广西地区猪水肿病流行病学调查与病原研究

收稿日期:20070411;修回日期:2007207223基金项目:广西科学研究与技术开发计划项目(桂科攻0235001-2)作者简介:杨　威(19572),男,副研究员,硕士研究生1广西地区猪水肿病流行病学调查与病原研究杨　威1,谢永平1,陈泽祥1,李　军1,盘宝进2,许力干1,潘　艳1(1.广西壮族自治区兽医研究所,广西南宁530001;2.广西出入境检验检疫局,广西南宁530021)中图分类号:S858.28文献标识码:B文章编号:100427034(2007)102006603 猪水肿病是由某些血清型的大肠杆菌引起的以全身或局部麻痹、共济失调以及面部水肿为主要特征的传染病,发病突然,死亡率高。

近年来,广西地区猪水肿病的发病率和死亡率也呈上升趋势,已成为危害广西地区养猪业的一种重要传染病。

因此,有必要对广西地区猪水肿病的流行病学进行深入细致的调查,为制定切实可行的综合防制措施提供可靠的依据。

1　材料和方法1.1　试剂及仪器微量生化反应管,购自杭州天和试剂公司;细菌琼脂粉、麦康凯培养基、伊红美兰培养基和三糖铁培养基,购自北京陆桥技术有限公司;血琼脂培养基,自制;药敏纸片,自制或购自上海伊华临床医学科技公司;大肠杆菌单因子血清,购自中国兽药监察所;Taq 酶、d NTP 、饱和酚和细菌质粒抽提试剂盒,购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

1.2　试验动物健康N I H 小鼠[体重(21.9±2.85)g],购自广西中医学院动物实验室;35日龄健康断奶仔猪,购自广西畜牧品种改良站种猪场。

1.3　调查方法2002年至2005年间,对广西壮族自治区10个市、县的200个猪场采取询问的方式,以发病猪年龄、临床症状等为指标进行调查。

对调查中疑似为猪水肿病的患猪进行临床观察和病理剖检,详细记录病理变化并采集病理组织。

1.4　实验室检验1.4.1　细菌分离和培养特性　无菌采取病猪的心血、淋巴结、水肿液,分别划线接种于营养琼脂、鸡血琼脂培养基上,37℃培养24h,观察菌落形态,涂片,革兰染色,镜检。

将分离到的单个菌落接种到麦康凯、伊红美兰和三糖铁培养基上,观察细菌菌落形态和培养特性。

1.4.2　细菌的生化鉴定　将疑似大肠杆菌的细菌分别接种到微量生化反应管中,37℃培养观察。

1.4.3　细菌的血清型鉴定　用大肠杆菌单因子血清进行平板凝集试验。

1.4.4　动物感染试验　将经过血清型鉴定的细菌制成5×1010CF U /mL 的悬液,分别给N I H 小鼠和断奶仔猪腹腔注射,剂量分别为按体重0.02mL /g 和2mL /头;对照组按同样剂量腹腔注射灭菌生理盐水,观察动物的发病情况。

1.4.5　体外抑菌试验　采用琼脂扩散试验纸片法。

试验结果判定标准:抑菌圈直径(Ф)>15mm 为高度敏感,10mm ≤Ф≤15mm 为中度敏感,Ф<10mm 为不敏感。

1.4.6　细菌质粒DNA 指纹图谱法分析　用细菌质粒抽提试剂盒对所分离的大肠杆菌进行质粒抽提后,于0.7%琼脂糖凝胶中点样电泳,E B 染色,观察,用凝胶成像系统观察,拍照。

1.4.7　志贺样毒素基因的检测　对分离到的大肠杆菌进行DNA 抽提和志贺样毒素基因的检测。

引物为S LT -Ⅱv15′-AGT AT CGGGG AG AGG ATGGTG -3′;S LT -Ⅱv25′-CAGT CATTCCTGTCAACTG AGC -3′。

预计扩增片段大小为476bp 。

PCR 反应采用在50μL 反应体系,其中模板DNA 1μL,10×PCR Buffer 5μL,d NTP 2μL,Mg Cl 23μL,Taq DNA 聚合酶0.5μL,上游、下游引物各1μL 。

PCR 反应条件为95℃5m in;94℃1m in,55℃1m in,72℃1m in,共30个循环;72℃10m in 。

取5μL PCR 产物在1%琼脂糖凝胶中电泳,E B 染色,用凝胶成像系统观察,拍照。

2　结果2.1　广西地区猪水肿病的流行病学调查结果调查结果表明,广西各地普遍存在猪水肿病,主要危害断奶仔猪,引起仔猪全身或四肢麻痹,共济失调和面部水肿,严重者急性死亡。

病理变化主要是头颈部皮下水肿,切开后呈胶胨样;脑回、脑沟分界不明显,并有出血;胃壁水肿、出血;肠系膜水肿及淋巴结水肿、出血;发病率为18.2%,病死率为48.8%。

2.2　细菌的分离和培养特性从广西不同地区50多个患猪水肿病猪群中分离到大肠杆菌162株。

分离株为革兰阴性杆菌,在普通66Heil ongjiang Ani m al Science and Veterinary Medicine №102007营养琼脂平板上生长呈灰白色、半透明、表面隆起、光滑、湿润、边缘整齐的圆形菌落,直径13mm;麦康凯培养基上生长成粉红色菌落;伊红美兰培养基上生长菌落呈紫黑色,带金属光泽;能使三糖铁斜面变黄,低柱产气,但不产生H2S;血琼脂平板上多数菌株溶血,少数菌株不溶血。

2.3　细菌的生化鉴定结果(见表1)表1　分离菌株的生化试验结果试验项目结果试验项目结果试验项目结果葡萄糖+海藻糖+吲哚+果糖+侧金盏醇-/+氧化酶-鼠李糖+甘露糖+H2S-木糖+山梨醇-蔗糖+麦芽糖+肌醇-M1R1+乳糖-V.P.-明胶+ 注:“+”表示阳性,“-”表示阴性。

2.4　细菌的血清型鉴定采用大肠杆菌单因子血清对分离株进行了血清型鉴定,共鉴定出158株,分属34个血清型,结果见表2。

表2　猪大肠杆菌血清型鉴定结果血清型菌株数量/株占总菌株的比例/%O138322013O9127.6O1398 5.1O137、O60、O21各7414 O147、O131、O101、O18、O157、O15各6 3.8 O8、O24、O64、O85各5 3.2O5、O7、O119各4 2.5O413 1.9 O149、O141、O127、O123、O115、O100、O86、O77、O65、O55、O45、O35、O29、O2各10.6 2.5　动物感染试验分别选取血清型为O9、O100、O139、O138、O123、O147、O60、O101、O147、O21、O157、O5等共78株大肠杆菌菌液(5×1010CF U/mL)0.2mL腹腔接种10只N I H小鼠后,所有试验菌株对N I H小鼠致死率为100%,并从死亡N I H小鼠的肝脏分离到该菌。

选取血清型为O147、O60、O139、O138的5株大肠杆菌(5×1010CF U/mL) 2mL经腹腔注射断奶仔猪后,仔猪出现呕吐、肌肉震颤等症状;其中O147、O139、O138菌株对仔猪的致死率为100%,O60菌株对仔猪的致死率为50%。

2.6　体外抑菌试验选取经过血清型鉴定的34个血清型大肠杆菌中的104株进行体外药敏试验,结果表明从广西地区分离的大肠杆菌致病菌株耐药性强、耐药谱广。

所有试验药物都发现耐药菌株。

除头孢三嗪、头孢西丁、丁胺卡那霉素、复方氟苯尼考、痢克星、痢疾一针清6种药物尚对60%以上菌株高度敏感外,其他药物均产生较严重的耐药性。

一些临床常用药物,如阿莫西林、复方新诺明、青霉素、强力霉素、利福平、卡那霉素、恩诺沙星等只对40%左右的菌株有抑菌效果; 50%以上的菌株对氟哌酸、环丙沙星、链霉素、庆大霉素、痢特灵等不敏感。

2.7　细菌质粒DNA指纹图谱法分析选取17株血清型为O60、O138、O139、O131、O101、O9、O147、O77的大肠杆菌抽提质粒后,经凝胶电泳可以看到各个菌株分别含有1～6条大小不等的质粒带,而且都有1条大小相等的质粒带(见图1～3)。

M.λDNA H indⅢ; 1.GP20-3;2.GP20-8; 3.GP6-1;4.GP7-1;5.GP24-1;6.GP25-1;7.GP18-5。

图1　1～7株大肠杆菌质粒图谱M.λDNA H indⅢ;8.GP18-9;9.GP26-1;10.GP5-1;11.GP8-3;12.GP3-3;13.GP18-1;14.GP27-5;15.GP27-1;16.GP16-4。

图2　8～16株大肠杆菌质粒图谱M.λDNA H indⅢ;17.GP16-6。

图3　第17株大肠杆菌质粒图谱2.8　志贺样毒素Ⅱ型突变体基因的检测根据已知志贺样毒素Ⅱ型突变体基因(S LT-Ⅱe)的保守性核苷酸序列,设计合成1对特异性引物,以S LTⅡv 基因重组质粒为阳性对照,大肠杆菌DH5α为阴性对76　《黑龙江畜牧兽医》2007年第10期照,对分离的10株大肠杆菌进行扩增,其中2株菌株(O 139)扩增出特异性476bp 的S LT Ⅱv 片段与阳性对照一致,阴性对照DH5α未扩增出DNA 条带,表明这2株菌株含有S LT Ⅱv 基因(见图4)。

1.DL2000Marker;2.阳性质粒对照;3.GP 8-3;4.GP 26-1;5.DH5α阴性对照。

图4　扩增S LT Ⅱv 基因的PCR 结果3　讨论(1)2002年至2005年间,对广西地区10个市、县的200个猪场的猪水肿病调查结果表明,广西各地普遍存在该病,一年四季均有发生,但一般以每年4—7月份和9—10月份多发,主要危害断奶仔猪,发病率为18.2%,病死率为48.8%。

从广西不同地区50多个患病猪群中分离到大肠杆菌162株,经动物感染试验证实为致病性大肠杆菌,对其中158株进行了血清型鉴定,共分为34个血清型,其中以O 138、O 9、O 139为主。

(2)体外抑菌试验结果表明,从广西不同地区分离到的致病性大肠杆菌对药物的敏感性差别很大,所有试验药物都发现有耐药菌株。

由于分离菌株的耐药性强、耐药谱广,因而给临床用药带来了极大的困难,这是导致临床治疗失败的主要原因。

因此,在临床用药上应有针对性,各养殖场应根据药敏试验结果选择敏感药物来防治疾病,否则不仅会造成治疗失败,更为严重的是大肠杆菌可以通过其耐药质粒的传递致使耐药菌株不断蔓延扩大,对人医临床用药构成潜在威胁。

(3)本试验分离到的17株大肠杆菌指纹图谱显示,所有菌株都含有1条大小相同的质粒带,这提示了广西地区近年来流行的猪水肿病主要是由在遗传学上具有高度同源相关性的大肠杆菌的广泛流行所引起。

选用1～2个猪场的分离菌制成灭活苗,用于其他猪场,猪也可获得同样的免疫力,这也在一定程度上证明了病原菌的相关性。

从图谱上还可以发现,流行菌株间也存在一定的差异,即使是来源于同一猪群的菌株,其质粒图谱也不完全相同。

这种差异可能是细菌在传播过程中发生了分子遗传学的演化所致。

(4)从猪水肿病病料中分离的10株大肠杆菌,用特异性的S LT Ⅱv 引物进行PCR 扩增,从2株中扩增出目的片段。