大肠杆菌PCR检测方法

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大肠杆菌表达操作规程

大肠杆菌表达操作规程大肠杆菌表达操作规程一、实验材料和仪器准备1. 大肠杆菌菌株：选择适合表达目标蛋白的大肠杆菌菌株，如BL21(DE3)、Rosetta(DE3)等。

2. 表达载体：选择适合目标蛋白表达的载体，如pET 系列、pBAD系列等。

3. 目标蛋白基因：基因可以通过PCR扩增获得，或者从其他载体中克隆。

4. 培养基：溶液制备LB培养基，配制好含有适当抗生素的LB琼脂板，另外还需要制备适用于大肠杆菌表达的诱导培养基，如TB、SB等。

5. 抗生素：根据载体的需要，选用适当浓度的抗生素。

二、诱导表达实验操作流程1. 预先培养：取一株原始菌落接种到含有适当抗生素的LB液体培养基中，为了避免突变株的污染，建议每次都从冷冻保存的单一菌落开始。

培养条件为37℃，180rpm，过夜培养。

2. 选取合适菌液接种量：从过夜的预培养液中取2ml，用于接种适当量的诱导培养基。

3. 诱导表达：根据所用的表达载体，将接种量转移到含有适当抗生素的诱导培养基中，继续培养。

4. 培养条件：培养条件根据所选表达载体的要求进行设置，一般为37℃，180rpm。

5. 收集细胞：在适当的时间点，如在菌液浓度达到指定值或培养时间达到一定程度后，通过离心收集细胞。

6. 细胞破碎：采用适当的方法破碎细胞膜，如超声波破碎、冻融法等。

7. 蛋白质提取：以适当的缓冲液提取目标蛋白质。

8. 蛋白质纯化：采用各种纯化方法（如亲和层析法、凝胶过滤法等）对蛋白质进行纯化。

9. 检测和分析：对蛋白质进行SDS-PAGE、Western blot等分析方法进行检测。

三、注意事项1. 培养条件的控制：控制好培养温度、转速和时间等条件，以保证表达的效果。

2. 抗生素浓度的选择：根据所用载体对抗生素的要求，选择适当的浓度以抑制非目标菌株的生长。

3. 提取和纯化条件的选择：选择适当的缓冲液、酶和抑制剂，以保持目标蛋白的活性和稳定性。

4. 实验材料的无菌处理：所有实验材料（包括培养基、平板、显微镜片等）都要经过严格的无菌处理，以防止外源性污染。

鉴别大肠杆菌的方法

鉴别大肠杆菌的方法
首先，鉴别大肠杆菌的方法之一是通过培养基培养。

大肠杆菌在营养富集的培养基上生长迅速，因此可以通过在特定培养基上进行培养来鉴别大肠杆菌。

常用的培养基包括大肠埃希菌选择性培养基和大肠埃希菌选择性富集培养基。

在这些培养基上，大肠杆菌会表现出特定的形态和生长特征，有助于鉴别。

其次，大肠杆菌的鉴别方法还包括生化试验。

大肠杆菌具有一些特殊的生化特性，如产气、发酵葡萄糖和乳糖等。

因此，可以通过进行气体产生试验、糖发酵试验等生化试验来鉴别大肠杆菌。

这些试验可以通过观察细菌在特定条件下的反应来确定其是否为大肠杆菌。

另外，分子生物学方法也被广泛应用于大肠杆菌的鉴别。

通过PCR扩增特定基因序列，再通过电泳分析等技术手段来鉴别大肠杆菌。

这种方法具有高度的特异性和准确性，能够快速鉴别出大肠杆菌。

除了上述方法，还可以利用质谱分析、免疫学方法等现代技术手段来鉴别大肠杆菌。

这些方法在鉴别大肠杆菌中起着重要作用，为食品安全和公共卫生提供了有力的支持。

综上所述，鉴别大肠杆菌的方法多种多样，可以根据实际情况选择合适的方法进行鉴别。

在食品生产和公共卫生领域，及时准确地鉴别大肠杆菌对于预防食源性疾病和保障公共健康至关重要。

希望通过不断的研究和实践，能够提高大肠杆菌鉴别的准确性和效率，为食品安全和公共卫生工作做出更大的贡献。

微生物大肠杆菌检测方法

微生物大肠杆菌检测方法微生物大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的肠道细菌，它可以以多种方式进入人体，包括通过摄入受污染的食物或水，以及通过直接接触感染或间接接触感染。

大肠杆菌是一种潜在的致病菌，它可以引起食物中毒，导致腹泻、腹痛、呕吐等症状。

因此，对大肠杆菌进行快速而准确的检测非常重要。

一般来说，对大肠杆菌的检测可以分为两种方法：传统方法和分子生物学方法。

传统方法主要包括培养法和生化检测法。

培养法是将样品在富含营养物的培养基上进行培养，并通过观察菌落形态、生理生化特性等来识别是否存在大肠杆菌。

常用的培养基包括大肠杆菌选择性培养基（如紫胶杆菌平板和免疫球蛋白平板）和大肠杆菌检测培养基（如二甲基绿平板和温和滴定培养基）。

在培养过程中，大肠杆菌通常会表现为革兰氏阴性、产生气体、氧可用的以及发酵甘露糖等特性。

这种方法的优点是简单易行，成本低廉，但需要较长的培养时间，一般需要24-48小时才能得到结果。

生化检测法是通过检测大肠杆菌产生的特定酶或其他代谢产物来快速识别该菌株。

传统的生物化学试剂盒可以用于检测大肠杆菌的存在，如白酒石酸盐绿的发酵和产气检测。

这种方法的优点是快速、简单，但缺点是它无法提供准确的菌株识别，因为其他细菌也可能产生相似的酶和代谢产物。

分子生物学方法是一种基于DNA或RNA的检测方法，可以提供更准确和快速的识别大肠杆菌。

这些方法包括聚合酶链反应（PCR）、实时荧光PCR、核酸杂交和基因测序等。

PCR是最常用的方法之一，它利用特定的引物扩增目标DNA 序列，然后通过凝胶电泳分析扩增产物，从而确定是否存在大肠杆菌。

PCR方法的优点是高度敏感和特异性，可以在几个小时内得到结果，但缺点是需要复杂的实验设备和技术，并且可能受到PCR抑制物质的干扰。

在实际应用中，常常会结合多种方法来进行微生物大肠杆菌的检测。

例如，可以通过培养法获得初步结果，并用PCR方法进行鉴定确认。

此外，还可以采用免疫学方法来检测大肠杆菌，如流式细胞仪和ELISA等。

大肠杆菌的鉴定方法

大肠杆菌的鉴定方法大肠杆菌是常见的肠道细菌，广泛存在于自然环境中，包括土壤、水体和动植物体内。

它是引起人类肠道感染和食源性疾病的重要致病菌之一、准确鉴定大肠杆菌的方法对于食品安全和公共卫生至关重要。

下面将介绍常见的大肠杆菌鉴定方法。

1.外观和生理鉴定大肠杆菌形态特征为革兰阴性，为短杆状细菌，常产生单一或双子。

在艾柯培养基上，大肠杆菌形成典型的金黄色、大且圆形的菌落，使用其可以初步鉴定大肠杆菌。

大肠杆菌是革兰阴性细菌，可以通过革兰氏染色进行鉴定。

大肠杆菌的细胞壁含有脂多糖，染色后呈现红色。

2.纯培养和典型菌落的选择将样品接种于含有葡萄糖和肉汤的液体营养培养基中，经过16-24小时的培养后，利用墨汁培养基将菌液分带于增菌板表面，进行分离纯化。

然后选择培养在巴斯德固体琼脂培养基上呈金黄色，并有金属光泽的典型菌落。

3.酶活性测试大肠杆菌具有多种酶活性，常用的酶活性测试有氧化/发酵测试、甲基红松解试验和呈色反应等。

（1）氧化/发酵测试：大肠杆菌通常以无氧产酸为代谢途径进行葡萄糖发酵。

将菌液接种于以葡萄糖为唯一碳源的气泡管中，通过产酸后的颜色变化来鉴定大肠杆菌。

气泡管中产生黄色的酸性底部，说明转化为酸性，即为大肠杆菌。

（2）甲基红松解试验：大肠杆菌代谢糖酸，产生酸性代谢产物，导致菌落周围的甲基红转为黄色。

通过添加甲基红指示剂，观察溶解指示剂颜色的变化，由红色转为黄色可以初步鉴定大肠杆菌。

（3）呈色反应：大肠杆菌产生酶活性，能够将一些酶底物转化为有颜色的产物。

例如，大肠杆菌在聚糖中生成酶胆红素琼脂糖，呈现金黄色。

这种特征可以用于大肠杆菌的鉴定。

4.生化和生理特性鉴定（1）靛酚蓝糖蛋白胱氨酸琼脂糖（Ipv）试验：肠道杆菌能产生硫化氢，将外源底物半胱氨酸转化为硫化氢，使琼脂糖中的靛酚蓝变为铁蓝色，可以通过这个试验鉴定大肠杆菌。

（2）铁蛋白试验：大肠杆菌可以利用铁蛋白作为唯一的铁源进行生长，将铁蛋白分解为铁和胆红素，使培养基呈现深绿色，可通过这个试验鉴定大肠杆菌。

大肠杆菌检验方法

大肠杆菌检验方法
大肠杆菌(Escherichia coli)是一种革兰氏阴性的厌氧菌，常常被用作指示性微生物来评估食品和水源的卫生质量。

以下是常见的大肠杆菌检验方法：
1. 培养基方法：将样品接种在包含大肠杆菌生长所需营养物质的培养基上，如大肠杆菌选择性琼脂培养基(MacConkey琼脂培养基)和EC培养基等。

大肠杆菌能够利用琼脂中的乳糖发酵产生酸，导致培养基呈现红色或粉红色。

此外，EC 培养基还包含了可以检测大肠杆菌β-葡萄糖苷酶的亚甲基红试剂，如果大肠杆菌存在，则培养基呈现金属光泽。

2. 确认方法：对落有培养基上的鲜艳深色菌落进行进一步确认。

典型的确认方法包括革兰染色、目测观察形态特征、氧化发酵试验和测试产气杆菌酶试验。

3. PCR检测方法：利用聚合酶链反应(PCR)技术，从样品中扩增大肠杆菌特异性基因片段（如16S rRNA基因），然后通过凝胶电泳检测扩增产物。

4. 快速方法：如免疫层析试纸法和光学组织测定法。

免疫层析试纸法利用抗大肠杆菌抗体与大肠杆菌特异性抗原结合生成可视化结果。

光学组织测定法利用大肠杆菌的β-葡萄糖苷酶水解比色底物产生颜色变化。

这些方法都可用于检测大肠杆菌在食品和水源中的存在及其数量。

在进行检验时，应严格遵守相关的操作规程和实验室操作规范，以确保结果的准确性和可靠性。

大肠杆菌检测原理

大肠杆菌检测原理
大肠杆菌检测是一种用于确定食品、水源或环境中是否存在大肠杆菌的常用方法。

大肠杆菌是一种肠道菌群常见的细菌，其存在通常表明可能存在粪便污染或其他健康危害的风险。

大肠杆菌检测主要基于以下原理：
1. 培养方法：采集样品后，将其接种到含有适宜营养物质的培养基上，利用大肠杆菌特有的形态、生理生化特性以及产生的气体等特点进行初步鉴定。

2. 确认方法：通过进一步的生化试验，如颜色反应、形状、气体产生情况等，进一步确认被培养出的菌落是否为大肠杆菌。

3. 分子生物学方法：利用PCR技术或核酸杂交等方法，针对大肠杆菌特异的基因序列进行扩增或检测。

4. 免疫学方法：利用特异性抗原或抗体与大肠杆菌产生的免疫反应，进行检测和确认。

这些方法都可以用于大肠杆菌的初步筛查和确认，根据不同的检测需求和样品特性选择合适的方法进行检测。

大肠杆菌检测的结果可以用于评估食品、水源、环境等是否存在粪便污染，从而采取相应的控制和预防措施。

中国药典大肠杆菌的检测方法

中国药典大肠杆菌的检测方法中国药典中关于大肠杆菌的检测方法主要包括传统培养方法和分子生物学方法。

下面将分别介绍这两种方法。

一、传统培养方法：1.外源菌培养基法：将待检样品接种于含有选择性培养基的平板上，培养一定时间后观察菌落形态。

通过形态特征、气味、色素等来初步判断是否为大肠杆菌。

常用的选择性培养基有VRB和EMB。

2.确认试验法：通过进行染色试验，如革兰氏染色和断杆试验，来判断菌体形态和结构。

可以进一步采用生化试验，如IMVIC试验（亮甲基绿青试验、分解氯化酪蛋白试验、甲酸氧化试验、酒石酸汞试验）来鉴定大肠杆菌。

3.基于生长特性的检测方法：通过观察大肠杆菌在特定培养条件下的生长特性来确定其存在。

如革兰氏正浓度法、大肠杆菌生长阳性试验法等。

二、分子生物学方法：1. PCR方法：通过引物设计，利用PCR扩增大肠杆菌特异性位点的DNA片段，再通过凝胶电泳检测。

PCR方法准确度高、灵敏度强，能够快速、准确地检测大肠杆菌。

2.实时荧光定量PCR法：利用特定引物和探针，对大肠杆菌特异性序列进行定量扩增，并实时监测荧光信号的增加。

这种方法能够自动化操作，结果可靠。

3.基于32P标记的杂交法：通过将亲和探针与32P标记进行杂交，通过放射性自显影来检测标本中特异结构。

该方法精确度高，但操作复杂。

4.基于质谱技术的检测方法：通过质谱技术检测大肠杆菌的代谢产物，如脂肪酸、糖代谢物等，来判断其存在。

该方法准确度高，且对菌落的生长条件要求不高。

以上是中国药典中常用的大肠杆菌检测方法。

根据实际需要，可选择合适的方法进行检测。

每种方法都有其优缺点，因此在应用时需要综合考虑实验条件、检测要求和经济成本，选择最合适的方法进行检测。

提高大肠杆菌检测的准确度和效率，对于保障药品质量和公共健康具有重要意义。

PCR扩增uidA、rfbE和fliCH7基因检测大肠杆菌 O157-H7特异性和灵敏性的比较

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讨论
• 针对O157:H7的rfbE基因设计的引物均有很高的
特异性。
• fliCH7基因对检测O157:H7有辅助鉴定作用，但在
直接对样品进行快速检测时，用rfbE和fliCH7基因
同时检测O157:H7似乎没有意义，此方法更适用于已经分离纯化菌株的鉴定。
stx1 stx2 eaeA ehxA
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目的基因扩增结果
uidA rfbE fliCH7
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ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
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实验七大肠杆菌检测

实验七大肠杆菌检测
目录
CONTENTS
• 实验目的 • 实验原理 • 实验步骤 • 结果分析 • 实验总结与注意事项
01 实验目的
了解大肠杆菌的特性
大肠杆菌是一种常见的肠道细菌，通常与人类肠道共生，但在某些情况下也可能引起食物中毒和肠道感染。
大肠杆菌有多种类型，其中一些类型对人体有害，如肠产毒素大肠杆菌（ETEC）和肠侵袭性大肠杆菌（EIEC）。
采集可能含有大肠杆菌的样品，如食品、水、土壤等。
样品处理
将采集的样品进行稀释、过滤等处理，以便后续的增菌培养。
增菌培养
01
将处理后的样品接种在含有选择性培养基的试管中，进行增菌培养。
02
在适宜的温度下培养一段时间，使大肠杆菌得以增殖。
分离培养
将增菌培养后的培养基进行划线分离，得到单菌落。
大肠杆菌对热敏感，在适宜的温度下容易繁殖，因此是食品卫生检测的重要指标之一。
学习并掌握大肠杆菌的检测方法
01
02
03
培养法
通过将样品接种到选择性培养基上培养，观察菌落形态和生化反应来鉴定大肠杆菌。
免疫学方法
利用抗体和抗原的特异性结合，通过免疫学技术检测样品中的大肠杆菌抗原或抗体。
分子生物学方法
对于易燃、易爆、有毒有害的化学品应妥善保管，避免发生意外事故。
感谢您的观看
THANKS
本实验包括样品采集、增菌培养、分离纯化、生化鉴定和结果观察等步骤。
实验结果
实验意义
通过本实验，我们成功检测出样品中存在大肠杆菌污染，并对其进行了分离纯化和生化鉴定。
本实验对于保障食品安全和水质卫生具有重要意义，为预防和控制食源性和水源性疾病提供了科学依据。

环境中大肠杆菌检测标准方法

环境中大肠杆菌检测标准方法
大肠杆菌是一种常见的细菌，通常被用来评估环境卫生和食品安全。

在环境中检测大肠杆菌的标准方法通常包括以下几种：
1. 膜过滤法，这是一种常见的方法，通过将水样或其他环境样品通过特定孔径的滤膜，然后将滤膜培养在含有大肠杆菌生长所需营养物质的琼脂培养基上，来筛选和计数大肠杆菌。

2. 多管法，这是一种用于水样检测的常见方法，通过将水样加入含有发酵引起的气体产生的小管中，然后观察气体产生情况来判断大肠杆菌的存在和数量。

3. 膜过滤-PCR法，这是一种结合了膜过滤和聚合酶链式反应（PCR）的方法，可以更快速和准确地检测大肠杆菌的存在，并且可以对其进行分子水平的鉴定。

4. 生物传感器法，这是一种新兴的方法，利用生物传感器检测大肠杆菌在环境中的存在，通过细胞生物学、生物化学或生物物理学的变化来实现对大肠杆菌的检测。

除了上述方法外，还有一些其他的方法用于检测环境中的大肠杆菌，每种方法都有其优缺点和适用范围。

在实际操作中，需要根据具体情况选择合适的方法进行检测。

同时，为了保证检测结果的准确性，操作人员需要严格按照标准操作程序进行操作，并对仪器设备进行定期维护和校准。

希望这些信息能够对你有所帮助。

水质大肠杆菌检测方法

水质大肠杆菌检测方法水质大肠杆菌是一种常见的水污染指标微生物，其存在表明水体可能受到了粪便或污水的污染。

因此，对于饮用水、游泳水、工业用水等不同用途的水体，检测水质中大肠杆菌的含量具有重要意义。

本文将介绍几种常用的水质大肠杆菌检测方法，以供参考。

一、培养基法。

培养基法是一种常见的大肠杆菌检测方法，其基本原理是将水样在含有大肠杆菌生长所需营养物质的培养基上培养，然后观察培养基上是否有大肠杆菌的生长。

这种方法操作简单，成本较低，但需要一定的培养时间，通常需要24-48小时才能得到结果。

此外，培养基法对于大肠杆菌的特异性较差，可能会同时检测出其他肠道菌群。

二、膜过滤法。

膜过滤法是一种常用的水质微生物检测方法，其原理是将水样通过微孔膜过滤，然后将膜放置在含有营养物质的培养基上进行培养。

通过计数膜上的大肠杆菌落，可以得到水样中大肠杆菌的数量。

这种方法操作简便，结果准确，而且可以检测到低浓度的大肠杆菌。

但是，膜过滤法需要一定的实验室设备和技术支持。

三、分子生物学方法。

随着分子生物学技术的发展，PCR（聚合酶链式反应）和实时荧光定量PCR等分子生物学方法也被应用于水质大肠杆菌检测中。

这些方法具有高度的特异性和灵敏度，可以快速准确地检测出水样中的大肠杆菌。

此外，分子生物学方法还可以对大肠杆菌进行分子鉴定和基因分析，为进一步研究提供了有力的支持。

然而，分子生物学方法需要相对复杂的实验操作和昂贵的设备，对操作人员的技术要求也较高。

综上所述，针对水质大肠杆菌的检测，可以根据实际情况选择合适的方法。

培养基法操作简单，成本低，适合于一般的水质监测；膜过滤法准确性高，可以检测低浓度的大肠杆菌；而分子生物学方法则具有高度的特异性和灵敏度，适合于对水质中微生物的深入研究。

在实际应用中，可以根据需求和条件选择合适的检测方法，以保障水质安全和生态环境的健康。

大肠杆菌基因组DNA的提取及荧光定量PCR试验设计

大肠杆菌基因组DNA的提取及荧光定量PCR试验设计大肠杆菌是一种常见的细菌，其基因组DNA的提取非常重要，可以用于进一步的分子生物学研究。

本文将介绍如何提取大肠杆菌基因组DNA以及如何设计荧光定量PCR试验。

一、大肠杆菌基因组DNA的提取基因组DNA的提取是分子生物学实验的基础步骤之一、下面是一种常规的大肠杆菌基因组DNA的提取方法：1. 培养大肠杆菌：从冻存的大肠杆菌液体培养物中取出1 mL，加入含有适量抗生素（如氨苄青霉素或巴龙霉素）的LB培养基中。

以250 rpm的速度在37℃下培养12-16小时，直到菌体适量生长。

2.收集菌体：离心培养物，将上清液去除，保留细胞沉淀。

3.溶菌：使用适当的溶解液（如0.2MNaOH/1%SDS溶液），彻底悬浮菌体，并在65℃下孵育5分钟。

4.中和反应：向菌液中加入3M的钾酸溶液，通过中和作用将菌体中的DNA中和沉淀出来。

6.洗涤：用70%乙醇洗涤DNA沉淀。

去除乙醇，使菌体中的盐等杂质完全去除。

7. 溶解：用 TE溶液（10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0）或纯水溶解DNA沉淀。

如果需要更高浓度的DNA，可使用低TE溶液（10 mM Tris-HCl, pH 8.0）。

荧光定量PCR（qPCR）是一种通过实时监测PCR反应的荧光强度来定量分析PCR产物的技术。

下面是一种针对大肠杆菌基因组DNA的定量PCR试验设计：试验目的：测定大肠杆菌基因组DNA中一些特定基因的拷贝数。

试验步骤：1.制备PCR反应体系：根据需要测定的基因和引物的特异性设计引物。

将PCR反应体系组分按照以下配方进行调配：- 模板DNA：5 ng-引物（正向和反向）：0.2μM-qPCR反应缓冲液：根据厂家推荐的浓度加入适量-dNTP混合液：0.2mM-热启动酶：根据厂家推荐的浓度加入适量- ddH2O：适量2.设计合适的PCR程序：-预热：95℃，5分钟-循环：95℃，30秒；55℃，30秒；72℃，30秒（重复30-40个循环）-最终延伸步骤：72℃，10分钟-保存在4℃下待用3.实施定量PCR试验：-根据样本中DNA浓度的不同，选择适当的试管和引物。

大肠杆菌的检测方法

大肠杆菌的检测方法
大肠杆菌是一种常见的肠道细菌，常用于食品安全和水质检测，以下是常见的大肠杆菌检测方法：
1. 营养琼脂平板法：将样品接种于含有大肠杆菌生长所需营养成分的琼脂平板上，培养一定时间后，观察平板上是否有典型的大肠杆菌菌落形成。

2. MPN法：通过连续稀释法，将样品分别接种到含有大肠杆菌生长所需营养成分的培养基中，根据样品最终的阳性管数，使用MPN表进行计算，得到大肠杆菌的数量。

3. PCR方法：利用特定引物和酶对大肠杆菌的DNA进行扩增反应，通过检测PCR产物是否存在来判断是否存在大肠杆菌。

4. 发酵管法：将样品接种到含有大肠杆菌发酵底物的管内，根据产气情况判断是否存在大肠杆菌。

5. 荧光定量PCR法：通过特定的引物和荧光标记探针，结合实时荧光PCR技术，可定量检测大肠杆菌的存在情况。

这些方法可以根据实际需要选择不同的检测方法进行大肠杆菌的检测。

大肠杆菌PCR检测方法

大肠杆菌PCR检测方法文档仅供参考ICS11.220DB21B41辽宁省地方标准DB 21/ XXXXX—XXXX大肠杆菌PCR检测方法Method of PCR for the detection of Escherichia coli点击此处添加与国际标准一致性程度的标识（征求意见稿）XXXX - XX - XX发布XXXX - XX - XX实施前言本标准按照GB/T 1.1—给出的规则起草。

本标准由辽宁省动物疫病预防控制中心提出。

本标准由辽宁省畜牧兽医局归口。

本标准起草单位：辽宁省动物疫病预防控制中心、辽宁省动物医学研究院。

本标准主要起草人：赵凤菊，关淼，关乃鹏，李清竹，陈瑶大肠杆菌PCR检测方法1 范围本标准规定了大肠杆菌PCR检测方法的技术要求。

本标准适用于大肠杆菌的诊断、监测及流行病学调查，适用于猪粪便、脏器及纯培养物中大肠杆菌的检测。

本标准中的试验操作应在生物安全Ⅱ级（BSL-2）以上的实验室进行。

2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。

凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

中华人民共和国农业部公告第302号兽医实验室生物安全技术管理规范3 缩略语下列缩略语适用于本标准。

E.coli：大肠杆菌（Escherichia coli）DNA：脱氧核糖核酸（Diethylpyrocarbonate）bp：碱基对（base pair）PCR：聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（Deoxy-ribonucleoside triphosphate）Taq酶：Ex Taq DNA聚合酶（Taq DNA polymerase）TAE：三羟甲基氨基甲烷-乙酸电泳缓冲液（Tris acetate-EDTA buffer）4 原理根据E.coli保守基因序列设计一对引物，在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以引物为延伸起点，经过变性、退火和延伸，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA。

PCR法扩增大肠杆菌甘露醇

PCR法扩增大肠杆菌甘露醇-1-磷酸脱氢酶基因及图1 PCR反应示意图实验一所制备的大肠杆菌E. coli JM109基因组DNA溶液（2）试剂1）天根生化科技有限公司的PCR反应试剂盒，含ddH2O、2× PCR 反应混合液（包括dNTP、Tag酶、PCR缓冲液等）；2）上游引物、下游引物（设计后由公司合成）；3）石蜡油；4）琼脂糖；5）10×TBE电泳缓冲液：称取Tris54g，硼酸27.5g，并加入0.5mol/LEDTA(pH8.0) 20mL，定容至1000mL；6）6×上样缓冲液：0.25%溴酚蓝，40%（w/v）蔗糖水溶液；7）EB溶液母液：将EB配制成10mg/mL，用铝箔或黑纸包裹；8）生工生物工程（上海）有限公司的BS363-N柱式PCR产物纯化试剂盒。

包括吸附缓冲液（Binding Buffer）、漂洗液（Washing Buffer）、洗脱液（Elution Buffer）。

（3）仪器超净工作台、高压灭菌锅、高速离心机、移液枪、PCR扩增仪、水平电泳仪、电泳仪电源、凝胶成像系统、电炉。

3. 实验步骤（1）引物设计在ncbi（/）上查询Escherichia coli mannitol-1-phosphate dehydrogenase（MTLD）的基因序列，作为模板设计引物。

检索得到，该蛋白质由382个氨基酸组成，具体序列如下：1 mkalhfgagn igrgfigkll adagiqltfa dvnqvvldal narhsyqvhv vgeteqvdtv61 sgvdavssig ddvvdliaqv dlvttavgpv vleriapaia kglvkrkeqg nesplniiac121 enmvrgttql kghvmnalpe dakawveehv gfvdsavdri vppsasatnd plevtvetfs181 ewivdktqfk galpnipgme ltdnlmafve rklftlntgh aitaylgkla ghqtirdail241 dekiravvkg ameesgavli krygfdadkh aayiqkilgr fenpylkddv ervgrqplrk301 lsagdrlikp llgtleyslp hknliqgiag amhfrseddp qaqelaalia dkgpqaalaq361 isdldansev vseavtayka mq其全基因序列如下，长度为1149个bp：1 atgaaagcat tacattttgg cgcaggtaat atcggtcgtg gctttatcgg taaactgctg61 gcagacgcgg gtatccaact gacgtttgcc gatgtcaatc aggtggtact tgatgccctg121 aatgcccgtc atagctatca ggttcatgtg gtcggtgaaa ccgagcaggt agataccgtt181 tccggcgtcg atgctgtcag cagcattggt gatgatgtcg ttgatctgat tgctcaggtc 241 gatttagtca ctaccgccgt tggcccggtt gtgctggaac gtattgctcc ggctatcgcc301 aaagggctgg tgaaacgtaa agaacaaggt aatgaatccc cgctgaacat catcgcctgt 361 gaaaacatgg tacgcggtac cacgcagctg aaaggtcatg tgatgaacgc cctaccagaa 421 gacgccaaag cgtgggtaga agaacacgtt ggctttgtcg attccgccgt tgaccgcatc 481 gtaccgcctt cggcttcggc aactaacgat ccgctggaag tgacggtaga aactttcagc 541 gaatggattg tcgataaaac gcagttcaaa ggcgcactgc cgaacatccc aggcatggag 601 ttaaccgaca acctgatggc atttgtcgaa cgtaaactct tcaccctgaa cacgggtcat661 gctataaccg cgtacctcgg aaaactggcc ggtcatcaga ccattcgtga cgctattctc721 gacgagaaaa tccgcgcggt ggtaaaaggt gcgatggaag aaagtggtgc ggtactgatc 781 aagcgctacg gctttgacgc agacaaacat gcggcgtaca tccagaaaat cctcggtcgt 841 tttgagaacc cgtatctgaa agatgatgta gagcgcgtag gccgtcagcc gctgcgtaaa 901 ctgagtgctg gcgaccgtct gatcaagcca ttgctcggta cgctggaata cagccttccg961 cacaagaatc tgattcaggg gattgctggt gcaatgcact tccgcagtga agacgatccg 1021 caggctcagg aactggcagc actgatcgct gacaaaggtc cgcaggcggc gctggcacag 1081 atttccgatc ttgatgccaa cagcgaggtt gtatccgagg cggtaaccgc ttataaagca1141 atgcaataa //根据以上DNA序列和所采用的表达质粒载体pET-28a-c(+) 的图谱，用Primer Premier 5.0软件设计了两对引物。

大肠杆菌四环素类抗生素主要耐药基因PCR检测方法的建立

大肠杆菌四环素类抗生素主要耐药基因PCR检测方法的建立李井春【摘要】本研究通过对tet(A)、tet(B)、tet(C)和tet(M)基因的序列分析,利用Primer Premier 5.0软件设计并合成了4对特异性引物,建立了四环素类抗生素主要耐药基因的PCR检测方法.通过反复试验确定这4对特异性引物的最佳退火温度均为55℃.灵敏性试验和特异性试验表明这4对特异性引物能够在核酸浓度分别为1.36、10.8、0.206和136 pg/L时扩增出清晰地目的基因,并具有较高的特异性.稳定性与重复性试验表明本方法具有良好的稳定性.应用所建立的方法对25株辽宁地区猪源大肠杆菌中四环素类耐药菌株主要耐药基因进行检测分析,辽宁省猪源大肠杆菌中对四环素类的耐药性可能主要与tet(A)、tet(B)介导的主动外排机制有关,其次与tet(M)介导的核糖体保护机制有关.【期刊名称】《现代畜牧兽医》【年(卷),期】2017(000)012【总页数】7页(P1-7)【关键词】大肠埃希菌;四环素类抗生素;耐药基因;PCR【作者】李井春【作者单位】辽宁省动物疫病预防控制中心,辽宁沈阳 110164【正文语种】中文【中图分类】S852.612抗生素耐药性已经成为全球严重的公共卫生问题，耐药菌的产生和传播成为21世纪全球公共健康的第三大威胁[1-2]。

由于抗生素在人类治疗和畜牧业生产中的过度使用和滥用，导致耐抗生素病原菌的不断出现和传播[3]。

细菌耐药性的产生不仅降低了抗生素的治疗效果，导致发病率、死亡率的增加，也因抗生素残留问题也直接影响到人类食品卫生安全，使人类健康受到严重威胁。

同时因细菌耐药性的产生导致人类疾病、动物疫病防控和治疗费用的增加，给社会造成巨大的经济压力。

四环素类抗生素作为一类广谱抗菌药物，在20世纪40年代，被广泛应用于人类、动物以及农作物各种疾病的治疗[4]。

细菌对四环素类抗生素产生耐药性的主要原因是耐药基因的获得[5]，因此，加强细菌四环素类耐药基因的检测、监测，控制携带耐药基因菌株的传播及外来耐药基因的引入，对延缓或避免四环素类抗生素耐药菌株的产生至关重要。

大肠杆菌的鉴定方法

大肠杆菌的鉴定方法
大肠杆菌的鉴定方法主要有以下几种：
1.形态学鉴定：通过显微镜观察大肠杆菌的形态、大小、颜色等，来确定其种属。

2. 生理生化鉴定：通过大肠杆菌的代谢特征，如糖代谢、氧化酶、蛋白质降解、生长要求等来进行鉴定，常见用于此类鉴定的试剂有
Triple Sugar Iron Agar（三糖铁素琼脂）、Lysine Iron Agar（赖氨酸铁素琼脂），并且在不同的温度下观察细菌的生长状况，进行鉴定。

3.分子生物学鉴定：通过基因测序、PCR等技术，将大肠杆菌的DNA 进行鉴定，如16SrRNA测序，单核苷酸多态性（SNP）分析等。

4.免疫学鉴定：通过免疫学反应进行鉴定，如ELISA、免疫电泳等。