控因子研究进展
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一种培育肠道特异性表达红色荧光转基因斑马鱼的方法[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010511231.4(22)申请日 2020.06.08(71)申请人浙江大学地址 310058 浙江省杭州市西湖区余杭塘路866号(72)发明人单颖　李肖梁　方维焕　(74)专利代理机构杭州中成专利事务所有限公司 33212代理人周世骏(51)Int.Cl.C12N 15/85(2006.01)C12N 15/65(2006.01)A01K 67/027(2006.01)(54)发明名称一种培育肠道特异性表达红色荧光转基因斑马鱼的方法(57)摘要本发明涉及转基因斑马鱼的培育方法，旨在提供一种培育肠道特异性表达红色荧光转基因斑马鱼的方法。

通过观察胚胎红色荧光蛋白基因的表达情况，挑选出肠道有特异性荧光的斑马鱼胚胎，以采用人工饲养方法获得杂交子代。

通过杂交子代自交获得稳定遗传的肠道表达红色荧光蛋白斑马鱼，再将其与野生型斑马鱼测交，筛出100％肠道表达红色荧光蛋白胚胎对应的亲本斑马鱼作为双整合纯系留种保存。

本发明方法实施过程简单易控，能够获得肠道特异性表达的启动子和红色荧光蛋白在肠道高效表达的斑马鱼品系；所得斑马鱼品系用于斑马鱼肠道功能的研究，可以随时观察在任何时期的肠道红色荧光蛋白表达特征，满足对斑马鱼肠道功能研究的整体性与完整性要求。

权利要求书2页说明书7页序列表9页附图3页CN 111621522 A 2020.09.04C N 111621522A1.一种培育肠道特异性表达红色荧光转基因斑马鱼的方法，其特征在于，是以Tol2转座酶系统为工具，构建以肠道脂肪酸结合蛋白启动子带动DsRed红色荧光蛋白在肠道特异表达的转基因斑马鱼；该方法具体包括以下步骤：(1)从斑马鱼肠道组织基因组扩增获得肠道特异性启动子Pifabp，其序列如SEQ ID NO:1所示；(2)从商品化质粒中扩增获得dsred片段，其序列如SEQ ID NO:2所示；(3)以mini Tol2质粒为骨架，构建基于肠道特异性启动子Pifabp表达红色荧光蛋白dsred的重组表达载体；(4)将步骤(3)中的重组表达载体显微注射至斑马鱼受精卵，筛选出存在红色荧光信号的胚胎，并按常规方法饲养，得到F0代；(5)将F0代斑马鱼与野生型斑马鱼杂交获得F1代，筛选获得杂合的肠道特异性表达红色荧光转基因斑马鱼；(6)将F1代斑马鱼进行自交获得F2代，筛选得到纯合及杂合的肠道特异性表达红色荧光转基因斑马鱼；(7)将F2代斑马鱼与野生型斑马鱼测交，筛选出后代100％肠道表达红色荧光蛋白对应的F2代亲本斑马鱼，作为纯品系留种保存。

斑马鱼模型在免疫学中的应用研究

斑马鱼模型在免疫学中的应用研究斑马鱼（zebrafish）是一种常见的热带鱼类，因其在科学研究中的广泛应用而备受关注。

近年来，斑马鱼模型在免疫学中的应用研究引起了越来越多的关注和重视。

本文将从斑马鱼模型在免疫学方面的应用和研究进展角度展开讨论。

一、斑马鱼模型在免疫学方面的应用斑马鱼模型作为一种生命科学研究工具，具有许多优越性。

相对于哺乳动物模型，斑马鱼模型体积小、繁殖力强、生命周期短，而且发育过程可见。

这些优点使得斑马鱼模型成为研究生命科学、特别是免疫学问题的有力工具。

斑马鱼是脊椎动物，其免疫系统与哺乳动物的免疫系统有很多相似之处。

斑马鱼模型可以对人类免疫系统相关疾病的机制进行研究。

斑马鱼还可以通过植入肿瘤细胞来建立癌症模型，从而探究癌症的发生机制。

同时，斑马鱼可以被用来进行免疫功能的研究，包括免疫细胞的发育、分化、功能和免疫反应等方面。

二、斑马鱼模型在免疫学研究中的进展随着研究的不断深入，斑马鱼模型在免疫学研究中的应用也不断推进。

1. 斑马鱼模型在免疫细胞发育过程中的应用斑马鱼模型可以被用来研究免疫细胞的发育和功能，特别是针对一些疾病中免疫细胞发育异常的情况。

例如，在过敏反应中，嗜酸性粒细胞（Eosinophil）对于炎症反应的调节非常重要。

研究人员曾经在斑马鱼模型中发现，一些免疫调节因子会影响斑马鱼嗜酸性粒细胞的发育和活动，从而使得其免疫系统得以平衡。

2. 斑马鱼模型在炎症反应中的应用炎症反应是免疫系统对感染和组织损伤的反应。

研究人员可以在斑马鱼模型上研究各种炎症反应，并研究其中代表性的信号通路和分子机制，这有助于对炎症反应进行更深入的研究。

3. 斑马鱼模型在免疫激活过程中的应用免疫激活是免疫系统对于感染等外部刺激的反应。

斑马鱼模型可以被用来研究免疫激活的过程。

例如，在炎症反应中，一些细胞因子和蛋白质的产生与免疫激活密切相关。

斑马鱼模型可以被用来研究这些细胞因子和蛋白质的分泌和相关机制。

4. 斑马鱼模型在肿瘤研究中的应用肿瘤研究是斑马鱼模型在免疫学领域中的另一大应用。

斑马鱼造血系统发育过程中Hox基因的表达模式研究

位杂交试验。

我们发现在20hpf胚胎Hoxa2b表达在头部，Hoxa5a和Hoxa9a分别在中部和尾部。

但在3dpf幼鱼，这种前后表达模式消失。

Hoxa2b、Hoxa5a和Hoxa9a 都在假想的斑马鱼胸腺原基高表达。

在成体，Hoxa2b、Hoxa5a、Hoxa9a基因主要分布在脾红髓中，白髓中少量分布。

在肾脏，Hoxa2b、Hoxa5a、Hoxa9a基因主要分布在肾小管边缘及肾小管之间的间隙里。

由于Hox基因主要表达在分化程度较低的干细胞或者祖细胞中，因此我们推测Hoxa2b、a5a、a9a在肾脏和脾脏的表达部位可能反映了肾小管附近和脾红髓为斑马鱼肾脏造血干细胞增生并向髓样先祖细胞分化的场所。

为了验证上述假说，我们最后制备了MLL-AF9转基因斑马鱼。

MLL-AF9融合蛋白已被证明能进行增加髓样先祖细胞A簇Hox基因，特别是5`端Hox基因表达。

本研究我们发现Hoxa2b、a9a、b5a、b5b在转基因鱼相对于正常鱼高表达。

这些结果进一步证明Hox基因在造血细胞和它们的巢居场所呈特征性时空表达模式。

总之，Hox基因的时空表达模式，即Hox密码在Hox造血过程中发挥明显作用。

但到底是Hox基因的表达模式指引造血细胞迁移到造血器官，还是造血器官微环境授予造血细胞的Hox基因表达模式有待继续研究。

无论如何，本课题为进一步研究Hox基因在成体干细胞的迁移和巢居中的作用开辟了新方向。

关键词：同源盒基因，成体干细胞，巢居，实时荧光定量，原位杂交，斑马鱼The expression pattern of Hox genes in the development ofzebrafish hematopoietic systemsABSTRACTFrom Drosophila to mammals all Hox genes (homeobox gene) contain a highly conserved DNA-binding domain. The basic function of Hox genes is to control how and where parts of the body develop. During vertebrate evolution, Hox genes have co-opted to achieve a variety of functions. V arious downstream targets of Hox proteins identified within the developing central nervous system (CNS) suggest that Hox genes not only play a role in patterning of the CNS during early development, but also contribute to cell specification and identity. There is increasing evidence that Hox transcription factors play a direct role in normal proliferation and differentiation of hematopoietic cells, as well as tissue regneration and turmorigenesis. All hematopoietic progenitors express Hox genes in a pattern characteristic of the lineage and stage of differentiation of the cell. In murine immatured hematpoietic cells, at least 22 of the 39 Hox genes are expressed. Expression of clustered Hox genes, and enforced overexpression and knockout studies have demonstrated that dysregulation of Hox genes can lead to various developmental abnormalities and malignancies. Hox genes encode DNA-binding proteins that are deployed in overlapping domains along various body axes during embryonic development. This sequential activation of Hox genes in temporal and spatial mode, the Hox code, is critical for the proper positioning of segmented structures along those axes, which include the vertebrate, the limbs and also, the digestive and reproductive tracts. It remains unknown how Hox genes are regulated to determine the identity of hematopoietic stem cells and their derivatives which migrate and express most Hox genes.Zebrafish as a model organism is widely used in the study of human development and disease models. It has a number of advantages such as transparent embryos, easy cultivation, esay operation and powerful regenerative capacity. What the most important is, zebrafish has a complete blood circulatorysystem, and its hematopoietic genetic network in the evolutionary is highly conserved with the human’s. Compared to 39 Hox genes with humans and other mammals, zebrafish has at least 48 Hox genes. Therefore, zebrafish is an ideal model to further investigate Hox code in hematopoietic system.In this study, we first use quantitative RT-PCR or qRT-PCR,to examine the expressions of 41 Hox genes in 30 hpf and60hpf of zebrafish embryos and four adult organs. These adult organs are supposed to closely link to hematopoiesis. Our results show that the number and abundance of the Hox gene expression reduces when the embryos grow.There are 31 hox genes expressing at 30hpf, and 26 hox genes at 60 hpf. In adult organs, five Hox genes are expressed in, liver, 24 in heart, 22 in spleen and 23 in kidney. The majority of the expressed genes belong to the A & B cluster, and mostly are located the the 3 'end including paralogs 1 to 9. While the genes of a10b，a11a，a11b，c4a，c6b，c11a，c11b，c12b，d4a，d9a，d10a，d11a are transiently expressed, the expression of Hoxa2b，a5a，a9a， b2a，b8a and d3a are stably detected in heart, spleen and kidney. Consistently, Hoxa1a，a2b，a3a，a4a，a5a，a9a，a11a，b5a，b6a，b7a，b8a and d3a are highly expressed in the embryos, spleen and kidney, suggesting that these genes may be specific to hematopoiesis.To determine the spatio-temporal expression patterns of Hox genes, we then select three representative Hox genes and perform RNA in situ hybridizations. We find that the expression of Hoxa2b is located in the head area while, Hoxa5a and Hoxa9a are respectively expressed in the central and caudally part of the embryo of 20hpf. In 3dpf juvenile fish, however, the anterior-posterior (AP) patterns disappear. Hoxa2b, Hoxa5a and Hoxa9a genes become expressed in similar domain，localized in the presumptive thymic primordium. In adult, Hoxa2b、Hoxa5a、Hoxa9a genes are mainly distributed in the red pulp of the spleen, and in the edge of renal tubules. Given that Hox genes are mainly expressed in the lower differentiated stem cells e or precursors, we propose that the neighbor of renal tubules and red pulp of the spleen may be the homing sites where hematopoietic stem cells proliferate and differentiate into hemacytoblasts or myeloblasts.To verify our hypothesis mentioned above, we finally create the MLL-AF9 transgenic zebrafish. MLL-AF9 fusion protein has been shown to aggreasively increase the the expression of Hoxa cluster genes, particularly of 5’ Hoxa cluster genes. In this study we do find higher expression levels of Hoxa2b，a9a，b5a，b5b in transgenic zebrafish.These results further demonstrate that Hox genes are spatotemporally expressed in hematopoeitic cells and their homing locations.In conclusion, the Hox code refers to the expression pattern of Hox genes in a mode of time and spatial collinearity. This characteristic expressionm play critical roles in in the hematopoietic developemnt of the zebrafish. It is still unknown whether Hox expression pattern determines the homing and trifficking og hematopoietic cells or homing microenviroment confers Hox expression patterns to hematopoietic cells. Whatever, our study has proivided a new venue for us to further validate the functions of Hox gene in the migration and homing of adult stem cells.KEY WORDS: Homeobox gene, adult stem cells, Homing, Real-time PCR, in situ hybridization,zebrafish.目录第一章综述 (1)1.1 同源盒基因及Hox密码 (1)1.2 Hox基因家族的主要生理功能。

一种Ⅱ型糖尿病斑马鱼模型的构建方法及应用[发明专利]

专利名称：一种Ⅱ型糖尿病斑马鱼模型的构建方法及应用专利类型：发明专利
发明人：薛钰,彭伟,许璟瑾,雷妙玉,潘裕添
申请号：CN201911005040.4
申请日：20191022
公开号：CN110714026A
公开日：
20200121
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种Ⅱ型糖尿病斑马鱼模型的构建方法及应用，涉及医药技术领域。

其包括如下步骤：(1)构建转基因斑马鱼；(2)采用药物对转基因斑马鱼进行造模；在步骤(1)构建转基因斑马鱼的过程中，先构建表达载体，再将表达载体与Tol2 mRNA混合，显微注射到斑马鱼胚胎中；表达载体包括pdx1基因启动子，编码荧光蛋白的基因和nsfb基因；其中步骤(2)中所采用的药物为含有硝基基团的化合物。

本发明利用pdx1启动子构建胰腺组织特异表达荧光蛋白和硝基还原酶的转基因品系，对该品系用含有硝基基团的化合物诱导可特异杀死胰腺组织细胞，从而模拟II型糖尿病。

申请人：闽南师范大学
地址：363000 福建省漳州市县前直街36号
国籍：CN
代理机构：北京超凡宏宇专利代理事务所(特殊普通合伙)
代理人：刘兰
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斑马鱼糖尿病模型的构建及应用进展

doi:10.3969/j.issn.1674-5817.2020.06.016•综述•斑马鱼糖尿病模型的构建及应用进展江霞钱豪杰2,魏迅】，郑羽旋】，周正宇1(1.苏州大学实验动物中心，苏州215123; 2.苏州市科学技术局，苏州215002)［摘要］糖尿病是一组代谢紊乱性疾病，其发病机制至今尚未完全阐明。

糖尿病主要分为1型糖尿病、2型糖尿病和妊娠糖尿病。

常用的糖尿病模型动物主要有小鼠、大鼠、兔、小型猪和扌弥猴等。

另外，斑马鱼(Danio reri o)作为一种模式生物，在很多领域已被用于构建人类疾病模型，包括1型糖尿病和2型糖尿病研究中斑马鱼模型也取得了一定的应用进展。

本文总结了现有的斑马鱼糖尿病模型构建方法以及应用进展，以期为今后糖尿病斑马鱼模型研究及应用提供参考”［关键词］糖尿病；斑马鱼；动物模型；1型糖尿病；2型糖尿病［中图分类号］Q95-33；R587.1［文献标志码］A［文章编号］1674-5817(2020)06-0547-06糖尿病是以慢性高血糖为特征，由胰岛素分泌或其作用缺陷引起的非传染性代谢性疾病。

国际糖尿病联合会(International Diabetes Federation, IDF)指出，2015年全球有4.15亿糖尿病忠者，预计到2040年糖尿病忠者将增至6.42亿2〕。

随着中国老年人口数目增加，老龄化速度加快，最近三十多年来中国糖尿病发病率从0.67%飙升至10.9%，因此中国已经成为糖尿病大国之一［3］。

已知糖尿病主要分为1型、2型以及妊娠糖尿病，其中多数患者为1梨糖尿病或2烈糖尿病。

动物模梨是研究人类疾病发病机制的良好材料，且便于治疗药物的研发与筛选。

目前较成熟的糖尿病动物模型有大鼠、小鼠、兔和小型猪等，它们的优点是实验稳定性好，缺点是需要样本量大、实验周期长(通常需要2〜3个月)，且难以完全呈现出人类糖尿病的临床症状和发病过程。

因此，开发新的动物模梨对糖尿病发病机［收稿日期］2020-04-01［基金项目］国家自然科学基金资助项日(31970505)［作者简介］江霞(1993―),女，硕士研究生。

斑马鱼免疫细胞一代与介导免疫应答的信号通路

斑马鱼免疫细胞一代与介导免疫应答的信号通路斑马鱼是一种重要的实验动物，被广泛用于生物医学研究中。

其免疫系统也成为了一个重要的研究对象。

在斑马鱼免疫系统中，免疫细胞扮演了重要的角色，而免疫细胞一代与介导免疫应答的信号通路则是其实现的关键。

免疫细胞一代指的是由骨髓造血干细胞生成的淋巴细胞、单核细胞和粒细胞等细胞。

这些免疫细胞在斑马鱼体内具有泛素化作用，并参与介导免疫应答。

免疫细胞一代主要包括B细胞、T细胞和巨噬细胞等，其中B细胞主要参与抗体介导的免疫应答，T细胞则主要参与细胞介导的免疫应答，而巨噬细胞则主要具有吞噬和消化作用，在感染和炎症等过程中发挥着重要的作用。

介导免疫应答的信号通路主要包括T细胞受体、B细胞受体和细胞因子等。

T细胞受体是由T细胞表面的TCR（T细胞受体）和CD3分子复合体组成的，具有识别抗原的作用。

B细胞受体则由IgM和IgD分子组成，能够特异性地结合抗原并激活B细胞。

细胞因子则是介导免疫反应的重要分子，包括IL、IFN、TNF等。

在介导免疫应答的信号通路中，信号的传递主要经过T细胞、B细胞和APC （抗原呈递细胞）等，这些细胞在免疫应答时相互作用，从而实现免疫细胞的激活和功能的调节。

APC主要包括树突细胞、巨噬细胞和B细胞等，这些细胞通过呈递抗原和信号分子的方式，在免疫反应过程中起到了重要的作用。

免疫细胞一代与介导免疫应答的信号通路在斑马鱼中发挥着重要的作用。

斑马鱼的免疫系统相对简单，但与人类免疫系统具有很多共同点，因此在免疫学的研究中得到了广泛的应用。

通过对斑马鱼免疫细胞一代的研究，人们可以更深入地了解免疫系统的结构和功能，从而更好地开发新型的免疫治疗和疫苗等。

总之，斑马鱼免疫细胞一代与介导免疫应答的信号通路是斑马鱼免疫系统的重要组成部分，也是斑马鱼生物医学研究中的一个重要研究方向。

通过对这些方面的深入研究，可以更好地了解免疫系统的结构和功能，为开发新型的免疫治疗和疫苗等提供更深入的理论基础和实验依据。

基于斑马鱼模型研究木蝴蝶苷A的抗阿尔茨海默病活性和作用机制

山东科学ＳＨＡＮＤＯＮＧＳＣＩＥＮＣＥ第３６卷第６期２０２３年１２月出版Ｖｏｌ.３６Ｎｏ.６Ｄｅｃ.２０２３收稿日期:２０２３￣０１￣３１基金项目:济南市新高校２０条项目(２０２１ＧＸＲＣ１０６)ꎻ齐鲁工业大学(山东省科学院)科教产融合试点工程项目(２０２２ＰＹ０３３ꎬ２０２２ＪＢＺ０１￣０６)作者简介:时瑞碟(１９９７ )ꎬ女ꎬ硕士研究生ꎬ研究方向为神经药理学ꎮＥ￣ｍａｉｌ:ｓｈｉｒｕｉｄｉｅ＠１６３.ｃｏｍ∗通信作者ꎬ靳梦(１９８５ )ꎬ女ꎬ博士ꎬ研究员ꎬ硕士生导师ꎬ研究方向为神经系统疾病模型建立和神经药理学ꎮＥ￣ｍａｉｌ:ｍｊｉｎ１９８５＠ｈｏｔｍａｉｌ.ｃｏｍ张秀军(１９６６ )ꎬ男ꎬ博士ꎬ教授ꎬ博士生导师ꎬ研究方向为药理学㊁毒理学ꎮＥ￣ｍａｉｌ:ｚｈａｎｇｘｉｕｊｕｎ６６＠１６３.ｃｏｍ基于斑马鱼模型研究木蝴蝶苷Ａ的抗阿尔茨海默病活性和作用机制时瑞碟１ꎬ２ꎬ高鑫２ꎬ王宝堃２ꎬ高代丽２ꎬ靳梦２∗ꎬ张秀军１∗(１.华北理工大学心理与精神卫生学院ꎬ河北唐山０６３２００ꎻ２.齐鲁工业大学(山东省科学院)生物研究所山东省科学院药物筛选技术重点实验室ꎬ山东济南２５０１０３)摘要:基于六水合氯化铝诱导的斑马鱼阿尔茨海默病模型ꎬ探究木蝴蝶苷Ａ的抗阿尔茨海默病活性及作用机制ꎮ将受精后３ｄ的野生型ＡＢ品系斑马鱼随机分为阴性对照组ꎬ８０μｍｏｌ/Ｌ六水合氯化铝模型对照组ꎬ８０μｍｏｌ/Ｌ六水合氯化铝与６μｍｏｌ/Ｌ多奈哌齐阳性对照组ꎬ８０μｍｏｌ/Ｌ六水合氯化铝与不同浓度(５㊁１０㊁２０μｍｏｌ/Ｌ)木蝴蝶苷Ａ受试物组ꎮ斑马鱼受精后６ｄꎬ利用明暗交替行为学实验观察不同处理组斑马鱼行为差异并分析其变化ꎻ通过硫黄素Ｓ染色测定各组斑马鱼头部Ａβ斑块沉积数ꎻ采用酶活测定试剂盒检测各组斑马鱼乙酰胆碱酯酶活性ꎻ以实时荧光定量ＰＣＲ检测自噬相关基因(ｂｅｃｌｉｎ１㊁ｕｌｋ１ｂ㊁ｕｌｋ２和ａｔｇ７)的表达变化ꎻ借助分子对接技术验证木蝴蝶苷Ａ与自噬相关蛋白(ｂｅｃｌｉｎ１㊁ｕｌｋ１ｂ㊁ｕｌｋ２和ａｔｇ７)结合的可靠性ꎮ结果表明ꎬ木蝴蝶苷Ａ缓解了六水合氯化铝造成的斑马鱼运动障碍ꎬ降低了Ａβ斑块沉积数和乙酰胆碱酯酶活性水平ꎬ使自噬相关基因的异常表达趋于正常ꎮ该研究初步揭示了木蝴蝶苷Ａ能够缓解六水合氯化铝诱导的斑马鱼运动障碍ꎬ其机制可能与激活细胞自噬有关ꎬ这为木蝴蝶苷Ａ的临床应用及其治疗阿尔茨海默病的相关研究提供了理论依据ꎮ关键词:阿尔茨海默病ꎻ六水合氯化铝ꎻ自噬ꎻ斑马鱼ꎻ木蝴蝶苷Ａ中图分类号:Ｒ９６５㊀㊀㊀文献标志码:Ａ㊀㊀㊀文章编号:１００２￣４０２６(２０２３)０６￣００２８￣１０开放科学(资源服务)标志码(ＯＳＩＤ):Ａｎｔｉ￣ＡｌｚｈｅｉｍｅｒᶄｓｄｉｓｅａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｏｒｏｘｉｎＡａｎｄｉｔｓｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆａｃｔｉｏｎｂａｓｅｄｏｎｚｅｂｒａｆｉｓｈｍｏｄｅｌＳＨＩＲｕｉｄｉｅ１ꎬ２ꎬＧＡＯＸｉｎ２ꎬＷＡＮＧＢａｏｋｕｎ２ꎬＧＡＯＤａｉｌｉ２ꎬＪＩＮＭｅｎｇ２∗ꎬＺＨＡＮＧＸｉｕｊｕｎ１∗(１.ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＰｓｙｃｈｏｌｏｇｙａｎｄＭｅｎｔａｌＨｅａｌｔｈꎬＮｏｒｔｈＣｈｉｎａＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬＴａｎｇｓｈａｎ０６３２００ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＤｒｕｇＳｃｒｅｅｎｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆＳｈａｎｄｏｎｇＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＢｉｏｌｏｇｙＩｎｓｔｉｔｕｔｅꎬＱｉｌｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ(ＳｈａｎｄｏｎｇＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ)ꎬＪｉｎａｎ２５０１０３ꎬＣｈｉｎａ)ＡｂｓｔｒａｃｔʒＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅａｍｅｌｉｏｒａｔｉｖｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｏｒｏｘｉｎＡｏｎＡｌｚｈｅｉｍｅｒᶄｓｄｉｓｅａｓｅ(ＡＤ)ａｎｄｔｈｅｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆａｃｔｉｏｎꎬａｚｅｂｒａｆｉｓｈＡＤｍｏｄｅｌｉｎｄｕｃｅｄｂｙａｌｕｍｉｎｕｍｃｈｌｏｒｉｄｅｈｅｘａｈｙｄｒａｔｅ(ＡｌＣｌ３)ｗａｓｕｓｅｄ.Ｗｉｌｄ￣ｔｙｐｅｚｅｂｒａｆｉｓｈＡＢｌａｒｖａｅａｔ３ｄｐｆ(ｄａｙｓｐｏｓｔｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ)ｗｅｒｅｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏｄｉｆｆｅｒｅｎｔｇｒｏｕｐｓꎬｉｎｃｌｕｄｉｎｇｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐꎬＡｌＣｌ３(８０μｍｏｌ/Ｌ)ｍｏｄｅｌｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐꎬＡｌＣｌ３(８０μｍｏｌ/Ｌ)ｃｏｍｂｉｎｅｄｗｉｔｈｄｏｎｅｐｅｚｉｌ(６μｍｏｌ/Ｌ)ｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐꎬａｎｄＡｌＣｌ３(８０μｍｏｌ/Ｌ)ｃｏｍｂｉｎｅｄｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ(５ꎬ１０ꎬａｎｄ２０μｍｏｌ/Ｌ)ｏｆｏｒｏｘｉｎＡｔｅｓｔｇｒｏｕｐ.Ａｔ６ｄｐｆꎬｚｅｂｒａｆｉｓｈｂｅｈａｖｉｏｒｗａｓｍｏｎｉｔｏｒｅｄａｎｄａｎａｌｙｚｅｄｕｓｉｎｇｚｅｂｒａｆｉｓｈｌｉｇｈｔ￣ｄａｒｋｌｏｃｏｍｏｔｉｏｎｔｅｓｔ.ＡβｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎｉｎｚｅｂｒａｆｉｓｈｈｅａｄｓｗａｓａｓｓａｙｅｄｂｙｔｈｉｏｆｌａｖｉｎＳｓｔａｉｎｉｎｇ.Ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅａｓｓａｙｋｉｔｔｅｓｔｅｄａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ(ＡｃｈＥ)ａｃｔｉｖｉｔｙ.Ｉｎａｄｄｉｔｉｏｎꎬｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆａｕｔｏｐｈａｇｙ￣ｒｅｌａｔｅｄｇｅｎｅｓ(ｂｅｃｌｉｎ１㊁ｕｌｋ１ｂ㊁ｕｌｋ２ａｎｄａｔｇ７)ｗａｓｔｅｓｔｅｄｂｙｒｅａｌ￣ｔｉｍｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ.ＭｏｌｅｃｕｌａｒｄｏｃｋｉｎｇｗａｓｐｅｒｆｏｒｍｅｄｔｏｖａｌｉｄａｔｅｔｈｅｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｏｒｏｘｉｎＡａｎｄａｕｔｏｐｈａｇｙ￣ｒｅｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ(ｂｅｃｌｉｎ１㊁ｕｌｋ１ｂ㊁ｕｌｋ２ａｎｄａｔｇ７).ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｏｒｏｘｉｎＡｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｒｅｌｉｅｖｅｄｔｈｅｄｙｓｋｉｎｅｓｉａａｎｄｉｎｈｉｂｉｔｅｄＡβｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎａｎｄＡｃｈＥａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｚｅｂｒａｆｉｓｈｉｎｄｕｃｅｄｂｙＡｌＣｌ３.Ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆａｕｔｏｐｈａｇｙ￣ｒｅｌａｔｅｄｇｅｎｅｓｔｅｎｄｅｄｔｏｂｅｎｏｒｍａｌａｆｔｅｒｏｒｏｘｉｎＡｔｒｅａｔｍｅｎｔ.ＴｈｉｓｓｔｕｄｙｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｉｌｙｒｅｖｅａｌｅｄｔｈａｔｏｒｏｘｉｎＡａｌｌｅｖｉａｔｅｄＡｌＣｌ３￣ｉｎｄｕｃｅｄＡＤｓｙｍｐｔｏｍｓｉｎｚｅｂｒａｆｉｓｈꎬｗｈｅｒｅｔｈｅｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆａｃｔｉｏｎｉｓｐｏｓｓｉｂｌｙａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈａｃｔｉｖａｔｅｄａｕｔｏｐｈａｇｙꎬｐｒｏｖｉｄｉｎｇａｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌｂａｓｉｓｆｏｒｔｈｅｃｌｉｎｉｃａｌａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｏｒｏｘｉｎＡａｎｄｉｔｓｒｅｌａｔｅｄｒｅｓｅａｒｃｈｉｎｔｒｅａｔｉｎｇＡＤ.ＫｅｙｗｏｒｄｓʒＡｌｚｈｅｉｍｅｒᶄｓｄｉｓｅａｓｅꎻａｌｕｍｉｎｕｍｃｈｌｏｒｉｄｅｈｅｘａｈｙｄｒａｔｅꎻａｕｔｏｐｈａｇｙꎻｚｅｂｒａｆｉｓｈꎻｏｒｏｘｉｎＡ㊀㊀阿尔茨海默病(ＡｌｚｈｅｉｍｅｒᶄｓｄｉｓｅａｓｅꎬＡＤ)是一种常见的神经退行性疾病ꎬ主要病理特征是细胞外β￣淀粉样蛋白(ａｍｙｌｏｉｄβ￣ｐｒｏｔｅｉｎꎬＡβ)斑块的沉积和细胞内神经原纤维缠结的形成[１]ꎮＡＤ的发病机制复杂多样ꎬ目前广为认可的发病机制假说包括淀粉样蛋白级联假说㊁ｔａｕ蛋白异常磷酸化假说㊁胆碱能假说等[２]ꎮ目前针对ＡＤ的治疗ꎬ主要是胆碱酯酶抑制剂(多奈哌齐㊁加兰他敏和卡巴拉汀)和Ｎ￣甲基￣Ｄ￣天冬氨酸受体拮抗剂(美金刚)[２]ꎮ这些药物虽然能在一定程度上改善ＡＤ患者的行为和认知障碍ꎬ但并不能治愈或者预防该疾病ꎮ自噬是细胞自我降解的过程ꎬ在去除错误折叠或聚集的蛋白质㊁清除受损细胞器等方面起着重要作用[３]ꎮ研究表明自噬的增强能够降低人神经元细胞中ｔａｕ蛋白的过度磷酸化ꎬ缓解ＡＤ小鼠模型的记忆障碍[４]ꎮ杜仲雄花通过调节自噬基因异常表达来改善ＡＤ样症状[５]ꎮ自噬与ＡＤ病理之间存在复杂的联系ꎬ这表明自噬相关蛋白(ｂｅｃｌｉｎ１㊁ｕｌｋ２㊁ｕｌｋ１ｂ和ａｔｇ７)可能是ＡＤ治疗的重要靶点ꎮ中药木蝴蝶来源于紫葳科植物木蝴蝶的干燥成熟种子ꎬ具有清肺利咽㊁疏肝和胃等作用[６]ꎮ木蝴蝶苷Ａ是木蝴蝶提取而得到的一种黄酮类物质ꎮ研究表明ꎬ木蝴蝶苷Ａ具有抗氧化㊁抗炎㊁抗病毒㊁抗癌等特性ꎬ但目前还缺乏关于木蝴蝶苷Ａ对神经系统疾病作用的研究[７￣８]ꎮ斑马鱼是人类疾病和药物开发的理想模型系统ꎬ常用于研究ＡＤ㊁帕金森病㊁精神分裂症等神经退行性疾病ꎮ六水合氯化铝诱导的斑马鱼ＡＤ模型ꎬ是一种比较成熟的能够反映ＡＤ主要特征性病理变化的体内动物模型[９]ꎮ本研究中ꎬ我们使用六水合氯化铝诱导的斑马鱼ＡＤ模型ꎬ通过观察并记录斑马鱼的行为表现ꎬ检测乙酰胆碱酯酶(ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅꎬＡｃｈＥ)的活性和Ａβ斑块沉积以及测定自噬相关基因的表达变化ꎬ从而分析木蝴蝶苷Ａ对六水合氯化铝诱导的斑马鱼ＡＤ症状是否具有缓解作用ꎬ并对其机制进行探究ꎮ１㊀仪器与材料１.１㊀实验仪器Ｚ￣Ａ￣Ｓ５斑马鱼养殖系统(上海海圣公司)ꎻＺｅｂｒａＬａｂ３.３Ｚｅｂｒａｂｏｘ斑马鱼行为分析仪(法国Ｖｉｅｗｐｏｉｎｔ公司)ꎻＨＰＧ￣２８０ＢＸ光照培养箱(东联电子技术开发有限公司)ꎻ１３７２０实时荧光定量ＰＣＲ仪器(瑞士Ｒｏｃｈｅ诊断产品有限公司)ꎻＣ１０００Ｔｏｕｃｈ梯度ＰＣＲ仪(美国Ｂｉｏ￣Ｒａｄ公司)ꎻＦＶ１２００激光扫描共聚焦显微镜(日本Ｏｌｙｍｐｕｓ公司)ꎻＮａｎｏＤｒｏｐＯｎｅ超微量分光光度计(上海基因生物技术国际贸易有限公司)ꎻＳｐｅｃｔｒａＭＲ全波长酶标仪(美国Ｄｙｎｅｘ公司)ꎮ１.２㊀实验材料木蝴蝶苷Ａ(批号ＤＭ００２８ꎬ纯度ȡ９６％ꎬ成都乐美天医药科技有限公司)ꎻ六水合氯化铝(批号Ａ１１２５１１ꎬ纯度９９.９９％ꎬ上海阿拉丁生化科技股份有限公司)ꎻ盐酸多奈哌齐(批号Ｄ１２９９４８ꎬ纯度ȡ９８％ꎬ上海阿拉丁生化科技股份有限公司)ꎻＲＮＡ快速提取试剂盒(批号３１２４２３ＡＸꎬ北京艾德莱生物科技有限公司)ꎻ逆转录试剂盒(批号Ｅ０４７￣０１Ｂꎬ苏州近岸蛋白质科技股份有限公司)ꎻＢＣＡ蛋白浓度测定试剂盒(批号************ꎬ上海碧云天生物技术有限公司)ꎻ实时荧光定量ＰＣＲ试剂盒(批号Ｅ０９６￣０１Ｂꎬ苏州近岸蛋白质科技股份有限公司)ꎻ硫磺素Ｓ(批号ＭＫＣＨ４１０８ꎬ美国Ｓｉｇｍａ公司)ꎻＡｃｈＥ活性检测试剂盒(批号２０２００８２９ꎬ南京建成生物工程研究所)ꎻＮ￣苯基硫脲(批号Ｐ７６２９ꎬ美国Ｓｉｇｍａ公司)ꎻ０.３％ＴｒｉｔｏｎＸ￣１００(批号３４６６８５０ꎬ上海生工生物工程有限公司)ꎻ柠檬酸钠抗原修复液(１ˑ)(批号２０１９０３２２ꎬ北京索莱宝科技有限公司)ꎻ４％多聚甲醛(批号７１０４１８００ꎬ北京兰杰柯科技有限公司)ꎮ１.３㊀斑马鱼品系野生型ＡＢ品系斑马鱼由山东省科学院生物研究所提供ꎮ将成年斑马鱼饲养在恒温２８ħ的养殖系统中ꎬ每天同一时间段给与１４ｈ/１０ｈ的光照循环ꎬ定点喂食两次丰年虾ꎮ将成年斑马鱼按照２:２的雌雄比例于前一天分别放置于鱼缸中ꎬ用挡板将雌雄鱼分开ꎬ并于第二天早上８:３０抽取挡板ꎬ大概２ｈ后ꎬ将鱼缸中的鱼卵转移到玻璃缸中ꎬ并加入５ｇ/Ｌ的亚甲基蓝ꎬ之后放置在恒温２８ħ的光照培养箱中培养ꎮ２㊀方法２.１㊀实验分组及处理将受精后３ｄ的斑马鱼随机转移到６孔细胞培养板中ꎬ之后将斑马鱼随机分为６个组:阴性对照组ꎬ六水合氯化铝(８０μｍｏｌ/Ｌ)模型对照组ꎬ六水合氯化铝和不同浓度(５㊁１０和２０μｍｏｌ/Ｌ)木蝴蝶苷Ａ受试物共处理组ꎬ六水合氯化铝和多奈哌齐(６μｍｏｌ/Ｌ)阳性对照组ꎮ每天给药一次ꎬ之后放置在光照培养箱中培养ꎮ在斑马鱼受精后６ｄ进行明暗交替行为学观察ꎬＡｃｈＥ活性检测ꎬ斑马鱼头部Ａβ斑块数检测和实时荧光定量ＰＣＲ分析自噬相关基因的表达ꎮ２.２㊀明暗交替行为学观察将受精后６ｄ的斑马鱼(ｎ＝３２)分别吸入到４８孔板中ꎬ每孔加入１ｍＬ的养鱼水ꎮ将斑马鱼置于行为学观测箱中在１００％光照环境中适应１０ｍｉｎꎬ之后进行６０ｍｉｎ包括３组明暗交替循环(１０ｍｉｎ黑暗ꎬ１０ｍｉｎ光照)的行为学测试ꎮ实验结束后利用Ｚｅｂｒａｂｏｘ斑马鱼行为分析仪对斑马鱼的游动轨迹㊁游动速度和游动距离进行分析ꎮ２.３㊀ＡｃｈＥ活性检测将药物处理结束的受精后６ｄ的斑马鱼(ｎ＝１００)收集在１.５ｍＬ的离心管中ꎬ每管加入２００μＬ的生理盐水ꎬ之后用破碎机进行破碎匀浆ꎮ以１１０００ｒ/ｍｉｎ的转速在４ħ离心１０ｍｉｎ后取上清液ꎬ之后按照ＢＣＡ蛋白浓度测定试剂盒说明书进行操作ꎬ用全波长酶标仪测定５６２ｎｍ处的光密度值(ｏｐｔｉｃａｌｄｅｎｓｉｔｙꎬＯＤ)并计算样品的蛋白浓度ꎮ之后根据ＡｃｈＥ活性检测试剂盒的说明书ꎬ稍作修改后进行实验ꎮ具体操作为分别吸取双蒸水㊁底物缓冲液和显色应用液各５㊁５０㊁５０μＬ配置空白管所需溶液ꎻ分别吸取标准液㊁底物缓冲液和显色应用液各５㊁５０㊁５０μＬ配置标准管所需溶液ꎻ分别吸取各组斑马鱼样品蛋白上清液㊁底物缓冲液和显色应用液各５㊁５０㊁５０μＬ配置不同处理组的测定溶液ꎮ之后将各组配置好的溶液振荡混匀后加入到９６孔板中ꎬ每个处理组５次重复ꎮ在３７ħ恒温培养箱中孵育２０ｍｉｎ后ꎬ每孔加入１０μＬ的透明剂和３μＬ的抑制剂ꎮ在室温下放置１５ｍｉｎ后ꎬ使用酶标仪在４１２ｎｍ波长和０.５ｃｍ光径处测定ＯＤ值ꎬ之后根据各样品组的ＯＤ值和浓度ꎬ计算得出各处理组的ＡｃｈＥ活力ꎮ２.４㊀斑马鱼头部Ａβ斑块数检测将受精后的斑马鱼卵收到养鱼缸之后ꎬ加入１ｍｇ/ｍＬ的Ｎ￣苯基硫脲以抑制黑色素的形成ꎮ每天同一时间换一次液ꎬ其他药物处理方法同２.１节所述ꎮ将４％多聚甲醛处理后的受精后６ｄ的斑马鱼放入４ħ冰箱中过夜ꎮ第二天使用磷酸缓冲盐缓冲液(ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｅｄｓａｌｉｎｅꎬＰＢＳ)将斑马鱼清洗３次ꎬ每次１０ｍｉｎꎮ将清洗完的斑马鱼使用１％的琼脂凝胶固定后ꎬ进行酒精梯度脱水ꎬ二甲苯透明ꎬ石蜡浸润ꎮ之后将处理完的蜡块ꎬ以７μｍ间距进行横切切片ꎮ脱蜡之后在室温下用ＰＢＳ洗涤切片５ｍｉｎꎬ重复３次ꎮ吸干水分ꎬ用免疫组化笔将载玻片上的组织框起来ꎮ然后按照３μＬ:１ｍＬ比例配制０.３％ＴｒｉｔｏｎＸ￣１００和柠檬酸钠抗原修复液(１ˑ)ꎬ混匀后加到框起来的组织上ꎬ在４ħ冰箱孵育２０ｍｉｎ后ꎬ用ＰＢＳ清洗２次ꎬ每次５ｍｉｎꎮ用滤纸将载玻片上的ＰＢＳ完全吸干后ꎬ在免疫组化笔圈住的部分加入０.３％硫黄素Ｓꎬ并放入４ħ冰箱避光过夜ꎮ第二天用ＰＢＳ在避光环境下洗涤切片１０ｍｉｎꎬ重复３次ꎬ之后用激光扫描共聚焦显微镜观察斑马鱼头部Ａβ斑块沉积状况并进行拍照ꎮ使用Ｉｍａｇｅ￣ＰｒｏＰｌｕｓ５.１分析图像ꎬ并计数斑马鱼头部Ａβ斑块沉积数ꎮ２.５㊀实时荧光定量ＰＣＲ分析自噬相关基因的表达将药物处理结束的受精后６ｄ的斑马鱼(ｎ＝３０)收集在１.５ｍＬ的离心管中ꎬ每管加入５００μＬ的裂解液ꎬ之后用破碎机进行破碎匀浆ꎮ按照ＲＮＡ快速提取试剂盒的说明书进行ＲＮＡ提取后ꎬ利用超微量分光光度计检测不同组别斑马鱼的ＲＮＡ浓度ꎮ之后立即使用Ｃ１０００Ｔｏｕｃｈ梯度ＰＣＲ仪将ＲＮＡ进行逆转录ꎬ将逆转录得到的ｃＤＮＡ进行稀释ꎬ之后根据实时荧光定量ＰＣＲ试剂盒说明书ꎬ加入相应的引物ꎮ用实时荧光定量ＰＣＲ仪对基因进行扩增ꎬ扩增结束后ꎬ用Ｃｑ值计算各组样品基因的差异表达ꎬ选用ｒｐｌ１３ａ为内参ꎬ目的基因与内参基因的Ｃｑ差值用ΔＣｑ表示ꎬΔΔＣｑ值为各样品的ΔＣｑ值与Ｃｔｌ组ΔＣｑ值平均数的差值ꎬｍＲＮＡ的相对表达量根据２－ΔΔＣｑ相对定量法计算ꎬ每组设置３个重复组ꎮ引物序列见表１ꎮ表１㊀实时荧光定量ＰＣＲ所需引物序列信息ＴａｂｌｅＰＣＲｒｐｌ１３ａ上游:ＴＣＴＧＧＡＧＧＡＣＴＧＴＡＡＧＡＧＧＴＡＴＧＣ下游:ＡＧＡＣＧＣＡＣＡＡＴＣＴＴＧＡＧＡＧＣＡＧｂｅｃｌｉｎ１上游:ＧＴＴＣＡＧＧＴＧＧＴＣＴＧＣＧＴＴＴＴ下游:ＧＣＡＡＡＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＴＧＴＣＡｕｌｋ１ｂ上游:ＡＧＧＣＣＧＡＡＡＧＴＣＴＣＡＣＴＴＣＡ下游:ＡＧＣＣＡＴＧＴＡＣＡＴＣＧＧＡＧＡＣＣｕｌｋ２上游:ＡＣＣＴＣＴＧＡＴＴＧＧＣＴＧＡＣＡＡＡＡＴ下游:ＧＡＧＡＴＴＧＣＡＡＧＡＧＧＣＴＴＧＡＧＴＴａｔｇ７上游:ＡＧＡＧＴＣＣＡＧＴＣＣＧＡＴＧＴＣ下游:ＡＧＡＡＧＴＡＡＣＡＧＣＣＧＡＧＡＣＧ２.６㊀分子对接的准备过程木蝴蝶苷Ａ的３Ｄ结构从ＰｕｂＣｈｅｍ(ｈｔｔｐｓ://ｐｕｂｃｈｅｍ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ/)数据库中下载ꎬ自噬相关蛋白(ｂｅｃｌｉｎ１㊁ｕｌｋ１ｂ㊁ｕｌｋ２和ａｔｇ７)的３Ｄ结构从ＰｒｏｔｅｉｎＤａｔａＢａｎｋ(ｈｔｔｐｓ://ｗｗｗ.ｒｃｓｂ.ｏｒｇ/)数据库下载ꎮ使用薛定谔分子对接软件对自噬相关蛋白进行加氢㊁去水等处理ꎬ之后将自噬相关蛋白和木蝴蝶苷Ａ进行对接ꎬ以对接分数作为分子对接的结果ꎬ最后借助Ｐｙｍｏｌ进行可视化分析ꎮ２.７㊀统计分析使用ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ７.０通过单向方差分析和双向方差分析进行统计分析ꎬ结果用ｘʃｓ表示ꎬＰ<０.０５表示差异有统计学意义ꎮ３㊀结果３.１㊀木蝴蝶苷Ａ具有缓解六水合氯化铝诱导的斑马鱼运动障碍作用如图１(ａ)和１(ｂ)所示ꎬ与空白对照组的斑马鱼相比ꎬ六水合氯化铝模型对照组中斑马鱼的游动总距离明显变短(Ｐ<０.００１)ꎬ游动速度减缓ꎮ与六水合氯化铝模型对照组相比ꎬ不同浓度的木蝴蝶苷Ａ受试物(５㊁１０㊁２０μｍｏｌ/Ｌ)与六水合氯化铝共同处理时ꎬ斑马鱼的游动总距离(Ｐ＝０.００９ꎬＰ＝０.００２ꎬＰ<０.００１)和速度均显著增加ꎮ与六水合氯化铝模型对照组相比ꎬ六水合氯化铝和多奈哌齐阳性对照组的速度和总距离有所增加ꎬ其结果(Ｐ＝０.２３)不具有统计学意义ꎮ如图１(ａ)所示ꎬ在黑暗环境下ꎬ不同药物处理组斑马鱼的游动距离变化与总游动距离变化具有一致性ꎮ以上结果表明ꎬ木蝴蝶苷Ａ对六水合氯化铝诱导的斑马鱼运动障碍具有一定的缓解作用ꎮ注:∗∗Ｐ<０.０１ｖｓ.空白对照组ꎬ∗∗∗Ｐ<０.００１ｖｓ.空白对照组ꎻ＃＃Ｐ<０.０１ｖｓ.模型对照组ꎬ＃＃＃Ｐ<０.００１ｖｓ.模型对照组ꎻｎ＝３２ꎻ红色线为快速游动轨迹ꎬ绿色线为中速游动轨迹ꎬ黑色线为慢速游动轨迹ꎮ图１㊀木蝴蝶苷Ａ对六水合氯化铝诱导的斑马鱼运动障碍的影响Ｆｉｇ.１㊀ＥｆｆｅｃｔｏｆｏｒｏｘｉｎＡｏｎａｌｕｍｉｎｕｍｃｈｌｏｒｉｄｅｈｅｘａｈｙｄｒａｔｅ￣ｉｎｄｕｃｅｄｌｏｃｏｍｏｔｉｏｎｉｍｐａｉｒｍｅｎｔｓｉｎｚｅｂｒａｆｉｓｈ３.２㊀木蝴蝶苷Ａ对斑马鱼头部Ａβ斑块沉积的抑制作用如图２(ａ)和２(ｂ)所示ꎬ与空白对照组相比ꎬ六水合氯化铝模型对照组的斑马鱼大脑中Ａβ斑块的数明显增多(Ｐ<０.００１)ꎮ与六水合氯化铝模型对照组相比ꎬ六水合氯化铝和多奈哌齐阳性对照组中Ａβ斑块沉积数减少(Ｐ＝０.０６)ꎬ六水合氯化铝和木蝴蝶苷Ａ受试物组的Ａβ斑块沉积数显著降低(Ｐ＝０.０３ꎬＰ＝０.００２)ꎮ注:∗∗∗Ｐ<０.００１ｖｓ.空白对照组ꎻ＃Ｐ<０.０５ｖｓ.模型对照组ꎬ＃＃Ｐ<０.０１ｖｓ.模型对照组ꎻｎ＝８ꎮ图２㊀木蝴蝶苷Ａ对斑马鱼头部Ａβ斑块沉积的抑制Ｆｉｇ.２㊀ＩｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆｏｒｏｘｉｎＡｏｎＡβｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎｉｎｚｅｂｒａｆｉｓｈ３.３㊀木蝴蝶苷Ａ对ＡｃｈＥ活性的抑制作用抑制ＡｃｈＥ活性ꎬ可以提高脑中的乙酰胆碱水平ꎬ从而改善ＡＤ患者的学习记忆障碍[１０]ꎮ在本实验中ꎬ研究探讨了木蝴蝶苷Ａ对六水合氯化铝处理的斑马鱼ＡｃｈＥ活性的影响ꎮ如图３所示ꎬ与空白对照组相比ꎬ六水合氯化铝模型对照组斑马鱼的ＡｃｈＥ活性显著增加(Ｐ<０.００１)ꎮ与六水合氯化铝模型对照组相比ꎬ六水合氯化铝和多奈哌齐阳性对照组中斑马鱼的ＡｃｈＥ活性显著降低(Ｐ＝０.００８)ꎬ在六水合氯化铝和木蝴蝶苷Ａ受试物组中斑马鱼的ＡｃｈＥ活性也显著降低(Ｐ<０.００１)ꎬ且剂量与效应呈正相关ꎮ注:∗∗Ｐ<０.０１ｖｓ.空白对照组ꎻ＃＃Ｐ<０.０１ｖｓ.模型对照组ꎬ＃＃＃Ｐ<０.０１ｖｓ.模型对照组ꎻｎ＝５ꎮ图３㊀木蝴蝶苷Ａ对斑马鱼ＡｃｈＥ活性的抑制Ｆｉｇ.３㊀ＩｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆｏｒｏｘｉｎＡｏｎｔｈｅＡｃｈＥａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｚｅｂｒａｆｉｓｈ３.４㊀木蝴蝶苷Ａ对自噬相关基因表达的影响如图４所示ꎬ与空白对照组相比ꎬ六水合氯化铝模型对照组中ｂｅｃｌｉｎ１㊁ｕｌｋ１ｂ㊁ｕｌｋ２㊁和ａｔｇ７的表达明显下调(Ｐ＝０.０２ꎬＰ<０.００１ꎬＰ<０.００１ꎬＰ<０.００１)ꎮ如图４(ａ)所示ꎬ与六水合氯化铝模型对照组相比ꎬ六水合氯化铝与５㊁２０μｍｏｌ/Ｌ木蝴蝶苷Ａ受试物组ｂｅｃｌｉｎ１表达明显上调(Ｐ＝０.００１ꎬＰ<０.００１)ꎻ如图４(ｂ)所示ꎬ六水合氯化铝与不同浓度木蝴蝶苷Ａ(５㊁１０㊁２０μｍｏｌ/Ｌ)受试物组中ｕｌｋ１ｂ的表达明显上调(Ｐ<０.００１ꎬＰ<０.００１ꎬＰ<０.００１)ꎻ如图４(ｃ)所示ꎬ六水合氯化铝与５㊁２０μｍｏｌ/Ｌ木蝴蝶苷Ａ受试物组ｕｌｋ２表达明显上调(Ｐ<０.００１ꎬＰ<０.００１)ꎻ如图４(ｄ)所示ꎬ六水合氯化铝与不同浓度木蝴蝶苷Ａ(５㊁１０㊁２０μｍｏｌ/Ｌ)受试物ａｔｇ７的表达也明显上调(Ｐ＝０.０１ꎬＰ<０.００１ꎬＰ<０.００１)ꎮ注:∗Ｐ<０.０５ｖｓ.空白对照组ꎬ∗∗∗Ｐ<０.００１ｖｓ.空白对照组ꎻ＃Ｐ<０.０５ｖｓ.六水合氯化铝ꎬ＃＃Ｐ<０.０１ｖｓ.六水合氯化铝ꎬ＃＃＃Ｐ<０.０１ｖｓ.六水合氯化铝ꎻｎ＝４０ꎮ图４㊀木蝴蝶苷Ａ对自噬相关基因表达的影响Ｆｉｇ.４㊀ＥｆｆｅｃｔｓｏｆｏｒｏｘｉｎＡｏｎａｕｔｏｐｈａｇｙｒｅｌａｔｅｄｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ３.５㊀分子对接结果通过２.６方法对木蝴蝶苷Ａ与自噬相关蛋白(ｂｅｃｌｉｎ１㊁ｕｌｋ１ｂ㊁ｕｌｋ２和ａｔｇ７)进行分子对接ꎬ得出图５ꎬ即ｂｅｌｃｌｉｎ１(ＰＤＢＩＤ:４ＺＷ１)与木蝴蝶苷Ａ的对接㊁ｕｌｋ１ｂ(ＰＤＢＩＤ:６ＹＩＤ)与木蝴蝶苷Ａ的对接㊁ｕｌｋ２(ＰＤＢＩＤ:６ＱＡＴ)与木蝴蝶苷Ａ的对接㊁ａｔｇ７(ＰＤＢＩＤ:４ＰＨ４)与木蝴蝶苷Ａ的对接ꎮ木蝴蝶苷Ａ与ｂｅｌｃｌｉｎ１㊁ｕｌｋ１ｂ㊁ｕｌｋ２和ａｔｇ７的对接分数分别为－６.７０７㊁－７.７０８㊁－７.８８８㊁－７.２４９ꎬ这说明木蝴蝶苷Ａ对自噬相关蛋白发挥调控作用ꎮ图５㊀木蝴蝶苷Ａ与自噬相关蛋白的对接结果Ｆｉｇ.５㊀Ｄｏｃｋｉｎｇｒｅｓｕｌｔｓｏｆａｕｔｏｐｈａｇｙ￣ｒｅｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｓｗｉｔｈｏｒｏｘｉｎＡｓｈｏｗｉｎｇｔｈｅｂｉｎｄｉｎｇ４㊀讨论与结论ＡＤ是一种进行性神经退行性疾病ꎬ可导致神经元丧失㊁脑萎缩和死亡ꎮ研究表明ꎬ木蝴蝶能够改善ＡＤ小鼠的学习记忆能力ꎬ但具体哪些化学成分起作用还未见报道ꎬ所以我们利用六水合氯化铝诱导的斑马鱼ＡＤ模型去探讨木蝴蝶苷Ａ的抗ＡＤ活性ꎮ正常斑马鱼在面对突然的刺激时ꎬ会表现出快速的保护反应ꎮ研究表明斑马鱼幼鱼在受精后４ｄ后暴露于明暗交替的刺激时ꎬ在光亮中运动活动会突然增加[１１]ꎮ斑马鱼明暗交替行为学测试常被用来识别测定药物的神经保护活性ꎬ通过评估斑马鱼的游动轨迹㊁游动距离和速度ꎬ可以了解其神经行为效应[１０]ꎮ在本研究中ꎬ明暗交替行为学测试表明ꎬ与空白对照组相比六水合氯化铝模型组的斑马鱼游动速度减慢ꎬ游动距离变短ꎬ表明斑马鱼的认知能力受损ꎬ反应迟缓ꎬ不能对外界刺激做出及时的反应ꎮ而经过木蝴蝶苷Ａ的处理ꎬ这种表现有所改变ꎬ这提示木蝴蝶苷Ａ对六水合氯化铝诱导的斑马鱼运动障碍具有缓解作用ꎮＡＤ的特征在于海马和新皮层中ＡｃｈＥ活性升高ꎬ使ＡＤ患者脑内乙酰胆碱水平降低ꎬ影响神经信号的传递ꎬ从而损伤学习记忆能力[１２]ꎮ抑制ＡｃｈＥ活性ꎬ可以提高脑中的乙酰胆碱水平ꎬ改善ＡＤ患者的学习记忆障碍[１３]ꎮ有研究表明暴露于六水合氯化铝的斑马鱼在５０~２５０μｍｏｌ/Ｌ的浓度范围内显示出ＡｃｈＥ活性增加ꎬ运动活性缺乏[１４]ꎮ我们的研究结果表明ꎬ六水合氯化铝和木蝴蝶苷Ａ受试物组的斑马鱼ＡｃｈＥ的活性水平降低ꎬ这说明木蝴蝶苷Ａ能够抑制ＡｃｈＥ活性ꎬ减少乙酰胆碱的水解ꎮＡβ的细胞毒性已在众多体内和体外研究中得到证实ꎬ脑实质中Ａβ斑块的沉积在ＡＤ发病机制中起着核心作用[１５]ꎮＡβ沉积会引发一系列相关反应ꎬ导致ｔａｕ蛋白的错误折叠和组装ꎬ进而将病变扩散到整个神经回路和皮层ꎬ最终损害神经系统ꎬ导致认知能力下降[１６]ꎮ我们的研究表明ꎬ木蝴蝶苷Ａ明显降低了ＡＤ模型中斑马鱼头部的Ａβ斑块计数ꎮ以上表明木蝴蝶苷Ａ能够缓解六水合氯化铝诱导的ＡＤ样症状ꎮ为了进一步探究木蝴蝶苷Ａ是如何发挥抗ＡＤ活性的ꎬ我们进行了机制探究ꎮ自噬在Ａβ的生成和代谢中起重要作用ꎬ与ＡＤ发病进展密切相关[１７]ꎮｂｅｃｌｉｎ１是酵母自噬蛋白ａｔｇ６和ａｐｇ６的同系物ꎬ被认为是自噬体形成的标记蛋白ꎮ研究表明抑制ｂｅｃｌｉｎ１的表达会增加ＡＤ中Ａβ的聚集ꎬ从而加速神经病变[１８]ꎮ还有研究表明ＡＤ患者神经元ｂｅｃｌｉｎ１表达明显下降[１９]ꎮ在本研究中ꎬ六水合氯化铝模型组ꎬｂｅｃｌｉｎ１的基因表达量明显下调ꎬ六水合氯化铝和木蝴蝶苷Ａ受试物组ｂｅｃｌｉｎ１的表达量上调ꎬ说明木蝴蝶苷Ａ能够促进Ａβ在细胞内部降解ꎮｕｌｋ１ｂ具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性ꎬｕｌｋ２和ｕｌｋ１ｂ在自噬的起始阶段发挥着重要的调控作用[２０]ꎮ六水合氯化铝模型组ｕｌｋ２和ｕｌｋ１ｂ的表达明显下调ꎬ而六水合氯化铝和木蝴蝶苷Ａ受试物组ｕｌｋ２和ｕｌｋ１ｂ的表达明显上调ꎬ说明木蝴蝶苷Ａ能够激活自噬的表达ꎮａｔｇ７是与自噬相关的细胞降解和再循环的必需蛋白质ꎬ主要参与自噬小体的形成ꎬ是调节自噬偶联系统的关键基因[２１]ꎮ研究发现ＡＤ小鼠模型大脑皮层和海马体中ａｔｇ７蛋白水平降低[２２]ꎮ六水合氯化铝模型组ꎬａｔｇ７的表达明显降低ꎬ抑制了自噬的过程ꎬ而六水合氯化铝和木蝴蝶苷Ａ受试物组ａｔｇ７的表达明显上调ꎬ说明ａｔｇ７激活了自噬ꎬ可能促进自噬性溶酶体的形成ꎬ恢复细胞内稳态ꎮ基于分子对接初步模拟木蝴蝶苷Ａ与自噬相关蛋白(ｂｅｃｌｉｎ１㊁ｕｌｋ１ｂ㊁ｕｌｋ２和ａｔｇ７)之间的分子作用机制ꎬ对接分数的大小直接反应预测结果的可靠性ꎬ对接分数越小表示结合活性越高ꎮ其对接分数均为负数ꎬ表明木蝴蝶苷Ａ与自噬相关蛋白(ｂｅｃｌｉｎ１㊁ｕｌｋ１ｂ㊁ｕｌｋ２和ａｔｇ７)具有良好的结合能力ꎮ这进一步验证了木蝴蝶苷Ａ能对自噬相关蛋白发挥调控作用ꎬ但后续仍需进一步的生物实验验证ꎮ本研究通过对六水合氯化铝诱导的斑马鱼行为的观察㊁ＡｃｈＥ活性的检测以及Ａβ斑块的沉积情况ꎬ预测了木蝴蝶苷Ａ对ＡＤ的潜在治疗作用ꎮ实时荧光定量ＰＣＲ以及分子对接的结果提示木蝴蝶苷Ａ可能通过激活自噬ꎬ从而发挥抗ＡＤ活性ꎮ本研究为治疗ＡＤ药物研发拓展了新思路ꎬ但还需要采取哺乳动物实验及临床试验等方法做进一步的验证ꎮ参考文献:[１]ＴＡＴＵＬＩＡＮＳＡ.ＣｈａｌｌｅｎｇｅｓａｎｄｈｏｐｅｓｆｏｒＡｌｚｈｅｉｍｅｒᶄｓｄｉｓｅａｓｅ[Ｊ].ＤｒｕｇＤｉｓｃｏｖｅｒｙＴｏｄａｙꎬ２０２２ꎬ２７(４):１０２７￣１０４３.ＤＯＩ:１０.１０１６/ｊ.ｄｒｕｄｉｓ.２０２２.０１.０１６.[２]ＴＡＭＫꎬＪＵＹＪ.ＰａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌｍｅｃｈａｎｉｓｍｓａｎｄｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓｔｒａｔｅｇｉｅｓｆｏｒＡｌｚｈｅｉｍｅｒᶄｓｄｉｓｅａｓｅ[Ｊ].ＮｅｕｒａｌＲｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎＲｅｓｅａｒｃｈꎬ２０２２ꎬ１７(３):５４３.ＤＯＩ:１０.４１０３/１６７３￣５３７４.３２０９７０.[３]ＳＲＩＲＡＭＮꎬＳＡＨＭＫ.ＲｅｇｕｌａｔｏｒｙｉｎｓｉｇｈｔｓｉｎｔｏｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃａｎｃｅｒａｎｄＡｌｚｈｅｉｍｅｒᶄｓｄｉｓｏｒｄｅｒｆｒｏｍａｕｔｏｐｈａｇｙｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ[Ｊ].ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＲｅｐｏｒｔｓꎬ２０２１ꎬ４８(１２):８２２７￣８２３２.ＤＯＩ:１０.１００７/ｓ１１０３３￣０２１￣０６８３８￣４.[４]ＦＡＮＧＥＦꎬＨＯＵＹＪꎬＰＡＬＩＫＡＲＡＳＫꎬｅｔａｌ.Ｍｉｔｏｐｈａｇｙｉｎｈｉｂｉｔｓａｍｙｌｏｉｄ￣βａｎｄｔａｕｐａｔｈｏｌｏｇｙａｎｄｒｅｖｅｒｓｅｓｃｏｇｎｉｔｉｖｅｄｅｆｉｃｉｔｓｉｎｍｏｄｅｌｓｏｆＡｌｚｈｅｉｍｅｒᶄｓｄｉｓｅａｓｅ[Ｊ].ＮａｔｕｒｅＮｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅꎬ２０１９ꎬ２２(３):４０１￣４１２.ＤＯＩ:１０.１０３８/ｓ４１５９３￣０１８￣０３３２￣９. 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RasGRP1在斑马鱼淋巴管发育中作用的初步研究的开题报告

RasGRP1在斑马鱼淋巴管发育中作用的初步研究的
开题报告
一、研究背景与意义
淋巴管是重要的血液循环系统，但它们也在免疫、炎症和转移瘤等
方面起着重要的作用。

因此，了解淋巴管系统在发育和功能中扮演的角
色非常重要。

RasGRP1是一种重要的GTP酶活化蛋白，已被证明在免疫、神经和胚胎发育中具有重要作用。

最近的研究表明，RasGRP1也在小鼠
淋巴管系统中具有作用。

但尚未了解RasGRP1在斑马鱼淋巴管系统中的
作用。

因此，本研究旨在研究RasGRP1对斑马鱼淋巴管系统发育的影响。

二、研究内容与方法
1. 显微注射：通过注射RasGRP1-MO (RasGRP1特异性形态发生特
效抑制子)、GFP mRNA或RasGRP1 MO/GFP mRNA混合物入斑马鱼胚胎中，观察其对斑马鱼淋巴管系统发育的影响。

2. 活体显微镜：观察斑马鱼淋巴管的形成。

3. 免疫组化：使用淋巴管特异性标志物LYVE-1和Prox1，确定斑马鱼淋巴管的位置和数量。

三、研究预期结果
本研究预计将证实RasGRP1在斑马鱼淋巴管系统中的作用，并描述其作用机制。

预计将观察到RasGRP1 MO处理后斑马鱼淋巴管系统数量
和位置的变化。

此外，还将确定RasGRP1在淋巴管细胞生存、分化和增
殖中的作用。

四、研究意义
本研究有助于更好地了解淋巴管系统的发育和调节，并有助于进一步开发针对人类淋巴管相关疾病的新药物和治疗方法。

此外，本研究还将提供基本的斑马鱼淋巴管研究材料，促进斑马鱼基础研究的发展。

斑马鱼研究报告

斑马鱼研究报告（Zebrafish,Danio rerio）目录一﹑斑马鱼二﹑斑马鱼基因与人类极为相似三﹑利用斑马鱼作为模式动物四﹑斑马鱼的心生五﹑突变斑马鱼及转基因斑马鱼表現类似人类疾病六﹑斑马鱼胚胎研究七﹑研究者在活的斑马鱼身上直接观看器官的发育与病变八﹑解开人与体內活菌共生秘密九﹑斑马鱼胚胎基因有助研究癌症、阿滋海默和帕金森症十﹑视网膜有自我修复潜能十一﹑培育变种斑马鱼可望用于人脸整型十二﹑基因決定人类肤色十三﹑斑马鱼的运动情形肌肉的发育及肌肉与运动神经的调控机制十四﹑细胞如何储存脂肪有助減肥新疗法十五﹑类固醇荷尔蒙的功能与调控十六﹑中神经细胞形成之分子调控机制十七﹑斑马鱼基因调控网路十八﹑干扰斑马鱼基因的技术十九﹑培育环保转基因斑马鱼二十﹑改造斑马鱼基因來试水质二十一﹑利用斑马鱼作为人类疾病模型及药物节选二十二﹑药物节选二十三﹑抗癌药物节选斑马鱼原产于东印度恒河流域，亦分布于巴基斯坦、尼泊尔、缅甸。

斑马鱼成鱼体长约4～5公分，体呈纺锤形，稍侧扁。

体侧从头至尾布满多条蓝色条纹，酷似斑马，故得名斑马鱼。

1.斑马鱼是研究发育生物学的新兴模式动物。

2.斑马鱼由于具有饲育容易、胚胎透明、体外受精、突变种多、遗传学工具成熟等诸多优点，近年来已成为研究脊椎动物发育与人类遗传疾病的新兴模式动物。

3.与其他脊椎动物相较下，斑马鱼最大的优点就是具有多达6000多种的遗传突变种，这些突变种的建立大致上是利用X射线、ENU或反转录病毒的感染造成基因组的突变，之后再经由多次的子代筛选所得。

4.突变种的表征包含如胚层分化，器官发育，生理调适与行为表现等多方面，所以可提供研究人员极佳的正向遗传学材料来进行发育机制上的研究。

5.在斑马鱼系统中也开发出阻断基因功能的工具-Morpholino，可快速以逆向遗传学手法来验证基因的功能。

所以正向遗传学与逆向遗传学的巧妙利用，可以正确推导出斑马鱼遗传发育途径，也是目前斑马鱼成为研究人类疾病新兴模式动物的主要原因。

斑马鱼DR-SARM基因的克隆与初步功能研究的开题报告

斑马鱼DR-SARM基因的克隆与初步功能研究的开题报告一、研究背景SARM (sterile α and HEAT/Armadillo motif-containing protein)是一种保守的调节免疫系统的重要信号分子，它在参与病毒识别、促进新陈代谢、调节细胞凋亡和自噬过程等方面发挥重要作用。

近年来，越来越多的研究表明，SARM是调节宿主抗病能力的一个重要分子，特别是在免疫应答中的调节作用，对于维持动物体内稳态和对外界环境的快速适应具有重要作用。

斑马鱼因其发育速度快、胚胎透明、生长周期短等特点，已成为模式动物研究领域的重要模式生物。

近年来，斑马鱼在免疫学研究中得到了广泛应用。

然而，目前关于斑马鱼SARM基因的研究较为有限。

本研究旨在克隆斑马鱼DR-SARM基因并进行初步功能研究，为斑马鱼免疫系统调控机制的深入探究提供新的线索。

二、研究内容与方法1. 克隆斑马鱼DR-SARM基因通过NCBI GenBank数据库比对和分析已知物种的SARM基因序列，设计引物并从斑马鱼全长cDNA文库中克隆DR-SARM基因。

进行基因测序后，对序列进行比对和分析。

2. 构建重组腺病毒载体将目标基因序列进行PCR扩增并克隆到pAd-Track-CMV载体中，随后将其与pAd-Easy-1载体通过重组技术构建重组腺病毒质粒。

3. 细胞培养及基因转染采用HEK293T细胞株，进行无菌培养并进行基因转染实验。

选取适宜的转染浓度和转染时间，观察目标基因的表达情况以及对细胞的影响。

4. 免疫学实验采集经基因转染的细胞进行免疫印迹实验，观察目标基因对细胞内信号通路的调节作用。

三、研究意义本研究将克隆并初步研究斑马鱼DR-SARM基因，为斑马鱼免疫学研究提供新的线索，同时也将深入探究SARM在免疫调控中的作用机制，为未来宿主抗病能力的调节机制研究提供理论依据。

斑马鱼多能性因子的研究进展

Abstract: The mammalian pluripotency factors, including transcription factors such as Pou5f1/Oct4, Sox2, Klf4 and Nanog, play critical roles in maintaining pluripotency of embryonic stem cells and inducing reprogramming of differentiated cells. However, the functions of vertebrate pluripotency factors in vivo have not been elucidated. Zebrafish(Danio rerio H.) is an excellent model for studying vertebrates’ early embryo development. It allows functional studies of pluripotency factors to be conducted in an in vivo environment and therefore provides more accurate information on their roles. Nowadays, several homologs of mammalian pluripotency factors including oct4, nanog etc. have been identified in zebrafish. This review aimed at introducing the progress of the functional study on zebrafish pluripotency factors and comparing to those of other vertebrates.

eaf1基因在斑马鱼血液发生过程中的功能研究的开题报告

eaf1基因在斑马鱼血液发生过程中的功能研究的开题报告作为一种广泛应用于基因功能研究的模式生物，斑马鱼具有发育迅速、生殖周期短、遗传易于操纵等优点，因此被广泛应用于研究基因功能。

本研究计划探究斑马鱼血液发生过程中的关键基因eaf1的功能及其调控机制。

eaf1是一个与mammalian eaf1功能高度保守的基因，其编码的蛋白质是一种Eaf1蛋白，常见于细胞核和细胞质中，是细胞凋亡和转录调节的关键因子。

虽然在哺乳动物中对eaf1的研究较多，但其在斑马鱼中的功能和调控机制还不清楚，本研究拟从以下两个方面进行研究：首先，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术制备eaf1基因敲除斑马鱼，进一步分析eaf1在斑马鱼血液发育中的功能。

利用敲除斑马鱼与野生型斑马鱼进行比较，观察敲除eaf1基因是否影响斑马鱼血液细胞发育过程，包括血细胞的形态结构、数量、分化程度等。

通过比较敲除和野生型斑马鱼的基因表达谱，确定eaf1在血液发生过程中调控哪些基因的表达，从而揭示其潜在的调节机制。

其次，利用荧光素酶底物（Luciferase）荧光探针技术，研究eaf1基因调控的转录因子活性。

通过构建dualluciferase报告基因载体，将eaf1基因启动子上游区域植入到负载体中，研究它能否影响荧光素酶的表达。

同时，利用CHIP-PCR技术寻找eaf1基因启动子上下游区域内与其相互作用的转录因子，并分析它们对eaf1基因启动子活性的影响。

本研究旨在探究eaf1基因在斑马鱼血液发生过程中的功能及其调控机制，研究结果将有助于揭示该基因参与斑马鱼血液发生过程中的分子调节机制，为进一步深入研究斑马鱼血液发生提供基础数据和理论支持。