MMF抑制大鼠同种心脏移植排斥反应及细胞间粘附分子-1表达的实验研究

同济医科大学硕士学位论文MMF抑制大鼠同种心脏移植排斥反应和细胞间粘附分子-1表达的实验研究姓名：龙刚申请学位级别：硕士专业：外科学指导教师：陈实1998.11.1同济医科大学学位论文ＭＭＦ抑制大鼠同种心脏移植捧斥反应和细胞间粘附分子．１表达的实验研究研究生龙刚导师陈实中文摘要第一部分大鼠同种心脏移植排斥反应中细胞间粘附分子．１表达的实验研究ｊ建立大鼠同种异位心脏移植模型，检测排斥反应期间移植心组织细胞间粘附分子－ｌ（ＩＣＡＭ－１）的表达。

共分４个实验组：未移植对照组、移植后３天组、移植后５天组及移植后７天组。

采集移植心组织样本行免疫组织化学和组织病理学检查，采用多媒体彩色图文分析系统对移植心脏组织１Ｃ＾Ｊｄ．１的表达进行定量检测。

结果表明正常心脏组织ＩＣＡＭ．１表达微弱。

排斥反应期间移植心组织毛细血管内皮细胞１ＣＡＭ－１的表达强度和数量明显增加，说明ＩｃＡＭ．１表达的水平与捧斥反应的发生和发展有关。

检测移植心脏组织ＩＣＡＭ．１的表达，比普通组织病理学检查可以提早２－３天发现捧斥反应的发生，有利于器官移植临床早期诊断和防治排斥反应。

／／第二部分ＭＭＦ抑制大鼠同种心脏移植排斥反应和细胞间粘附分子－ｌ表达！ｌ的实验研究～通过监测细胞阿粘附分子．１（ＩＣＡＭ．１）在大鼠移植心的表达，探讨ＭＭＦ（ＭｙｃｏｐｈｃｎｏｌａｔｅＭｏｆｏｔｉｌ）对移植心脏ＩＣＡＭ－１的表达和排斥反应有无抑制同济医科大学学位论文ｆ／作用。

实验共分４个组：未用药对照组根据不同时间分为２个亚组：移植后３天组、移植后５天组；ＭＭＦ治疗组根据不同的时间也分为２个亚组：移植后５天组、移植后１５天组。

用小鼠抗大鼠ＩＣＡＭ．１单克隆抗体（１Ａ２９）检测移植心组织ＩＣＡＭ．１的表达，标本用多媒体彩色图文分析系统定量测定。

未用药组移植心组织广泛表达ＩＣＡＭ．１且有大量淋巴细胞浸润。

ＭＭＦ治疗组移植心仅微弱表达ＩＣＡＭ．１，同时很少有淋巴细胞浸润．结果提示，ＭＭＦ显著抑制移植心１ＣＡＭ－ｌ的表达和淋巴细胞的浸润，明显延长移植、物的存活。

，关键词大鼠心脏同种移植细胞问粘附分子－１ＭＭＦ免疫抑制排斥反应２同济医科大学学位论文ＴｈｅＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＲｅｓｅａｒｃｈｏｆＩｎｈｉｂｉｔｉｎｇＥｆｆｅｃｔｏｎｔｈｅＲｅｊｅｃｔｉｏｎｏｆＲａｔＣａｒｄｉａｃＡＩＩｏｇｒａｆｔａｎｄｔｈｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＩｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒＡｄｈｅｓｉｏｎＭｏｌｅｃｕｌｅ－１ｂｙＭｙｃｏｐｈｅｎｏｌａｔｅＭｏｆｅｔｉｌＭⅢｌｔｅｒ：ＬｏｎｇＧａｎｇＤｉｒｅｃｔｏｒ：ＣｈｅｎＳｈｉＰａｒｔＩＴｈｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＩｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒＡｄｈｅｓｉｏｎＭｏｌｅｃｕｌｅ－１ｄｕｒｉｎｇｔｈｅＲｅｊｅｃｔｉｏｎｏｆＣａｒｄｉａｃＡｌｌｏｇｒａｆｌｉＩｌＲａｔＲａｔｈ吼ｅｒｏｔｏｐｉｃｃａｒｄｉａｃａｌｌｏｇｒａｆ＇ｔｍｏｄｅｌＷａＳｂｕｉｌｔｔｏｄｅｔｅｃｔｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｉ１１ｌ盯ｃｅｌｌｌｌｌ盯ａｄｈｅｓｉｏｎｍ０１ｅｃｌｌｌｅ－ｌＯＣＡＭ－１）ｉｎｈｖａｒｔｔｉｓｓｕｅｓｄｕｒｉｎｇｔｈｅｃｏｕｒｓｅｏｆｔｈｅｒｅｊｅｃｆｉｏｎ．ＡｌｌｔｈｅｒａｔｗｅｒｅｄｉｖｉｄｅＡｉｎｔｏ４ｇｒｏｕｐｓ：ｃｏｎｔｒｏｌ，ａｎｄ３，５，７ｄａｙｓｐｏｓｔｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎＴｈｅｇｒａｆｔｓｗｅｒｅｃｏｌｌｅｃｔｅｄｔｏｐｅｒｆｏｒｍｉｍｍｕｎｅ－ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓ砸ｅａｌａｎｄｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌｅｘａｍｉｎａｇｏｎ．ＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｏｆＩＣＡＭ・１ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｇｒａｆｔｓＷａＳｄｏｎｅｗｉｔｈＭｕｌｔｉｍｅｄｉａＰａｔｈｏｌｏｇｙＩｍａｇｉｎｇＡｎａｌｙｓｉｓＳｙｓｔｅｍ．ＦａｉｎｔＩＣＡＭ－１ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｗａｓｆｏｕｎｄｉｎｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐｃａｐｉＵ＝ｙｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓｏｆｇｒａｆｔｓｓｔｒｏｎｇｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄＩＣＡＭ－Ｉｄｕｒｉｎｇｔｈｅｅｐｉｓｏｄｅｏｆ蛹ｅｃｔｉｏｎ，ｗｈｉｃｈｏｃｃｅｒｅｄｔｗｏｏｒｔｈｒｅｅｄａｙｓｅａｒｌｉｅｒｔｈａｎｔｈｅｏｒｄｉｎａｒｙｌｌｉｓｔｏｌｏｇｉｃｓｔｕｄｙ．Ｔｌ［１ｅｓｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆＩＣＡＭ－１Ｗａｓｒｅｌａｔｅｄｔｏｔｈｅｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｒｅｊｃｃｔｉｏｎ，ｗｈｉｃｈＷａＳｈｅｌｐｆｕｌｔｏｔｈｅｏｆ鲫ｆＩｒｅｊｃｃｔｉｏｎｉｎｃｌｉｎｉｃａｌｗｏｒｋｓ．ｅａｒｌｙｄｉａｇｎｏｓｉｓ，ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎａｎｄｒｅｍｅｄｙ３同济医科大学学位论文ＰａｒｔＩＩ：ＭｙｃｏｐｈｅｎｏｌａｔｅＭｏｆｅｔｌｌ（ＭＭＦ）ｉｎｈｉｂｉｔｓｔｈｅｒｏｊｅｃｔｉｏｎｏｆｒａｔｃａｒｄｉａｃａ１１０掣ａｆＩａｎｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｉｎｔｃｒｃｃｌｌｎｌａｒａｄｈｅｓｉｏｎｍｏｌｅｃｕｌｅ－１（ＩＣＡＭ—１）ＴｏｅｘｐｌｏｒｅｗｈｅｔｈｅｒＭＭＦｈａｓｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇｅｆｆｅｃｔｏｎｔｈｅｒｅｊｅｃｔｉｏｎｏｆｃａｒｄｉａｃａｌｌｏｇｒａｇａｎｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＩＣＡＭ・１，ａｌｌｔｈｅｒａｔｓｗｏｒｅｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏｆｏｕｒｄｉｆｆｅｒｅｎｔｇｒｏｕｐｓ．Ｍｏｕｓｅａｎｔｉ－ｒａｔＩＣＡＭ一１ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙ（ＩＡ２９）ｗａｓｕｓｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔＩＣＡＭ—ｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｒｅｃｉｐｉｅｎｔｈｅａｒｔｓ．ＴｈｅｇｒｏｕｐｓｒｅｃｅｉｖｅｄｎｏＭＭＦｈａｄ谢ｄｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＩＣＡＭ－１．ｔｏｇｅｔｈｅｒｗｉｔｈｉｎｔｅｎｓｉｖｅｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎｏｆｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｒａｔｓＵｖａｔｃｄｗｉｔｈＭＭＦｏｎｌｙｄｉｓｐｌａｙｅｄｆａｉｎｔＩＣＡＭ－１ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｖｅｒｙｆｅｗｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ，ｗｈｉｃｈｓｈｏｗｅｄＭＭＦｃｏｕｌｄｒｅｄｕｃｅｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒａｄｈｅｓｉｏｎｍｏｌｅｃｎｌｅａｎｄｔｈｅｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎｏｆｌｙｍｐｈｏｃｙｔｃｓｉｎｇｒａｆｔｓｏｂｖｉｏｕｓｌｙａｎｄｐｒｏｌｏｎｇｇｒａｆｔｓｓｕｒｖｉｖａｌｇｒｅａｔｌｙＫｅｙＷｏｒｄｓ４ＩｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎＡｌｌｏ缸ａｎｓｐｌａｎｔａｔｌｏｎ同济医科大学学位论文第一部分大鼠同种心脏移植排斥反应中ＩＣＡＭ一１表达的实验研究研究生龙剐导师陈实排斥反应是器官移植失败的主要原因。

排斥反应的早期诊断、早期抗排斥治疗在临床器官移植中具有极其重要的意义。

细胞间粘附分子．１（ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌ＂ａｄｈｅｓｉｏｎｍｏｌｅｃｕｌｅ．１，ＩＣＡＭ．１）参与同种异体器官移植排斥反应并起到很重要的作用‘“２’３１。

本实验建立大鼠同种异位心脏移植模型，检测排斥反应前后移植心脏ＩＣＡＭ．１的表达，旨在探讨ＩＣＡＭ．１与排斥反应之间的关系，寻求早期诊断移植排斥反应的方法。

材料和方法一，动物：随机采用清洁级近交系封闭群大鼠，雄性Ｗｉｓｔａｒ大鼠为受者，体重２２０．２８０克，ＳＤ大鼠为供者，雌雄不拘，体重１８０－２２０克。

所有动物购自同济医科大学实验动物中心。

二，试剂：小鼠抗大鼠ＩＣＡＭ．１单克隆抗体（１Ａ２９）购自日本ＳＥＩＫＡＧＡＫＵ公司。

羊抗，ＦＲＩｇＧ－Ｆｒｒｃ购自卫生部武汉生物制品研究所。

同济医科大学学位论文三，分组：建立Ｗｉｓｔａｒ对ＳＤ大鼠同种异位心脏移植模型共６例，每天记录大鼠腹部移植心脏的搏动。

移植心停搏为功能丧失的标志，记录移植心存活时间，取其中位数，作为判断排斥反应发生时间及随后进一步分组的依据。

ｌ，对照组未行移植术大鼠（ｎ＝６）。

２，移植组根据移植术后处死天数不同分为３个亚组（移植后３、５、７天，每组ｎ－６）。

四，排斥反应的诊断和分级：采用Ｓｔａｎｆｏｒｄ标准ｐｌ对移植心脏排斥反应进行组织学分级：０级：无排斥ｌ级：ｌＡ个别淋巴细胞浸润ｌＢ散在少量的淋巴细胞浸润２级：单灶性侵袭性淋巴细胞浸润或伴有灶性心肌细胞损害３级：３Ａ多灶性侵袭性淋巴细胞浸润或伴有心肌细胞损害３Ｂ弥漫性炎症伴有心肌坏死４级弥漫性多类型细胞浸润伴有出血、水肿和坏死五，大鼠异位心脏移植术和样本的采集：用陈忠华【５】的方法，将供心主动脉与受者腹主动脉，供心肺动脉与受者下腔静脉分别行端侧吻合。

血流再通后移植心很快复跳，总缺血时间不超过６０分钟。

以手术当天为零天记录。

术后每日一次腹腔注射青霉素４０万单位，连续７日，预防感染。

移植后３、５、７天分别处死大鼠切取移植心脏，标本分为两部分，一部分新鲜心脏组织迅速置液氦中冷冻，取出液氨中心脏组织冻块，在恒冷切片机（．２５＂Ｃ）中切成６ｐｍ切片，丙酮固定ｌＯ．１５分钟备用。

另一部分用１０％６同济医科大学学位论文甲醛固定，石蜡包埋切片，ＨＥ染色光镜观察。

六，免疫组化检查及图象分析定量研究：采用间接免疫荧光法，冰冻组织切片用磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ）洗一次，加小牛血清封闭非特异性抗原，３７＂（２温育１５．２０分钟取出，滴加以１：７５稀释的小鼠抗大鼠ＩＣＡＭ一１单抗（１Ａ２９），４℃下过夜。

ＰＢＳ液洗３分钟Ｘ３次，滴加以ｌ：１６稀释的羊抗小鼠ＩｇＧ－ＦＩＴＣ，３７＂Ｃ温育２０．３０分钟，ＰＢＳ液洗３分钟Ｘ３次，双蒸水洗３分钟Ｘ２次，缓冲甘油封片。

在荧光显微镜下放大４００倍摄取图象，用ＭＰＩＡＳ．５００多媒体彩色图文分析系统，以ｏ．７８５ｕｍ象紊点长在１．７１５×１０５ｕｍ２测量窗下进行图象分析，将细胞图象在同一光源下吸收光的数值作为光密度，以积分光密度（即各个单独探测的图象象素点密度分布的总和）表示细胞化学反应强度量的变化。

七，统计学处理：所有数据应用ｔ检验进行差异显著性分析。

通过两两比较，当Ｐ值＜０．０５时认为差异具有显著性意义。

结果本实验心脏移植模型记录移植心存活的时间分别为１０、７、１１、８、８、ｌｏ天，移植心存活时间中位数是９天。

移植心病理组织学改变：移植术后第３天移植心可见极少数教在淋巴细胞漫润，组织结构基本正常（图１，２）。

第５天没润的淋巴细胞数量明７同济医科大学学位论文显增加，出现心肌间质水肿，灶性心肌坏死（图３，图４）。

第７天表现为弥漫性淋巴细胞漫润，间质水肿，大片心肌坏死（图５）。

各组心脏排斥反应组织学分级见表１。

表ｌ移植各组排斥反应组织学分级组织学分级Ｐ值为移植各组与对照组比较移植心１ＣＡＭ．１的表达：对照组大鼠心脏组织ＩＣＡＭ．１的表达微弱（图６）。

术后第３天移植心毛细血管内皮细胞即可见ＩＣＡＭ．１明显表达（图７）。