草鱼抗病育种研究进展

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核移植—由草鱼细胞核和团头鲂细胞质配合而成的核 质杂种鱼#($) 生物工程学报，#*+, $ % ’ - # . ##) #" 章怀云/ 屈孝初/ 包树王旬 ) 人 !—干扰素对草鱼出血病 病毒干扰作用的研究#($) 湖南师范大学自然科学学报/
#**&/ #0 $ #! ’ - #"& . #"1) ## 章怀云/ 张学文/ 陈涛，等 ) 精子载体法将外源 234 导
细胞工程应用于鱼类研究起步于 !" 世纪 2" 年代 末 @" 年代初，在 4"、&" 年代有了较大发展培养。目 前在抗病草鱼品系培育方面主要集中于细胞核移植和 细胞培养。 !B # 细胞核移植
自 C-=: 和 D.-::（0 #;2! 年）1!%? 首次报道了细胞核 移植在两栖动物类上获得成功以来，这项卓越的技术 引起国内外学者的极大重视和兴趣并逐渐应用到两栖 类以外的其他动物。在我国，童第周教授等 1%? 在 #;@7 年首次应用该项技术于鱼类，他们在金鱼上的开拓性 实验，证明了鱼类细胞核同样可以进行核移植。4" 年 代起，我国在鱼类细胞核移植方面的研究得到迅速发 展。在草鱼细胞核移植研究方面，严绍颐等（#;&2 年） 1;? 在亚科间鱼类和团头鲂细胞核移植取得成功，获得 了性腺正常发育的雄性核质鱼。张念慈等（#;;" 年）1#7$ 利用体外长期培养的草鱼体细胞作供体，在属间和亚 科间鱼类上作核移植，得到不同发育期的胚胎。余来宁 等（#;;@ 年）1!#$采用电融合与继代移核相结合的方法， 将具有抗性的草鱼肝培养细胞核移植于草鱼未受精卵 内，获得了一批不同发育期的胚胎和仔鱼。 !B ! 细胞培养
细胞培养技术在国内外领域长期以来一直应用于 鱼病研究。中科院武汉病毒研究所、长江水产研究所和 中科院水生生物研究所利用理化方法对草鱼出血病毒
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敏感的细胞株分离并鉴定了草鱼出血病病毒。近年来， 我国已将细胞培养技术应用范围扩大到了遗传育种方 面，#$%# 年张念慈等 &#’$利用对呼肠孤病毒敏感的草鱼 吻端组织细胞株 ()*$"# 筛选出对草鱼出血病病毒有 一定抗性的亚株 ()*$"#+#。李亚南等（#$$"）&,-利用对 呼 肠 孤 病 毒 敏 感 的 草 鱼 ()*$"# 细 胞 株 经 过 紫 外 线 （./）诱变筛选，获得了突变株 01()%% 细胞。经生物 学特性鉴定及感染试验等表明，突变株 01()%% 对草 鱼出血病病原具有抗性。 , 基因工程
在草鱼抗病育种的初期，育种的方法多局限于常 规杂交和选择压力。&" 年代细胞工程技术的日益成 熟，为草鱼育种提供了一种有效的手段。本文就以生物 技术在草鱼育种上的应用为主线，对草鱼抗病育种研 究的进展做一综述。 # 常规育种策略
常规育种策略是通过种群内、间的抗病遗传力的 差异性杂交获得抗病性较亲本强的子代，然后对子代 进行选种或者直接对单种群进行自然压力或人工饲养 环境压力选择，选育出抗病力较强的个体作为繁殖核 心群体的策略。压力选择育种往往属于一种目标长期 育种方式，这种育种的方式实际上就是利用鱼类在适 应方面的加性遗传变异。在鱼类种群间和群内抗病遗 传力的差异性，鱼类学家已广泛地深入作了探讨。国内 外鱼类育种工作者根据种群间和种群内存在的显著遗 传差异性，利用种群的选择差异进行鱼类种间的水平 杂交或对群体进行选育来获得抗病力较强的后代。目 的就是希望通过性状的叠加来缩短传统上长期育种的 时间，加快核心群的建立。8+9+:* $ #;4! 年 ’ 用易感水肿 病的人工孵化亲鱼（鲤鱼）与有抗水肿病的野生亲鲤杂 交，获得了有抗病力的同源杂交体的后代。<+,*=>- 等 （#;&& 年）用有色匈牙利鲤鱼和日本鲤鱼杂交获得了 良好的结果。在培育抗病草鱼方面，由于草鱼种内品系 少，育种工作者往往采用远源杂交以期获得草鱼抗病 的优势后代。在前期的杂交育种过程中，大多选用鲤 鱼、团头鲂作为杂交的亲本。长江水产研究所（#;47
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草鱼抗病育种研究进展
湖南农业大学动科院 $ %#"#!& ’ 苏建明 章怀云 肖调义
草鱼属于鲤科草食性鱼类，为我国四大家鱼之一( 素有味美，生长快的特点。在我国的淡水养殖中几乎遍 布全国各地，但是其多病、成活率低的特点严重制约了 养殖业的发展。与草鱼有关的疾病有草鱼出血病、肠炎 病、烂鳃病等十几种，而草鱼出血病是最严重的疾病之 一。草鱼出血病是由呼肠孤病毒（)*+,-./0）引起的一种 急性传染病 1!( #2 3 #4$，主要对当年和 # 龄的草鱼种形成 危害。该病发病快、流行广、死亡率高，其组织病理变化 主要表现为全身性小血管损伤、出血 1#!$。呼肠孤病毒 增殖的主要特征是在细胞质中进行复制、生物合成及 装配等全过程。与其他病毒不同的是，这类 )56 病毒 增殖的任一阶段都不在细胞核内进行 1!7$。因此，关于 草鱼抗病育种的研究，特别是在提高草鱼种抗病毒侵 染力育种研究上，有非常重大的意义。
组采用将人 !H 干扰素基因导入草鱼受精卵，以期获得 抗病的转基因草鱼有了可靠的基础。这项工作开创了 鱼类抗病基因工程育种的新途径。 ’ 草鱼抗病育种的方向以及期待解决的问题
通过多年的探索，我国水产品种的遗传改良工作 者在草鱼抗病育种方面积累了大量的科学资料。在家 鱼长期育种目标中，传统育种方法依然有着很高的地 位，也为渔业的发展起着巨大的推进作用。对草鱼的远 缘常规育种的方法存在着明显的局限就是育种周期较 长，子二代性状分离，远缘杂交不育，死亡率高，难以形 成纯系繁殖群体。而且不同种群的杂交常常会削弱促 进生长率的杂交优势，而生长率又是衡量一个育种品 系的标准之一。细胞工程在草鱼抗病育种上起步较迟， 对鱼类的育种工程有较大的推动作用。其缺点在于移 植或融合鱼细胞核后的存活鱼苗相当低，而且细胞核 在移植或融合前，经过数次传代，有可能发生染色体非 二倍体改变的情况。同时在体外培养细胞上进行遗传 操作难度较大，到目前为止还没有形成一个抗病草鱼 鱼种品系。真核基因分子克隆技术的建立，提供了从核 苷酸水平了解鱼类基因结构的手段。采用重组 ?<0 技 术制作转基因鱼获得成功，为定向遗传育种提供了方 便。到目前为止，人们所得的转基因鱼并不是单位点遗 传稳定的品系，转基因的定点整合和转基因鱼纯系的 建立依然是解决这些问题的关键。这也是草鱼抗病育 种所面对的问题。如何解决这些问题，随着基因工程基 因的日益完善以及转基因动物研究的深入，这一结果 不难预见。 参考文献 # 长江水产研究所 I 草鱼和团头鲂人工杂交试验#J$I 湖
#$%’ 年朱作言等##$F !"F !%$ 首先运用基因转移技术 将含有人生长激素基因的重组 ?<0 导入鱼的受精卵 内，获得快速生长的转基因鱼，证明了外源基因在受体 鱼的整合、表达和促生长作用以及通过性腺传递给子 代，建立了一个完整的转基因鱼模型，这些结果表明了 鱼类基因工程育种的可行性。#$$* 年章怀云等###$将草 鱼精子先与红鲤总 ?<0 共同培养，再与草鱼卵受精， 获得体形、体色变异的个体。王铁辉等（#$$% 年）#G$将 团头鲂总 ?<0 导入草鱼受精卵获得抗病力较强的子 代。由于总 ?<0 中除带有自身抗病基因外还包括供体 鱼本身控制的各种性状的遗传基因，在总 ?<0 导入受 体鱼受精卵后，发育后代中往往发现是供体鱼性状以 及受体鱼性状都存在的混合群体。因此，这对后代选育 产生较大的阻力。与导入总 ?<0 相比导入单功能融合 基因则有一定的优势。它往往只对单性状进行改良，而 不出现多性状的混合群体。章怀云等##"$在 #$$, 年直 接将人 !H 干扰素注入草鱼体内后进行的攻毒试验以 及导入人 !H 干扰素基因的草鱼组织细胞对出血病病 毒抗性研究后，证明干扰素这种广谱抗病毒活性蛋白 能在鱼体及组织发挥较好的功能。这些结果为该课题
南科技情报，#$*,（#）：$ K ##I ! 陈燕F 江育林 I 草鱼出血病病毒形态结构及其礼花特性
的研究#J$I 科学通报F #$%,F !% L #% M N ##,% K ##’"I , 李亚南F 毛树坚F 等 I 紫外线诱变建立草鱼抗出血病病
原病 毒 01()%% 细 胞 株#J$I 水 产 学 报 F #$$" F #’ L ! M N %$ K $,I ’ 童第 周，等 I 鱼 类 细 胞 核 的 移 植#J$I 科 学 通 报 F #$:, L * M N :" K :#I G 王铁辉F 刘汉勤，等 I 抗出学病草鱼子代抗病力的分析 #J$I 水生生物学报F #$$%F !! L ’ M N ,%$ K ,$"I : 吴维新，等 I 一个四倍体杂种—兴国红鲤 O 草鱼#J$I 水 生生物集刊F #$*%F * L , M N ’,, K ’,:I * 吴维新F 李传武F 刘国安，等 I 鲤鱼和草鱼杂交四倍体及 其回交三倍体草鱼杂种的研究#J$I 水生生物学报F #$%%F #! L ’ M N ,GG K ,:,I % 吴维新F 李传武，曾国清 I 抗病草鱼 L %,H! 系鱼 M 选育的 研究#J$I 中国水产科学F #$$*F ’ L ! M N *’ K *%I $ 严绍颐 I 硬骨鱼类的细胞核移植 ;P3F 不同亚科间的细胞
#$%! 年 23456789 等 &!:$通过显微注射的方法，把克 隆的生长激素基因导入小鼠受精卵原核内，致使该基 因获得表达，并且表达产物呈现明显的促生长效应，培 养得到世界上第一例“超级鼠”。这类研究除了理论上 的意义外，在实践上为进行动物定向育种研究开辟了 有效途径。鱼病学、遗传学研究证明，鱼类的抗病力与 其生存的环境和遗传有关系，大多数情况下抗病力的 强弱取决于抗病基因的存在。随着分子生物学技术的 发展，人们不仅分离或合成了诸如干扰素（;<=）、白介 素（;>）等一类具有病毒和免疫调节作用的细胞因子以 及与病毒相关 ?<0 或 @?<0，还发现了具有终止病毒 基因转录和翻译的诸如反义 A<0、A6BCDE58 等一类分 子 A<0。这些 ?<0、@?<0 或 A<0 的表达质粒不仅可 以插入细胞染色体 ?<0 内和进行表达，而且可使转化 细胞获得抗病毒等功能。这些相关基因的克隆，大大地 推动了基因工程抗病育种的研究发展。