2015年版《中国药典》微生物限度检查法洁净环境及计数培养基修订分析探讨
浅谈2015年版中国药典的重点变更-PDF (简)
2015 年版药典收载品种总数约为 5515 个，増幅达到 26.2%。
2010 版药
2015 年版药典
类别
典收载 总收载品种 新增品种 修订品种
中药
2165
化药
2139
药用辅料
132
生物制品
品种 通则、总论
131 10
小计
4567
通则(附录)
---
指导原则
---
2627 2617 约 271 145 14 约 5515 321 31
约 462 约 500
139 14 4 约 1201 29 15
约 400 149 132 62 8
约 751 145 8
不收载 品种
2 5 --6 --13 -----
4. 2015 年版药典的部份增加及修订的项目: 附录是药典的重要部份，药典的灵魂和水平均集中反映在附录中。本版是将三部 药典的附录合一，加强共性的系统化、完善化及规范化，新版 <中国药典> 的附 录调整为凡例、通则与方法、指导原则、药用辅料等单独成卷，为第四部。把以 往各部药典附录里相同的方法之间的归纳统一作为本版药典的工作重点，同时， 亦解决长期以来各部药典之间相同方法/通则要求不统一的问题。再且，附录对 药典以外的其他国家标准具同等法律效力。
4.6 二氧化硫残留的限制 通则里说明，除另有规定外，中药材及饮片(矿物类除外)的二氧化硫残留量不得 超过 150mg/kg (ppm)。
正文品种说明山药、牛膝、粉葛、天冬、天麻、天花粉、白及、白芍、白朮、党 参 10 味药材及其饮片二氧化硫残留量不得超过 400mg/kg(ppm)。
新版药典锐意加强科学监管，防止中药材加工过程中滥用或过度使用硫磺熏蒸，
2015版中国药典微生物限度解析
（MPN法） 1.3 计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用
性试验：菌种及菌液制备、培养基适用性检查 、计数方法适用性试验。 1.4 供试品检查：检验量、供试品检查 1.5 结果判断 1.6 稀释液、冲洗液及培养基
1.1 总则：
• 微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温 细菌和真菌的计数。
• 当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否 符合规定的微生物限度标准时，应按规定进行检 验，包括样品的取样量和结果的判断等。除另有 规定外，本法不适用于活菌制剂的检查。
30～35 ℃ 不超过3天
20～25 ℃ 不超过5天
每一试验菌株平行制备2 管或2 个平皿；接种量50~100cfu ； 同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。 结果判定：
若被检培养基上的菌落平均数不小于对照培养基上的菌落 平均数的70 %，且菌落形态大小与对照培养基上的菌 落一致，判该培养基的适用性检查符合规定。
1.3 计数培养基适用性检查和供试品计 数方法适用性试验
• 供试品微生物计数中所使用的培养基应进 行适用性检查。
• 供试品的微生物计数方法应进行方法适用 性试验【10版：方法验证】， 以确认所 采用的方法适合于该产品的微生物计数。
• 若检验程序或产品发生变化可能影响检验 结果时， 计数方法应重新进行适用性试 验。
1.3.3计数方法适用性试验
1. 供试液制备 2. 接种和稀释 3. 抗菌活性的去除与灭活 4. 供试品中微生物的回收
– 平皿法 – 薄膜过滤法 – 最可能数法（MPN 法）
5. 结果判断
1.4 供试品检查
• 1.4.1检验量
– 检验量即一次试验所用的供试品量（g、ml
2015版中国药典微生物检查方法及培养基变更参照
2015版中国药典微生物检查方法及培养基变更参照1.无菌检查法1.1变更内容1.1.1无菌检查方面，使用胰酪胨大豆肉汤（胰酪胨大豆液体培养基/大豆酪蛋白肉汤培养基）取代改良马丁培养基与硫乙醇酸盐流体培养基配合进行细菌和真菌的全面微生物检测。
1.1.2菌液制备环节，使用胰酪胨大豆肉汤、胰酪胨大豆琼脂取代营养肉汤、营养琼脂进行金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌和大肠埃希氏菌的菌液制备。
1.1.3菌液制备环节，使用沙氏葡萄糖液体培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基取代改良马丁培养基、改良马丁琼脂进行白色念珠菌和黑曲霉菌液的制备，同时对沙氏葡萄糖液体培养基、沙氏葡萄糖琼脂的配方进行了变更。
1.1.4适用性试验中，胰酪胨大豆肉汤使用枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉进行灵敏度检查；硫乙醇酸盐流体培养基使用金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、生孢梭菌、铜绿假单胞菌进行灵敏度检查。
1.2培养基信息2010版2015版无菌检查/菌液制备——硫乙醇酸盐流体培养基无菌检查/菌液制备——改良马丁培养基菌液制备——改良马丁琼脂培养基菌液制备——营养肉汤菌液制备——营养琼脂无菌检查——0.5%葡萄糖肉汤培养基供试品制备——0.1%蛋白胨水培养基无菌检查/菌液制备——硫乙醇酸盐流体培养基无菌检查/菌液制备——胰酪胨大豆肉汤菌液制备——胰酪胨大豆琼脂菌液制备——沙氏葡萄糖琼脂菌液制备——沙氏葡萄糖肉汤无菌检查——0.5%葡萄糖肉汤培养基供试品制备——0.1%蛋白胨水培养基供试品制备——pH7.0氯化钠—蛋白胨缓冲液1.3参考文件（国家药典委员会—中国药典2015版附录征求意见稿—1101无菌检查法）http://w w /cms/new scenter/new s/000603.html2.非无菌产品微生物限度检查2.1变更内容2.1.1供试品制备环节，除了pH7.0氯化钠—蛋白胨缓冲液、pH6.8磷酸盐缓冲液、pH7.6磷酸盐缓冲液外，添加了pH7.2磷酸盐缓冲液和胰酪胨大豆肉汤。
2015版微生物限度检查方法验证方案
验证文件扬子江药业集团四川海蓉药业有限公司目录一、验证概述 (2)1.验证对象 (2)2.验证原因 (2)3.验证目的 (2)4.验证要求 (2)二、验证组织机构和职责 (3)1.职责 (3)2.组织机构 (4)三、验证风险评估及范围 (6)1.严重性（S） (6)2.可能性（O） (7)3.可检测性（D） (8)4.风险优先数量等级判定（RPN） (9)四、验证实施计划 (35)五、验证准备 (36)1.验证依据 (36)2.验证条件 (36)六、验证内容 ......................................... 错误!未定义书签。
七、验证异常情况处理 (54)八、验证结论 (55)九、再验证周期 (56)十、附件 (56)一、验证概述1.验证对象本次验证的对象为阿戈美拉汀片（25mg）微生物限度检查法。
2.验证原因对阿戈美拉汀片（25mg）微生物限度检查法进行适用性验证。
3.验证目的确认阿戈美拉汀片（25mg)微生物限度检查法的可靠性。
4.验证要求验证过程需严格按方案中规定的步骤进行。
对于验证过程中出现的所有偏差，应查明原因并得到有效处理后，验证方可进入下一步骤。
二、验证组织机构和职责1.职责1.1.质量受权人—验证文件的批准。
—组织验证工作的实施及各部门的协调，保证验证工作有序的进行。
1.2.质量管理部—现场监督保证整个操作过程按照验证计划进行。
—负责验证方案的审核，及操作过程中对验证文件修订的审核工作。
—验证文件的归档工作。
—按照验证方案要求对操作过程中的样品抽样检测。
—涉及到的仪器仪表的校验，以及一些相关的化验工作。
1.3.质量控制实验室—负责验证文件的起草工作。
—负责验证文件的审核工作。
—验证方案起草人员现场对操作过程进行指导。
—对验证实施过程中资料和数据进行汇总并完成验证报告。
—需要时与相关部门的协调工作。
1.4.供应部按照验证物资采购计划进行物资采购。
2.组织机构2.1验证领导小组2.2.验证实施小组三、验证风险评估及范围根据SOP6-00001《验证管理规程》对验证的相关要求，对检测过程中可能影响检测结果的因素进行风险分析。
2015版《中国药典》微生物检验增修订内容
导引图 制剂通则
通用方法/检测方法 指导原则
修订内容概况
2015版药典编制大纲设计方案
------ 附录、药用辅料单独成卷
附录规范统一 附录编号研究 制剂通则修订与完善 通用检测方法的修订与完善 微生物及生物检定附录的修订与完善 指导原则的修订与完善
修订内容概况
取出滤膜接种至培养基，或将培养基 加入到滤筒….。培养3~5天。
薄膜 过滤 法
直接 接种 法
取硫乙醇酸盐流体培养基6管，金葡、 大肠、生孢各接种2管；取胰酪大豆胨 液体培养基6管，枯草、白念、黑曲霉 各2管。
分子生物学技术 生物检查法
1200系列
2000系列 3000系列
生物活性测定法
中药相关检测方法 生物制品相关检测方法
8000系列 9000系列
试剂与标准物质 指导原则
修订内容概况
光 谱 检 测 方 法 的 合 并
修订内容概况
色 谱 检 测 方 法 的 合 并
修订内容概况
微 生 物 检 查 法 的 合 并
非无菌产品微生物限度标准（1107）
抑菌效力检查法（1121）
微生物检查修订情况
指导原则
非无菌药品微生物限度检查指导原则（9202） 药品微生物实验室质量管理指导原则（9203） 微生物鉴定指导原则（9204） 受控洁净环境的监控指导原则（9205） 无菌检查用隔离系统验证指导原则（9206）
应定期按照医药工业洁净室（区） 照医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游 悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测 试方法的现行国家标准进行洁净 度确认。隔离系统应定期按相关 菌和沉降菌的测试方法的现行国家标准进 行洁净度验证。隔离系统按相关要求进行 验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检
中国药典2015版-微生物限度检查解析
*
*
注*：限度未做统一规定。
控制菌
*
不得检出沙门菌 （10g） ； 耐胆盐革兰阴性菌应小 于104（1 g）
执行及制定标准的注意事项
执行范围： 生产、贮存、销售过程中的药品 药用原料、辅料 中药提取物、中药饮片 新药标准 进口药品标准复核 药品质量考察及仲裁
标准执行的注意事项： 药典标准出处：中国药典通则项下【微生
或菌株已无使用需要时应及时灭菌销毁”； • 管理：应有程序文件，包括申购、操作、转种传代、纯度特性确认记录，注明名称、标准号、
接种日期、代数、培养基和培养条件、保藏的位置和条件等。
环境
• 实验室的布局和运行 • 环境监测 • 清洁、消毒和卫生
设备
建立仪器设备管理制度 清洁保养制度 操作规程 使用、监控的记录
器、天平、量器等等） 3.供应商评估与现场审计 使用正确的、有严格质量保障的产品
《中国药典》2015年版-微生物限度标准修订解析
标准修订内容 修订思路1 《中国药典》2010年版一、二、三部限度标准的相关内容合并。 修订思路2 参考EP7.0，USP35，JP X V标准，修订中国药典的微生物限度标准。
胆盐革兰阴性菌应小102
不含豆豉、神曲等发酵 5×102 原粉
102
液体口服给药
制剂
含豆豉、神曲等
发酵原粉
103
102
不得检出大肠艾希菌 不得检出沙门菌
耐胆盐革兰阴性菌应小 于 101
固体局部给药 表皮或粘膜不完整
104
102
不得检出金黄色葡萄球
制剂
菌、
表皮或粘膜完整
103
102
铜绿假单胞菌 ；阴道、
药品微生物检验的现状与发展
2015版中国药典微生物限度
1.4.2供试品检查
• 供试液制备
– ⑶油脂类供试品
• 取供试品，加入无菌十四烷酸异丙酯使溶 解，或与最少量并能使供试品乳化的无菌 聚山梨酯 80或其他无抑菌性的无菌表面 活性剂充分混匀。表面活性剂的温度一般 不超过 40℃（特殊情况下，最多不超过 45℃），小心混合，若需要可在水浴中进 行，然后加入预热的稀释液使成 1∶10供 试液，保温，混合，并在最短时间内形成 乳状液。必要时，用稀释液或含上述表面 活性剂的稀释液进一步 10倍系列稀释。
– 培养和计数 培养条件和计数方法同平皿计数 法，每张滤膜上的菌落数应不超过100cfu。
• 菌数报告规则
– 以相当于 1g、1ml 或10cm2 供试品的菌落数 报告菌数；若滤膜上无菌落生长，以﹤1 报 告菌数（每张滤膜过滤1g、1ml 或10cm2 供 试品）,或﹤1 乘以最低稀释倍数的值报告菌 数。
1.4.2供试品检查
• 供试液制备
– ⑷需用特殊方法制备供试液的供试品
• 膜剂供试品 • 肠溶及结肠溶制剂供试品 • 气雾剂、喷雾剂供试品 • 贴膏剂供试品
1.4.2供试品检查
1. 平皿法
– 平皿法包括倾注法和涂布法。 – 除另有规定外，取规定量供试品，按方法适用性
试验确认的方法进行供试液制备和菌数测定，每 稀释级每种培养基至少制备2个平皿。 – 培养和计数 除另有规定外，胰酪大豆胨琼脂培养 基平板在30～35℃培养3~5天，沙氏葡萄糖琼脂 培养基平板在20～25℃培养5 ~7天， 观察菌落 生长情况,点计平板上生长的所有菌落数，必要时 可适当延长培养时间至7 天进行菌落计数并报告 。菌落蔓延生长成片的平皿不宜计数。点计菌落 数后，计算各稀释级供试液的平均菌落数，按菌 数报告规则报告菌数。 – 若同稀释级两个平皿的菌落数平均值不小于15， 则两个平皿的菌落数不能相差1 倍或以上。
《中国药典》2015年版微生物培训2
色念珠菌、黑曲霉
色念珠菌、黑曲霉
通用要求变化——菌种及菌液制备
9203：药品微生物实验室质量管理知道原则——菌种
药品微生物检验用的试验菌应来自认可的国内或国外菌种保藏机 构的标准菌株，或使用与标准菌株所有相关特性等效的可以溯源的 商业派生菌株。
标准菌株的复苏、复壮或培养物的制备应按供应商提供的说明或 按已验证的方法进行。
9203：药品微生物实验室质量管理指导原则——
“微生物限度检查应在不低于D级背景下的B级单向流空气区域内进 行”。
9205：药品洁净实验室微生物检测和控制指导原则——
用于指导药品微生物检验用的洁净室等受控环境微生物污染情况的 检测和控制。
通用要求变化——试剂和试药
试剂和试药
中和剂、灭火剂和表面活性剂均应对微生物无毒性， 其相互间具有相容性，有利于样品中微生物的分散。
适用性检查：白色念珠菌、黑曲霉于20-25℃培养不超过5天。 与对照培养基比较，比值在0.5-2范围内，且菌落大小、形态一 判断标准 致。
阴性对照：20-25℃培养5天无菌落生长。
培养基适用性检查—示例
名称
沙氏葡萄糖琼脂+抗生素 （当细菌超标引起需氧菌总数超标时用）
阴性对照及培养基适用性检查同沙氏葡萄糖琼脂，增加抑菌性检查试验。
稀释液
1.PH7.0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液；
2.PH6.8无菌磷酸盐缓冲液、PH7.2无菌磷酸盐缓冲液、 PH7.6无菌磷酸盐缓冲液；如需要可在上述稀释液灭菌前 加入表面活性剂或中和剂等。
3.0.9%无菌氯化钠溶液。
通用要求变化——培养基
对照培养基 按标准物质管理，由中检院负责研制分 发。
培养基适用性试验 2皿（0.5～2.0），2管（生长良 好）。
2015年药典微生物检
2015年药典微生物检在检测环境中生长，或者生长相对缓慢，在设定时间内不能形成可见菌落。
1、细菌存活但不能被检出2、陪演技的选择性3、培养方法的固有缺陷4、细菌的亚致死受损与再生长提高一样菌计数结果的途径：1、直接计数法1.1扫描电镜观察计数法1.2荧光显微镜观察计数2、改进接种方法2.1均匀涂布接种2.2薄膜过滤法2.3调整培养温度和时间（生物制品两种温度培养）2.4选用替代培养基所用培养基及其成分：由于R2A培养基能促进受损细菌的恢复性再生长，其在20℃下培养7d或得的最高菌落数总是高于营养琼脂和m-SPC，R2A均匀涂布计数结果更高细菌在R2A培养基上的生长速度要慢，形成的菌落要小，在48h内，准确计数困难，因而需要延长培养时间，使菌落生长的足够大，但不会或少融合生长。
有利于刺激受损细菌和对氯有耐药性细菌的生长。
纯化水【检查】微生物限度取本品不少于1ml，按薄膜过滤法处理后，采用R2A琼脂培养基，30-35℃培养不少于5天，依法检查（通则1105），每1ml供食品中需氧菌总数不得过100cfu。
R2A轻质培养基适用性检查试验按照通则1105中“计数培养基适用性检查”的胰酪大豆胨琼脂培养基的适用性检查方法进行，试验菌株为铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌。
应符合规定。
注射用水【检查】微生物限度取本品不少于100ml，按薄膜过滤法处理后，采用R2A琼脂培养基，30-35摄氏度培养不少于5天，依法检查（通则1105），每100ml供试品中需氧菌总数不得过10cfu。
2015年版药典的纯化水、注射用水[微生物限度]检查方法在参考欧、美药典制药用水微生物检查要求的基础上，由浙江所立课题考察、比对，在所用培养基和方法上将有较大的修订。
不同药典关于纯化水的微生物检测方法和质量标准修订原因：营养琼脂等培养基可能只检出了水样细菌总数中很少的一部分，其他未检出的细菌根本就不能在检测环境中生长，或者生长相对缓慢，在设定时间内不能形成可见菌落。
2015版中国药典关于微生物检验有关变化的解读
黑龙江省食品药品检验检测所
杨利红
目
录
1 2
3
概况及背景 标准修订内容
执行及制定标准的注意事项
4 5
标准与方法 国外药典的标准收载情况
一、概况及背景
参照欧、美药典中“微生物限度”相关内容的组织形 式，将原“微生物限度检查法”修订后拆分为3个附录， 并在药典会网站上公示： -1、非无菌产品微生物检查：微生物计数法（一、二、 三部相同） -2、非无菌产品微生物检查：控制菌检查法（一、二、 三部相同） -3、药品微生物限度标准（一部；二部同三部）
在2005版chp收载微生物限度标准的基 础上，眼用制剂修订为无菌要求；阴 道、尿道给药制剂增加白色念珠菌 的控制；增加了贴膏剂的控制菌检查。
二、标准修订内容
1、药典标准的修订思路 （1）三部药典的合并 现行2010版《中国药典》三部分在微生物限度标准有 重叠，一部多于二部、三部。
一部标准为 基础
二、标准修订内容
非无菌药用原料及辅料微生物限度标准中药提取物及中药饮片微生物限度标准
制剂类型
TAMC
TYMC
控制菌
药用原料及辅料
103
102
未统一要求
中药提取物
103
102
未统一要求
中药饮片
未统一要 未统一要 求 求
不得检出沙门菌(10g)，耐胆盐 的阴性菌应小于104(1g)
二、标准修订内容
（4）实验环境的重大修订 ①无菌检查环境洁净度规定 GMP2010年版对洁净度的规定及确认标准 无菌检查： 2010年版：应在洁净度10000级背景下的局部100级单向流 空气区域内或隔离系统中进行。 2015年版：应在洁净度B级背景下的局部A级单向流空气区 域内或隔离系统中进行。 ②微生物限度检查环境洁净度规定 微生物限度检查： 2010年版：应在洁净度10000级背景下的局部100级单向流 空气区域内进行。 2015年版：应在受控洁净环境下（不低于D级）的局部不 低于B级单向流空气区域内进行。
2015年版中国药典微生物限度检查法
1.1 总则：
• 环境： – 微生物计数试验环境应符合微生物限度检查的要 求。(在不低于GMP 现行版要求的D 级洁净环境 、局部洁净度不低于B 级的单向流空气区域内进 行)【10版：在环境洁净度10000级下的局部洁净 度100级的单向流空气区域内】。 – 检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染 ，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检 出。 – 单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监 测。
菌数报告规则
– 需氧菌总数测定宜选取平均菌落数小于 300cfu 的稀释级、霉菌和酵母菌总数测定宜 选取平均菌落数小于100cfu 的稀释级，作为 菌数报告（取两位有效数字）的依据。取最 高的平均菌落数，计算1g、1ml 或10 cm² 供 试品中所含的微生物数。 – 如各稀释级的平皿均无菌落生长，或仅最低 稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小 于1 时，以﹤1 乘以最低稀释倍数的值报告菌 数。
1.4.2供试品检查
• 供试液制备 – ⑴ 水溶性供试品
• 取供试品，用 pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨 缓冲液，或pH7.2 磷酸盐缓冲液，或胰酪 大豆胨液体培养基溶解或稀释制成 1:10 供试液。若需要，调节供试液 pH 值至 6 ～8。必要时，用同一稀释液将供试液进 一步 10倍系列稀释。水溶性液体制剂也 可用混合的供试品原液作为供试液。
1.3.1菌液制备及使用
试验菌株 试验菌液的制备
金黄色葡萄球菌 〔CMCC(B) 26 003)〕
铜绿假单胞菌 〔CMCC（B)10 104〕 枯草芽孢杆菌 〔CMCC(B) 63 501〕 白色念珠菌 〔CMCC(F) 98 001〕
胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培 养基 【10版：营养肉汤或营养琼脂培养基】 30～35℃，18～24小时
2015版中国药典微生物限度记录
培养基的储藏
琼脂培养基不得在 0 ℃ 或 0 ℃ 以下存放，防止冷冻破 坏凝胶特性。
琼脂培养基最好现用现配，如置冰箱保存，一般不 超过一周，且应密闭包装，若延长保存需经验证 确定。 培养基灭菌后应立即取出，不得储存在高压灭菌器 中。
培养基适用性试验
修订内容
控制菌检查用培养基数量减少 7个，在增菌过程中， 使用无选择性增菌培养基。
2.一次只可加0.1-0.2ml样品。
薄膜过滤法
1.孔径应不大于0.45微米。直径一般为50mm，若采用其他直 径的滤膜，冲洗量应进行相应的调整。 2.滤膜材质应保证供试品及其溶剂不影响微生物的充分被截 留。 滤器注意点 1.滤器及滤膜在使用前应采用适宜的方法灭菌。 2.使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。 3.水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以湿润滤膜。 4.油类供试品，其滤膜和滤器在使用前应充分干燥。 5.供试液经滤膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤 膜每次冲洗量为100ml，总冲洗量不得超过1000ml,以避免 滤膜上的微生物受损伤。
理由：
污染菌受到环境、加工过程及储存等影响，受到损 伤，使用无选择性增菌培养基培养，使受损伤的 细胞得到修复，提高检出 配制的培养基的适用性检查 促生长能力、抑制能力和指示特性 的检查。
实验菌株的管理使用及鉴定
菌种的保藏 低温、干燥、缺氧、缺乏营养等环境条件都可以抑制微生物 的代谢和生长繁殖，因此，低温、干燥和真空是菌种保藏 的重要手段。
（三）2015版药典微生物检查法修订内容——计数法
修订前
细菌数——营养琼脂 霉菌及酵母菌数——玫瑰红钠琼脂 修订后 需氧菌总数——胰酪大豆胨琼脂（TSA）
霉菌及酵母菌总数——沙式葡萄糖琼脂（TSB）
2015版《中国药典》微生物检查法控制菌检查法修订解析
的胰酪大豆胨肉汤中，混匀，30～35℃培
养18-24h。（ Chp为营养肉汤培养基）
• （2）选择和分离培养
• 取上述预培养物接种至10mlRV増菌肉 汤中，30～35℃培养18-24h。取少量RV沙 门菌増菌肉汤培养物划线接种于木糖赖氨酸 脱氧胆酸琼脂平板上，30～35℃培养18-
五、供试品检查
三、培养基适用性
4、适用性检查
（1）测试能力：促生长能力（+）；抑制能力（-）；
指示能力（“指示”）
1）琼脂： 方法：涂布，至少2皿。
①比较菌落特征 ②是否生长
2）液体：
方法：直接接种
①培养基是否浑浊
三、培养基适用性
4、适用性检查
（2）要求： 1）菌株：根据表格要求接种 2）接种量：根据测试指标而定 ①“+”和“指示”：不大于100cfu ②“-”：不少于100cfu，也不能过多。 ③涂布：不少于接种，也不能过多。 3）培养时间 ①“+”和“指示”：不长于规定的最短培养时间。 ②“-”：不短于规定的最长培养时间。
可通过培养基适用性检查提供一定依据。在保证配 制和灭菌过程无误的条件下，对照培养基可以不经 适用性实验检查直接用于样品检查。 （3）不同处方培养基的替代使用不能通过培养基适 用性试验简单确定。不能使用经过对照培养基进行 适用性试验检查合格的其他培养基作为实验室自用 的“对照培养基”。 （4）如果没有特殊规定，培养基配置采用蒸馏水或纯 化水均可，但应进行检测控制，如蒸馏水pH应为5～7。
三培养基适用性4适用性检查控制菌检查培养基特性试验菌株耐胆盐革兰阴性菌肠道菌増菌肉汤促生长能力ecolipaeruginosa抑制能力saureus紫红胆盐葡萄糖琼脂促生长能力指示特性ecolipaeruginosa大肠埃希菌麦康凯肉汤促生长能力ecoli抑制能力saureus麦康凯琼脂促生长能力指示特性ecoli沙门菌rvs増菌肉汤促生长能力抑制能力saureus木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂促生长能力指示特性ecoli铜绿假单胞菌溴化十六烷基三甲铵琼脂促生长能力paeruginosa抑制能力ecoli金黄色葡萄球菌甘露醇高盐琼脂促生长能力指示特性saureus抑制能力ecoli梭菌増菌培养基促生长能力clsporogenes哥伦比亚琼脂促生长能力clsporogenes白色念珠菌沙氏葡萄糖琼脂促生长能力calbicans沙氏葡萄糖琼脂促生长能力指示特性calbicans三培养基适用性4适用性检查1测试能力
2015年版《中国药典》微生物限度检查法洁净环境及计数培养基修订分析探讨
2015年版《中国药典》微生物限度检查法洁净环境及计数培
养基修订分析探讨
景荣先;张国林
【期刊名称】《中国卫生产业》
【年(卷),期】2015(000)005
【摘要】2015年版《中国药典》将于2015年7月起开始实施：该版药典对微生物限度检查法检查时的洁净环境、培养基及检查方法进行了修订。
其中洁净环境要求由10000级背景下的100级单向流(2010年版)修订为受控背景下的不低于B 级环境(2015年版)；计数培养基由营养琼脂/玫瑰红钠琼脂培养基(2010年版)修订为胰酪大豆琼脂培养基/沙氏葡萄糖琼脂培养基(2015年版)。
该文旨在分析2015年版中国药典与2010年版中国药典在非无菌产品微生物限度检查时洁净环境与计数培养基的异同点，为更规范执行2015年版中国药典提供参考。
【总页数】2页(P184-185)
【作者】景荣先;张国林
【作者单位】苏州市立医院本部药学部，江苏苏州 215002;苏州市食品药品检验所，江苏苏州 215104
【正文语种】中文
【中图分类】R927
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2015年版《中国药典》微生物限度检查法洁净环境及计数培养基修订分析探讨
2015年版《中国药典》微生物限度检查法洁净环境及计数培养基修订分析探讨2015年版《中国药典》将于2015年7月起开始实施：该版药典对微生物限度检查法检查时的洁净环境、培养基及检查方法进行了修订。
其中洁净环境要求由10000级背景下的100级单向流（2010年版）修订为受控背景下的不低于B 级环境（2015年版）；计数培养基由营养琼脂/玫瑰红钠琼脂培养基（2010年版）修订为胰酪大豆琼脂培养基/沙氏葡萄糖琼脂培养基（2015年版）。
该文旨在分析2015年版中国药典与2010年版中国药典在非无菌产品微生物限度检查时洁净环境与计数培养基的异同点，为更规范执行2015年版中国药典提供参考。
标签：中国药典；2015年版；2010年版；洁净环境；培养基[Abstract] The Chinese Pharmacopoeia （2015 edition）will be implemented in July，2015 which have revised in some part，including clean environment and medium in microbial limit test. The clean environment was rectified from 10000 background plus 100 degree to control background plus A or B environment. The counting medium was changed from nutrient medium and rose bengal agar to trypticase soy agar （TSA）medium and sabouraud dextrose agar medium. In this part，we analyzed the differences of the clean environment and counting medium between 2010 and 2015 edition Chinese Pharmacopoeia for normative enforcement.[Key words] Chinese Pharmacopoeia；2010 edition；2015 edition；Clean environment；Medium微生物限度检查是用于检查非无菌制剂及其原料、辅料等是否符合规定的方法[1-2]。
2015版《中国药典》微生物限度检查法计数法修订解析
三、通用要求
（5）菌种及菌液的制备 各实验室应根据自身操作习惯总结出一套切
实可行、快速稳定的菌液制备标准程序。 注意事项： 1）使用前确认菌种身份 2）根据生产商说明书复苏菌种 3）使用接种技术，不要重复从菌种包装瓶中移取菌
种或重新冷冻菌种。 4）传代代数（每接种一次即为一代） 5）菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；
若保存在2～8 ℃，可在24小时内使用。
三、通用要求
7、试验菌 修订前
修订后
大肠埃希菌
铜绿假单胞菌
金黄色葡萄球菌、枯草 金黄色葡萄球菌、枯草
芽孢杆菌、白色念珠菌、 芽孢杆菌、白色念珠菌、
黑曲霉
黑曲霉
三、通用要求
8、培养基
修订前
（1）细菌计数：营养琼脂 （2）霉菌和酵母菌计数：玫瑰红钠琼脂 （3）酵母菌计数：酵母浸出粉胨葡萄糖琼 脂 （4）菌液稀释液：0.9%氯化钠溶液
2、氯霉素：广谱。对G-菌作用强；对G+菌作用不及青霉素与四环 素
接种方法
涂布法：表面接种不大于100cfu试验用菌悬液于SDA平板表面；
倾注法：接种不大于100cfu试验用菌悬液于无菌平皿，倾注该培养 基，轻轻摇匀。
适用性检查 白色念珠菌、黑曲霉于20～25 ℃培养不大于5天
与标准培养基比较，恢复率在50% ～200%之间。
接种试验用菌株后， 30～35 ℃ 培养不超过72小时，与对照培
养基比较，试验菌应生长良好。（建议：培养基呈混浊的液体， 或划线于相应的分离平板上，培养后呈现典型菌落）
备注：该培养基同时用于稀释液的制备和控制菌检查时，需要考虑同时满足计数 和控制菌检查培养基适用性检查控制要求。
四、培养基适用性检查
培养基名称 无菌性检查
《中国药典》2010版与2015版微生物限度检查法对四种药物检测结果的比较
《中国药典》2010版与2015版微生物限度检查法对四种药物检测结果的比较李趣嫦;江艳芳【期刊名称】《中国药品标准》【年(卷),期】2015(0)2【摘要】Objective:To compare the two microbial limit test methods proposed by Chinese Pharmacopoeia 2010 Edition appendix and Chinese Pharmacopoeia 2015 Edition ( general rules in public draft ) for microbes determination in various pharmaceuticals .Methods:Two Chinese patent medicines: Spores of Ganoderma LucidumRhodiola Capsules and Herba Cirsii Carbonisatus Granules , and two chemical medicines:Montelukast Sodium Granules and Diclofenac Sodium Patch , were selected as the subjects for investigation .Their microbial limit test methods were established and validated according to Chinese Pharmacopoeia 2010 Edition and 2015 Edition, respec-tively.The established methods were then applied for determination of microbes presented in the investigated pharmaceutical samples . Results:Similar detection results were obtained by using the microbial limit test methods proposed by Chinese Pharmacopoeia 2010 E-dition and 2015 Edition, although their method establishment and validation processes were slightly different .In addition, the method proposed by Chinese Pharmacopoeia 2015 Edition ( general rules in public draft ) was more sensitive than that of 2010 Edition appen-dix.Conclusion:The microbial limit test method proposed by Chinese Pharmacopoeia 2015 Edition ( general rules in public draft ) is more reasonable and superior than that proposed by Chinese Pharmacopoeia 2010 Edition appendix.%目的：比较《中国药典》2015年版（通则公示稿）中的微生物限度检查法与《中国药典》2010年版对不同药物的检测结果。
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2015年版《中国药典》微生物限度检查法洁净环境及计数培养基修订分析探讨
作者：景荣先张国林
来源：《中国卫生产业》2015年第05期
[摘要] 2015年版《中国药典》将于2015年7月起开始实施：该版药典对微生物限度检查法检查时的洁净环境、培养基及检查方法进行了修订。
其中洁净环境要求由10000级背景下的100级单向流（2010年版）修订为受控背景下的不低于B级环境（2015年版）；计数培养基由营养琼脂/玫瑰红钠琼脂培养基（2010年版）修订为胰酪大豆琼脂培养基/沙氏葡萄糖琼脂培养基（2015年版）。
该文旨在分析2015年版中国药典与2010年版中国药典在非无菌产品微生物限度检查时洁净环境与计数培养基的异同点，为更规范执行2015年版中国药典提供参考。
[关键词] 中国药典；2015年版；2010年版；洁净环境；培养基
[中图分类号]R927 [文献标识码]A [文章编号]1672-5654（2015）02（b）-0184-02
[Abstract] The Chinese Pharmacopoeia （2015 edition） will be implemented in July， 2015 which have revised in some part， including clean environment and medium in microbial limit test. The clean environment was rectified from 10000 background plus 100 degree to control background plus A or B environment. The counting medium was changed from nutrient medium and rose bengal agar to trypticase soy agar （TSA） medium and sabouraud dextrose agar medium. In this part， we analyzed the differences of the clean environment and counting medium between 2010 and 2015 edition Chinese Pharmacopoeia for normative enforcement.
[Key words] Chinese Pharmacopoeia； 2010 edition； 2015 edition； Clean environment；Medium
微生物限度检查是用于检查非无菌制剂及其原料、辅料等是否符合规定的方法[1-2]。
为防止污染，确保检查结果的准确性，微生物限度检查必须在受控的洁净环境中进行，并严格执行检验过程的无菌操作。
培养基是进行微生物限度及无菌检查的主要载体，其质量合格与否及选择的合理性直接关系到检查结果的准确性和可靠性。
2015年版中国药典对微生物限度检查的洁净环境、培养基及检查方法进行了修订。
该文比较分析2015年版中国药典与2010年版中国药典在非无菌产品微生物限度检查时洁净受控环境与计数培养基异同点，为更规范执行新版中国药典提供参考。
1 2015年版与2010年版中国药典微生物检查项目异同
微生物限度检查法主要用于检查非规定灭菌的制剂及其原料、辅料等是否符合规定的标准方法。
2010年版中国药典微生物限度检查法中检查的项目包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌（大肠埃希菌、大肠菌群、沙门菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、梭菌及白色念珠菌）[1]；而2015年版中国药典对计数法微生物检查项目界定为嗜温细菌和真菌，同时将控制菌检查中的“大肠菌群”修订为“耐胆盐格兰阴性菌”[2]，见表1。
2010年版中国药典中规定微生物限度检查的计数项目中细菌培养温度为30～35℃，霉菌和酵母菌培养温度为23～28℃，因此，样品中可能存在的极端微生物在此条件下无法检出。
因此，2015年版中国药典对计数法检查项目界定为嗜温细菌和真菌具有合理性。
大肠菌群是能发酵乳糖产酸、产气的一类需气或兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，主要来源于粪便，是判定食品、药品等是否被粪便污染的重要指标；而耐胆盐革兰氏阴性菌是一类在胆汁酸中可以存活并繁殖的革兰氏阴性菌，其范围比大肠菌群更广，包括肠杆菌科、产单孢菌属及家单孢菌属等，且该方法在大肠菌群检测上更容易操作和进行结果判读[3]。
同时，现行的美国药典也是采用检查耐胆盐革兰氏阴性菌进行报告。
2 2015年版《中国药典》微生物限度检查法环境修订与分析
微生物限度检查时洁净环境是保证检查结果准确性的重要保证。
2010年版中国药典中规定“微生物限度检查应在环境洁净度10 000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内进行”，而2015年版中国药典要求“微生物计数试验应在受控环境下的局部洁净度不低于B级的单向流空气区域内进行”。
新旧版药典的变化首先是洁净环境洁净度称谓上的变化：2015年版中国药典与2010年药品生产质量管理规范的称谓一致，将环境洁净度的等级按照A、B、C、D级进行划分。
2010年版中国药典的洁净度等级划分样式目前多应用于无菌医疗器具生产及保健品、化妆品生产厂房等洁净度的划分。
虽然D级与10 000级环境在洁净环境的关键项目尘埃数和沉降菌控制方面无明显差别：D和10 000级洁净环境控制≤5μm和≤0.5μm粒子数为≤29 000/3 520 000个/m3和≤20 000/3 500 000个/m3（静态），而二者对沉降菌的控制相同，均为≤10个/平皿（静态）。
为防止检验过程造成污染影响检验结果，目前微生物限度检查时的洁净环境一般要求不低于其生产时的洁净环境度，而目前非无菌制剂生产环境主要处于C级或D级洁净环境下。
同时，考虑到洁净环境的洁净度越高，相应的运行成本越高、风险越大[4-5]，因此，将微生物限度检查的洁净环境定位于“受控环境（C级或D级）下的局部洁净度不低于B级（A级或B 级）的单向流空气区域内进行”是合理的。
见表2。
3 2015年版《中国药典》微生物限度检查法技术培养基比较
2010年版中国药典微生物限度检查法中计数检查的项目包括细菌数、霉菌和酵母菌数；而2015年版中国药典对计数法检查项目界定为嗜温细菌和真菌。
2010年版细菌和霉菌及酵母菌计数采用的是营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基，而2015年版中国药典检查嗜温细菌和真菌采用的是胰酪胨大豆琼脂培养基和沙氏葡萄糖琼脂培养基。
有研究表明胰酪胨大豆琼脂培养基上细菌的生长状态更佳，该培养基更适合于细菌的计数检查[6]。
另外，新版中国药典增加了含抗生素的玫瑰红钠和沙氏葡萄糖琼脂选择性培养基用于因沙氏葡萄糖琼脂上因细菌生长而造成的霉菌和酵母菌计数不合格的情况，克服了2010年版中国药典的不足。
另外，2015年版中国药典取消了酵母浸出粉胨琼脂培养基用于酵母菌计数的方法。
2015年版中国药典的以上修订均与现行的美国药典要求趋向于一致。
见表3。
4 讨论
与2010年版中国药典相比，2015年版中国药典对微生物限度检查及无菌检查方法进行了较大的修订，包括培养基的选择、验证方法、检查是的洁净环境等多个方面。
该文主要分析了新版药典中微生物限度检查在计数培养基和洁净环境方面的变化。
总体上来看，新版药典微生物限度检查与无菌检查修订后在培养基选择、方法验证、洁净环境的控制方面均向现行的美国药典靠拢。
两国药典标准的一致性为药品生产企业通过GMP认证及出口贸易均具有积极的意义。
本文中参考的内容来自于《中国药典》2015年版总则（草案）第二次公开征求意见稿，其内容可能与正式稿有所出入。
如正式稿内容有所变化，一切以正式稿为准。
[参考文献]
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[2] 曾婧娉，崔蓉，李全兴，等.苯酚滴耳液微生物限度检查方法的建立与验证[J]. 中国现代应用药学，2015，32（1）：78-81.
[3] 国家药典委员会.关于《中国药典》2015年版总则（草案）第二次公开征求意见的通知[EB/OL].（2014-07-28）http：///cms/newscenter/news/000623.html.
[4] 朱文娟.大肠菌群检查与胆汁耐受革兰阴性菌检查比较研究[J]. 中国医药指南，2012，10（34）：109-111.
[5] 李立，张利群. 洁净室净化空调系统的节能浅探[J]. 洁净与空调技术，2014（3）：46-47.
[6] 陈伟盛，朱荣峰，关倩明.统计分析在洁净室污染评估及风险分析中的应用研究[J]. 中国医药工业杂志，2014（10）：1004-1008.
[7] 由亚宁，陈雪芹，周志云，等.2005年版《中国药典》和《欧洲药典》菌落计数培养基比较[J]. 中国药事，2010，24（6）：587-589.
（收稿日期：2014-11-15）。