鱼用核酸疫苗研究进展

了 4?, 与两种鱼源启动子—鲤 " T肌动蛋白和花 （ 7,’3,8,) 乳酸脱氢酶" 1060"(+8.6,)） T启动子驱动萤火虫荧光素酶基因在 鲑 （ 9&8*( )&8&" ） 肌肉中的表达情况。结果 4?, 和 " T肌动蛋 白启动子都能使荧光素酶基因高水平表达， T肌动蛋白启动 " 子较 4?, 效果稍差， 但差异不显著。 肌动蛋白启动子在很 T "
关键词： 鱼类； 核酸疫苗； 免疫机理； 接种途径
012 34567：@7AB；<C9CD7E F6EE79C；3GG=9(H(?7E GCEB697AG；39(E=H6D7(9 I(=DC
中图分类号： ,&2!
文献标识码： ;
文章编号： （!""2） $"""#%!"0 "$#""&"#"1 对鱼用核酸疫苗的免疫机理、 构建方法和接种途径等方面的 总结， 探讨了研究、 开发新型鱼用核酸疫苗在疾病防治方面 的应用前景。 8 核酸免疫的免疫机理 核酸免疫是抗原以遗传物质的形式主动或被动地进入 免疫对象的细胞， 合成抗原并与主要组织相容性复合物 ! （R6S(I B7AD(E(GL6D7T7H7DU E(GLHCV !， 类分子结合形成 R5- ! ） 复合体， 随后被提呈到细胞表面， 激活机体免疫细胞免疫应 答的生理学过程。 898 核酸免疫的免疫应答 鱼类预防感染的第一道防线是非特异性免疫系统， 如黏
［=’］ 。 导鲫产生细胞介导的免疫应答
启动子是驱动外源基因在宿主细胞中表达的主要元件。 在各种各样的启 动 子 中， 以人巨细胞病毒 （ 4;657G@#95$%:8&， 早期启动子效果最好， 使用也最广泛。这种启动子能 4?,）
［==］ 使外源基因在有鳍鱼类中高水平表达 。为了构建水产动 ［=+］ 比较 物核酸疫苗安全而高效的表达载体， NW7GJT4U%#::% 等
［’(］ 止。"#$%& 等 用免疫组化连mp;’()(*& +",-. ）
［’/］ 用同样的方法从利氏曼原虫 特异性的 A@N。 3%G*:#O%6# 等
表达特异性蛋白的情况。免疫后 )*， 外源蛋白能够正常表 达； ’(* 后表达抗原的肌细胞出现明显的坏死； +(* 后在注射 局部没有检测到表达抗原的肌细胞。肌肉注射含 ,-., 糖 蛋白基因的核酸 疫 苗 后 第 /0*， 表达该基因的细胞减少了
［2］
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"
!!!!!" 综 述 "
鱼用核酸疫苗研究进展 谢海侠 聂 品 王桂堂
（中国科学院水生生物研究所 淡水生态与生物技术国家重点实验室， 武汉 2%""0!）
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［’=］
研究背景的情况下， 可以筛选到病原基因组中的每一个可能 的基因。 #"!"$ 其他筛选方法 直接将亚单位疫苗的编码基因作为 核酸疫苗的候选基因。病毒的保护性免疫应答是由包裹病 毒的表面多肽或从病毒表面突起穿过脂质囊膜的多肽激发 的， 可将编码这些免疫原的基因直接作为候选基因。另外， 毒力是病原微生物致病性的根本原因， 诱导针对主要毒力抗 原决定族的免疫力是建立免疫保护的另一种重要手段。 #"# 核酸疫苗载体设计 鱼类采用哺乳动物表达载体， 如 FP"B2+ Q ’ （R S C） 作为 表达外源基因的质粒骨架， 标准载体中的转录控制序列 （启 动子、 增强子、 内含子、 在水产动物中同样有 359;T2 信号等）
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染性 造 血 组 织 坏 死 症 病 毒 （ 39MCED7(=A B6CG6D(L(7CD7E 9CEI(A7A 35’K） N(=9: O=DDC 株的糖蛋白基因构建的第一例鱼用 F7I=A， 核酸疫 苗， 能够诱导虹鳟幼鱼产生高水平保护性免疫应
［*］ 答 。PC(9? 等用致死剂量的 35’K 攻击虹鳟， 免疫组的保护
［=(］ 淋巴细胞的靶位不会被丢失 。 DKA 在不清楚抗原性靶位
肌肉接种核酸疫苗时， 尽管注射部位会因局部炎症而有 但外源核酸主要是由肌细胞摄取并表达， 但肌细 234 浸润， 胞表面缺乏与绝大多数 234 有关系的共刺激 （ 45&6%789#65:;） 分子， 故其表达的抗原不能有效地激活 < 淋巴细胞
率达到 $""J ， 而对照组的死亡率高达 Q*J —&"J
［%］
。
虽然鱼用核酸疫苗尚处在研究和试验阶段， 却体现出巨 大的优越性和应用前景。核酸疫苗是由含保护性抗原基因 的质粒构成， 导入机体后被宿主细胞摄取、 表达、 加工并提呈 给免疫系统诱导特异性体液免疫和细胞免疫
收稿日期： 修订日期： !""!#$!#"%； !""%#"&#!"
［’’］ 。 !(1
（ /0.)1*&’.& *护力的克隆， 则筛选到杜氏利氏曼原虫 （ /0.)1*&$ ?G9I; 等
的组蛋白和核糖体蛋白能够诱导动物机体产生 ’.& 3(’(4&’. ） 病原特异性的 < 细胞免疫应疫， 并且在筛选过程中细胞毒性 <
［1］
。本文通过
基金项目： 国家自然科学基金 （ ’() %"$%"$*"） ； 国家杰出青年科学基金 （ ’() %""!*"%*） ； 中国科学院知识创新工程方向性项目 （ +,-.!#,/# 资助 %"!） 作者简介： 谢海侠 （$&01—） ， 女， 陕西宝鸡人； 博士研究生； 主要从事鱼类免疫学研究 通讯作者： 聂 品 万方数据
［=0］ 多组织和细胞中都诱导到外源基因较高水平的表达 ， 因
而成为水产动物核酸疫苗载体构建过程中病毒启动子的安 全而高效的替代元件。 $ 核酸疫苗的免疫接种策略 基因枪导入法 核酸免疫接种途径包括直接注射裸 "B2、
万方数据 的斑点。或通过酶标抗体与底物显色筛选目的克隆。
;! 和浸泡等。 !"# 肌肉注射
［!］ 效 。载体的属性， 如不相关的 <U 表位， 共线性表 4FN 756%O，
。< 淋
巴细胞的激活主要是在淋巴组织中完成的。 4#$# 的实验表 明： 并在这里完 234 将抗原递呈给接种部位附近的淋巴结，
［’+］ 成对抗原的感应 。由于在这些淋巴结及远离接种部位的
脾脏中都可以检测到核酸疫苗特异性序列的长期存在， 所以 这些淋巴结是核酸免疫时刺激免疫系统的主要抗原来源， 也 是刺激免疫记忆细胞产生和维持的主要基地。 !"$ 核酸免疫的免疫保护性 用 ,-., 糖蛋白基因构建的核酸疫苗肌肉接种虹鳟幼 鱼， 并在接种后第 /* >* 后检测到 ?-4!基因表达量的增加， 产生了免疫保护力
［’0］
， /(* 后的攻毒试验表明这种核酸疫苗
［’’］ 仍能提供很强的保护力 。体重为 =@ 的虹鳟接种 A-B, 的
核酸疫苗后第 0* 产生了免疫保护， 但 +—0 周后才能检测到 体液免 疫 的 产 生。 ,-., 与 A-B, 的 核 酸 疫 苗 肌 肉 接 种 后 但两个月后的攻毒实验发现这 0—>* 产生了交叉免疫保护， 两种病毒的核酸疫苗只对相应的病毒具有保护力。可见， 在 接种后早期， 这两种核酸疫苗诱导了非特异性免疫保护， 但
水
生
生
物
学
报
!G 卷
［J7］ 个发育过程中始终以咽腔上皮与水环境相接触 ； 从胸腺
的结构来看， 胸腺的淋巴 > 上皮结构较肠黏膜组织的更为完
［JK］ 善 ， 而肠道是鱼类重要的免疫接种部位。
核酸疫苗主要是通过肌肉注射接种的。虽然注射免疫 劳动强度大并会对鱼体造成很大胁迫， 但其免疫效果往往却 是最好 的 达
［’M］ 片段的一种方法。 L#::; 等 最先报道 DKA， 这种方法常被用 ［’>］ 来筛选寄生虫 的 候 选 基 因。 29IG:6% 等 用克氏锥虫 （ !"#$
理是体细胞摄取的真核表达质粒能够长期稳定地表达外源 抗原蛋白， 从而不断地刺激机体的免疫系统， 达到类似加强 免疫的效果， 但外源蛋白的表达会因细胞免疫的产生而终
’期
谢海侠等： 鱼用核酸疫苗研究进展 #"!"#
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［!］ 不同于主要诱导体液mp;%5H 9%I:#:; %778H%J#6%5H，
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核酸免疫中免疫记忆产生的机制 接种一次核酸疫苗即可产生免疫保护级分组免疫动物， 通过攻毒实验获取候选基因或候选基因
并产生、 分泌抗原 O 细胞能够识别和结合可溶性循环抗原， 特异性的抗体。鱼类的 > 细胞参与细胞介导的免疫反应， 首 先是识别抗原呈递细胞 （ ;9D7?C9 LICAC9D79? ECHH，;8-） 表面的 与 R5- 相结合的抗原， 而后激活细胞毒 > 淋巴细胞 （ -UD(D(V7E 并使 > 细胞分泌细胞因子， 如： （肿瘤 > HUGLB(EUDC，->P） >’@ " ［Q］ 坏死因子" ） 及 3P#$ （白介素#$） 等。核酸疫苗还可通过非甲 基化的 -L< 基元 （R(D7M） 激发非特异性的免疫， 通过保护性抗 原的表达来激活特异性的细胞免疫及体液免疫应答， 其作用 机理与活疫苗非常相似， 但几乎没有被感染的风险。这一点
#
核酸疫苗的构建 构建核酸疫苗的关键是保护性抗原基因的筛选和载体
的选择。 #"! 保护性抗原基因的筛选 保护性抗原基因的筛选是通过比较不同保护性抗原编 码基因在被免疫对象体内的表达与诱导免疫保护力的情况， 筛选有效的基因作为目的基因。其筛肽疫苗的编码基因作为候选基因等。 #"!"!膜上进行免疫结合 反应， 再与放射性标记的二抗结合， 进而找出带有示踪讯号
鱼用疫苗可分为三种类型： 第一种为减毒及灭活疫苗； 第二种为重组亚单位疫苗和合成多肽疫苗； 第三种是核酸疫 苗。第一、 二种疫苗虽然在生产实践中得到了较大程度的应 用， 然而在生产成本、 效价稳定性、 保护力等方面还存在一定 的问题。例如， 接种病毒性造血器官坏死症病毒 （ K7I6H B6CG# 的糖蛋白虽然能够诱导虹鳟 (IIB6?7E ACLD7E6CG76 F7I=A，K5,K） 。而用传
［’)］ 随后逐渐被特异性免疫保护所取代 。
达的细胞因子或共刺激分子都通过核酸疫苗体现。如将小 鼠粒 细 胞 C 巨 噬 细 胞 集 落 刺 激 因 子 （ ?58&G @:#H895P;6GT 基因与抗原编码 7#P:5FU#@G P595H;T&6%789#6%H@ O#P65:， N?T4.V） 基因构建在同一个质粒载体上免疫鲫 （ 5&"&)).,) &,"&6,) ） ， 诱
［0］ 液 。第二道防线是特异性细胞免疫和体液免疫。鱼类的
近几十年， 传染性疾病的暴发给世界鱼类与贝类养殖造 成约 $"J 的产量损失
［$］
。防治寄生虫和传染性病原的化学
药剂和抗生素的使用往往会导致药物残留和耐药性的产生，
［!］ 甚至污染水环境 ； 对于病毒病目前尚无有效的防治药物， ［%］ 免疫接种是预防水产动物疾病发生的有效途径 。
第 !Q 卷
第$期
水 生 生 物 学 报
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（ @"5(-2+"52&# 7+A%## ） 产生中和抗体并使 > 细胞增殖， 但这种 重组亚单位疫苗却不能提供 $""J 的免疫保护力