ELISA protocol ELISA方法流程
ELISA操作规程
ELISA操作规程一、引言ELISA（酶联免疫吸附测定）是一种常用的实验方法，用于检测和定量分析生物样本中的特定蛋白质、抗体或其他分子。
本文将详细介绍ELISA的操作规程，包括实验前准备、试剂准备、样本处理、板涂覆、洗涤、标记物添加、洗涤、底物添加和测量等步骤。
二、实验前准备1. 准备所需试剂和材料，包括ELISA板、标准品、样本、缓冲液、洗涤缓冲液、底物液等。
2. 检查仪器设备是否正常工作，如酶标仪、洗板机等。
3. 温度控制，确保实验室温度稳定在适宜的范围内。
三、试剂准备1. 缓冲液的配制：根据实验需要，配制适当的缓冲液，如PBS（磷酸盐缓冲液）、TBST（三乙胺缓冲盐水）、BSA（牛血清蛋白）溶液等。
2. 标准品的稀释：根据实验要求，将标准品按照一系列浓度稀释，制备标准曲线。
四、样本处理1. 收集待测样本，如血清、尿液等。
2. 根据实验要求，对样本进行预处理，如离心、稀释等。
五、板涂覆1. 取出ELISA板，将每个孔加入适量的涂层抗体或抗原，覆盖整个孔底。
2. 将板密封，放置在4℃的冰箱中，静置一夜或按照实验要求的时间。
六、洗涤1. 取出ELISA板，将涂层液倒掉。
2. 向每个孔加入适量的洗涤缓冲液。
3. 将洗涤缓冲液倒掉，重复此步骤3次，确保洗涤干净。
七、标记物添加1. 向每个孔加入适量的标记物，与待测物相互作用。
2. 将板密封，放置在室温下静置一段时间，使标记物与待测物结合。
八、洗涤1. 取出ELISA板，将标记物液倒掉。
2. 向每个孔加入适量的洗涤缓冲液。
3. 将洗涤缓冲液倒掉，重复此步骤3次，确保洗涤干净。
九、底物添加1. 向每个孔加入适量的底物液，使其与酶标记物反应。
2. 将板密封，放置在室温下静置一段时间，观察颜色的变化。
十、测量1. 使用酶标仪测量每个孔的吸光度值。
2. 根据实验设计和标准曲线，计算出待测样本中特定物质的浓度。
十一、数据分析与结果解释根据测量结果和标准曲线，进行数据分析和结果解释，得出实验结论。
ELISA操作规程
ELISA操作规程引言概述ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种常用的实验技术，用于检测特定蛋白质或其他分子在生物样本中的存在和浓度。
本文将详细介绍ELISA的操作规程，包括实验前的准备工作、样本处理、试剂配制、板上实验步骤和结果分析等内容。
一、实验前的准备工作1.1 样本准备：收集样本时应注意避免污染和交叉污染，避免冻融次数过多。
样本应在规定时间内处理，避免长时间存放。
1.2 试剂准备：根据实验方案准备所需的试剂，如稀释缓冲液、洗涤缓冲液、底物液等，确保试剂的质量和稳定性。
1.3 仪器准备：准备好ELISA板阅读器和洗板机等设备，确保仪器的正常运行和校准。
二、样本处理2.1 样本稀释：根据实验需求将样本进行适当的稀释，以确保浓度在标准曲线的线性范围内。
2.2 样本处理：对于血清或血浆样本，应先离心去除悬浮物，避免干扰因子的影响。
2.3 样本保存：处理完样本后，应储存于-20℃或更低的温度下，避免多次冻融。
三、试剂配制3.1 稀释缓冲液：根据实验方案准确称取试剂，按照比例稀释，确保最终浓度符合实验要求。
3.2 洗涤缓冲液：配制洗板机所需的洗涤缓冲液，保证洗板的干净程度。
3.3 底物液：根据实验方案配制底物液，确保底物液的质量和稳定性。
四、板上实验步骤4.1 包被：将包被抗体加入到板上，孵育一定时间后洗涤，使包被抗体固定在板上。
4.2 加样本：加入样本和标准品，孵育一定时间后洗涤，去除未结合的物质。
4.3 加底物：加入底物液，孵育一定时间后停止反应，加入停止液终止反应。
五、结果分析5.1 读板：使用ELISA板阅读器测定吸光度值，绘制标准曲线并计算样本的浓度。
5.2 数据处理：根据实验方案进行数据处理，包括样本浓度的计算和结果的统计分析。
5.3 结果解释：根据实验结果进行数据解释，得出结论并撰写实验报告。
总结：ELISA操作规程是一项重要的实验技。
ELISA方法详细过程及步骤
ELISA方法详细过程及步骤ELISA（酶联免疫吸附实验）是一种常用于测定生物样本中特定分子的定量方法。
它结合了免疫化学和酶学原理。
下面是对ELISA方法的详细过程及步骤的完整版说明：1.准备工作：首先，准备实验室材料，包括ELISA板、试剂、标样、洗涤液、试管、酶标板读取器等。
确保所有物品都是干净且无污染的。
2.涂覆抗原或抗体：将要测定的抗原或抗体在ELISA板的孔中涂覆。
可以将抗原或抗体溶液加入每个孔中，然后在37°C的恒温箱中孵育2到4个小时，以便其吸附在板上。
3.孔的封闭：将孔洗涤掉未吸附的物质，并用阻断液封闭孔，以防止非特异性结合。
4.样本和标准品的加入：将待测样本和不同浓度的标准品加入对应的孔中。
将ELISA板返回恒温箱，孵育一段时间，使样本和标准品中的抗原或抗体与固相相结合。
5.洗涤：将洗涤液加入孔中，用洗涤机或手动洗涤涡流器洗涤孔，以去除未结合的物质。
6.加入检测抗体：加入检测抗体，该抗体具有与待测物质结合的亲和性。
将ELISA板返回恒温箱进行孵育，使检测抗体与待测物质结合。
7.洗涤：重复第5步中的洗涤步骤，以去除未结合的检测抗体。
8.加入次级抗体：加入与检测抗体结合的二抗，通常是与酶结合的抗体。
这个二抗具有抗体结合和酶活性。
9.洗涤：重复第5步中的洗涤步骤，以去除未结合的次级抗体。
10.反应底物：加入染色底物，它通常是可以与酶发生反应并产生可见信号的底物。
11.反应停止：通过加入停止液，中止底物的反应并停止信号的产生。
12.读板：使用酶标板读取器，在特定波长下测量每个孔的吸光度。
这个吸光度与待测样本中目标物质的含量成正比。
13.数据分析：根据标准曲线，计算出待测样本中目标物质的浓度。
总结：ELISA方法是一种常用的免疫学定量方法，它可以用于测定生物样本中特定分子的含量。
在ELISA方法中，首先将待测物质（抗原或抗体）固定在ELISA板上，然后加入待测样本和标准品，进行孵育和洗涤的步骤，以去除未结合物质。
ELISA操作步骤
ELISA操作步骤酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种常用的实验方法，用于检测抗原或抗体的存在和浓度。
双抗体夹心法是ELISA的一种常见方法，也被称为间接ELISA。
该方法通过将待测抗原与特异性抗体结合，然后将该复合物夹在两种抗体之间，从而实现检测目标物的定量。
以下是ELISA操作步骤（双抗体夹心法）：1.准备所需试剂和设备，包括等量酶联免疫吸附试剂，洗涤缓冲液，检测抗体，底物液和浓缩液。
2.预先涂上酶标板：用特异性抗体溶液将酶标板的孔涂覆。
将抗体溶液加入每个孔中，然后在常温下孵育2小时或过夜在4°C下孵育。
孵育结束后，将溶液倒掉，然后用洗涤缓冲液洗涤掉未结合的抗体。
3.加入待测样品：将待测样品加入酶标板中，然后在常温下孵育1小时。
孵育结束后，倒掉孵育液，并用洗涤缓冲液洗涤掉未结合的样品。
4.加入检测抗体：将检测抗体加入酶标板孔中，然后在常温下孵育1小时。
检测抗体可以与目标物中的特异性抗体结合，并形成夹心复合物。
5.加入底物液：将底物液加入每个孔中，然后在室温下孵育20-30分钟。
底物液通常含有染色剂，当底物液与酶产生反应时，颜色会发生变化。
6.停止反应：在孵育结束后，加入停止液停止反应。
停止液会改变底物液的pH值，从而停止酶的反应。
这将保持颜色稳定，并允许结果的定量测量。
7.结果分析：使用酶标仪读取每个孔的吸光值。
这些吸光值可以用于计算样品中目标物的浓度。
通常，在酶标板上设置标准曲线，用于根据吸光值确定目标物的浓度。
8.清洗：在每个步骤之后，用洗涤缓冲液充分清洗酶标板。
洗涤的目的是去除未结合的试剂和非特异性物质，以确保结果的准确性。
9.数据处理和统计分析：根据读数结果计算样品中目标物的浓度，并进行统计分析。
常见的统计方法包括均值、标准差和方差。
以上是双抗体夹心法ELISA的一般操作步骤。
在实际操作中，可能会根据具体要求进行一些调整和优化。
同时，实验室安全操作规范和个性化要求也需要被遵循和注意。
ELISA步骤
马怀雷：1、包被：用包被液将待包被抗原或抗体稀释到100ng/ul，每孔包被100ul，共100ng，4℃过夜；2、封闭：取出包被的板子，甩掉包被液，用PBST洗3次，每次5min，200ul/孔。
拍干孔中残余的液体；用5%PBS牛奶封闭，每孔200ul，37℃温浴1小时；3、加一抗：取出封闭的板子，甩掉封闭液，用PBST洗3次，每次5min，200ul/孔，拍干孔中残余的液体；加入用牛奶稀释的一抗，100ng/ul，100ul每孔，37℃温浴1小时；4、加二抗：取出板子，甩掉一抗，用PBST洗3次，每次5min，200ul/孔，拍干孔中残余的液体；加入用牛奶稀释的二抗（1:2000），100ul每孔，37℃温浴1小时；5、加显色底物：取出板子，甩掉二抗，用PBST洗3次，每次5min，200ul/孔，拍干孔中残余的液体；向每孔加入TMB底物，100ul每孔，37℃温浴15-20分钟，最多不超过30分钟；6、终止：取出板子，向每孔中加入100ul终止液，终止反应。
7、读数：在450nm处读数。
细胞ELISA-protocol：1、胰酶消化培养瓶内细胞为单个细胞，1500 rpm离心10 min，用无血清培养基重新稀释并计数，106 cells/ml2、96细胞培养板每孔加100ul稀释好的细胞悬液，37度过夜使其贴壁3、次日PBS洗板2次，按150 ul/well加入10% Formalin-PBS，固定15 minutes4、用PBS洗3次，吸干溶液，每孔加200 ul的2% BSA-PBS，37度1 h5、用PBS洗3次，加1%BSA-PBS稀释的一抗100ul/well，37度1h6、用PBS洗5次，加入1% BSA-PBS稀释的anti-mouse IgG:HRP 50 ul/well ，浓度1：2000，37度1h7、dH2O洗5次，加入150ul显色液，室温放置20min，2N H2SO4终止，酶标仪读OD值帖壁细胞：1、消化细胞，调整细胞浓度10 5/ml；2、讲细胞加入96孔板100ul/孔，5％CO2孵箱24-48hr，至细胞在孔底生长为一薄层；3、弃上请，1％BSA-PBS轻轻洗板一次；3、加4度预冷的0.025％戊二醛200ul/孔，置4度15min；4、PBS洗3次，每孔加200 ul的1% BSA-PBS，置4度过夜（亦可37度1－2 h）；以下步骤同常规。
elisa法检测步骤
elisa法检测步骤ELISA法，即酶联免疫吸附测定法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay），是一种常用于检测特定抗原或抗体的方法。
它基于免疫学原理，通过特异性抗体与抗原结合并利用酶的催化作用产生可测定的信号，从而实现对目标物质的定量检测。
下面将介绍ELISA法的基本步骤以及注意事项。
1. 抗原或抗体的固定需要将待测抗原或抗体固定在固相载体上，常用的载体有微孔板等。
固定的目的是为了使待测物能够与特异性抗体或抗原结合，并保持其稳定性。
2. 阻断非特异性结合位点在固定的抗原或抗体上，加入一种阻断剂，如牛血清蛋白（BSA）或鱼胶蛋白（Gelatin），以防止非特异性结合。
3. 特异性抗体的结合将待测样品加入到固定的抗原上，使其中的抗原与特异性抗体发生结合反应。
特异性抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，其选择应根据具体实验需求。
4. 酶标记二抗的结合经过特异性抗体的结合后，再加入酶标记的二抗。
酶标记的二抗与特异性抗体的结合形成免疫复合物。
5. 酶底物的加入在免疫复合物形成后，加入酶底物。
酶底物与酶标记的二抗结合后，酶会催化底物的反应，产生可测定的信号。
常用的酶有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）。
6. 反应停止根据酶底物的选择，选择合适的反应停止液，使酶催化反应停止。
常用的反应停止液有硫酸或碳酸氢钠。
7. 信号检测将停止反应后的溶液转移到酶标仪或光度计中，测定产生的信号强度。
ELISA法可以通过颜色反应或发光反应来进行信号检测。
ELISA法作为一种常用的检测方法，在临床诊断、生物医学研究和生物工业等领域都有广泛应用。
但在进行ELISA实验时，还需要注意以下几点：1. 严格控制实验条件，包括温度、时间和pH值等，以确保实验结果的准确性。
2. 选择合适的阳性和阴性对照，以验证实验的可靠性和敏感性。
3. 遵循操作规范，注意实验操作的无菌和无污染。
4. 合理选择稀释倍数，以保证实验结果在检测范围内。
ELISA操作规程
ELISA操作规程一、实验目的本实验旨在通过酶联免疫吸附试验（ELISA）的操作，检测目标物质的存在与浓度，以实现对生物样本中特定抗原或抗体的定量分析。
二、实验材料1. 96孔ELISA板2. 目标抗原或抗体样本3. 特异性一抗和二抗4. 辅助试剂：洗涤缓冲液、稀释缓冲液、底物和停止液5. 高精度微量移液器和相应的移液器头6. 高精度电子天平7. 显微镜和酶标仪三、实验步骤1. 预处理：将96孔ELISA板放置在实验台上，加入稀释缓冲液，轻轻震荡混合，然后倒掉液体。
重复此步骤3次。
2. 样本添加：将待测样本加入96孔ELISA板中，每孔加入相同体积的样本。
3. 孵育：将ELISA板盖上密封膜，置于恒温箱中孵育一定时间，使样本中的抗原或抗体与固相特异性一抗结合。
4. 洗涤：将洗涤缓冲液加入96孔ELISA板中，轻轻震荡混合，然后倒掉液体。
重复此步骤3次，以洗去未结合的物质。
5. 二抗结合：将特异性二抗加入96孔ELISA板中，轻轻震荡混合，然后盖上密封膜，继续孵育一定时间，使二抗与固相特异性一抗结合。
6. 洗涤：重复步骤4。
7. 底物添加：将底物加入96孔ELISA板中，轻轻震荡混合，然后暗处孵育一定时间，使底物与二抗结合的酶发生反应。
8. 反应停止：加入停止液，终止底物与酶的反应。
9. 测量：将96孔ELISA板放入酶标仪中，根据实验要求选择相应波长进行测量。
记录各孔的吸光度值。
10. 数据分析：根据实验目的，利用标准曲线或其他方法，计算出目标物质的浓度。
四、实验注意事项1. 实验前需准备好所有试剂和材料，确保实验环境清洁和无尘。
2. 操作过程中需佩戴手套，避免污染样本和试剂。
3. 洗涤步骤中，确保洗涤缓冲液充分覆盖每个孔，且每次洗涤液倒掉后，孔内无残留液体。
4. 孵育和暗处孵育步骤中，需控制好时间和温度，以确保反应的充分进行。
5. 底物和停止液需按照说明书的要求配制和使用，避免使用过期或变质的试剂。
ELISA操作规程
ELISA操作规程一、引言ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种常用的免疫学实验技术，用于检测和定量分析生物样本中的特定抗原或者抗体。
本操作规程旨在提供详细的步骤和指导，确保ELISA实验的准确性和可重复性。
二、实验材料准备1. 缓冲液：根据实验需求选择合适的缓冲液，如PBS（磷酸盐缓冲液）或者TBS（三氯甲烷缓冲液）。
2. 抗原或者抗体：根据实验目的选择合适的抗原或者抗体，并进行适当的稀释。
3. 酶标记的二抗：根据实验需求选择合适的酶标记的二抗，如HRP（辣根过氧化物酶）或者AP（碱性磷酸酶）。
4. 底物：选择合适的底物，如TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯胺）或者ABTS（2,2'-联氨基二乙基三乙酸）。
5. 住手液：根据实验需求选择合适的住手液，如2M硫酸或者2M盐酸。
三、ELISA实验步骤1. 板涂覆a. 取ELISA板，将每一个孔加入适量的抗原或者抗体，通常为100-200ng/mL。
b. 将板封闭剂（如BSA或者牛血清白蛋白）加入每一个孔中，封闭非特异性结合位点。
c. 在4℃下孵育过夜，或者在室温下孵育2小时。
2. 样本处理a. 采集待测样本，如血清或者细胞上清。
b. 根据实验需求对样本进行适当的稀释。
c. 加入样本到孔中，每一个孔加入适量的样本，通常为50-100 μL。
d. 在室温下孵育1小时。
3. 二抗结合a. 弃去孔中的样本，并用洗涤缓冲液洗涤孔3次，每次洗涤时间为1-2分钟。
b. 加入酶标记的二抗到每一个孔中，每一个孔加入适量的二抗，通常为100-200 ng/mL。
c. 在室温下孵育1小时。
4. 底物反应a. 弃去孔中的二抗，并用洗涤缓冲液洗涤孔3次。
b. 加入适量的底物到每一个孔中，通常为100-200 μL。
c. 在室温下孵育适当的时间，观察颜色的发展。
5. 反应终止a. 加入适量的住手液到每一个孔中，通常为50-100 μL。
b. 轻轻摇晃板，确保住手液均匀混合。
ELISA实验 Protocol
ELISA实验的原理：ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。
在测定时，受检标本(测定其中的抗体或抗原)与固相载体表面的抗原或抗体起反应。
用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。
再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。
此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。
加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。
所需试剂和耗材：1.抗原或抗体溶液。
2.酶标记的抗原或抗体溶液。
3.洗涤液。
4.底物溶液。
5.终止液。
实验仪器：1.酶标板。
2.移液器。
3.洗涤器。
4.分光光度计。
准备工作：1.准备好所需的试剂和耗材，确保它们在有效期内，并按照要求储存和使用。
2.确保实验区域干净整洁，并无菌操作。
3.了解和掌握实验步骤，以及如何解决可能出现的问题。
实验方法（以双抗夹心法为例）：1.在酶标板的每个孔中加入100ul的标准品或待测样本，然后在37℃的环境中孵育2小时。
2.用洗涤液洗涤3次，每次5分钟，以确保去除未结合的物质。
3.加入生物素化抗体工作液，在37℃的环境中孵育1小时，然后再次用洗涤液洗涤3次。
4.加入链霉亲和素-HRP工作液，在37℃的环境中孵育0.5小时，再用洗涤液洗涤3次。
5.加入底物溶液，在37℃的环境中孵育15-20分钟，注意避光。
6.加入终止液，5分钟内检测450nm波长的OD值，并记录数据。
7.使用分光光度计进行定量分析，根据标准品和待测样本的OD值计算出相应的浓度或含量。
注意事项：1.在实验过程中，要注意防止污染，尤其是避免交叉污染，因为这会对实验结果产生极大的影响。
2.所有溶液都应该是新鲜的，并且在使用之前应该进行充分的过滤和离心处理。
3.在孵育和洗涤过程中，要保证温度和时间的一致性，这有助于提高实验的准确性。
4.在加入底物溶液和终止液时，要保证速度和量的准确性，这有助于保证实验结果的可靠性。
ELISA试验基本步骤及材料和试剂
ELISA试验基本步骤及材料和试剂ELISA（酶联免疫吸附测定）是一种常用于检测蛋白质或抗体的定性和定量方法。
它的基本原理是利用酶-抗体偶联物来检测特定目标物质的存在，通过酶催化底物的变化来实现信号的放大和检测。
下面将介绍ELISA试验的基本步骤以及相关的材料和试剂。
1.涂板：首先，将微孔板（96孔板或其他规格的板）用目标蛋白质或抗体溶液涂覆在表面上，使其吸附固定。
这一步通常称为“涂板”。
2.阻断：将蛋白质或抗体涂覆后的微孔板用阻断剂（例如牛血清蛋白、BSA）进行阻断处理，以防止非特异性结合。
3.样品处理：将待检测的样品加入到微孔板中，并与目标蛋白质或抗体结合（如果存在）。
样品通常需要经过一系列稀释步骤，以便在量化检测时得出准确的结果。
4.洗涤：使用缓冲液反复洗涤微孔板，以去除未结合的物质。
5.二抗处理：加入与待检测物种类对应的二抗荧光素，使其与待检测物结合。
这一步通常称为“二级标记”。
6.洗涤：再次使用缓冲液反复洗涤微孔板，以去除未结合的二抗。
7.底物结合：加入底物（如TMB或ABTS）并等待一定的反应时间，使酶催化底物的变化产生可观察的颜色变化。
8.反应停止：加入停止液（如硫酸、盐酸）停止底物的反应。
9.测量：利用酶催化反应产生的颜色变化通过酶标仪或光谱仪进行测量，得出待测量物的浓度或定性。
1.微孔板：一般使用96孔的微孔板，也可根据需要选择其他规格的板。
2.涂板物质：目标蛋白质或抗体等。
3.阻断剂：常用的阻断剂有牛血清蛋白（BSA）等。
4.样品：待检测的生物样品，可以是血清、细胞提取物或其他组织液。
5.二抗：与待检测物种类对应的二抗，通常是抗体。
6.底物：用于酶催化反应并产生颜色变化的化学底物，如TMB（3,3',5,5'-四甲基苯基二胺）、ABTS等。
7.停止液：停止底物的反应，如硫酸、盐酸等。
8. 缓冲液：用于洗涤和稀释的缓冲液，如PBS（磷酸盐缓冲液）、TBST（含Tween-20的洗涤缓冲液）等。
ELISA操作流程
ELISA操作流程（一）、基本操作流程方法一双抗体夹心法（用于检测未知抗原的）1.包被：用包被液将抗体稀释至蛋白质含量为0.5～20μg／ml，按100ul/孔加入酶标板，4℃包被过夜。
2.洗板：次日弃去孔内液体，在纸巾上轻轻扣打以吸去残留液体，加入洗涤液（约280-300ul/孔），漂洗2-3次，每次3-5min；3. 封闭：按200-250ul/孔加入封闭液，室温2-3小时或37℃1-2小时，也可4℃封闭过夜，然后弃去孔内封闭液；4. 样品处理：用洗涤液或样品稀释液将待检样品(含未知抗原)稀释至所需浓度；5.标准液：用洗涤液或样品稀释液将标准液稀释至所需浓度（定性分析可省略本步骤）；6.加样：按排列顺序依次加入50-100ul/孔稀释好的标准液、处理过的待检样品、阴性对照及阳性对照，室温或37℃孵育30-60min；7. 洗板：同步骤2；8.加酶标抗体：酶标抗体的稀释按产品说明书，按50-100ul/孔加入新鲜配制的酶标抗体，室温或37℃孵育1小时；9. 洗板：同步骤2；10. 加底物液显色：按100-150ul/孔加入新配制的TMB底物溶液，室温避光反应15～30分钟。
11. 终止反应：于各反应孔中加入50ul的终止液。
12. 结果判定：可于白色背景上，直接用裸眼观察结果，反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。
也可在酶标仪上于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处测OD值。
检测时以空白对照孔调零后测各孔OD值，若样品孔中的OD值大于阴性对照孔的2.1倍，即为阳性。
方法二间接法（用于检测未知抗体）1. 包被：用包被缓冲液将已知抗原稀释至0.5～20μg／ml，按100ul/孔加入酶标板，4℃包被过夜，次日洗涤2-3次；2.洗板：次日弃去孔内液体，在纸巾上轻轻扣打以吸去残留液体，加入洗涤液（约280-300ul/孔），漂洗2-3次，每次3-5min；3. 封闭：按200-250ul/孔加入封闭液，室温2-3小时或37℃1-2小时，也可4℃封闭过夜，然后弃去孔内封闭液；4. 样品处理：用洗涤液或样品稀释液将待检样品稀释致所需浓度；5.标准液：用洗涤液或样品稀释液将标准液稀释至所需浓度（定性分析可省略本步骤）；6.加样：按排列顺序依次加入50-100ul/孔稀释好的标准液、处理过的待检样品(含未知抗体),阴性对照及阳性对照，室温或37℃孵育30-60min；7. 洗板：同步骤2；8.加酶标抗体：按50-100ul/孔加入新配制的酶标抗体（抗抗体），室温或37℃孵育1小时；酶标抗体的稀释按产品说明书；9. 洗板：同步骤2；10. 加底物液显色：按100-150ul/孔加入新配制的TMB底物溶液，室温避光反应15～30分钟。
大题简述elisa的操作流程与要求
大题简述elisa的操作流程与要求ELISA, or enzyme-linked immunosorbent assay, is a commonly used laboratory test to detect and measure antibodies in the blood. The process involves several steps that need to be followed carefully in order to obtain accurate results. ELISA plays a crucial role in diagnosing various diseases, monitoring treatment effectiveness, and researching new drugs or vaccines.ELISA的操作流程大致分为涂覆、孵育、洗板、添加酶标记二抗、洗板、底物反应和终止反应等多个步骤。
首先，将待检样品加入到酶标记的抗体涂覆的微孔板中。
然后，将该微孔板放置在37摄氏度的恒温箱中孵育一段时间，以便样品中的特定抗体与酶标记的抗体结合。
接着，通过洗板等步骤确保板上没有非特异性的结合物，然后加入底物使酶发生反应，评价待检样品中特定抗体的含量。
It is important to note that ELISA requires specific reagents and equipment, including microplates, antibodies, enzymes, and substrates. These supplies must be stored and handled properly to maintain their efficacy. Additionally, the operator needs to have a good understanding of the principles and techniques involved inELISA in order to interpret the results accurately. Any deviation from the standard protocol can lead to inaccurate or misleading results.使用ELISA进行实验时，需要进行质控和标准曲线的建立。
elisa操作步骤及注意事项
elisa操作步骤及注意事项以elisa操作步骤及注意事项为题，本文将为大家介绍elisa（酶联免疫吸附测定法）的操作步骤和注意事项。
一、操作步骤1. 准备工作在进行elisa实验前，需要准备好实验所需的试剂和仪器设备，包括酶标板、试剂盒、洗涤缓冲液、底物溶液、阻断缓冲液等。
同时，需要对实验室台面和仪器进行消毒，并佩戴好实验手套和口罩，以确保实验的准确性和安全性。
2. 样品处理将待测样品（如血清、尿液、细胞培养上清液等）和对照样品放置在室温下静置，使其达到室温后，进行稀释处理。
通常情况下，待测样品需要按照一定比例进行稀释，以确保其浓度处于检测范围之内。
3. 酶标板涂覆将酶标板中的亲和素或抗体溶液加入到孔板中，然后将其在4℃下静置过夜，使亲和素或抗体能够均匀地吸附在酶标板上。
4. 标准曲线制备将标准品按照一定比例稀释，以制备出一系列浓度递增的标准品溶液。
然后将这些标准品溶液依次加入已涂覆的酶标板孔中，孔位之间要保持一定的距离。
5. 样品孔加样将样品溶液加入到酶标板的样品孔中，注意每个孔的加样量要保持一致。
为了保证实验的准确性，通常会设置阳性对照孔和阴性对照孔，以验证实验的可靠性。
6. 孔板洗涤使用洗涤缓冲液对酶标板进行洗涤，去除未结合的物质和杂质。
洗涤时要注意洗涤液的温度和洗涤次数，以确保洗涤的充分彻底。
7. 酶标记物加入将酶标记的二抗或酶标记的亲和素加入到酶标板的孔中，使其与靶分子结合。
然后，将酶标板置于恒温摇床上，进行孵育反应，使酶标记物与靶分子发生特异性结合。
8. 反应终止通过加入反应终止溶液，使酶标记物的酶活性停止，并终止酶标记物与靶分子的结合。
终止溶液的选择要根据实验所使用的底物和酶标记物来确定。
9. 读板测定使用酶标仪或多功能酶标仪对酶标板进行测量，测定底物的反应产物的吸光度。
根据吸光度值，可以计算出样品中靶分子的浓度。
二、注意事项1. 严格控制实验条件在进行elisa实验时，需要严格控制实验条件，包括温度、湿度、时间等。
ELISA方法的及步骤
ELISA方法的及步骤ELISA（酶联免疫吸附法）是一种常用于检测目标分子的方法，被广泛应用于生物医学研究、临床诊断和生物工程等领域。
ELISA方法通过利用免疫试剂（如抗体）与待测物发生特异性结合，再通过酶的催化作用来检测和定量目标分子的存在。
1.血清或其他样品的制备：将待测样品（如血清、细胞上清液等）收集并处理，如离心去除固体颗粒物或红细胞。
将样品稀释至适当的浓度，以保证检测结果在测量范围内。
2.包被试剂的制备：将目标分子（如蛋白质、病毒等）或其相应的抗体溶解在缓冲液中，然后将溶液加入到固相（如酶标板）上，使目标分子或抗体固定在固相表面上。
接下来，将固相洗涤以去除未结合的试剂，防止非特异性结合的发生。
3.样品的添加：将制备好的样品加入到包被试剂的固相上。
样品中的目标分子或抗体（如抗原、抗体）与包被试剂表面的抗体或抗原发生特异性结合。
4.洗涤：将固相进行多次洗涤以去除未结合的样品成分。
洗涤步骤可以使用缓冲液，如PBS（磷酸盐缓冲液）或TBS（三氯乙酸盐缓冲液）。
5.二抗的添加：将与目标分子或抗体结合的复合物的稳定剂（例如辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗）加入到固相上。
二抗与前一步骤中的特异性结合复合物再次发生特异性结合，形成二级结合复合物。
6.洗涤：将固相多次洗涤以去除未结合的二级抗体。
7.发色反应：在固相上加入一种含氢过氧化物（如TMB）的底物。
该底物与HRP酶发生反应，生成可测量的色素产物。
发色反应的发生时间应根据实验需求进行控制，以确保准确的测量。
8.反应终止：通过向反应混合物中添加酸（如硫酸）或碱（如氢氧化钠）等溶液来终止发色反应。
终止反应后，反应混合物中的混浊液体会变为蓝色或黄色。
9.信号测量：通过光谱法（如吸光度法）测量混合物的光密度，来反映目标分子或抗体的含量。
使用酶标仪可以读取光密度值，并将其与标准曲线进行比较以确定目标物的浓度。
ELISA方法的优点包括高灵敏度、高特异性、易于操作和较少的试剂消耗。
ELISA操作流程
ELISA操作流程ELISA（受体结合酶联免疫吸附检测）是一种常用的生物化学实验技术，用于检测生物样品中特定抗原或抗体的存在。
该技术主要基于抗原-抗体特异性结合的原理，结合酶的反应可使目标分子在颜色、荧光或发光等性质上发生变化，从而实现定量或半定量的检测。
下面是ELISA的操作流程：1.涂布酶标板：将特异性或捕获性抗体溶液加入酶标板孔中，并在孔底表面吸附，形成抗体层，常用的方法为静置法或旋涂法。
吸附抗体的选择要考虑其特异性、纯度和稳定性。
2.阻断：在涂布之后，使用适当的阻断缓冲液封闭剩余的吸附位点，以避免非特异性结合。
3.样品孔：在吸附抗体的孔中加入待测样本，如血清、尿液或细胞培养上清。
一般来说，样品应该先经过稀释，以便在酶标板上形成可测的信号。
为了获得准确的结果，通常要进行样品的多倍稀释。
4.洗涤：通过将酶标板孔填满洗涤缓冲液，轻轻摇晃或用洗板机进行洗板，以洗去未固定的样品和其他成分。
洗涤过程至少重复3次，以确保非特异性结合物质的彻底去除。
5.次级抗体：将标记有酶的次级抗体加入孔中，使其与样品中的目标抗原或抗体结合。
次级抗体可以是针对特定物种IgG的抗血清，或是针对相对特异性的抗体，如蛋白A/G。
6.洗涤：再次进行洗涤步骤，以去除未结合的次级抗体。
7. 底物加入：向每个孔中加入染色底物，如TMB （tetramethylbenzidine），底物与酶反应后会在颜色上发生可见变化。
对于荧光ELISA或发光ELISA，将相应的底物加入。
8.反应停止：添加停止剂，如硫酸或酸，以停止酶的反应。
底物反应停止后，颜色会停在一定的反应时间点处。
9. 读取结果：通过光谱分析，使用酶标仪测定吸光度或荧光/发光的强度，以检测抗原或抗体的存在。
吸光度（Absorbance）与目标物质的浓度成正比。
10.数据分析：计算各标准品的吸光度值和待测样品的吸光度值，根据标准曲线或内部对照，计算出待测样品中目标物质的浓度。
总结：ELISA技术广泛用于生物医学研究和临床诊断，其操作流程简洁明了，通常需要进行涂布、阻断、样品孔、洗涤、次级抗体、底物加入、反应停止和结果读取等步骤。
ELISA操作规程
ELISA操作规程引言概述：ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种常用的生物化学实验技术，广泛应用于医学、生物学和生物化学等领域。
本文将详细介绍ELISA操作规程，并按照一、二、三、四、五这样的顺序，分为五个部份进行阐述。
一、试剂准备1.1 根据实验需要，准备ELISA板、酶标板液、洗涤缓冲液、样本稀释液等试剂。
1.2 检查试剂的有效期和储存条件，确保试剂的质量。
1.3 根据实验方案，按照规定的比例和方法，将试剂进行稀释和配制。
二、样本处理2.1 采集样本，并根据实验要求进行标记和编号。
2.2 根据实验方案，对样本进行预处理，如离心、稀释等。
2.3 确保样本的质量和数量符合实验要求，并进行必要的记录和标记。
三、板涂覆3.1 将ELISA板放置在工作台上，并按照实验方案要求，在每一个孔中加入特定抗原或者抗体。
3.2 保持ELISA板在适当的温度下孵育一段时间，以确保抗原或者抗体的吸附。
3.3 将孔中的液体倒出，并用洗涤缓冲液洗涤孔，以去除未吸附的物质。
四、标记物检测4.1 准备酶标记的抗体或者抗原，并按照实验方案要求进行稀释和标记。
4.2 将标记物加入到ELISA板的每一个孔中，并在适当的温度下孵育一段时间，使标记物与抗原或者抗体结合。
4.3 将孔中的液体倒出，并用洗涤缓冲液洗涤孔，以去除未结合的标记物。
五、结果分析5.1 加入底物溶液，使酶标记物发生可见的颜色反应。
5.2 在适当的时间内住手反应，并用酶标仪或者其他仪器测量吸光度。
5.3 根据实验方案和标准曲线，计算样本中目标物质的浓度或者活性。
总结：ELISA操作规程是进行ELISA实验的基本指南。
通过试剂准备、样本处理、板涂覆、标记物检测和结果分析等五个部份的详细阐述，可以确保实验的准确性和可重复性。
在操作过程中，需要严格遵守实验室的安全操作规范，并根据实验方案进行操作。
惟独正确操作，才干获得准确可靠的实验结果。
酶联免疫吸附测定法(ELISA) 标准操作规程
酶联免疫吸附测定法（ELISA）标准操作规程一、适用范围适用于实验室从事ELISA实验的实验技术人员和研究生。
二、操作规程1、标准品的配制：使用前在标准品中加入适量的去离子水，配成10ng/ml的母液，设标准品八管，第一管加入标本稀释液900ul，第二管至第八管加入标本稀释液500ul，在第一管中加入10ng/ml的标准品溶液100ul混匀后用加样器吸出500ul，移至第二管。
如此反复作对比稀释，从第七管中吸出500ul,弃出，第八管为空白对照。
2、检测程序：1）加样：每孔各加入标准品或待测样品100ul，将反应物充分混匀后置37℃120分钟。
2）洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干。
3）每孔中加入第一抗工作液100ul，将反应板充分混匀后置37℃60分钟。
4）洗板，同前。
5）每孔加酶标抗体工作液100ul。
将反应板置37℃30分钟。
6）洗板，同前。
7）每孔加入底物工作液100ul，置37℃暗处反应15分钟。
8）每孔加入100ul终止液混匀。
9）30分钟内用酶标仪在450nm处测吸光值。
3、结构计算与判断：1）所有OD值都应扣除空白后在进行计算。
2）以标准品浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上作图，画出标准曲线。
3）根据样品OD值在该曲线上查出相应的样品含量。
4、注意事项：1) 以上标准孔及样品空均建议做复孔，每次测定时均应做标准曲线。
2) 洗涤过程很关键，洗涤不充分将导致精确度误差及OD值错误升高。
3) 板条开封后剩余板条要密封好，保持剩余板条的干燥。
4) 本试剂盒应在4℃保存，仅用于科研，不用于临床。
5) 以上标准曲线的制作和加样流程仅供参考，具体检测时请按试剂盒说明书进行。
ELISA操作规程
ELISA操作规程一、引言ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种常用的实验技术，用于检测特定抗原或抗体的存在和浓度。
本文将详细介绍ELISA操作规程，包括试剂准备、样品处理、板涂覆、孵育、洗涤、检测和数据分析等步骤。
二、试剂准备1. 缓冲液的配制：根据实验需求，配制适当的缓冲液，例如PBS（磷酸盐缓冲液）、TBST（三倍磷酸盐缓冲液-Tween 20缓冲液）等。
2. 酶标板涂层抗体的制备：将特定抗体稀释至适当浓度，加入涂层液中，进行孵育。
三、样品处理1. 样品收集：收集待测样品，如血清、尿液等。
2. 样品预处理：根据实验要求，对样品进行适当的处理，如稀释、离心等。
四、板涂覆1. 涂层液加入：将酶标板中的孔加入涂层液，注意避免气泡的产生。
2. 孵育：将酶标板在适当温度下孵育一段时间，使抗体与孔壁结合。
五、孵育1. 样品加入：将经过处理的样品加入酶标板的孔中。
2. 孵育：将酶标板在适当温度下孵育一段时间，使待测物与抗体结合。
六、洗涤1. 洗涤液准备：配制适当的洗涤液，如TBST。
2. 洗涤：将洗涤液加入酶标板孔中，轻轻摇晃或使用洗涤器进行洗涤，去除未结合的物质。
七、检测1. 二抗加入：将特定的二抗加入酶标板的孔中，与待测物结合。
2. 孵育：将酶标板在适当温度下孵育一段时间，使二抗与待测物结合。
3. 洗涤：使用洗涤液洗涤酶标板，去除未结合的二抗。
4. 底物加入：将底物加入酶标板孔中，使酶与底物反应产生可测量的信号。
5. 反应停止：加入适当的反应停止液，停止底物反应。
八、数据分析1. 读板：使用酶标仪读取各孔的吸光度值。
2. 数据处理：根据实验设计和标准曲线，计算出待测物的浓度或相对含量。
3. 统计分析：对实验数据进行统计学分析，如均值、标准差、相关性等。
九、结果解读根据数据分析的结果，结合实验目的和背景知识，解读实验结果，得出相应的结论。
十、结论根据ELISA操作规程的步骤和结果解读，得出实验的结论，并讨论实验的可靠性和局限性。
Elisa方法
ELISA试剂盒protocol
一.试剂准备：
使用前,将所以时间放置室温15min，可以缓慢的摇晃加速沉淀溶解，稀释的工作液，需要立即使用；
二.标准品准备：用Reagent Diluent稀释
三.实验方法
1．用PBS稀释Capture Antibody 至工作浓度，马上用100ul/孔稀释的抗体铺平板,密封平板至室温抚育过夜;
2．吸干平板,每孔用400ul Wash buffer清洗,反复洗三次,最后一次洗版,倒置平板,放置于吸水纸上,充分吸干剩余的Wash buffer;
3．每孔中加入300ul Reagent Diluent 封闭板子至少1h;
4．重复步骤2,此时板子可以用于检测样品;
5．加100ul样品,标准品/孔,封板,室温抚育2h;
6．重复步骤2的洗板子过程;
7．加100ul detection Antibody(预先稀释),封闭,室温抚育20min(避光)；
8．重复步骤2的洗板子过程;
9．加100ul Streptavidin‐HRP 工作液，封闭，室温抚育20min(避光)；
10．重复步骤2的洗板子过程;
11．加100ul Substrate solution,室温抚育20min(避光)
12. 加50ul stop solution,彻底混合；
13. 用450nm测OD，540nm，570nm可以做校准波长；。
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ELISA protocol：
1.取5－10ul BMMY表达上清用0.05M NaHCO3稀释到100ul铺ELISA板，37度或室温振荡大于1小时。
注意一定要做一个GS115空菌株表达上清作为阴性对照，最好还找一个带有histag的蛋白作为阳性对照。
2.TPBS洗板3次，方法：倒掉铺板液，倒置于毛巾上轻轻拍打几次，加TPBS至满，重复。
3.加封闭液（TPBS加1％脱脂奶粉）350ml/孔，室温下放置40分钟－1小时，TPBS洗3次。
4.加封闭液稀释的histag一抗100ul/孔，ELISA板于室温振荡0.5－1小时，TPBS洗3次。
很多公司都有histag的单抗，个人觉得Qiagen和Pharmacia单抗较好，Invitrogen和Labvision的一般般，一般1：1000－5000稀释，不同公司的抗体效价不同。
5.加封闭液稀释的HRP标记的羊抗鼠二抗100ul/孔，ELISA板于室温振荡0.5－1小时，TPBS洗3次。
二抗很多公司有，国产的华美都可以，1：500－1000。
如果是HRP标记的histag抗体，不加二抗直接显色。
6.加入OPD显色液100ul/孔，避光反应约10－30分钟。
显色液配方：1mg/ml OPD于0.1M 柠檬酸钠，PH5.5，0.1%H2O2，－20度避光保存。
也可以用DAB显色。
7.1M H2SO4 100ul/孔终止反应，酶标仪测OD490nm。