基因工程概论
基因工程概述
1 . “鸟枪法”（“散弹射 击法”）
用限制酶将供体细胞中 的DNA切成许多片段，将这 些片段分别载入运载体，然 后通过运载体分别转入不同 的受体细胞，让供体细胞提 供的外源DNA的所有片段分 别在各个受体细胞中大量复 制（即扩增），从中找出含 有目的基因的细胞，再利用 一定方法将目的基因的DNA 片段分离出来。
思考：依照中心法则分析番茄软化的原因：
多聚半乳糖酸酶基因 转录 mRNA 翻译 多聚半乳糖酸酶
细胞壁结构被破坏
番茄软化
• 哪些新技术能大大简化基因工程的操作技术？
1、DNA测序仪：
能快速地测定DNA 样品的碱基序列。
2、PCR技术：
在体外通过酶促反应 有选择的大量扩增目的 基因或序列的技术。
概念的把握
基因工程的别名 操作环境 操作对象 操作水平 基本过程 结果 优点 本质
DNA重组技术 体外 基因
分子水平 剪切→ 拼接 →导入→ 表达 获得人类需要的基因产物
定向改造生物 基因重组
（二）基因工程的工具——酶和载体
关键步骤一的工具： “分子手术刀”—限制性内切酶 关键步骤二的工具： “分子针线”—DNA连接酶 关键步骤三的工具： “分子运输车”—载体
步骤四：筛选出获得目的基因的重组细胞
氨苄青霉 素抗性基因
四环素 抗性基因
步骤五：培养受体细胞并诱导目的基因的表达
• 受体细胞摄入DNA分子后就说明目的基因 完成了表达吗？ 重组的DNA分子进入受体细胞后受体细 胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基 因完成了表达过程。
若不能表达， 要对抗虫基因 再进行修饰。
• 将目的基因导入受体细胞的原理
借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径， 如土壤农杆菌转化法。
基因工程概论
基因工程概论重点知识：遗传工程、基因工程的概念；基因工程理论上的三大发现和技术上的三大发现；基因工程的基本步骤；基因工程的意义。
难点知识：基因工程的概念；基因工程的基本步骤；基因工程的基本原理。
第二章基因工程的工具酶重点知识：同位酶；同裂酶；同尾酶；星号活力；DNA操作酶的功能及应用（Bal 31, E. coli外切酶III,S1核酸酶，DNase I,测序酶，DNA连接酶，DTD, Ligase,逆转录酶，碱性磷酸酯酶，甲基化酶）；限制性内切酶的分类、命名原则；电泳后DNA的检测方法；DNA分子量的估算方法；怎样提高平头末端的连接效率；如何实现目的基因与载体连接效率；提高重组率的方法；构建酶切图谱的方法。
难点知识：DNA操作酶的功能及应用；怎样提高平头末端的连接效率；如何实现目的基因与载体连接效率；提高重组率的方法；构建酶切图谱的方法。
第三章基因克隆的载体重点知识：载体；克隆载体；表达载体；穿梭载体；质粒；严谨型质粒松弛型质粒；cos位点；λ cI突变体；溶源/溶菌性噬菌体；粘粒（cosmid）；噬菌粒；2μm质粒；载体的基本要求；质粒的基本特征及其分类；λDNA的特点；M13作为载体的优点；如何测定DNA的浓度和纯度？质粒DNA的提取方法，纯化的原理与方法；噬菌体DNA的分离纯化方法；大肠杆菌质粒pBR322、pUC8、pGEM3Z-DNA的特点；不同载体克隆DNA的片段大小；M13、λDNA作为载体需要进行哪些改造？λ克隆载体的类型；建生物基因组文库需要克隆的数目；酵母克隆载体的类型；YAC载体包括那些结构，来源和构建方法。
难点知识：严谨型质粒松弛型质粒；粘粒（cosmid）；噬菌粒；M13、λDNA作为载体需要进行哪些改造？λ克隆载体的类型；建生物基因组文库需要克隆的数目；YAC载体包括那些结构，来源和构建方法第四章重组DNA的转化与筛选重点知识：感受态细胞；插入失活；α-互补；Spi+；转化的方法有哪些？转化效率如何；噬菌体DNA转化大肠杆菌的方法；重组噬菌斑的鉴定方法；重组DNA的鉴定方法。
《基因工程的概述》word版
第一章基因工程第一节基因工程的概述【学习目标】1、简述基因工程的概念含义，简述基因工程的诞生历程，认同基因工程的诞生和发展离不开理论突破和技术创新2、简述基因工程的原理，说出DNA重组技术的基本工具及其作用、特点，简述基因工程基本操作程序，以及各步骤的一般方法、原理，模拟重组DNA分子的操作过程【课前预习】1、基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，在通过人工和等方法，对生物的基因进行和，然后导入并使重组基因在中表达，产生人类需要的基因产物的技术。
因而又叫DNA重组技术。
基因工程是在水平上操作、改变生物遗传性状的技术，包括基因的、以及在受体细胞内的和过程。
2、为基因工程的创立作出了重要的理论铺垫，而的发现，则直接促进了基因工程的诞生。
1973年，美国科学家将不同来源的两种DNA分子体外重组，并首次实现了在大肠杆菌中的表达。
3、“分子手术刀”：。
其作用的特点是：其产生的DNA末端有两种形式：和。
“分子针线”将双链DNA片段缝合起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的。
4、“运载工具”。
通常利用质粒作为载体。
作为载体必须具备以下条件：载体DNA必需有一个或多个的切割位点；载体DNA必需能在受体细胞中；载体DNA必需带有特殊的基因。
5、基因工程的基本操作步骤包括：①②、③、④6、PCR是一项在生物复制特定DNA片段的核酸合成技术。
目的基因受热形成，与结合，在的作用下延伸形成DNA。
【共同探究】【思考题1】（10全国2）下列叙述符合基因工程概念的是A．B淋巴细胞与肿瘤细胞融合，杂交瘤细胞中含有B淋巴细胞中的抗体基因B．将人的干扰素基因重组到质粒后导入大肠杆菌，获得能产生人干扰素的菌株C．用紫外线照射青霉菌，使其DNA发生改变，通过筛选获得青霉素高产菌株D．自然界中天然存在的噬菌体自行感染细菌后其DNA整合到细菌DNA上（一）DNA重组技术的基本工具1、“分子手术刀”——限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶能将外来的DNA切断，即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA却无损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息。
基因工程概论
基因工程的安全性
一、基因工程的安全隐患
1. 对环境的影响 重新组合一种在自然见尚未发现的的生物性 状有可能给现有的生态环境带来不良影响。
2. 新型病毒的出现
制造带有抗生素抗性基因或有产生病毒能力 的基因的新型微生物有可能在人类或其它生 物体内传播。
1978年， Goeddel等，人胰岛素的发酵生产成功。 1979年， Goeddel等，又在大肠杆菌中成功表达了人生长激素基因。 1980年， Nagata等， 遗传工程菌生产干扰素获得成功。 1981年， 用遗传工程菌生产的生物制剂包括动物口蹄疫疫苗、乙型肝 炎
病毒表面抗原及核心抗原、牛生长激素等。
第一章 导 论
第一节 基因工程的诞生 第二节 基因工程的研究内容 第三节 基因工程的成就和前景展望
基因工程的兴起
1977年，激素抑制素的发酵生产成功。Itakara等，化学合成的激素抑制素
基因和大肠杆菌-半乳糖（苷）激酶基因插入到PBR322中得到重组质粒，并通 过大肠杆菌生产出含有激素抑制素的嵌合型蛋白，经溴化氰处理后释放出了有 生物活性的激素抑制素。首次实现了真核基因的原核表达。用价值几美元的9升 培养液生产出50毫克的生物活性物质，这相当于50万头羊脑的提取量。
心脏 肺 心脏（新生） 心脏（新生） 心脏（新生） 心脏（正常） 心脏 心脏 心脏 肺 心脏 肾 心脏 肾 肺 肺 肾
基因构件
hDAF +hCD59 hCD59 hDAF hDAF hDAF hCD59 hDAF hDAF hCD59/hDAF hCD59/hDAF hDAF hCD59/hDAF hCD55+ hCD59+ hCD46 hCD55+ hCD59+ hCD46 hMCP(Hcd46) hCD59 +hDAF hDAF
基因工程概论复习重点
复习题一、名词解释1. 原核基因（Prokaryotic gene）：由原核生物（如大肠杆菌）基因组编码的基因，以及高等生物细胞器线粒体基因组和叶绿体基因组等编码的基因，统称原核基因。
2. 真核基因（Eukaryotic gene）：真核生物基因组DNA编码的基因,以及感染真核细胞的DNA病毒和反转录病毒基因组编码的基因，统称真核基因。
3. .前导序列（Leader sequence）：又叫前导序列区或5'-非翻译区（5'-UTR），，系指位于mRNA5'-起始密码子之前的一段长数百个核苷酸的不翻译的RNA 区段。
4. 尾随序列（Tai1er sequence）：又称尾随序列区或3'-非翻译区（3'-UTR），系指位于mRNA3'-终止密码子之后一段100多核苷酸的不翻译的RNA区段。
5 复制子（Replicon）：指有一个复制起始区（oriC）和起始基因的DNA复制单元。
例如细菌染色体、病毒基因组、质粒基因组等，凡其DNA能够进行复制的遗传单元，均称复制子。
真核细胞基因组的复制子是指含有一个复制起始位点的DNA（RNA）的复制子特称复制单元。
6. 增强子（Enhancer）：又叫增强子序列或增强子元件，是真核基因中发现的一种特异序列，能够在距离目标基因50kb以上的位置，从上游或下游的不同位置及方向增强该基因的转录活性。
7. 沉默子（Silencer）在真核基因启动子中除了增强子之外，沉默子同样也是一种可远距离调控相关基因转录活性的顺式元件。
与增强子一样，沉默子也能够从启动子的上游、下游甚至是基因内部三种不同的位置以及正向或反向，影响相关基因启动子的转录起始效率。
同时沉默子往往是以组织特异性或时间特异的作用方式，控制基因的表达作用。
但与增强子的功能效应相反，沉默子只能抑制而不能激活相关基因的转录起始活性。
8. 绝缘子（Insulator）亦即是增强子活性的物理边界元件（physical boundaryelement），它是一段能够抑制或隔离增强子功能效应的顺式转录调节序列。
基因工程第1讲概论课件
理论上的可行性。
41
二、分子遗传学新方法是基因工程的 技术基础（六大技术）
首当其冲的是要解决: ① 如何自如地得到目的基因； ② 如何在体外改造基因，得到重 组体； ③ 如何在体外转移重组基因；
直到20世纪70年代中期，相继出现了 几项关键性技术，梦想成真。
42
实际上的可操作性 材料、实验条件、时空条件、
经济条件和政策。 基础方面的基本条件（可能性+ 可行性+ 可操作性）具备, 尚需人的科学创新 思维+ 艰苦的实践。才能得到创新的发明、 发现
49
1970年, MIT 的 科学家率先提出在体 外把不同来源的遗传 物质进行重组的设想, 但遭到反对, 不予支
50
办
不
不
到
到
的
的
22
第一节 基因工程的 发生与发展
23
一、基因工程诞生的理论基础
2生物遗传的物质基础是 DNA 肺炎链球菌光滑型和粗糙型的转化 试验
24
● 1944年, 美 国微生物学家 Avery证明基 因就是DNA分 子, 提出 DNA 是遗传信息的 载体。
32
遗 传 密 码 表
目 录33
mRNA分子上从5 至3 的方向,每3个核 苷酸构建一个密码子, 编码某一特定氨基酸或 作为蛋白质合成的起始、终止信号, 称为三联 体密码(triplet codon), 也称遗传密码子(genetic codon)。
解决了信息语言的对应关系。
34
•密码: 43 = 64
14
（4）利用重组DNA技术可以在体外大 量扩增、纯化人们感兴趣的基因, 研 究其结构、功能及调控机制, 从而拓 宽了分子生物学的研究领域。
基因工程知识点全
第一章基因工程概述1.什么是基因工程，基因工程的基本流程基因工程（Genetic engineering）原称遗传工程。
从狭义上讲，基因工程是指将一种或多种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿遗传并表达出新的性状。
因此，供体、受体和载体称为基因工程的三大要素。
1.分离目的基因2.限制酶切目的基因与载体3.目的基因和载体DNA在体外连接4.将重组DNA分子转入合适的宿主细胞,进行扩增培养5.选择、筛选含目的基因的克隆6.培养、观察目的基因的表达第二章基因工程的载体和工具酶1. 基因工程载体必须满足哪些基本条件具有对受体细胞的可转移性或亲和性。
具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点。
具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点。
具有合适的筛选标记。
分子量小，拷贝数多。
具有安全性。
2. 质粒载体有什么特征，有哪些主要类型1、自主复制性2、可扩增性3、可转移性4、不相容性主要类型有1.克隆质粒2.测序质粒3.整合质粒4.穿梭质粒5.探针质粒6.表达质粒3. 质粒的构建（1）删除不必要的 DNA 区域，尽量缩小质粒的分子量，以提高外源 DNA 片段的装载量。
一般来说，大于20Kb 的质粒很难导入受体细胞，而且极不稳定。
（2）灭活某些质粒的编码基因，如促进质粒在细菌种间转移的 mob 基因，杜绝重组质粒扩散污染环境，保证 DNA 重组实验的安全，同时灭活那些对质粒复制产生负调控效应的基因，提高质粒的拷贝数（3）加入易于识别的选择标记基因，最好是双重或多重标记，便于检测含有重组质粒的受体细胞。
（4）在选择性标记基因内引入具有多种限制性内切酶识别及切割位点的 DNA序列，即多克隆接头（Polylinker），便于多种外源基因的重组，同时删除重复的酶切位点，使其单一化，以便环状质粒分子经酶处理后，只在一处断裂，保证外源基因的准确插入。
（5）根据外源基因克隆的不同要求，分别加装特殊的基因表达调控元件。
基因工程的概述
基因工程的概述定义：狭义的基因工程仅指用体外重组DNA技术去获得新的重组基因；广义的基因工程则指按人们意愿设计，通过改造基因或基因组而改变生物的遗传特性。
如用重组DNA技术，将外源基因转入大肠杆菌中表达，使大肠杆菌能够生产人所需要的产品；将外源基因转入动物，构建具有新遗传特性的转基因动物；用基因敲除手段，获得有遗传缺陷的动物等。
基因工程又被称为基因拼接技术或者DNA重组技术，可分为微生物基因工程、动物基因工程和植物基因工程三种生物转基因技术。
其主要特点是通过人工转移的方式，将一种生物的基因转移到另外一个受体细胞中，并使该转移基因在受体细胞中表达，从而获得全新的具有生物活性的产物。
基因工程技术为遗传物质研究和医药研究提供了重要的技术支撑。
动物基因工程技术利用先进的生物技术手段对动物基因进行编辑和改造，以达到揭示基因功能和利用基因治疗疾病等目的。
常见的动物基因工程技术包括基因敲除、基因敲入、基因编辑和转基因技术等。
通过使用基因编辑工具精确地切割和删除目标基因的特定区域，使该基因在动物个体中的表达缺失，可以揭示该基因在特定生理过程中的功能和调控机制。
基因治疗能够通过修复或替换患有遗传性疾病的动物个体的缺陷基因来达到治疗和预防遗传疾病的目的。
如利用基因编辑技术可以修复猫头鹰视网膜变性等遗传性视网膜疾病，从而改善视力。
微生物具有结构简单、迅速繁殖的特性，在其繁殖发展中应用生物基因工程技术能取得显著的效果。
将外源基因转入微生物中表达，使微生物能够生产人所需要的产品，如抗体和药用蛋白质等。
利用基因工程技术开发的重组亚单位疫苗、重组活载体疫苗及基因疫苗，有利于打破传统疫苗的局限性。
植物细胞具有全能性，在特定环境下，植物组织或者细胞能够生长出完整的植株。
所以，可以将药物基因组合到植物细胞内，通过分别培养，得到具有药物基因的植株。
植物独特的稳定遗传特性为医药领域的发展提供了充足而良好的条件。
目前，借助植物基因工程制造的药物有纯化的血清蛋白、干扰素与脑啡肽等。
基因工程概述
合酶链式反应.是以DNA变性、复制的某些特性 为原理设计的.1988，K.Mulllis莫里斯发明。
前提条件是必须对目的基因有一定的了解， 需要设计引物。
高温变性 低温退火(复性) 中温延伸
3.通过化学方法直接人工合成
第二步： 制备重组DNA分子
2.下列关于DNA连接酶作用的叙述，正确的是（ B ）
A.将单个核苷酸加到某DNA片段末端，形成磷酸二 酯键 B.将断开的两个DNA片段的骨架连接起来，重新形 成磷酸二酯键 C.连接两条DNA链上碱基之间的氢键 D.只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起 来，而不能将双链DNA片段平末端之间进行连接
DNA分子杂交技术 分子探针
检测目的基因是否转录出mRNA
• 最后： 检测目的基因是否翻译出蛋白质
• 还要： 个体生物学水平的鉴定
DNA分子杂交技术
• 基因探针：核酸分子探针是指特定的已知核酸 片段，能与互补核酸序列退火杂交，用于对待 测核酸样品中特定基因顺序的探测。
• 满足：（1）必须是单链，（2）带有容易 被检测出来的标记物。
基因工程的别名 操作环境 操作对象 操作水平 基本过程 结果 实质
DNA重组技术 生物体外 基因
DNA分子（基因）水平 剪切 →拼接 →导入 →表达
人类需要的基因产物 基因重组
基因工程的诞生和发展
1944，艾弗里 证明DNA是遗传物质
1970，阿尔伯、 内森斯、史密斯
1953，沃森和克里克 发现DNA双螺旋结构
要切两个切口，产生四个黏性末端。
• 如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶 来切割，会怎样呢？
会产生相同的黏性末端，然后让两者的 黏性末端黏合起来，就似乎可以合成重组 的DNA分子了。
2023年中国农科院历年考博试题汇总
中国农科院历年考博基因工程概论试题2023年中国农科院博士入学基因工程概论试题一、简答题1、聚丙烯酰胺、琼脂糖在dna电泳中的区别是什么？2、举出动物转基因的两种方法，并说明其原理。
3、双脱氧法测序的原理。
4、以拟南芥或玉米为例，说明转座子标签法进行基因转移的原理。
5、southern印迹的原理及应用。
三、试论述植物基因工程研究进展以及在农业生产上的意义。
2023年中国农科院博士入学基因工程概论试题一、名词解释1、限制性内切酶2、同裂酶3、核酶4、2μ环5、hat选择6、ti质粒7、t-dna8、同功trna9、反义trna 10、有义链11、α互补12、基因文库13、cdna 14、染色体步查二．简答题01、举两种植物基因转移的方法?简述其原理。
2、southern印迹的基本原理，这种方法有何应用。
3、噬菌体与cos作载体有何区别？4、aflp的原理及其应用5、普通pcr与rapd有何区别，何谓普通pcr？6、何谓双元载体，简述其组装过程及其作用机理？三、判断题1、无论用哪种转化方法均可用pbr322作载体2、进入细菌的外来dna之所以被降解，是由于细菌只修饰自身dna，不修饰外来dna3、只有粘粒端才可以被连接起来4、用自身作引物合成的cdna链，往往cdna并不完整1998年中国农科院博士入学基因工程概论试题一、什么是基因工程，基因工程在农业生产上有何意义？二、简答：1、聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖凝胶电泳应用有何特点？2、举两种植物基因转移的方法?简述其原理。
3、双脱氧法测序的原理4、转座子标签法克隆植物基因的原理5、southern印迹的基本原理，这种方法有何应用？6、在dna复制过程中会形成一种复制体（replisome）的结构，它是由哪几部分组成的？7、sanger测序法的基本原理是什么？1999年中国农科院博士入学基因工程概论试题一．名词解释：1．cdna 2 ti质粒3. 2u环4. hat选择5 a互补6 yac 7 转导8 基因文库9 限制性内切酶10 染色体步查二．问答题：1 举例说明两种植物转基因的方法。
19基因工程概论20141022
类型
来源 相同点
功能 差别
E·coli DNA 连接酶
T4DNA连接酶
大肠杆菌 恢复 只能连接黏性末端
磷酸
T4噬菌体 二酯键
能连接黏性末端和 平末端(效率较低)
G AA TT C
G AA TT C
C TT AA G
C TT AA G
用同种限制酶切割
G AA TT C
G AA TT C
C TT AA G
标记基因， 便于检测。
载体
常用载体： 质粒、噬菌体和动、植物病毒等
条 件: ①能够在宿主细胞中复制并稳定地保存 ②具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接 ③具有标记基因，便于进行筛选
载体--分类
1、克隆载体：以繁殖DNA片段为目的的载体。 如pBR322及其衍生质粒。
2、穿梭载体：既能在真核细胞中复制又能在 原核细胞中复制的载体。
环境污染治理
通常一种假单孢杆菌只能分解石油中的一种烃类。 基因工程的“超级细菌”能吞食和分解多种污染物
环境治理 抗虫转基因植物
抗虫棉花--问题探讨：
普通棉花 抗虫棉
苏云金芽孢杆菌含有一种可 以合成毒蛋白的基因。
让细菌的毒蛋白基因在棉花 细胞中表达，可培育出抗虫棉。
想一想：完成抗虫棉的培育，需要哪些关键工作？
反对派的观点
▪ 一英国科学家声称，转基因马铃薯会减弱老 鼠免疫系统功能；
▪ 美国康乃尔大学也发现，转基因玉米会危害 蝴蝶幼虫及其相关生态环境。
▪ 环保团体认为未经长期安全测试，长期食用 可能对人类及生态环境造成负面影响。
基因工程培育抗虫棉的简要过程：
苏云金芽孢杆菌
普通棉花(无抗虫特性)
提取
通过运载体导入
基因工程第一章 基因工程概论
DNA is the genetic material
The transforming principle is DNA.
1953年，J.Watson和F.Crike创立
DNA双螺旋模型，证实基因是具有 一定遗传效应的DNA片段。
1955年，Benzer在T4噬菌体的顺
反互补实验中，正式使用 “顺反子 （cristron）”这个术语，并将顺反 子与基因在意义上和功能上统一起 来。 同时证实了基因不是最小单位。它 仍然是可分的；并非所有的DNA序 列都是基因，只有其中某一特定的 核苷酸区段才是基因的编码区。
技术上的三大发现
（1）、工具酶的发现和应用
限制性内切酶和DNA连接酶的发现（标志 着DNA重组时代的开始）
1970年，逆转录酶的发现。
（2）、载体的发现及其应用 • 载体主要是小分子量的复制子如：病毒 、噬菌体、质粒。 • 1972年，美国Stanford大学的P. Berg 等首 次成功地实现了DNA的体外重组；
“遗传因子/基因”的设想一经提出， 便推动人们去寻找，去探索
基因在哪里？ 基因是什么？
1910年，美国遗传学家摩尔根
（an）以果蝇为研究材料，发 现了连锁交换定律并提出遗传粒子学说， 第一次将代表某一特定性状的基因与某 一特定的染色体联系起来，即基因位于 染色体上。
1944年，美国微生物学家O.T.Avery 首次证实遗传物质的基础是DNA， 基因位于DNA上。
基因工程的实施至少要有四个必要条件 工具酶 基因 载体 受体细胞
遗传工程 DNA重组 基因工程
区别？
遗传工程是发生在遗传过程中的自然界原 本存在的导致变异的一种现象，及自然 出现的不同DNA链断裂并连接成新的 DNA分子，新的DNA分子含有不同于亲 本的DNA片段。 DNA重组是人们根据遗传工程的原理利用 限制性内切酶在体外对于DNA进行的人 工操作，构成杂种DNA，在自然界一般 不能自发实现。
基因工程概论
一、简述基因研究所取得主要成就，及其与基因工程创立与发展的关系。
1、基因学说的创立孟德尔提出遗传因子学说到后来的摩尔根染色体理论，揭示了在染色体上基因的线性排列。
2、DNA是遗传物质从Avery的细菌转化实验到沃森和克里克揭示了DNA的双螺旋模型及半保留复制机理，表明DNA是遗传物质。
3、DNA是基因的载体4、基因是细胞中RNA及蛋白质的“蓝图”。
5、随着中心法则的提出和64种密码子的破译，基因碱基顺序与蛋白质氨基酸顺序得到对应。
6、随着基因克隆和DNA序列分析技术的发展，人们对基因的分子结构有了进一步的认识。
7、随着操纵子模型的提出，人们对基因的表达调控有了进一步的认识。
8、随着基因分离与克隆技术的不断改良与发展，基因组文库、cDNA文库、分子探针、PCR 等技术不断被人们运用。
9、目前，不仅能够分离天然基因，还能结合化学合成等方法，在实验室内进行基因的合成、构建，并进行相应的表达分析。
基因工程是在分子生物学和分子遗传学等学科综合发展的基础上诞生的一门新兴学科，它的创立和发展，直接依赖于基因及其分子生物学研究的进步，基因及其研究为基因工程的创立奠定了坚实的理论基础。
二、基因工程建立的三大理论基础和技术条件是什么？并简述其在基因工程中的应用。
1、三大理论基础：（1）1940年艾弗里（O.Avery）等人通过肺炎球菌的转化试验证明了生物的遗传物质是DNA，而且证明了通过DNA可以把一个细菌的性状转移给另一个细菌；（2）1950年沃森（J.D.Watson）和克里克(F.Crick)发现了DNA分子的双螺旋结构及DNA半保留复制机理；（3）1960年关于遗传信息中心法则的确立。
2、三大技术条件：（1）限制性内切核酸酶和DNA连接酶的发现；（2）基因工程载体；（3）大肠杆菌转化体系的建立。
3、应用：通过限制性内切核酸酶和DNA连接酶，可以将切割得到的目的基因与载体连接在一起，经由大肠杆菌转化体系增值复制，为基因工程的后续研究提供基础材料。
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主要基因工程产品的研制、开发、上市时间
产品
人生长激素释放抑制素(SRM) 人胰岛素 人生长激素（HGH）
时间
1977 1978 1979
国家 用途
日本 巨人症 美国 糖尿病 美国 侏儒症
上市时间 国家
1982 1985
欧洲 美国
人α-干扰素（IFN）
乙肝疫苗（HBsAgV）
1980
198破了常规育种难以突破的物种之间界限，可使
原核生物与真核生物之间、动物与植物之间、甚至人与其
他生物之间的遗传信息进行重组和转移。 缩短了新物种出现的时间。
基因工程的基本操作程序
供体细胞
目的基因
载体 重 组D N A分 子
受体细胞 转化细胞
基因治疗 基因诊断
多肽药物 疫苗、抗体
（二）克隆载体研究
基因工程的发展是与克隆载体构建密切相关的； Ti质粒的发现使植物基因工程研究迅速发展起来；
动物病毒克隆载体的构建，使动物基因工程研究也有
一定的进展。可以认为构建克隆载体是基因工程技术路线 中的核心环节。 构建适合于高等动植物转基因的表达载体和定位整合 载体是今后研究的重要内容。
（三）受体系统的研究
就基因药物而言，最理想的表达场所是 转基因动物的乳腺。
1）乳腺是一个外分泌器官，乳汁不进入体内循环，不
会影响转基因动物本身的生理代谢反应。 2）从乳汁中获取目的基因产物，产量高，易提纯，表 达的蛋白质已经过充分的修饰加工，具有稳定的生物活性。 3）从乳汁中源源不断获得目的基因的产物的同时，转
基因动物又可无限繁殖。
基因工程 Gene Engineering
生物工程
包括基因工程、细胞工程、发酵工
程、蛋白质工程和酶工程等。
基因工程是生物工程的核心和关键，是主导技术
细胞工程是生物工程的基础
蛋白质及酶工程是生物工程的条件 发酵工程是生物工程获得最终产品的手段 生物工程是一个综合技术体系，其中基因工程最为突出。
第一章 绪论 一、基因（gene）和基因工程
组合，然后通过载体转入微生物、植物和动物细胞内，进
行无性繁殖，并使所需要的基因在细胞中表达，产生出人 类所需要的产物或组建成新的生物类型。
又名遗传工程（Genetic Engineering) DNA重组技术(Recombinant DNA Techniques)
分子克隆（Molecular Cloning)
Protein
transcription
1957年Crick又提出了遗传信息传递的“中心法则” (central dogma)，揭示了遗传信息的流向和表达问题。
2.技术上的三大发明 ①限制性核酸内切酶的发现与DNA切割 1970年H.O. Smith等分离出第一种限制性核酸内切酶。
Werner Arber 理论预见限制酶
1953年James D. Watson 和Francis H. C. Crick揭示 了DNA分子的双螺旋结构
和半保留复制机制。
Francis Crick & James Watson
③遗传密码的破译和遗传信息传递方式的确定
1966年Nireberg等破译了全部64个遗传密码
DNA
mRNA
translation
（一） 基因（gene）
1. 基因——生命的载体 基因是生物遗传信息的载体，它是由核苷酸序列(通
常为DNA)组成的生物大分子，决定着生物的所有性状
、行为和疾病的发生。
2. 基因是疾病患者的福音
发现了某疾病基因，就可以对患者进行基因水平上的 治疗，从根本上根除疾病的危害。
3. 基因是企业家的聚宝盆
巨大的市场：基因工程药物
• 1990年，Perlak 将B.T.基因导入棉花获得抗虫棉 。 • 1991年，美国开始人类基因组计划。 • 1997年，“多利”绵羊诞生。
三、基因工程研究的主要内容
（一）基础研究
构建克隆载体及相应新技 术、新的操作方法。
（六）应用研究
供体细胞
目的基因
载体 重组DNA分子
受体细胞 转化细胞
基因治疗 基因诊断
多肽药物 疫苗、抗体
(畜牧业、渔业 生物反应器)
转基因动物
转基因植物
(农业、林业 生物反应器)
冶金、环保 轻工、食品
1.基因工程与农业
●光合作用
●固氮作用
●转基因植物 ●转基因动物
抗病虫 提高品质 提高花卉的观赏价值 抗逆性
Tet
Kan
R6-5
Stanley Cohen 1986 Nobel生 理或医学奖
Boyer-Cohen实验
Herb Boyer
(三）基因工程的发展
1.艰难阶段
主要关注安全性问题
2.逐渐成熟阶段
1977年第一次实现基因在原核生物中的表达 3.迅速发展阶段 20世纪80年代以后，高等动植物的遗传转化。
大肠杆菌K-12： 463 9221bp， 4288个基因
枯草杆菌： 4.21×106bp, 4100个基因
1980年提出Human Genome Project (HGP)；
1990年开始，美国、英国、日本、德国、法国等国实施“人类基因组计划”
我国1999年9月获准参加这一计划，承担1%的测序任务。
1972年前后使用小分子量的细菌质粒和噬菌体作载体。 在细菌细胞里的大量扩增。
理论上的三大发现：
证明了生物的遗传物质是DNA （基因工程的先导）
DNA的双螺旋结构和半保留复制机理 遗传信息的传递方式（中心法则）
技术上的三大发现：
限制性内切酶的发现（标志着DNA重组时代的开始）
DNA连接酶的发现 载体的使用
3.将重组DNA分子转 移到适当的受体细胞 并与之一起增殖。
4.从大量的细胞繁殖群体 中，筛选出获得了重组 DNA分子的受体细胞,并筛 选出已经得到扩增的目的 基因。
5. 将目的基因克隆到表 达载体上，导入寄主细胞 ，使之在新的遗传背景下 实现功能表达，研究核酸 序列与蛋白质功能之间的 关系。
基因工程四大要素：
DNA ligase
2. Boyer-Cohen实验
1973年，Cohen等人将编码Kan抗性基因质粒R6-5和 编码Tet抗性基因质粒pSC101混合后，加入EcoRI进行酶 切，用T4 DNA连接酶连接成重组DNA分子，最后转化大 肠杆菌，结果某些转化菌落表现出既抗Kan又抗Tet的双重 抗性特性。从这种双抗性转化菌落的大肠杆菌中分离出的 重组质粒DNA带有完整pSC101分子和一个来自R6-5质粒 编码Kan抗性基因DNA片段。 后来又把非洲爪蟾核糖体基因片断同pSC101质粒重组， 转化大肠杆菌，并在菌体内成功转录出相应的mRNA。这 是第一次成功的基因克隆实验。
养液中提取的生长激素，相当于6万具尸体的全部产量。
基因工程药品 —— 干扰素 干扰素治疗病毒感染简直是 “万能灵药”！过去从人血中提取， 300L血才提取1mg！其“珍贵”程 度自不用多说。 人造血液及其生产 人造血液、白细胞介素、 乙肝疫苗等通过基因工程 实现工业化生产，均为解 除人类的病苦，提高人类 的健康水平发挥了重大的 作用。
2.基因工程与工业
●纤维素的开发利用
●酿酒工业
●食品工业
●制药工业
●新型蛋白质的生产
100kg胰腺→4-5g胰岛素
胰岛素 2000L培养液→ 100g胰岛素！
基因工程药品 —— 生长激素
治疗侏儒症的唯一方法，是向人体注射生长激素。而
生长激素的获得很困难。以前要获得生长激素，需解剖尸 体，从大脑的底部摘取垂体，并从中提取生长激素。 现可利用基因工程方法，将人的生长激素基因导入大 肠杆菌中，使其生产生长激素。人们从 450 L大肠杆菌培
发展过程中的重大事件：
• 1977年，E. coli中合成了人生长激素基因。 • 1978-1979年，胰岛素基因在大肠杆菌中表达。
• 1982年，培育出了超级鼠。
• 1985年，Horsch发明了植物基因工程的基本方法： 叶圆盘法，并获得转基因植株。
• 1990年，患有遗传免疫疾病的4岁女孩接受了基因疗法。
转基因动物
(畜 牧 业 、 渔 业 生 物 反 应 器)
转基因植物
冶金、环保 (农 业 、 林 业 轻工、食品 生 物 反 应 器)
基因工程一般操作步骤
1.从生物有机体基因组 中，分离带有目的基因 DNA片段。
2.将带有目的基因的外 源DNA片段连接到能 够自我复制的并具有选 择标记的载体分子上， 形成重组DNA分子。
（四）目的基因研究
基因工程研究的基本任务：开发人民需要的基因产物，这样的基 因叫做目的基因。
获得目的基因的方法：主要通过构建基因组或cDNA文 库，从中筛选出特殊需要的基因。
基因：医药相关的基因； 抗病、虫害和恶劣环境的基因；
特殊营养价值的蛋白或多肽的基因。
（五）生物基因组学研究
嗜血流感杆菌： 183 0137bp， 1743个基因 产甲烷球菌： 16 64976bp， 1682个基因
潜在的市场：肥胖基因（2000万美元）
4.基因是铁的证据 基因分析在重大犯罪案件、历史案件的侦破中是最终确 定罪犯的有力工具，当事人的头发、血、皮屑的基因分析 都将作为确凿证据。
（二）基因工程
基因工程概念 基因工程(gene engineering):就是对不同生物的遗 传物质，在体外进行剪切、组合和拼接，使遗传物质重新
1972年第一个DNA重组分子产生
EcoRI recognition sites
λ phage DNA
EcoRI cuts DNA into fragments
Sticky end
SV40 DNA
The two fragments stick together by base pairing