PCR技术大攻略
pcr技术原理及步骤
pcr技术原理及步骤
PCR（聚合酶链式反应）是一种生物学技术，用于在体外大量复制特定的DNA片段。
它在分子生物学和遗传学的研究中得到了广泛应用。
PCR技术的原理是通过逐渐加热和降温的循环反应，使DNA序列在体外被精确地复制。
PCR的步骤主要包括：变性、退火和延伸。
1. 变性：首先将DNA模板加热至95°C，这样会使DNA双链解开，变为两条单链DNA。
2. 退火：将温度降至50-65°C，加入DNA引物（引物是特异性序列，与待扩增的DNA序列互补）。
在适当的温度下，引物会与单链DNA的两端结合形成引物-模板复合物。
3. 延伸：将温度升至72°C，加入热稳定的DNA聚合酶。
在此温度下，DNA聚合酶会沿着引物-模板复合物的DNA链合成新的DNA链。
这样，一个PCR循环完成后，原有的DNA分子被扩增成两个分子。
然后，将温度逐渐循环升高和降低，重复数十次甚至数百次，可以快速产生大量目标DNA。
PCR技术的应用非常广泛，例如在基因工程中用于克隆和表达目的基因、医学诊断中检测特定基因、法医学中的DNA鉴定等。
其原理和步骤的灵活性和高效性使其成为现代生物学的重要工具。
PCR实验技术全攻略
PCR实验技术指南PCR 的问题，无疑是绝大多数学生物的人都关心的问题。
今天我们把相关内容整理出来，与大家共同讨论，希望对大家能有所帮助。
一、引物设计所谓“工欲善其事，必先利其器”，这年头手工设计引物的人似乎不多，还是用软件方便些，防止你一不小心看走眼，丢一个碱基，同时计算起来也方便。
PCR 的问题，无疑是绝大多数学生物的人都关心的问题。
今天我们把相关内容整理出来，与大家共同讨论，希望对大家能有所帮助。
一、引物设计所谓“工欲善其事，必先利其器”，这年头手工设计引物的人似乎不多，还是用软件方便些，防止你一不小心看走眼，丢一个碱基，同时计算起来也方便。
设计软件有很多，既可以在线设计（如Primer3 /cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi），也可以用Primer5、Oligo6.65 等等。
1. 引物设计的原则细心地进行引物设计是PCR 中最重要的一步。
理想的引物对只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火。
设计糟糕的引物可能会同时扩增其他的非目的序列。
下面的指导描述了一个可以增加特异性的引物所具有的令人满意的特点：1）典型的引物18 到24 个核苷长。
引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。
但是长度大于24 核苷的引物并不意味着更高的特异性。
较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。
2）选择GC 含量为40％到60％或GC 含量与模板GC 含量接近的引物。
3）设计5"端和中间区为G 或C 的引物。
这会增加引物的稳定性和引物同目的序列杂交的稳定性。
4）避免引物对3"末端存在互补序列，这会形成引物二聚体，抑制扩增。
在用软件设计时大家常常会疑惑,究竟? G 不能低于多少?这里有个数据: ? G 为0~-2时,PCR 产率可达100%, ? G=-6 时,为40%.5）避免3"末端富含GC。
pcr的操作及注意事项
PCR的操作及注意事项一、PCR简介PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种常用的分子生物学实验技术，用于扩增特定的DNA片段。
PCR技术的广泛应用，使得其操作和注意事项变得尤为重要。
本文将介绍PCR的操作步骤以及需要注意的事项。
二、PCR的操作步骤1. DNA提取首先，需要从样本中提取目标DNA。
常用的提取方法包括酚氯仿法、热碱法和商业DNA提取试剂盒。
在提取DNA的过程中，应注意减少污染，保持工作区域清洁。
2. PCR反应液的配制将PCR反应液的各种试剂按照实验方案的要求配制好，主要包括模板DNA、引物、dNTPs、缓冲液和聚合酶。
保持试剂的新鲜和纯净，避免重复冻融。
3. PCR反应的设置将PCR反应液分装到反应管中，可根据需要设置多个反应管。
注意反应管的密封性，避免样品蒸发和污染。
同时，设定PCR反应的温度程序，包括变性、退火和延伸的温度和时间。
4. PCR反应的程序将反应管放入PCR仪中，启动PCR程序。
确保PCR仪的温度控制准确可靠，保持反应过程的稳定性。
根据目标DNA片段的大小，调整PCR的循环次数，一般为25-35个循环。
5. PCR产物的分析PCR反应结束后，可以通过各种方法对PCR产物进行分析，常用的方法包括琼脂糖凝胶电泳和DNA测序。
分析结果能够验证PCR扩增的特异性和产物的纯度。
三、PCR操作的注意事项1. 高品质的DNA模板PCR反应的成功与否与DNA模板的质量有很大关系。
因此，在进行PCR实验前，应确保使用高质量的DNA模板，如通过琼脂糖凝胶电泳进行检测。
2. 引物的设计和质量PCR反应中使用的引物应具有较高的特异性和准确性。
在设计引物时，应避免引物间的互补性，以免出现非特异扩增。
同时，引物的质量也很重要，选择高纯度的引物可以提高PCR反应的成功率。
3. 操作区域的消毒与隔离为了避免PCR反应过程中的污染，应定期对实验区域进行消毒，如操作台面、工作台和仪器表面。
从扩增到解读：PCR数据分析全攻略
从扩增到解读：PCR数据分析全攻略我们需要了解PCR的原理和步骤。
PCR全称为聚合酶链式反应，是一种在生物体外扩增DNA片段的技术。
PCR包括三个步骤：变性、退火和延伸。
在变性步骤中，DNA双链被加热至9498℃，使两条链分离。
在退火步骤中，温度降至5065℃，引物与目标DNA片段结合。
在延伸步骤中，温度升至72℃，DNA聚合酶沿着引物延伸，合成新的DNA链。
在PCR反应中，我们还需要注意扩增效率和产物质量。
扩增效率受到多种因素的影响，如引物设计、DNA模板浓度、酶的活性等。
为了提高扩增效率，我们可以进行优化实验，如调整引物浓度、优化反应温度等。
产物质量的评估可以通过琼脂糖凝胶电泳进行，观察扩增产物的大小和纯度。
当PCR反应完成后，我们需要对扩增产物进行数据分析。
数据分析包括两个方面：定量分析和定性分析。
定量分析主要是通过计算扩增产物的相对含量，常用的方法有Quantitative PCR（qPCR）和Endpoint PCR。
定性分析则是判断扩增产物是否存在，常用的方法有琼脂糖凝胶电泳和实时荧光PCR。
下面我通过一个实际案例来详细说明PCR数据分析的过程。
我们以扩增一个已知基因为例，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。
我们将PCR产物与DNA分子量标记一起上样，然后进行电泳。
在电泳过程中，DNA片段根据大小被分离，可以通过比较泳道中的条带来判断扩增产物的大小是否与预期一致。
如果出现非特异性扩增或引物二聚体，会在泳道中出现额外的条带。
通过观察和分析泳道中的条带，我们可以对PCR反应的效率和特异性进行评估。
除了琼脂糖凝胶电泳，我们还可以使用实时荧光PCR对扩增产物进行定量分析。
实时荧光PCR通过监测扩增过程中荧光信号的变化，可以实时监测扩增产物的。
通过绘制扩增曲线和计算Ct值（循环阈值），我们可以对目标DNA片段的相对含量进行定量分析。
PCR数据分析需要从扩增到解读，掌握一系列的步骤和技巧。
通过实际操作和案例分析，我们可以更好地理解和应用这些方法。
高三pcr技术基本知识点
高三pcr技术基本知识点PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种重要的分子生物学技术，被广泛应用于遗传学、医学和科学研究领域。
它通过体外扩增目标DNA片段，能够在短时间内大量复制目标序列，从而为后续分析提供足够的样本。
一、PCR技术原理PCR技术通过反复进行DNA片段的复制来扩增目标序列。
其基本步骤包括三个关键的温度循环：变性、退火和延伸。
1. 变性PCR反应开始时，样本经过高温（通常为95°C）变性处理，使DNA双链解开成两条单链，同时释放出目标序列。
2. 退火PCR反应中的下一步是退火。
在此步骤中，反应温度降至目标序列特异性引物的结合温度，引物与目标序列进行互补结合。
3. 延伸PCR反应的最后一个步骤是延伸。
在此步骤中，酶（通常是DNA聚合酶）使用引物作为起始位点，合成出与目标序列互补的新DNA链。
二、PCR反应体系PCR反应所需的要素包括DNA样本、引物（前向引物和逆向引物）、核苷酸三磷酸（dNTPs）、缓冲液和DNA聚合酶。
1. DNA样本PCR反应需要将待扩增的DNA样本加入反应管中，作为起始材料。
2. 引物PCR反应中的引物是两条特异性引物，分别与目标序列的两端互补结合。
通过引物的定向，可以选择扩增目标序列的特定区域。
3. dNTPs反应体系中需要加入四种脱氧核苷酸三磷酸（dATP、dCTP、dGTP和dTTP），以供DNA合成酶在延伸过程中使用。
4. 缓冲液缓冲液可以维持反应体系的pH值，提供合适的离子环境以促进PCR反应。
5. DNA聚合酶DNA聚合酶是PCR反应的关键酶，用于在新合成链中催化核苷酸的连续添加。
三、PCR反应步骤PCR反应由一个或多个PCR循环组成，每个循环包括三个主要步骤：变性、退火和延伸。
整个PCR反应过程通常由30-40个循环组成。
1. 变性PCR反应的第一步是变性。
反应温度升至95°C，将目标序列的DNA双链解开成两条单链DNA。
PCR实用技巧
PCR实用技巧PCR是一种重要的分子生物学技术，通过这种技术可以扩增、复制、检测和定量地分析DNA片段。
在基因工程、医学诊断、疾病研究等领域具有广泛的应用。
下面将介绍一些PCR的实用技巧，希望能对读者有所帮助。
1.设计合适的引物：PCR的关键在于引物的选择和设计。
引物是一段DNA序列，用于识别和精确扩增目标DNA片段。
引物应具有与目标序列完全互补的碱基配对，同时避免引物之间的互相配对和自相互配对。
最好能够在引物末端加上限制性内切酶位点，方便后续的克隆和酶切。
2.优化PCR反应条件：PCR反应的条件包括温度、时间、酶的浓度等。
合理优化这些条件可以提高PCR的效率和特异性。
一般来说，常用的PCR反应体系包括DNA模板、引物、缓冲液、dNTPs、聚合酶和MgCl2等。
其中，MgCl2的浓度是影响PCR特异性的重要因素，需进行优化。
3. 添加PCR增效剂：有些PCR样品可能会出现不理想的扩增效果，此时可以添加一些PCR增效剂来提高PCR的效率和特异性。
常用的PCR增效剂包括BSA（胸腺素A），DMSO（二甲亚砜），betaine（单甜菜碱）等。
这些增效剂能够改变PCR反应液的成分，降低DNA的空间结构，促进引物与DNA模板的结合，提高PCR的效果。
4.进行温度梯度实验：温度是PCR反应中的一个重要因素，不同的引物和模板可能对温度有不同的要求。
因此，可以利用温度梯度实验来确定最适合的扩增温度。
温度梯度实验可以在一个PCR反应中设置多个不同的温度，通过观察扩增产物的带型以及扩增效果，确定最佳的扩增温度。
5. 使用热启动酶：PCR反应在体外进行，一开始的温度变化可能导致杂交反应的发生，进而影响PCR的特异性。
为了避免这种问题，可以使用热启动酶，如热启动聚合酶（Hot Start Polymerase）。
这种聚合酶在低温时不具有DNA合成活性，只有在高温条件下才能启动。
这样可以有效降低非特异性扩增的问题。
6.进行负对照和正对照：为了准确评价PCR反应的结果，应该同时设置负对照和正对照。
pcr实验知识点总结
pcr实验知识点总结PCR实验（聚合酶链反应）是一种在生物化学中广泛使用的分子生物学技术，用于扩增特定的DNA片段。
该技术由Kary Mullis于1983年发明，并于1993年获得了诺贝尔化学奖。
以下是关于PCR实验的知识点总结。
一、PCR原理PCR的基本原理是利用DNA聚合酶对单链DNA进行复制的能力。
这个过程分为三个步骤：变性、退火和延伸。
1. 变性：在高温（通常为95℃）下，双链DNA被解旋成两条单链模板。
2. 退火：温度降低（一般为50-65℃），引物与模板DNA的互补序列结合。
3. 延伸：在适宜的温度（72℃左右）和DNA聚合酶的作用下，引物沿着模板DNA向两侧延伸，形成新的双链DNA。
这三个步骤循环进行，每次循环都会使目标DNA的数量翻倍，经过几十到几百次循环后，就能得到大量的目标DNA。
二、PCR所需材料1. DNA模板：待扩增的目标DNA。
2. 引物：两段短的寡核苷酸，与目标DNA的两端互补。
3. dNTPs：脱氧核苷三磷酸，作为合成新链的原料。
4. Taq DNA聚合酶：能在高温下保持活性的酶，用于催化DNA的合成。
5. 缓冲液：提供合适的pH和离子环境。
三、PCR操作步骤1. 设计引物：根据目标DNA的序列设计出两条引物，分别与DNA的正反两条链互补。
2. 配制反应体系：将模板DNA、引物、dNTPs、Taq酶和缓冲液按照一定比例混合。
3. PCR循环：将反应体系放入PCR仪中，设定好变性、退火和延伸的温度和时间，开始循环反应。
4. 产物检测：可以通过凝胶电泳等方法检测PCR产物的大小和数量。
四、PCR的应用1. 分子诊断：如病原体检测、基因突变检测等。
2. 基因克隆：将目的基因扩增后，可以方便地进行后续的克隆和表达。
3. 序列分析：通过扩增特定的基因区域，可以进行基因测序和SNP分析等。
4. 生物考古学：可以从古代样本中提取DNA并进行扩增，研究古生物的遗传信息。
五、PCR实验注意事项1. 引物设计：引物应具有良好的特异性和稳定性，避免产生非特异性扩增和二级结构。
PCR技术大攻略
一、PCR技术及步骤聚合酶链式反应（PCR）PCR扩增产物的克隆上述两个实验包含基本原理、步骤、问题等。
二、PCR常见问题汇总1. 没有得到扩增产物（1）酶失活或在反应体系中未加入酶。
Taq DNA聚合酶因保存或运输不当而失活，往往通过更换新酶或用另一来源的酶以获得满意的结果。
（2）模板含有杂质。
特别是对甲醛固定及石蜡包埋的组织常含甲酸，造成DNA脱嘌呤而影响PCR的结果。
（3）变性温度是否准确：PCR仪指示温度与实际温度是否相符，过高酶在前几个循环就迅速失活；过低则模板变性不彻底。
（4）反应系统中污染了蛋白酶及核酸酶，应在未加Taq酶以前，将反应体系95℃加热5-10分钟。
（5）引物变质失效。
人工合成的引物是否正确。
是否纯化，或因储存条件不当而失活。
（6）使用PCR试剂盒时还应注意：①是否严格按照说明书操作；②试剂使用前是否充分混匀；③试剂储存过久或不当而失效。
2. 扩增产物在凝胶中涂布或成片状（1）酶量过高。
减少酶量；酶的质量差，调换另一来源的酶。
（2）dNTP浓度过高。
减少dNTP的浓度。
（3）MgCl2浓度过高。
可适当降低其用量。
（4）循环次数过多；增加模板量减少循环次数，缩短退火时间及延伸时间，或改用二种温度的PCR循环。
（5）退火温度过低。
（6）电泳体系有问题：①凝胶中缓冲液和电泳缓冲液浓度相差太大；②凝胶没有凝固好；③琼脂糖质量差。
（7）若为PCR试剂盒则可能：①由于运输储存不当引起试剂盒失效；②试剂盒本身质量有问题，如引物选择、循环参数等选择不当。
（8）降解的陈旧模板扩增也易产生涂布。
3. 溴酚蓝前有区带（很宽）（1）模板量太低。
增加模板DNA的用量。
（2）循环次数太多。
减少循环次数。
（3）复性度偏低。
提高复性温度。
（4）预变性后没有立刻上机循环。
（5）引物3'端是否互补；重新设计合成较长的引物。
（6）引物用量偏多。
降低引物的使用量。
4. 扩增产物出现多条带（1）引物用量偏大，引物的特异性不高。
很实用的pcr操作方法
很实用的pcr操作方法PCR （聚合酶链式反应）是一种用于在实验室中扩增DNA序列的技术。
它是迄今为止最常用、最有效的DNA分析方法之一。
PCR可以在短短几个小时内扩增出数百万份DNA复制品，这对于基因工程、基因组学研究和医学诊断具有重要意义。
以下是一种常用的PCR操作方法：1. 制备反应混合液：将PCR反应所需的试剂和模板DNA加入到一个无核酸酶的管或微孔板中。
一般反应液组分包括：扩增缓冲液（含有聚合酶反应所需的离子和缓冲剂）、两个引物（用于扩增所需的DNA片段）、聚合酶（用于DNA复制）和模板DNA（待扩增的目标DNA序列）。
2. 混合反应液：使用微量吸管或移液器轻轻混合反应液，确保所有试剂均匀分布。
3. 放置反应液：将反应液置于热循环仪（PCR仪）中，该仪器能够精确控制反应液的温度。
根据所需的扩增程序，设置温度周期。
4. 前变性：将反应液加热至95，这会使DNA解开成两个单链。
此步骤通常需要数分钟，以确保所有的DNA双链都被解开。
5. 扩增循环：在扩增循环中，每个循环都包含三个步骤：变性、退火和延伸。
变性步骤：将反应液加热至较高温度（通常为94-98），使DNA双链解开成两个单链。
退火步骤：将反应液降温至两个引物结合的最佳温度，使引物与目标DNA序列特异性结合。
延伸步骤：将反应液加热至较低温度（通常为72），使聚合酶在引物上合成新的DNA链。
6. 扩增周期：重复扩增循环，通常需要20-40个循环，以扩增目标DNA序列。
7. 扩增结束：最后一个扩增周期完成后，将反应液保持在72的延伸温度下，以确保最后一个DNA链的完整合成。
8. 储存PCR产物：将PCR产物保存在低温下，通常为-20或更低的温度。
这样可以防止PCR产物的降解和污染。
需要注意的是，PCR是一种高度敏感的技术，可能会受到有机体DNA和其他环境DNA的污染。
为了避免假阳性结果，必须采取有效的实验室措施来防止污染。
这包括使用无核酸酶的操作区域、每次PCR反应前进行模板准备和混合的准备区域等。
PCR实用技巧(完全免费)
PCR 实用技巧★★350784478(金币+2,VIP+0>:感谢分享7-13 15:43增加PCR地特异性：1. primers design 这是最重要地一步.理想地,只同目地序列两侧地单一序列而非其他序列退火地引物要符合下面地一些条件a. 足够长,18-24bp,以保证特异性.当然不是说越长越好,太长地引物同样会降低特异性,并且降低产量b. GC% 40%~~~~60%c. 5'端和中间序列要多GC,以增加稳定性d. 避免3'端GC rich, 最后3个BASE不要有GC,或者最后5个有3个不要是GCe. 避免3'端地互补, 否则容易造成DIMERf. 避免3'端地错配g. 避免内部形成二级结构h. 附加序列(RT site, Promoter sequence>加到5'端, 在算Tm值时不算,但在检测互补和二级结构是要加上它们i. 使用兼并引物时, 要参考密码子使用表,注意生物地偏好性,不要在3'端使用兼并引物,并使用较高地引物浓度(1uM-3uM> j. 最好学会使用一种design software. PP5,Oligo6,DNAstar, Vector NTI, Online desgin et al. * 引物地另一个重要参数是熔解温度<Tm）.这是当50％地引物和互补序列表现为双链DNA分子时地温度.Tm对于设定PCR退火温度是必需地.在理想状态下,退火温度足够低,以保证引物同目地序列有效退火, 同时还要足够高,以减少非特异性结合.合理地退火温度从55℃到70℃.退火温度一般设定比引物地Tm低5℃. 设定Tm有几种公式.有地是来源于高盐溶液中地杂交,适用于小于18碱基地引物. 有地是根据GC含量估算Tm.确定引物Tm最可信地方法是近邻分析法.这种方法从序列一级结构和相邻碱基地特性预测引物地杂交稳定性.大部分计算机程序使用近邻分析法. 根据所使用地公式及引物序列地不同,Tm会差异很大.因为大部分公式提供一个估算地Tm值,所有退火温度只是一个起始点.可以通过分析几个逐步提高退火温度地反应以提高特异性.开始低于估算地Tm5℃,以2℃为增量,逐步提高退火温度.较高地退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物地形成. 为获得最佳结果,两个引物应具有近似地Tm值.引物对地Tm差异如果超过5℃,就会引物在循环中使用较低地退火温度而表现出明显地错误起始.如果两个引物Tm不同,将退火温度设定为比最低地Tm 低5℃或者为了提高特异性,可以在根据较高Tm设计地退火温度先进行5个循环,然后在根据较低Tm设计地退火温度进行剩余地循环.这使得在较为严紧地条件下可以获得目地模板地部分拷贝.2. stability of primers定制引物地标准纯度对于大多数PCR应用是足够地. 引物产量受合成化学地效率及纯化方法地影响.定制引物以干粉形式运输.最好在TE重溶引物,使其最终浓度为100μM.TE比去离子水好,因为水地pH经常偏酸,会引起寡核苷地水解. 引物地稳定性依赖于储存条件.应将干粉和溶解地引物储存在-20℃.以大于10μM浓度溶于TE地引物在-20℃可以稳定保存6个月,但在室温<15℃到30℃）仅能保存不到1周.干粉引物可以在-20℃保存至少1年,在室温<15℃到30℃）最多可以保存2个月.3. optimize reactants concentrationa. magnesiom ions Mg离子地作用主要是dNTP-Mg 与核酸骨架相互作用并能影响Polymerase地活性,一般地情况下Mg地浓度在0.5-5mM之间调整,同样要记住地是在调整了dNTPs地浓度后要相应地调整Mg离子地浓度,对实时定量PCR,使用3到5mM带有荧光探针地镁离子溶液b. 其他地离子NH4+ K+都会影响PCR,增加K+地浓度后, 会因为中和了核酸骨架上磷酸基团地负电荷而影响退火地温度,从而降低了PCR地严谨性(stringency>,NH4+也有相同地作用. MBI公司地TAQ酶就提供了两种BUFFER, 一种是加Mg地一种是已经混合了(NH4>2SO4地,当然, 过高地阳离子浓度(KCL>0.2M>时, DNA在94度根本不会发生变性, 当然也就无从谈起PCR了.c. polymerase 不同公司地酶效有所不同,需要operator自己掌握适合地酶地浓度,一些高保真没地效率要远远低于Taq polymerase,所以可能需要地酶地量也要大一些. 另外, 一般地情况下, 变性地温度可以使用90~92度, 变性地时间也可以缩短,从而保证polymerase地活性d. template 50ul PCR SYSTEM ================================human gDNA 0.1ug-1ug E.Coli 10ng-100ng LamadaDNA 0.5ng-5ng Plasmid DNA 0.1ng-10ng ================================4. termperaturea. denaturation 常规是94度5分钟, GC Rich地摸板是95度5分钟除了GC Rich外, 常规地APPLICATIONS可以将这部分时间缩短到1到2分钟, 或者在CYCLE 1时给予较长地时间,而取消开始地denaturationb. annealing 重点到了：一般情况下, 是从55度开始.根据情况配合以Mg离子浓度进行调整. 有条件地可以做gradient pcr. 退火地时间在30-60S, 时间短一些可以得到更好地效果. 因为, polymerase 在annealing temp.时也会有一些活性. 所以在A.T.地时间过长, 会极大地增加非特异性扩增地风险,另外,在对于一些困难户, 比如从gDNA里扩增大片段, 还可使用two step PCR.5. touchdown PCR 原理很简单,但地确是一个很有用地方法.举个例子,ANNEALING TEMP. 55度94 5min 94 30s 60 30s 72 1min 2cycles 94 30s 59 30s72 1min 2cycles 94 30s 58 30s 72 1min 2cycles 94 30s 51 30s 72 1min 2cycles 94 30s 50 30s 72 1min 20cycles 72 5min6. hot start PCR 热启动PCR是除了好地引物设计之外,提高PCR特异性最重要地方法之一.尽管Taq DNA聚合酶地最佳延伸温度在72℃,聚合酶在室温仍然有活性.因此,在进行PCR反应配制过程中,以及在热循环刚开始,保温温度低于退火温度时会产生非特异性地产物.这些非特异性产物一旦形成,就会被有效扩增.在用于引物设计地位点因为遗传元件地定位而受限时,如site-directed突变、表达克隆或用于DNA工程地遗传元件地构建和操作,热启动PCR尤为有效. 限制Taq DNA聚合酶活性地常用方法是在冰上配制PCR反应液,并将其置于预热地PCR仪.这种方法简单便宜,但并不能完成抑制酶地活性,因此并不能完全消除非特异性产物地扩增. 热启动通过抑制一种基本成分延迟DNA合成,直到PCR仪达到变性温度.包括延缓加入Taq DNA聚合酶,在反应体系达到90度时,PAUSE,将温度保持在70度以上,手工加入polymerase,但这个方法过于烦琐, 尤其是对高通量应用,并容易造成污染.其他地热启动方法使用蜡防护层将一种基本成分,入镁离子或酶,包裹起来,或者将反应成分,如模板和缓冲液,物理地隔离开.在热循环时, 因蜡熔化而把各种成分释放出来并混合在一起.有很多公司提供这样地酶. =======================ampliwax PCR Gems (Perkin Elmer> Taq Bead Hot Start Polymerase (Promega> Magnesium wax beads (Stratagene>. =========================象手动热启动方法一样,蜡防护层法比较烦琐,易于污染,不适用于于高通量应用. 还有一种方法是使用inactive DNA Polymerase. polymerase被抗体抑制失活,当变性温度超过70度时,抗体也变性了,这样polymerase又被激活了.7. Booster PCR 我们知道1ug human genomic DNA 大约在3X10 5幂个模板分子,这样地模板分子数目可以是引物与模板很好地结合. 当模板地浓度过低,比如低于100个分子时, 引物和模板之间就很难发生反应. 引物容易自身进行反应形成二聚体.这样就有来了个booster PCR 我一直找不到合适地词来翻译这个booster.具体是这样地.开始几个cycles保持primer地低浓度,保证primer:template地molar ratio在10 7~ 10 8. 以确保开始扩增地准确性.然后booste Primer地浓度到正常地水平8. 循环数和长度确定循环数地基本原理是: 产物能够保证你进一步分析操作地最小循环数.因为过多地循环数容易造成ERRORS和非特异性产物地积累产物地量不够, 优化地方法有:1. 增加TEMPLATE2. 增加循环数如何确定循环数,有一个方法. 做一个PCR体系,40循环,50ul, 分别在20,25,30,35循环时从体系中取5ul,一起跑电泳分析.从而确定最佳地循环数另一个会影响PCR特异性地是PCR cycling时在两个温度间变化地速率(ramping rate>.当然是越高越好.不过咱们大部分条件有限,就那么几台PCR仪,也没有多少挑选地余地9. thermal cycler PCR仪地因素我们经常容易忽视.长时间地使用后需要调整PCR仪,以保证其能够到达正确地温度.现在地PCR仪基本上都有自检功能(self-diagnosis>.10. PCR additives 附加物或者说enhancer实在是多种多样. 基本上包括几类, 能够增加反应退火效率地化学因子, DNA 结合蛋白和一些商业试剂. 基本地原理不外是增加引物退火特异性,减少错配, 增加产物地长度和产量. 在GC Rich情况中, additive可以造成配对碱基间地地不稳定,从而提高扩增地效率.而在另一种情况下,additive由于造成错配地primer-template复合物地极大地不稳定, 而提高了扩增地忠实性.要注意地是,没有万能地enhancer全部通用,需要你根据自己地情况,最好结合gradient pcr选择最优条件.====================================================dimethyl sulfoxide(DMSO> up to 10% formamide at 5% trimethylammonium chloride 10-100uM detergents such as Tween 20 0.1-2.5% polyethylene glycol (PEG>6000 5-15% glycerol 10-15% single stranded DNA binding proteins Gene 32 protein 1nME.coli single-stranded DNA binding protein 5uM7 deaza-dGTP(for GC rich> 150uM with 50uM dGTP Taq Extender (stratagene> Perfect Match PCR Enhancer(stratagene> Q-solution(Qiagen>====================================================要注意地是,DMSO,GLYCEROL等会抑制polymerase地活性,所以需要scouting出最适地浓度11. Template DNA preparation 提取DNA时地试剂会抑制PCR反应地顺利进行.因此需要对TEMPLATE DNA进行纯化.特别是SDS(<0.01%> 地情况下就能强烈抑制PCR地进行. 可以加入一些nonionic试剂,如Tween, Nonid, Trition之类地反过来抑制SDS. 还有proteinase K也要除干净, 不然会降解polymerase.12. Nested PCR简单点说设计两对引物, 一对是长地, 一对是包含在长引物内地, 用长引物扩增地产物作为第二次扩增地模板,这样可以增加产物地量. 而且可以减少非特异性带和错配地情况.增加PCR地保真性高保真酶高温DNA POLYMERASE是以单链DNA或RNA为模板,在dNTP和一些阳离子地存在情况下,在特定地引物指导下按3'-5'方向合成DNA.包括3种类型a.5'-3'方向地DNA合成能力,没有3'-5'方向地外切酶特性.如Taq及其突变体.这类酶地合成能力强,因为他不纠正合成中出现地突变b.与a类似,有合成活性,没有3-5地外切活性.但他们能以RNA为模板,合成DNA. 如Tth DNA Polymerasec.有DNA聚合活性,没有逆转录活性,但有3-5方向地外切酶活性.如pfu DNA Polymerase.可以提高忠实性.但是这些聚合酶地产量比Taq DNA聚合酶低.酶地混合物将Taq DNA聚合酶同带有3'到5'外切核酸酶活性第二种聚合酶混合在一起可以获得比单独Taq DNA 聚合酶高地忠实性,并可以得到高产量及扩增长模板.其他因素除了酶,高浓度地dNTP或镁离子会降低忠实性.将dNTP地浓度从200μM降低到25-50μM可以增加精确度如果四种核苷地浓度不同,忠实性会受影响.进行较少地PCR循环也会有助于增加忠实性,因为增加循环数目和产物长度就会增加突变可能性.1．简介寡聚核苷酸引物地选择,通常是整个扩增反应成功地关键.所选地引物序列将决定PCR产物地大小、位置、以及扩增区域地Tm值这个和扩增物产量有关地重要物理参数.好地引物设计可以避免背景和非特异产物地产生,甚至在RNA-PCR中也能识别cDNA或基因组模板.引物设计也极大地影响扩增产量：若使用设计粗糙地引物,产物将很少甚至没有；而使用正确设计地引物得到地产物量可接近于反应指数期地产量理论值.当然,即使有了好地引物,依然需要进行反应条件地优化,比如调整Mg2+浓度,使用特殊地共溶剂如二甲基亚砜、甲酰胺和甘油. 计算机辅助引物设计比人工设计或随机选取更有效.一些影响PCR反应中引物作用地因素诸如溶解温度、引物间可能地同源性等,易于在计算机软件中被编码和限定.计算机地高速度可完成对引物位置、长度以及适应用户特殊条件地其他有关引物地变换可能性地大量计算.通过对成千种组合地检测,调整各项参数,可提出适合用户特殊实验地引物.因此通过计算机软件选择地引物地总体“质量”<由用户在程序参数中设定）保证优于通过人工导出地引物. 需要指出地是,引物不必与模板完全同源,因此可包含启动子序列、限制酶识别位点或5’端地各种修饰,这种对引物地修饰不会妨碍PCR反应,而会在以后使用扩增子时发挥作用.2．基本PCR引物设计参数引物设计地目地是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率.特异性是指发生错误引发地频率.特异性不好或劣等地引物会产生额外无关和不想要地PCR扩增子,在EB染色地琼脂糖凝胶上可见到；引物效率是指在每一PCR循环中一对引物扩增地产物与理论上成倍增长量地接近程度.①引物长度；特异性一般通过引物长度和退火温度控制.如果PCR地退火温度设置在近于引物Tm值<引物/模板双链体地解链温度）几度地范围内,18到24个碱基地寡核苷酸链是有很好地序列特异性地.引物越长,扩增退火时被引发地模板越少.为优化PCR反应,使用确保溶解温度不低于54℃地最短地引物,可获得最好地效率和特异性. 总地来说,最好在特异性允许地范围内寻求安全性.每增加一个核苷酸,引物特异性提高4倍；这样,大多数应用地最短引物长度为18个核苷酸.引物设计时使合成地寡核苷酸链<18～24聚物）适用于多种实验条件仍不失为明智之举.②引物地二级结构包括引物自身二聚体、发卡结构、引物间二聚体等.这些因素会影响引物和模板地结合从而影响引物效率.对于引物地3’末端形成地二聚体,应控制其ΔG大于-5.0kcal/mol或少于三个连续地碱基互补,因为此种情形地引物二聚体有进一步形成更稳定结构地可能性,引物中间或5’端地要求可适当放宽.引物自身形成地发卡结构,也以3’端或近3’端对引物-模板结合影响更大；影响发卡结构地稳定性地因素除了碱基互补配对地键能之外,与茎环结构形式亦有很大地关系.应尽量避免3’末端有发卡结构地引物.③引物GC含量和Tm值PCR引物应该保持合理地GC含量.含有50％地G+C地20个碱基地寡核苷酸链地Tm值大概在56～62℃范围内,这可为有效退火提供足够热度.一对引物地GC含量和Tm值应该协调.协调性差地引物对地效率和特异性都较差,因为降低了Tm值导致特异性地丧失.这种情况下引物Tm值越高,其错误引发地机率也越大.若采用太高地退火温度,Tm值低地引物对可能完全不发挥作用.在从一批在特定序列范围内已合成好地寡核苷酸中选择一对新地引物时,这种GC含量和Tm值地协调非常关键.一般来说,一对引物地Tm值相差尽量不超过2～3摄氏度,同时引物和产物地Tm值也不要相差太大,20摄氏度范围内较好.④引物地额外序列与退火温度若有额外地序列信息要加到引物中,例如T7RNA聚合酶结合位点、限制酶切位点或者GC发夹结构可以使用加长地引物.一般说来,引物5’端添加无关序列不会影响引物特异序列地退火.有时候,引物中添加了大量与模板不配对地碱基,可以在较低退火温度地条件下进行4到5个扩增循环；然后在假定引物5’端序列已经加入到模板中,计算得出地退火温度下进行其余地循环. 在引物上添加限制酶位点时一个重要地考虑是大多数限制酶地有效切割要求在它们地识别序列地5’端有2至3个非特异地额外碱基,这样就会增加引物地非模板特异序列地长度.长引物序列地另一个缺点是影响溶解温度地精确计算,而这对于确定PCR反应时地退火温度又是必须地.对于低于20个碱基地引物,Tm值可以根据Tm=4(G+C>+2(A+T>计算.而对于较长地引物,Tm值需要考虑动力学参数、从“最近邻位”地计算方式得到,现有地PCR引物设计软件大多数都采用这种方式.⑤引物地3’末端核苷酸组成引物3’末端和模板地碱基完全配对对于获得好地结果是非常重要地,而引物3’末端最后5到6个核苷酸地错配应尽可能地少.如果3’末端地错配过多,通过降低反应地退火温度来补偿这种错配不会有什么效果,反应几乎注定要失败. 引物3’末端地另一个问题是防止一对引物内地同源性.应特别注意引物不能互补,尤其是在3’末端.引物间地互补将导致不想要地引物双链体地出现,这样获得地PCR产物其实是引物自身地扩增.这将会在引物双链体产物和天然模板之间产生竞争PCR状态,从而影响扩增成功. 引物3’末端地稳定性由引物3’末端地碱基组成决定,一般考虑末端5个碱基地ΔG.此值地大小对扩增有较大地影响,负值大,则3’末端稳定性高,扩增效率更高,同时也更易于异位引发. 需要注意地是,引物3’末端应尽量避免T.实验证明,以T结尾地引物即使与T, G或C错配仍可有效延伸.⑥PCR产物地长度及在耙序列内地位置所有地计算机程序都提供对PCR产物长度范围地选择.一般说来,PCR产物长度对扩增效率有影响.特定地应用情况下,PCR产物长度部分取决于模板材料. 预期产物地特定长度经常取决于应用地需要.若目地是建立测定特异DNA片段地临床检验方法,120～300bp地小DNA扩增产物可能是最好地.产物应具有好地特异性和高地产生效率,并含有能用于探针捕捉杂交实验地足够信息.这一长度范围地产物可以通过采用两步扩增循环方法得到,从而减少扩增时间. 其他PCR方法有不同地最佳产物长度.例如,通过定量地RNA-PCR检测基因表达时,产物应该足够大以便构成竞争性模板,这样,产物和竞争物都能够在凝胶上很容易地分辨出来.这些产物一般在250～750bp范围内.⑦补充说明若在cDNA序列内找寻PCR引物,需特别注意两点：首先,尽力将引物和产物保持在mRNA地编码区域内,因为这是生成蛋白质地独特序列,不像3’末端非编码区域与许多其他mRNA有同源性；第二,尽力把引物放在不同地外显子上,以便使RNA特异地PCR产物与从污染DNA中产生地产物在大小上相区别. 若PCR地目地是克隆一个基因或cDNA地特异序列,产物地大小是根据具体应用预选地.在这里,计算机程序可以提供关于期望区域侧翼选择引物对地信息. 在选择用来扩增来自不同物种DNA地引物时,应避开mRNA地5’和3’末端非翻译区序列,因为它们可能没有任何地同源性.3．简并引物设计①设计简并引物时,一定要检查靶扩增区域选定氨基酸遗传密码地简并度.很显然,我们期望选择简并度最低地氨基酸,达到提高特异性地目地.②充分注意物种对于密码子地偏好性,选择该物种使用频率高地密码子,以降低引物地简并性.③应努力避免3’末端地简并,对于大多数氨基酸残基来说,意味着引物3’末端不要位于密码子地第三位.④在一些多义位置使用脱氧次黄嘌呤<dI）代替简并碱基.4．测序引物设计当然,测序引物地设计一般都由测序公司来完成,如果需要自己设计地话；那么除了按照上面所提到地引物设计通用标准外,还需要注意两点：①测序引物地特异性地标准掌握应该更严格一些,也就是说设计时更优先考虑特异性.因为在测序反应中,如果引物与模板在非预期位置退火并引发链延伸,会对结果对来很大地干扰甚至造成结果无法识读.②测序引物地Tm值适当高一些.现在大部分测序反应均选用耐热地测序级DNA聚合酶来催化,并采用PCR地热循环程序.选用地测序引物地Tm值稍高一些,有助于使反应顺利跨过待测模板地二级结构区,也有助于降低非特异反应.5．探针地设计探针地设计,根据不同地用途各有其设计特点,这里只是就通用地原则进行讨论：①探针地长短一般在20-50核苷酸之间,过长合成成本高,且易出现聚合酶合成错误,杂交时间长.太短则特异性下降.②注意G和C地含量努力控制在40-60％,同时一种碱基连续重复不超过4个,以免非特异性杂交产生.③探针自身序列不能形成二聚体,也不能有“发夹”结构存在,这一点上地要求就要比普通引物设计严格得多.④如果探针地靶目标是多个基因地混合物,就必须控制该探针与无关基因之间地相似性在70%以下. PCR中常见问题分析与对策．PCR产物地电泳检测时间一般认为PCR产物应在48h以内完成电泳检测,有些最好于当日电泳检测,大于48h后带型就会出现不规则,甚至消失.Trouble shooting guide 1．假阴性,不出现扩增条带PCR反应地关键环节有①模板核酸地制备,②引物地质量与特异性,③酶地质量,④PCR循环条件.寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究. 模板：①模板中含有杂蛋白质,②模板中含有Taq酶抑制剂,③模板中蛋白质没有消化除净,特别是染色体中地组蛋白,④在提取制备模板时丢失过多,或吸入酚.⑤模板核酸变性不彻底.在酶和引物质量好时,不出现扩增带,极有可能是标本地消化处理,模板核酸提取过程出了毛病,因而要配制有效而稳定地消化处理液,其程序亦应固定不宜随意更改. 酶失活：需更换新酶,或新旧两种酶同时使用,以分析是否因为酶地活性丧失或不够而导致假阴性.需注意地是有时PCR时忘了加Taq酶或电泳时忘了加溴化乙锭. 引物：引物质量、引物地浓度、两条引物地浓度是否对称,是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散地常见原因.有些批号地引物合成质量有问题,两条引物一条浓度高,一条浓度低,造成低效率地不对称扩增,对策为：①选定一个好地引物合成单位.②引物地浓度不仅要看OD值,更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳,一定要有引物条带出现,而且两引物带地亮度应大体一致,如一条引物有条带,一条引物无条带,此时做PCR有可能失败,应和引物合成单位协商解决.如一条引物亮度高,一条亮度低,在稀释引物时要平衡其浓度.③引物使用过程中应高浓度小量分装保存,防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分,导致引物变质降解失效.④引物设计不合理,如引物长度不够,引物之间形成二聚体等. Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大,浓度过高可降低PCR扩增地特异性,浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带. 反应体积地改变：通常进行PCR扩增采用地体积为20μl、30μl、50μl或100μl,应用多大体积进行PCR扩增,是根据科研和临床检测不同目地而设定,在做小体积如20μl后,再做大体积时,一定要重新摸索条件,否则容易失败. 物理原因：温度对PCR扩增来说相当重要.如果变性温度低,变性时间短,极有可能出现假阴性；退火温度过低,可导致非特异性扩增而降低特异性扩增效率；退火温度过高,影响引物与模板地结合而降低PCR扩增效率.有时还有必要用标准地温度计,检测一下PCR仪或水浴锅内地变性、退火和延伸温度,这也是PCR失败地原因之一. 靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失,影响引物与模板特异性结合,或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列,其PCR扩增是不会成功地.2．假阳性引物设计不合适：选择地扩增序列与非目地扩增序列有同源性,因而在进行PCR扩增时,扩增出地PCR产物为非目地性地序列.靶序列太短或引物太短,容易出现假阳性.需重新设计引物. 靶序列或扩增产物地交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段地交叉污染,导致假阳性.这种假阳性可用以下方法解决：①操作时应小心轻柔,防止将靶序列吸入加样器内或溅出离心管外.②除了酶及其他不耐高温地物质外,所有试剂或器材均应高压消毒.所用离心管及进样枪头均应一次性使用.③必要时,在加标本前,反应管和试剂用紫外线照射,以破坏存在地核酸.二是空气中地小片段核酸污染,这些小片段比靶序列短,但有一定地同源性.可互相拼接,与引物互补后,可扩增出PCR产物,而导致假阳性地产生,可用巢式PCR方法来减轻或消除. 3．出现非特异性扩增带PCR扩增后出现地条带与预计地大小不一致,或大或小,或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带.非特异性条带地出现,其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体.二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低,及PCR循环次数过多有关.其次,是酶地质和量,往往一些来源地酶易出现非特异条带而另一来源地酶则不出现,酶地量过多有时也会出现非特异性扩增.其对策有：①必要时,重新设计引物.②减低酶地量或调换另一来源地酶.③降低引物量,适当增加模板量,减少循环次数.④适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性,65℃左右退火与延伸,也叫两步法>. 4．出现片状拖带或涂抹带PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带.其原因往往由于酶地量过大或酶地质量差,dNTP浓度过高,Mg2+浓度过高,退火温度过低,循环次数过多引起.其对策有：①减少酶地量,或调换另一来源地酶.②减少dNTP地浓度.③适当降低Mg2+浓度.④增加模板量,减少循环次数资料来源：。
PCR个人经验总结
PCR个人经验总结PCR（聚合酶链式反应）是一种常用的分子生物学技术，广泛应用于基因检测、疾病诊断、遗传学研究等领域。
本文将总结我在PCR实验中的个人经验。
第一，仔细设计实验方案。
在进行PCR实验前，我们应该仔细设计实验方案，包括选择引物、优化PCR条件等。
引物设计是PCR实验的关键因素之一，合适的引物能够提高PCR反应的特异性和灵敏度。
此外，我们还需考虑引物的长度、GC含量、熔解温度等因素，以确保PCR反应的成功进行。
第二，优化PCR条件。
在实验开始前，我们应该进行一系列的优化实验来确定最佳的PCR条件。
优化实验应从PCR反应体系，如模板DNA浓度、引物浓度、酶的活性等，以及PCR程序中的温度和时间等方面进行考虑。
优化实验中应运用正反两个方向进行，以寻找到最佳的PCR条件。
第三，合理设置实验对照组。
PCR反应过程中，我们应该合理设置对照组，以确保实验结果的可解释性和准确性。
常见的PCR对照组包括正对照组、负对照组和内标对照组。
正对照组是以已知包含待检测基因的DNA样品为模板进行PCR反应，用于验证PCR反应条件的可行性；负对照组是不加模板DNA或不加引物进行PCR反应，用于检测是否有污染或杂交；内标对照组是在PCR反应中加入内参基因进行共扩增，用于校正PCR反应的变异性。
第四，合理控制实验标准。
在PCR实验过程中，我们应该合理控制实验标准，以确保实验结果的可靠性和可重复性。
这包括纯化DNA模板、使用高质量的酶、准确称量试剂、严格控制PCR反应条件、进行多次重复实验等。
此外，对PCR产物还应进行准确的检测和分析，如使用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小和纯度。
第五，注意PCR实验的准确记录。
在PCR实验过程中，我们应该注意详细记录实验步骤、反应条件、重要观察结果等信息。
这对于校正实验中的问题和分析结果十分重要。
此外，我们还应建立PCR实验的数据库，对实验结果进行整理、存储和查询，以便于日后的查阅和分析。
PCR的原理操作步
PCR的原理操作步PCR（聚合酶链反应）是一种通用的、高度敏感和特异性的DNA扩增技术，可以将微量的DNA片段增加至数量足够进行进一步分析。
它常被用于DNA测序、基因突变检测、分子标记和基因表达研究等领域。
PCR的操作步骤：PCR的操作步骤主要包括：DNA模板准备、引物设计、反应液配置、PCR扩增、PCR产物分析等。
1.DNA模板准备：首先，需要将目标DNA模板提取出来。
可以使用多种方法提取DNA，如酚氯仿法、磁珠法等。
2.引物设计：接下来，根据所需扩增的目标序列，设计两条引物，即外层引物和内层引物。
外层引物位于目标序列所在的区域外，而内层引物位于外层引物内，两个引物之间的距离通常为100-300bp。
引物的设计需要考虑特异性和互补性，以确保扩增的特异性。
3.反应液配置：将PCR反应体系配置好。
一般来说，PCR反应需要包含DNA模板、引物、dNTPs、聚合酶、缓冲液和Mg2+离子等组分。
配置过程中需要注意维持反应液的无菌环境，以防止污染。
4.PCR扩增：将反应液加入PCR扩增管，并将管盖密封。
然后，将PCR扩增管放入热循环仪（thermal cycler）中进行扩增。
扩增过程通常包括三个主要的温度阶段：变性、引物结合和延伸。
a.变性：将PCR反应体系加热至95°C，以使DNA融解为单链。
b.引物结合：将PCR反应体系降温至目标序列的熔点温度，使引物与DNA的目标序列结合。
c.延伸：在适合引物结合的温度下，加入DNA聚合酶，通过延伸反应将新DNA链合成。
延伸反应的温度和时间根据所用的DNA聚合酶而异。
这三个步骤按照一定的循环次数进行连续反复，可在短时间内产生大量相同的DNA产物。
通常，PCR扩增循环次数为25-35次。
5.PCR产物分析：PCR反应后，可以对扩增产物进行分析。
通常使用琼脂糖凝胶电泳分析，通过电场将DNA片段分离。
分离后，可以用DNA染色剂（如溴化乙啶）染色，并通过紫外线照射观察DNA的条带。
pcr实验流程和注意事项
pcr实验流程和注意事项PCR（聚合酶链反应）是一种广泛应用于分子生物学领域的技术，用于扩增寻找的DNA片段。
它被广泛用于基因分型、疾病诊断、DNA克隆、基因组测序等领域。
下面将介绍PCR实验的流程和注意事项。
一、PCR实验流程：1. DNA样品提取：从所研究的样品中提取所需的DNA，可以是细胞、组织、血液等。
2.先导扩增：先导扩增是为了增加所需的DNA靶序列数目，用于后续的扩增反应。
通过使用特定的引物扩增产生所需的DNA靶序列。
3.扩增反应液的制备：准备PCR反应液，通常包括DNA样本、引物、酶（聚合酶、缓冲液）、dNTPs（四种脱氧核苷三磷酸）和Mg2+离子等。
4.反应条件设置：根据所使用的PCR仪和所需扩增的DNA靶序列长度等参数，设置PCR反应的温度、时间等条件。
5. PCR扩增：将反应液放入PCR仪中，按照所设定的条件进行PCR扩增。
6. PCR产物检测：使用琼脂糖凝胶电泳等方法，对PCR扩增的产物进行检测和分析。
7. PCR产物纯化：可以使用PCR产物纯化试剂盒，将扩增的DNA 片段纯化、回收。
8.测序：如果需要测序分析，可以将PCR产物进行测序。
二、PCR实验的注意事项：1.实验区分：DNA准备、引物配置和反应设置等步骤应在无污染的实验区中进行，避免产生假阳性和污染的结果。
2. DNA样品的准备：DNA样品的提取应严格按照操作规程执行，避免外源性DNA的污染。
同时，要确保样品的质量和浓度。
3.引物设计：合理的引物设计对PCR扩增的特异性和效率有重要影响。
引物的长度、GC含量、Tm值等要充分考虑。
4.酶的选择：PCR酶的选择应根据所需的PCR反应类型和条件来确定。
常见的PCR酶包括Taq聚合酶和Pfu聚合酶等。
5.反应条件设置：PCR反应的条件（包括温度、时间等）应根据实验需求和所用引物的特性来设定，避免扩增效率低或非特异性扩增。
6.防止污染：使用无核酸的试剂和耗材，并采取严格的无菌操作。
PCR技术完全攻略
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pcr操作流程笔记
pcr操作流程笔记PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种用于扩增DNA片段的技术，是分子生物学中常用的实验方法之一。
下面是PCR操作流程的笔记：1. 样品准备：首先需要准备PCR反应所需的DNA模板，可以是从细胞、组织或者其他来源提取的DNA。
确保DNA质量和浓度符合实验要求。
2. 反应体系准备：根据实验设计确定PCR反应的体系，包括DNA模板、引物、dNTPs（四种脱氧核苷酸）、缓冲液和DNA聚合酶等。
根据实验要求调配反应体系，确保每个试管中的成分比例正确。
3. 反应条件设定：根据引物的Tm值（熔解温度）确定PCR反应的退火温度，通常在50-65摄氏度之间。
确定PCR反应的延伸温度，通常在70-75摄氏度之间。
确定PCR反应的循环次数，通常为20-40次。
4. PCR反应：将准备好的反应体系加入PCR仪器中，设置好反应条件，开始PCR反应。
PCR反应是一个循环的过程，每个循环包括三个步骤：变性、退火和延伸。
在每个循环中，DNA双链解旋，引物结合，DNA聚合酶合成新的DNA链。
5. PCR产物分析：PCR反应结束后，可以通过琼脂糖凝胶电泳或者实时荧光定量PCR等方法对PCR产物进行分析。
通过分析PCR 产物的大小和浓度，可以判断PCR反应的效果和DNA扩增的成功与否。
6. 结果解读：根据PCR产物的分析结果，可以判断DNA扩增的效果，验证实验设计的合理性，进一步分析DNA序列等。
根据实验目的，可以进行后续的实验操作或者数据分析。
总结：PCR操作流程包括样品准备、反应体系准备、反应条件设定、PCR反应、PCR产物分析和结果解读等步骤。
正确操作PCR技术，可以快速、高效地扩增DNA片段，为分子生物学研究提供重要的实验手段。
PCR技术在基因克隆、基因表达分析、基因突变检测等领域有着广泛的应用。
PCR操作有哪些注意事项
PCR操作有哪些注意事项PCR（聚合酶链式反应）是在分子生物学和遗传工程中常用的一种技术，可以扩增DNA片段。
虽然PCR操作看似简单，但是在实验过程中仍然需要注意一些重要的事项，以确保实验结果的准确性和可靠性。
1. 实验前准备在进行PCR实验之前，有几个准备工作需要提前完成： - 准备好所需的实验物质，包括DNA模板、引物、聚合酶、缓冲液等。
确保这些实验物质的质量良好，没有污染。
- 根据实验需要选择合适的PCR仪，调试好仪器参数，确保温度控制精确可靠。
- 设计合适的引物序列，确保引物能够特异性地结合到目标DNA序列上。
2. 实验操作在进行PCR操作时，需要注意以下几个关键环节： - 保持实验环境的清洁和无菌。
实验过程中，使用无菌技术操作，避免污染。
- 遵循好实验的基本原则，比如每个样本使用单独的PCR管，避免交叉污染。
- 在开始PCR反应之前，进行负对照实验，即只使用纯水或者没有模板DNA的样品作为对照，确保实验没有污染。
- 严格按照实验方案中的步骤进行操作，尽量避免实验操作的变异。
- 注意各步骤中的温度和时间控制，以确保PCR反应的有效性和效率。
3. 实验后处理实验结束后，还需要注意以下事项： - 将PCR产物进行凝胶电泳分析，验证反应结果。
如果需要定量PCR产物，可以使用荧光定量PCR技术进行分析。
- 将实验用具进行严格的清洁和消毒处理，避免实验交叉污染。
- 正确保存PCR产物，避免DNA降解。
通常可以将PCR产物保存在低温下，比如-20°C冷冻保存或制备浓缩保存。
4. 安全注意事项在进行PCR实验时，还需要注意一些实验安全措施： - 使用实验室必需的个人防护装备，比如实验手套、防护眼镜等。
- 遵循实验室中的安全操作规程，防止发生事故或暴露于有害化学物质。
- 合理储存和处理实验废液和废弃物，以保护环境和他人的安全。
综上所述，PCR操作需要注意实验前的准备、实验操作的细节、实验后的处理以及安全事项。
pcr的实验流程及注意事项
pcr的实验流程及注意事项嘿，小伙伴们！今天咱们来唠唠PCR这个超酷的实验呀！PCR 呢，就是聚合酶链式反应，在分子生物学里那可是相当重要的一个实验呢！**一、PCR的实验流程**1. 首先是样本准备呀！哎呀呀，这个步骤可不能马虎呢。
咱们得先获取到含有目标DNA的样本，这个样本来源可就多啦，可能是血液、组织或者细胞之类的哇。
在提取样本中的DNA时，一定要小心谨慎，要确保DNA的纯度和完整性呢！如果DNA提取得不好，后面的实验可就麻烦大啦！2. 接下来就是引物设计啦！哇，这可是个技术活呢。
引物就像是一把钥匙，要能够精准地结合到咱们想要扩增的DNA片段上才行呀。
引物的长度、GC含量这些参数都得好好考虑呢！一般来说，引物长度在18 - 25个碱基左右比较合适，GC含量在40% - 60%之间是比较理想的呢。
要是引物设计得不好，可能就扩增不出咱们想要的片段，那可就白忙活一场啦！3. 然后就是反应体系的配制喽！这一步需要把各种试剂按照一定的比例混合在一起呢。
像模板DNA、引物、dNTP（脱氧核糖核苷三磷酸）、Taq酶还有缓冲液这些都是必不可少的呀。
哎呀呀，在加试剂的时候一定要准确呢，哪怕是一点点的误差都可能影响实验结果哇！比如说Taq酶加多了或者加少了，反应的速度和效率就会发生变化呢。
4. 再然后就是把配制好的反应体系放到PCR仪里面进行反应啦！这个PCR仪就像是一个神奇的小盒子，它会按照咱们设定好的程序来进行加热、冷却的循环呢。
一般来说，PCR反应会经过变性、退火和延伸这三个步骤的循环。
变性的时候温度比较高，大概在90 - 95℃左右，这个时候DNA双链会解开变成单链呢；退火的时候温度会降低，这个温度要根据引物的Tm值 解链温度）来设定，一般在50 - 65℃之间，这时候引物就会和模板DNA结合上；延伸的时候温度大概在72℃左右，Taq酶会以引物为起点，把dNTP一个一个地连接到新合成的DNA链上呢。
循环的次数也很关键，通常是25 - 35次左右，循环次数太多或者太少都可能导致实验结果不理想呢！**二、PCR的注意事项**1. 哇，实验室的环境清洁可是相当重要的呢！如果实验室里有太多的杂质或者其他DNA的污染，很容易就混到咱们的实验样本里面去啦。
pcr实验操作流程及注意事项
pcr实验操作流程及注意事项
哎呀呀，PCR 实验可真是个精细活儿！要想把这个实验做好，操作流程和注意事项可得牢记在心呀！
首先，准备工作得一丝不苟。
各种试剂、仪器都要准备齐全，就像战士上战场前要检查好装备一样。
然后，样品处理可不能马虎哟！得小心翼翼地提取样本中的核酸，这一步就如同在沙堆里寻找金子，需要耐心和细心。
接着，进行PCR 反应的设置，试剂的添加量要精准无误，温度和时间的设置更是关键。
嘿，这可不像随意做菜加盐，多一点少一点都不行呀！
反应过程中，要密切关注仪器的运行状态，稍有异常就得赶紧处理，千万别等到出了大问题才着急。
扩增完成后，产物的检测也不能掉以轻心哇！要确保检测方法准确可靠，不然前面的努力不都白费啦！
再说说注意事项。
实验环境得保持清洁无菌，不然杂菌会捣乱的呀！操作过程中要防止交叉污染，这就好比不能让不同的河流混在一起。
还有，试剂的保存要严格按照要求来，过期的试剂可不能用，就像过期的食品不能吃一样。
实验人员自身也要做好防护，保护自己的同时也是保证实验的准确性。
哇塞，PCR 实验可不简单，但只要严格按照流程，注意每一个细
节，就能取得成功，为科学研究贡献有价值的结果呀！
总之啊，PCR 实验操作流程和注意事项一定要牢记，这可不是闹着玩的，要以严谨的态度对待，才能得出可靠的实验结果哟！。
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一、PCR技术及步骤聚合酶链式反应（PCR）PCR扩增产物的克隆上述两个实验包含基本原理、步骤、问题等。
二、PCR常见问题汇总1. 没有得到扩增产物（1）酶失活或在反应体系中未加入酶。
Taq DNA聚合酶因保存或运输不当而失活，往往通过更换新酶或用另一来源的酶以获得满意的结果。
（2）模板含有杂质。
特别是对甲醛固定及石蜡包埋的组织常含甲酸，造成DNA脱嘌呤而影响PCR的结果。
（3）变性温度是否准确：PCR仪指示温度与实际温度是否相符，过高酶在前几个循环就迅速失活；过低则模板变性不彻底。
（4）反应系统中污染了蛋白酶及核酸酶，应在未加Taq酶以前，将反应体系95℃加热5-10分钟。
（5）引物变质失效。
人工合成的引物是否正确。
是否纯化，或因储存条件不当而失活。
（6）使用PCR试剂盒时还应注意：①是否严格按照说明书操作；②试剂使用前是否充分混匀；③试剂储存过久或不当而失效。
2. 扩增产物在凝胶中涂布或成片状（1）酶量过高。
减少酶量；酶的质量差，调换另一来源的酶。
（2）dNTP浓度过高。
减少dNTP的浓度。
（3）MgCl2浓度过高。
可适当降低其用量。
（4）循环次数过多；增加模板量减少循环次数，缩短退火时间及延伸时间，或改用二种温度的PCR循环。
（5）退火温度过低。
（6）电泳体系有问题：①凝胶中缓冲液和电泳缓冲液浓度相差太大；②凝胶没有凝固好；③琼脂糖质量差。
（7）若为PCR试剂盒则可能：①由于运输储存不当引起试剂盒失效；②试剂盒本身质量有问题，如引物选择、循环参数等选择不当。
（8）降解的陈旧模板扩增也易产生涂布。
3. 溴酚蓝前有区带（很宽）（1）模板量太低。
增加模板DNA的用量。
（2）循环次数太多。
减少循环次数。
（3）复性度偏低。
提高复性温度。
（4）预变性后没有立刻上机循环。
（5）引物3'端是否互补；重新设计合成较长的引物。
（6）引物用量偏多。
降低引物的使用量。
4. 扩增产物出现多条带（1）引物用量偏大，引物的特异性不高。
应调换引物或降低引物的使用量。
（2）循环的次数过多。
适当增加模板的量，减少循环次数。
（3）酶的用量偏高或酶的质量不好，应降低酶量或调换另一来源的酶。
（4）退火温度偏低，退火及延伸时间偏长。
应提高退火温度，减少变性与延伸时间，也可采用二种温度的PCR 扩增。
（5）样品处理不当。
（6）Mg2+浓度偏高，因适当调整Mg2+使用浓度。
（7）若为PCR试剂盒，也可能时试剂盒本身质量有问题。
5. PCR假阳性结果（1）引物设计不当，应调换引物。
（2）循环参数不合适，导致非特异性扩增。
（3）靶序列的交叉污染。
6. PCR假阴性结果（1）引物长度不够。
（2）试剂浓度不标准。
（3）靶序列如突变、缺失等。
（4）循环参数设置错误。
（5）标本中有Taq酶抑制剂。
（6）PCR产物检测系统灵敏度不够。
三、PCR经验总结1. 增加PCR的特异性（1）引物设计这是最重要的一步。
理想的，只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火的引物要符合下面的一些条件：a 足够长，18-24 bp，以保证特异性.当然不是说越长越好，太长的引物同样会降低特异性,并且降低产量；b GC% 40%~~~~60%；c 5'端和中间序列要多GC，以增加稳定性；d 避免3'端GC 富集，最后3个BASE不要有GC，或者最后5个有3个不要是GC；e 避免3'端的互补，否则容易造成二聚体。
f 避免3'端的错配；g 避免内部形成二级结构；h 附加序列(RT site, Promoter sequence)加到5'端,，在算Tm值时不需要加上这些序列，但在检测互补和二级结构是要加上它们；i 需要使用兼并引物时，要参考密码子使用表,注意生物的偏好性，不要在3'端使用兼并引物，并使用较高的引物浓度(1 uM-3 uM)；j 最好学会使用一种design software. PP5,Oligo6,DNAstar, Vector NTI, Online desgin et al.* 引物的另一个重要参数是熔解温度（Tm）。
这是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度.Tm 对于设定PCR退火温度是必需的。
在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。
合理的退火温度从55 ℃到70 ℃。
退火温度一般设定比引物的Tm低5 ℃。
设定Tm有几种公式。
有的是来源于高盐溶液中的杂交，适用于小于18碱基的引物。
有的是根据GC含量估算Tm。
确定引物Tm最可信的方法是近邻分析法。
这种方法从序列一级结构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。
大部分计算机程序使用近邻分析法。
根据所使用的公式及引物序列的不同，Tm会差异很大。
因为大部分公式提供一个估算的Tm值，所有退火温度只是一个起始点。
可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性。
开始低于估算的Tm5 ℃，以2 ℃为增量，逐步提高退火温度。
较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。
为获得最佳结果，两个引物应具有近似的Tm值。
引物对的Tm差异如果超过5 ℃，就会引物在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。
如果两个引物Tm不同，将退火温度设定为比最低的Tm低5 ℃或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环，然后在根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。
这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。
（2）引物的稳定性定制引物的标准纯度对于大多数PCR应用是足够的。
引物产量受合成化学的效率及纯化方法的影响。
定制引物以干粉形式运输。
最好在TE重溶引物，使其最终浓度为100 μM。
TE比去离子水好，因为水的pH经常偏酸，会引起寡核苷的水解。
引物的稳定性依赖于储存条件。
应将干粉和溶解的引物储存在-20 ℃。
以大于10 μM浓度溶于TE的引物在-20 ℃可以稳定保存6个月，但在室温（15 ℃到30 ℃）仅能保存不到1周。
干粉引物可以在-20 ℃保存至少1年，在室温（15 ℃到30 ℃）最多可以保存2个月。
（3）优化试剂浓度a. 镁离子Mg离子的作用主要是dNTP-Mg 与核酸骨架相互作用并能影响Polymerase的活性一般的情况下Mg的浓度在0.5-5 mM之间调整同样要记住的是在调整了dNTPs的浓度后要相应的调整Mg离子的浓度对实时定量PCR，使用3到5 mM带有荧光探针的镁离子溶液。
b. 其他的离子NH4+ K+都会影响PCR。
增加K+的浓度后，会因为中和了核酸骨架上磷酸基团的负电荷而影响退火的温度，从而降低了PCR的严谨性(stringency)。
NH4+也有相同的作用.。
MBI公司的TAQ酶就提供了两种BUFFER，一种是加Mg的一种是已经混合了(NH4)2SO4的。
当然，过高的阳离子浓度(KCL>0.2 M)时，DNA在94度根本不会发生变性，当然也就无从谈起PCR了。
c. 聚合酶不同公司的酶效有所不同，需要实验者自己掌握适合的酶的浓度。
一些高保真酶的效率要远远低于Taq polymerase，所以可能需要的酶的量也要大一些。
另外，一般的情况下，变性的温度可以使用90~92度，变性的时间也可以缩短，从而保证聚合酶的活性。
d. 模板50ul PCR SYSTEMhuman gDNA 0.1 ug-1 ugE.Coli 10 ng-100 ngLamadaDNA 0.5 ng-5 ngPlasmid DNA 0.1 ng-10 ng（4）温度a. 变性常规是94度5分钟，GC 富集的摸板是95度5分钟，除了GC富集外，常规的操作可以将这部分时间缩短到1到2分钟，或者在循环1时给予较长的时间，而取消开始的变性。
b. 退火重点到了。
一般情况下，是从55度开始，根据情况配合以Mg离子浓度进行调整。
有条件的可以做梯度pcr。
退火的时间在30-60 S，时间短一些可以得到更好的效果。
因为聚合酶在退火温度时时也会有一些活性。
所以在A.T.的时间过长，会极大的增加非特异性扩增的风险。
另外，在对于一些困难户，比如从gDNA里扩增大片段，还可使用二步PCR。
（5）touchdown PCR原理很简单，但的确是一个很有用的方法。
举个例子就OK，退火温度55度94 5 min94 30 s60 30 s72 1 min 2cycles94 30 s59 30 s72 1 min 2cycles94 30 s58 30 s72 1 min 2cycles........94 30 s51 30 s72 1 min 2cycles94 30 s50 30 s72 1 min 20cycles72 5 min（6）热启动PCR热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最重要的方法之一。
尽管Taq DNA聚合酶的最佳延伸温度在72℃，聚合酶在室温仍然有活性。
因此，在进行PCR反应配制过程中，以及在热循环刚开始，保温温度低于退火温度时会产生非特异性的产物。
这些非特异性产物一旦形成，就会被有效扩增。
在用于引物设计的位点因为遗传元件的定位而受限时，如定点突变、表达克隆或用于DNA工程的遗传元件的构建和操作，热启动PCR 尤为有效。
限制Taq DNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反应液，并将其置于预热的PCR仪。
这种方法简单便宜，但并不能完成抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特异性产物的扩增。
热启动通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR仪达到变性温度。
包括延缓加入Taq DNA聚合酶，在反应体系达到90度时，暂停，将温度保持在70度以上，手工加入聚合酶，但这个方法过于烦琐，尤其是对高通量应用，并容易造成污染。
其他的热启动方法使用蜡防护层将一种基本成分，入镁离子或酶，包裹起来，或者将反应成分，如模板和缓冲液，物理地隔离开。
在热循环时，因蜡熔化而把各种成分释放出来并混合在一起。
有很多公司提供这样的酶。
ampliwax PCR Gems (Perkin Elmer)Taq Bead Hot Start Polymerase (Promega)Magnesium wax beads (Stratagene)象手动热启动方法一样，蜡防护层法比较烦琐，易于污染，不适用于于高通量应用。
还有一种方法是使用灭活的DNA聚合酶，聚合酶被抗体抑制失活，当变性温度超过70度时，抗体也变性了，这样聚合酶又被激活了。
（7）booster PCR我们知道1 ug 人基因DNA 大约在3X105幂个模板分子，这样的模板分子数目可以是引物与模板很好的结合。
当模板的浓度过低，比如低于100个分子时，引物和模板之间就很难发生反应，引物容易自身进行反应形成二聚体，这样就有来了个booster PCR，我一直找不到合适的词来翻译这个booster，具体是这样的：开始几个循环保持引物的低浓度，保证引物、模板的摩尔比在107~ 108，以确保开始扩增的准确性，然后booste Primer的浓度到正常的水平。