毕赤酵母表达
毕赤酵母表达知识归纳
毕赤酵母表达知识归纳1a.配制500×BIOTIN stock solution（0.02％）有这么3种方案：1、懒人是将Biotin直接溶在去离子水中，放过夜，基本就能溶；2、急性子是将溶液配成0.02N的NaOH，就很容易溶解了；3、水浴加热，温度不能高于50度。
D－生物素是具有生物活性的生物素，也就是vitaminH。
在毕赤酵母代谢过程中，作为多种酶的辅基起作用。
天然培养基中一般可以不单独添加，因为YNB中、酵母粉、蛋白胨中均含有一定量的生物素，但是做高密度发酵还是必须要添加的。
b.有几个比较迷惑的问题请教大家：(很典型的小问题）1、制感受态细胞，OD多少比较好？pyrimidine 战友的方法：取1mlGS115过夜培养物(OD约6-10) 分装到1.5ml EP管中。
说明书还有一些文献是说在1.3左右效率高，再高了效率会很低2、关于高效转化法，文献说用(LiAc)，而invitrogen的说明书说转化毕赤酵母用(LiAc)没用，要用LiCl。
Lithium acetate does not work with Pichia pastoris. Use only lithium chloride.3、YNB到底能高温灭么？有的说能有的说不能。
过滤灭菌的怎么操作？我是把滤器装好膜绑到瓶口用纱布盖上，报纸包上，瓶盖放烧杯里单灭。
然后把配好的溶液用注射器一点点推进去。
4、葡萄糖为什么在YPD里一起灭颜色很深，单灭则不会。
该115度还是121度灭？网上搜了下，都有人用！5、电转化参数用400欧还是200欧？有的用400，有的还专门说不是用400。
都是从园里看到的！电击参数：1.5KV，25uF，200欧姆（不是400）6、电转后，在MD平板上长的应该就是整合了目的基因的重组子了吧？如果不想筛高拷贝的，是否PCR验证一下即可？网友的回答：ynb最好不灭菌，我是0.22um过滤处理的。
invitrogen手册上可以灭菌的。
毕赤酵母表达经验总结
毕赤酵母表达经验总结甲醇酵母表达系统有不少优点，其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表达系统最为人熟知，并广泛应用于外源蛋白的表达。
虽然说酵母表达操作简单表达量高，但是在实际操作中，并不是每个外源基因都能顺利得到高表达的。
不少人在操作中会遇到这样那样的问题，生物通编者特地收集了部分用户在使用EasySelect Pichia Expression System这个被誉为最简单的毕赤酵母表达的经典试剂盒过程中的心得体会。
其中Xiang Yang是来自美国乔治城大学（Georgetown University）Lombardi癌症中心（Lombardi Cancer Center），部分用户来自国内。
甲基酵母部分优点与其他真核表达系统比较与原核表达系统比较1.属于真核表达系统，具有一定的蛋白质翻译后加工，有利于真核蛋白的表达优点-+2.AOX强效启动子，外源基因产物表达量高，可以达到每升数克表达产物的水平++++3.酵母培养、转化、高密度发酵等操作接近原核生物，远较真核系统简单，非常适合大规模工业化生产。
+++=4.可以诱导表达，也可以分泌表达，便于产物纯化。
=+5.可以甲醇代替IPTG作为诱导物，部分甲醇酵母更可以甲醇等工业产物替代葡萄糖作为碳源，生产成本低+++++ 表示优胜于；- 表示不如；= 表示差不多EasySelect Pichia Expression System产品性能：优点——使用简单，表达量高，His-tag便于纯化缺点——酵母表达蛋白有时会出现蛋白切割问题全面产品报告及心得体会：巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是一种能高效表达重组蛋白的酵母品种，一方面由于其是属于真核生物，因此表达出来的蛋白可以进行糖基化修饰，另一方面毕赤酵母生长速度快，可以将表达的蛋白分泌到培养基中，方便蛋白纯化。
毕赤酵母表达载体pPICZ在多克隆位点（MCR）3'端带有his-tag和c-myc epitopes，这些tag有利于常规检测和纯化，而且在MCR5'端引入了alpha factor（α-factor）用以增加表达，并且在表达后α-factor 可以自动被切除。
毕式酵母表达常见问题及解析
毕式酵母表达常见问题及解析点击次数：433 作者：佚名发表于：2008-08-27 15:20转载请注明来自丁香园1、问：我用毕式酵母表达一个27KD的蛋白，小量表达并做SDS－PAGE有一条类似三聚体的条带。
用大量表达，表达上清用镍柱进行亲和层析，在FPLC上可以看到一个大峰，但跑电泳却没有发现条带，为什么呢？请赐教参考见解：你在大量表达后有没有跑电泳检测?表达上清用镍柱亲和层析后洗脱液有没有电泳检测?你首先要做的是:1,确定你的蛋白确实有表达;2,亲和层析是表达的蛋白确实被洗脱下来了.然后再考虑FPLC的事.在FPLC上可以看到一个大峰，但跑电泳却没有发现条带，可能的原因有：1，上样时没有目的蛋白，可能是1)没表达2)亲和层析时没洗脱或是穿透了；2，目的蛋白结合在FP LC柱子上没被洗脱；3，目的蛋白穿透FPLC柱子，你在FPLC上看到的大峰可能是盐分峰；4，电泳时没跑好,目的蛋白没被检测到.FPLC大峰也可能是目的蛋白峰，它的吸收值有多少？不要看与基线相比的高度,要看吸收值，如果吸收值不高的话就是蛋白的浓度太低,浓缩后再跑电泳。
2、问：我现在做的是裂殖酵母表达，表达载体pesp-2,酵母菌珠sp-q01.说明只提供用化学转化法，但我转化了好几次都没有结果，是否也可以用电转化，在多克隆位点把质粒线性化？参考见解：其实无论是那种类型的酵母表达，转化方法基本是一制的。
化学转化法对酵母转化讲就不是很高，这里你可以用电转的。
查一下以前别人的讨论，看看电转化方法，效率提高了，筛选的希望就大些了由于筛选表达酵母的时间比较长，两个方案同时做应该来的及的至于线性化，对于电转是要做的步骤，这是为了后面定位重组整合。
3、问：我做毕赤酵母分泌表达,想问做阴性对照的是应该用加甲醇前的上清还是用一直不加甲醇摇瓶同样时间的上清呢?参考见解：对于阴性对照我一般都用转了不含基因的原始质粒（比如９K等）的菌作为对照，诱导过程中同样加入甲醇，诱导的时间均一样，每次样品都会有一个对照。
毕赤酵母表达系统使用心得
毕⾚酵母表达系统使⽤⼼得Pichia酵母表达系统使⽤⼼得甲醇酵母表达系统有不少优点，其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表达系统最为⼈熟知，并⼴泛应⽤于外源蛋⽩的表达。
虽然说酵母表达操作简单表达量⾼，但是在实际操作中，并不是每个外源基因都能顺利得到⾼表达的。
不少⼈在操作中会遇到这样那样的问题，收集了部分⽤户在使⽤EasySelect Pichia Expression System这个被誉为最简单的毕⾚酵母表达的经典试剂盒过程中的⼼得体会。
其中Xiang Yang是来⾃美国乔治城⼤学（Georgetown University）Lombardi癌症中⼼（Lombardi Cancer Center），部分⽤户来⾃国内。
+ 表⽰优胜于；- 表⽰不如；= 表⽰差不多EasySelect Pichia Expression System产品性能：优点——使⽤简单，表达量⾼，His-tag便于纯化缺点——酵母表达蛋⽩有时会出现蛋⽩切割问题全⾯产品报告及⼼得体会：巴斯德毕⾚酵母（Pichia pastoris ）是⼀种能⾼效表达重组蛋⽩的酵母品种，⼀⽅⾯由于其是属于真核⽣物，因此表达出来的蛋⽩可以进⾏糖基化修饰，另⼀⽅⾯毕⾚酵母⽣长速度快，可以将表达的蛋⽩分泌到培养基中，⽅便蛋⽩纯化。
毕⾚酵母表达载体pPICZ 在多克隆位点（MCR ）3'端带有his-tag 和c-myc epitopes ，这些tag 有利于常规检测和纯化，⽽且在MCR5'端引⼊了alpha factor （α-factor ）⽤以增加表达，并且在表达后α-factor 可以⾃动被切除。
在进⾏克隆的时候，如果你选择的是EcoRI ，那么只需在⽬标蛋⽩中增加两个氨基酸序列即可完成。
另外pPICZ 系列选⽤的是Zeocin 抗⽣素作为筛选标记，⽽诱导表达的载体需要甲醇——甲醇⽐⼀般⽤于⼤肠杆菌表达诱导使⽤的IPTG 便宜。
毕赤酵母表达操作手册(精译版)
毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒用于在含多拷贝基因的毕赤酵母菌中表达并分离重组蛋白综述：基本特征：作为真核生物，毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点：如蛋白加工、折叠、翻译后修饰等。
不仅如此，操作时与E.coli及酿酒酵母同样简单。
它比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价，且表达水平更高。
同为酵母，毕赤酵母具有与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点，且它的外源蛋白表达水平是后者的十倍以至百倍。
这些使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达系统。
与酿酒酵母相似技术：许多技术可以通用：互补转化基因置换基因破坏另外，在酿酒酵母中应用的术语也可用于毕赤酵母。
例如：HIS4基因都编码组氨酸脱氢酶；两者中基因产物有交叉互补；酿酒酵母中的一些野生型基因与毕赤酵母中的突变基因相互补，如HIS4、LEU2、ARG4、TR11、URA3等基因在毕赤酵母中都有各自相互补的突变基因。
毕赤酵母是甲醇营养型酵母：毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源。
甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛，还有过氧化氢。
为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在一个特殊的细胞器－过氧化物酶体－里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。
由于醇氧化酶与O2的结合率较低，因而毕赤酵母代偿性地产生大量的酶。
而调控产生醇过氧化物酶的启动子也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子。
两种醇氧化酶蛋白：毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶－AOX1及AOX2。
细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1基因产物。
甲醇可紧密调节、诱导AOX1基因的高水平表达，较典型的是占可溶性蛋白的30%以上。
AOX1基因已被分离，含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的基因的表达。
AOX2基因与AOX1基因有97%的同源性，但在甲醇中带AOX2基因的菌株比带AOX1基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离Muts菌株。
表达：AOX1基因的表达在转录水平受调控。
毕赤酵母表达系统资料整理
毕赤酵母表黑系统之阳早格格创做Mut+战Muts毕赤酵母中有二个基果编码醇氧化酶——AOX1及AOX2，细胞中大普遍的醇氧化酶是AOX1基果产品，甲醇可稀切安排、诱导AOX1基果的下火仄表黑，较典型的是占可溶性蛋黑的30%以上.AOX1基果调控分二步：压制/去压制体制加诱导体制.简朴去道，正在含葡萄糖的培植基中，纵然加进诱导物甲醇转录仍受压制.为此，用甲醇举止劣化诱导时，推荐正在苦油培植基中培植.注意纵然正在苦油中死少(去压制)时，仍缺乏以使AOX1基果达到最矮火仄的表黑，诱导物甲醇是AOX1基果可辨表黑火仄所必须的.AOX1基果已被分散，含AOX1开用子的量粒可用去促进编码中源蛋黑的手段基果的表黑.AOX2基果与AOX1基果有97%的共源性，然而正在甲醇中戴AOX2基果的菌株比戴AOX1基果菌株缓得多，通过那种甲醇利用缓缓表型可分散Muts菌株.正在YPD(酵母膏、蛋黑胨、葡萄糖)培植基中，不管是Mut+仍旧Muts其正在对付数期删殖一倍的时间约莫为2h.Mut+战Muts菌株正在不甲醇存留的情况下死少速率是一般的，存留甲醇的情况下，Mut+正在对付数期删殖一倍的时间约莫为4至6个小时，Muts正在对付数期删殖一倍的时间约莫为18个小时.菌株GS115、X-33、KM71战SMD1168的辨别GS115、KM71战SMD1168等是用于表黑中源蛋黑的毕赤酵母受体菌，与酿酒酵母相比，毕赤酵母不会使蛋黑过糖基化，糖基化后有好处蛋黑的溶解或者产死粗确的合叠结构.GS115、KM71、SMD1168正在组氨酸脱氢酶位面(His4)有突变，是组氨酸缺陷型，如果表黑载体上携戴有组氨酸基果，可补偿宿主菌的组氨酸缺陷，果此不妨正在不含组氨酸的培植基上筛选变化子.那些受体菌自收突形成组氨酸家死型的概率普遍矮于10-8.GS115表型为Mut+，沉组表黑载体变化GS115后，少出的变化子大概是Mut+，也大概是Muts(载体与代AXO1基果)，不妨正在MM战MD 培植基上审定表型.SMD1168战GS115类似，然而SMD1168基果组中的Pep4基果爆收突变，是蛋黑酶缺陷型，可落矮蛋黑酶对付中源蛋黑的落解效率.其中X-33由于是家死型，果此耐受性比较佳，如果担心变化率的话不妨思量那种酵母菌，而X33与GS115一般皆是属于MUT＋表示型，也便是道不妨正在含甲醇的培植基中赶快死少，然而是传闻会对付中源基果表黑灵验率，KM71的亲原菌正在粗氨酸琥珀酸裂解酶基果(arg4)有突变，正在不含粗氨酸的培植基中不克不迭死少.用家死型ARG4基果(约2kb)拔出到克隆的家死型AOX1基果的BamHI(AOX1基果15/16暗号子)及SalI(AOX1基果227/228暗号子)位面，与代了AOX1基果16-227暗号子，此结构变化至KM71亲原菌(arg4his4)中，分散爆收KM71 MutsArg+His-菌株，Arg+变化子遗传领会隐现家死型AOX1被aox1::ARG4结构所与代，所以KM71所有变化子皆是Muts表型.AOX1位面不被真足缺得，表面上可用您的手段结构通过基果与代要领替换aox1::ARG4结构，那样沉组菌株的表型是His+MutsArg-，那表示着沉组菌株死万古需粗氨酸.然而仅增加粗氨酸本去不克不迭真足缓战arg4突变的效率，arg4菌株正在含粗氨酸的最小培植基中不克不迭很佳天死少.果此不推荐正在KM71中通过与代aox1::ARG4结构去赢得His＋变化子.普遍去道，如果是胞内表黑，应尽管用Muts细胞，那样得到的蛋黑产品中醇氧化酶蛋黑量较少而手段蛋黑量相对付较多，使下游杂化更易举止.而对付于分泌蛋黑的表黑，无论是甲醇利用缓(Muts)仍旧甲醇利用快(Mut+)的细胞皆可应用.基果沉组Pichia.pastoris酵母菌体内无天然量粒，所以表黑载体需与宿主染色体爆收共源沉组，将中源基果表黑框架调整于染色体中以真止中源基果的表黑，包罗开用子、中源基果克隆位面、末止序列、筛选标记表记标帜等.细菌内共源沉组被认为是沉组量粒构修历程的易面，果为已线性化的环状量粒之间爆收共源沉组的几率非常矮，所以沉组变化载体必须用特定的节制性内切酶举止线性化处理.那种处理的手段是预防随机拔出沉组时量粒正在功能区断开，制成手段基果表黑得活，让共源沉组以指定的办法爆收.表黑载体主要分为以下几类：(1)胞内表黑载体主要有pHIL-D2、pA0815、pPIC3K、pPICZ、pHWO10，pGAPZ、pGAPZa(Invitrogen)等.该类载体不妨将手段基果表黑正在胞内，不妨预防毕赤酵母的糖基化，主要符合于那些不克不迭被糖基化相闭基果的表黑；(2)分泌型表黑载体主要有pPIC9、pHIL-S1、pPICZα、pYAM75P等.由于毕赤酵母自己的泌内源蛋黑非常少，将中源蛋黑分泌到胞中，非常有好处手段蛋黑量的杂化及聚集.时常使用的分泌的旗号序列主假如由89个氨基酸组成的α接配果子(α-factor)的带领；(3)多拷贝拔出表黑载体如pPIC9K，pPIC3.5K.正在某些情况下，毕赤酵母中沉组基果多拷贝调整可减少所需蛋黑的表黑量.该载体均可用于正在体内(pPIC3.5K, pPIC9K)或者体中(pAO815)爆收并分散多拷贝拔出，共时可检测减少沉组基果的拷贝数是可减少蛋黑表黑量.体内调整可通过下遗传霉素抗性筛选大概的多拷贝拔出，而体中调整可通过对接爆收中源基果的串联拔出.正在GS115中筛选His+Mut+变化子：用SalI或者StuI线性化量粒变化GS115后，大多正在His4位面上爆收沉组，大普遍变化子是Mut+表型；然而由于量粒含有AOX1基果序列，有大概正在AOX1位面爆收沉组，损害家死型AOX1基果，爆收His+Muts变化子，则需要正在MD及MM仄板上检测可证据His+ Mut+变化子.毕赤酵母表黑时常使用培植基10×YNB(13.4%的无氨基酸酵母氮源)，134gYNB固体溶于1L蒸馏火，过滤灭菌，4℃保存.YPD真足培植基：酵母提与物10 g/L，蛋黑胨20 g/L，葡萄糖20 g/L(固体培植基含1.5%琼脂).变化培植基RDB：每100mL加进山梨醇18g(186 g/L)，琼脂糖2g(20g/L)121℃灭菌20分钟，而后待温度落至60℃以去正在超洁台上加进10×YNB 10mL(13.4 g/L)，10×葡萄糖10mL(20 g/L)，500×死物素0.2mL(4×10-4g/L)，100×AA 1mL.混匀，倒仄板(灭菌时只加进80ml火即可).采用培植基MD(最小葡萄糖)：配100mL，背80mL火中加进琼脂糖2g(20 g/L)121℃灭菌20分钟，待温度落至60℃以去正在超洁台上加进10×YNB10mL(13.4 g/L)，10×葡萄糖10mL(20 g/L)，500×死物素0.2mL(4×10-4g/L).采用培植基MM(最小甲醇)：配100mL，背90mL火中加进琼脂糖2g(20 g/L) 121℃灭菌20分钟，待温度落至60℃以去正在超洁台上加进10×YNB 10mL(13.4 g/L)，500×死物素0.2mL(4×10-4g/L)，0.5mL甲醇(0.5%).诱导表黑培植基BMGY：配1L，酵母提与物10 g/L，蛋黑胨20 g/L，3g/L K2HPO4，11.8g/L KH2PO4，加火至890mL，121℃灭菌20分钟，而后待温度落至60℃以去正在超洁台上加进10×YNB 100mL(13.4 g/L)，500×死物素1mL(4×10-4g/L)，苦油10mL.诱导表黑培植基BMMY：酵母提与物10g/L，蛋黑胨20 g/L，3g/LK2HPO4，11.8g/L KH2PO4，加火至895mL，121℃灭菌20分钟，而后待温度落至60℃以去正在超洁台上加进100×YNB 100mL(13.4 g/L)，500×死物素1mL(4×10-4g/L)，甲醇5mL.BMGY/BMMY含酵母浸出物及蛋黑胨，可宁静分泌蛋黑，遏止或者缩小分泌蛋黑的领会.如果手段蛋黑对付中性PH蛋黑酶敏感的话，可正在无缓冲培植基(MGY、MM)中表黑.如果不凭证道明您的分泌蛋黑对付中性PH 值蛋黑酶敏感，修议开初表黑时用BMMY.如果表黑蛋黑落解了，测验考查正在无缓冲培植基中举止表黑.如果以上条件仍不克不迭灵验预防蛋黑落解，可将基果转进SMD1168中，该菌株表型是his4pep4，缺得了蛋黑酶，变化与表黑步调与GS115相共，也可用于大规模收酵.用考马斯明蓝G-250测蛋黑含量。
猫血清白蛋白重组蛋白及其在毕赤酵母中的表达方法
猫血清白蛋白重组蛋白及其在毕赤酵母中的表达方法
猫血清白蛋白重组蛋白是一种重要的生物活性蛋白，具有多种生物学功能，如维持血浆渗透压、运输物质、免疫防御等。
在毕赤酵母中表达猫血清白蛋白重组蛋白，有助于研究该蛋白的结构和功能，并为生物制药、生物材料等领域提供重要资源。
猫血清白蛋白重组蛋白在毕赤酵母中的表达方法如下：
1. 基因克隆：首先从猫基因组数据库中获取猫血清白蛋白基因序列，通过 PCR 扩增得到目的基因。
然后，将目的基因与毕赤酵母的穿梭载体（如 pPICZα）进行重组，构建表达载体。
2. 转化毕赤酵母：将构建好的表达载体转化到毕赤酵母细胞中，通过筛选抗性平板得到转化子。
3. 诱导表达：在含有一定浓度诱导剂（如甲醇）的培养基中，培养转化子，诱导目的蛋白的表达。
甲醇诱导剂可以激活重组蛋白的表达，且在一定范围内，甲醇浓度越高，表达量也越高。
但过高的甲醇浓度会影响酵母的生长。
4. 蛋白纯化：诱导表达后的酵母细胞经过破碎、离心等步骤，获取含目的蛋白的的上清液。
然后，利用离子交换层析、凝胶过滤等方法对目的蛋白进行纯化。
5. 活性鉴定：对纯化的猫血清白蛋白重组蛋白进行活性鉴定，检测其在生理功能方面的表现，如抗氧化、抗炎等。
6. 应用：猫血清白蛋白重组蛋白在生物制药、生物材料等领域具有广泛应用前景。
例如，它可以作为生物制药的原料，用于治疗疾
病；也可以作为生物材料，用于组织工程和再生医学等。
总之，通过以上方法，可以在毕赤酵母中表达猫血清白蛋白重组蛋白，并进行纯化和活性鉴定。
这为研究猫血清白蛋白的结构和功能，以及将其应用于生物制药、生物材料等领域奠定了基础。
毕赤酵母表达常用溶液及相关培养基的配制.
毕赤酵母表达常用溶液及相关培养基的配制一、各种母液的配制10*YNB(含有硫酸铵、无氨基酸的13.4%酵母基础氮源培养基4℃保存。
34g酵母基础氮源培养基(无硫酸铵+100g硫酸铵,溶于1000ml水中,过滤除菌。
500*B(0.02%生物素Biotin4℃保存保存期为1年。
20mg的生物素溶于100ml水中,过滤除菌。
100*H(0.4%Histidine组氨酸4℃保存保存期为1年。
400mg的L-组氨酸溶于100ml水中,(加热至50℃以促进溶解,过滤除菌。
10*D(20%Dextrose葡萄糖保存期为1年。
200g葡萄糖溶于1000ml水中,过滤除菌。
10*M(5%Methanol甲醇保存期为2个月。
将5ml的甲醇与95ml水混匀,过滤除菌。
10*GY(10%Glycerol甘油保存期为1年以上。
将100ml甘油和900ml水混匀后,高压灭菌或过滤除菌。
100*AA(0.5%of each Amino Acid,各种氨基酸4℃保存,保存期为1年。
分别将500mg的L-谷氨酸、L-蛋氨酸、L-赖氨酸、L-亮氨酸和L-异亮氨酸溶于100ml水中,过滤除菌。
1M磷酸钾溶液(potassium phosphate buffer,pH6.0,将1mol/L的K2HPO4溶液132ml与1mol/L的KH2PO4溶液868ml混匀,其pH为6.0,若需调节pH,用磷酸和氢氧化钾调节。
二.毕赤酵母表达的培养基配制2.1LB(Luria-Bertani培养基:Trypton l%Yeast Extract0.5%NaCl l%(pH7.0制作平板时加入2%琼脂粉。
121℃高压灭菌20min。
可于室温保存。
用于培养pPICZαA原核宿主菌TOP10F’时可加入Zeocin25ug/ml。
2.2LLB(Low Salt LB培养基:Trypton l%Yeast Extract0.5%NaCl0.5%(pH7.0制作平板时加入2%琼脂粉。
毕赤酵母的基因表达及其初步纯化
1、表达效率高，遗传稳定性好 2、结构简单，表达调控机理比较清楚 3、有Pr加工系统 4、培养简单，成本低廉 5、表达产物可分泌至培养基中而自身蛋白的
分泌却很少，利于下游的纯化 （毕赤氏酵母是近年来广泛应用的真核表达
系统。）
一、实验材料
• DH5α、pPICZαA 、GS115、TOP10、， pQE4Aβ15
• 离心收集沉淀，取适量沉淀进行12% SDSPAGE 分析。
• 并用Band Scan 软件进行蛋白质纯度分析.
蛋白质的分离纯化方法
——Alade
四种分离纯化方法
• 1、根据分子大小不同进行分离纯化 • 2 、根据溶解度不同进行分离纯化 • 3 、根据电荷不同进行分离纯化 • 4 、利用对配体的特异亲和力进行分离纯化
• TBST 洗涤 5 次，H来自P-DAB 底物显色试剂 盒显色.
Western Blot 原理 a
• Western Blot与Southern印迹杂交或 Northern印迹杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测 物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色” 用标记的二抗。
Western Blot操作步骤
• 1、蛋白样品制备 • 2、蛋白含量的测定 • 3、SDS－PAGE电泳 • 4、转膜 • 5、免疫反应 • 6、化学发光，显影，定影 • 7、凝胶图象分析
6、重组蛋白的鉴定与分析
6.2 质谱分析
• 从考染（考马斯亮蓝R250CBR-250,用于检 测Pr的氨基和羧基）凝胶上切下重组蛋白 带， 进行基质辅助激光解吸附电离飞行时 间质谱分析.
• 挑阳性克隆单菌落接种于BMGY(含酵母粉、 甘油、生物素……）的培养基上摇床培养
毕赤酵母表达系统（学习资料）
毕赤酵母表达系统前言：所用表达质粒有pPIC3.5K,pAO815用于胞内表达，而pPIC9K用于分泌表达，所有载体均利用AOX1启动子来诱导高水平表达。
抗性选择：最有效的筛选遗传霉素抗性及高抗性克隆的程序需要先对HIS＋转化子进行选择，再进行不同水平遗传霉素抗性筛选。
毕赤菌株表型：毕赤酵母菌GS115 及KM71 在组氨酸脱氢酶位点（His4）有突变,因而不能合成组氨酸，所有表达质粒都有HIS4 基因可与宿主进行互补，通过不含组氨酸的培养基来选择转化子。
GS115 及KM71都可在复合培养基如YPD（YEPD）及含组氨酸的最小培养基中生长。
转化之前，GS115 及KM71 都不能在最小培养基中生长，因为它们是His-。
培养温度：毕赤酵母生长温度为28-30度（液体、平板、斜面）。
在32 度以上诱导生长时，对蛋白表达有害，甚至会导致细胞死亡。
贮存：贮存细胞几周或几月，用YPD培养基或YPD 琼脂斜面1 挑取所需菌株单克隆在YPD 平板上划线生长；2 挑取单克隆转移至YPD进行穿刺培养，30 度2 天；3 细胞在4 度可放几周几月或几年，存于－80度1 挑取所需菌株单克隆在YPD 中过夜培养；2 收集细胞，在含15%甘油的YPD 中悬浮至终OD600 为50-100（大约2.5-5.0×109细胞/ml）；3 细胞先用液氮或干冰/酒精浴中冰冻再贮存于-80 度。
注意：在4 度或－80 度长期保存后，用之前建议在MM、MD 或MGY 平板上划线培养以检测His+转化子的表型是否正确及其活力。
以质粒pPIC9K，酵母Pichia pastoris GS115为例说明做法。
载体pPIC9K酶切为点线性化质粒DNA：建议使用下列方法线性化载体以获得Mut+及Muts重组子，可能其中一个会比另一个更利于表达多拷贝重组子。
如果只想得到Muts重组子，使用KM71 菌株。
单个十字交换事件可比双重十字交换更容易、更有效地获得Muts重组菌（例如：插入A OX1或his4 而不是取代AOX1）。
毕赤酵母表达手册(详细)
毕赤酵母表达（pichia pastoris expression ）实验手册2010-07-15 10:54:56| 分类：毕赤酵母| 标签：|字号大中小订阅一．毕赤酵母表达常用溶液及缓冲液的配制二．毕赤酵母表达的培养基配制三．主要试验环节的操作 3.1 酵母菌株的分离纯化 3.2 pPICZαA原核宿主菌TOP10F’的活化培养 3.3毕赤酵母表达的试验方法 3.4 毕赤酵母电转化方法 3.5 Pichia酵母表达直接PCR鉴定重组子的方法 3.6 毕赤酵母基因组提取方法 3.7 Mut+表型重组酵母的诱导表达实验关键词：酵母实验毕赤酵母表达 pichia pastoris expression 毕赤酵母酵母菌株大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、周期短、生产成本低。
然而，许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。
大肠杆菌缺少上述加工机制，不适合用于表达结构复杂的蛋白质。
另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结构，在大肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。
包含体的形成虽然简化了产物的纯化，但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增加了成本。
大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的，其主要优点是成本低、产量高、易于操作。
但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。
近年来，以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视，原因是与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，除了具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的特点外，又具有真核生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻译后加工、修饰的不足。
毕赤酵母表达手册
Pichia Expression KitVersion M01110225-0043Pichia Expression KitA Manual of Methods for Expression of Recombinant Proteins in Pichia pastorisCatalog no. K1710-01tech_service@iiINDIVIDUAL PICHIA EXPRESSION KIT LICENSE AGREEMENTThe Pichia Expression Kit is based on the yeast Pichia pastoris. Pichia pastoris was developed into an expression system by scientists at Salk Institute Biotechnology/Industry Associates (SIBIA) for high-level expression of recombinant proteins. All patents for Pichia pastoris and licenses for its use as an expression system are owned by Research Corporation Technologies, Inc. Tucson, Arizona. Invitrogen has an exclusive license to sell the Pichia Expression Kit to scientists for research purposes only, under the terms described below. Use of Pichia pastoris by commercial corporations requires the user to obtain a commercial license as detailed below. Before using the Pichia Expression Kit, please read the following license a greement. If you do not agree to be bound by its terms, contact Invitrogen within 10 days for authorization to return the unused Pichia Expression Kit and to receive a full credit. If you do agree to the terms of this Agreement, please complete the User Registration Card and return it to Invitrogen before using the kit.INDIVIDUAL PICHIA EXPRESSION KIT LICENSE AGREEMENTInvitrogen Corporation (INVITROGEN) grants you a non-exclusive license to use the enclosed Pichia Expression Kit (EXPRESSION KIT) for academic research or for evaluation purposes only. The EXPRESSION KIT is being transferred to you in furtherance of, and reliance on, such license. You may not use the EXPRESSION KIT, or the materials contained therein, for any commercial purpose without a license for such purpose from RESEARCH CORPORATION TECHNOLOGIES, INC., Tucson, Arizona. Commercial purposes include the use in or sale of expressed proteins as a commercial product, or use to facilitate or advance research or development of a commercial product. Commercial entities may conduct their evaluation for one year at which time this license automatically terminates. Commercial entities will be contacted by Research Corporation Technologies during the evaluation period regarding the purchase of a commercial license.Access to the EXPRESSION KIT must be limited solely to those officers, employees and students of your institution who need access thereto in order to perform the above-described research or evaluation. You must inform each of such officer, employee and student of the provisions of this Agreement and require them to agree, in writing, to be bound by the provisions of this Agreement. You may not distribute the EXPRESSION KIT to others, even those within your own institution. You may transfer modified, altered or original material from the EXPRESSION KIT to a third party following notification of INVITROGEN such that the recipient can be licensed. You may not assign, sub-license, rent lease or otherwise transfer this License or any of the rights or obligation hereunder, except as expressly permitted.This License is effective until terminated. You may terminate it at any time by destroying all Pichia expression products in your control. It will also terminate automatically if you fail to comply with the terms and conditions of the Agreement. You shall, upon termination of the License, destroy all Pichia Expression Kits in your control, and so notify INVITROGEN in writing.This License Shall be governed in its interpretation and enforcement by the laws of the State of California.Product User Registration CardPlease complete and return the enclosed Product User Registration Card for each Pichia Expression Kit that you purchase. This will serve as a record of your purchase and registration and will allow Invitrogen to provide you with technical support and manual updates. It will also allow Invitrogen to update you on future developments of and improvements to the Pichia Expression Kit. The agreement outlined above becomes effective upon our receipt of your User Registration Card or 10 days following the sale of the Pichia Expression Kit to you. Use of the kit at any time results in immediate obligation to the terms and conditions stated in this Agreement.Technical ServicesInvitrogen provides Technical Services to all of our registered Pichia Expression Kit users. Please contact us if you need assistance with the Pichia Expression Kit.United States Headquarters:Japanese Headquarters European Headquarters:Invitrogen Corporation1600 Faraday AvenueCarlsbad, CA 92008 USATel: 1 760 603 7200Tel (Toll Free): 1 800 955 6288 Fax: 1 760 602 6500E-mail:tech_service@ Invitrogen Japan K.K.Nihonbashi Hama-Cho Park Bldg. 4F2-35-4, Hama-Cho, NihonbashiTel: 81 3 3663 7972Fax: 81 3 3663 8242E-mail: jpinfo@Invitrogen Ltd3 Fountain DriveInchinnan Business ParkPaisley PA4 9RF, UKTel (Free Phone Orders): 0800 269 210Tel (General Enquiries): 0800 5345 5345Fax: +44 (0) 141 814 6287E-mail: eurotech@iiiivTable of ContentsMaterials (vii)Purchaser Notification (x)Product Qualification (xii)Introduction (1)Overview (1)Experimental Outline (3)Recombination and Integration in Pichia (7)Methods (11)Pichia Strains (11)E. coli Strains (13)Selecting a Pichia Expression Vector (14)pHIL-D2 (16)pPIC3.5 (17)pHIL-S1 (18)pPIC9 (19)Signal Sequence Processing (20)Cloning into the Pichia Expression Vectors (21)Transformation into E. coli (26)Preparation of Transforming DNA (27)Growth of Pichia for Spheroplasting (30)Preparation of Spheroplasts (32)Transformation of Pichia (34)Screening for Mut+ and Mut S Transformants (36)PCR Analysis of Pichia Integrants (40)Expression of Recombinant Pichia Strains (42)Analysis by SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (45)Optimization of Pichia Protein Expression (47)Scale-up of Expression (49)Protein Purification and Glycosylation (51)Recipes (53)E. coli Media Recipes (53)Pichia Media Recipes (54)Appendix (59)Electroporation of Pichia (59)PEG 1000 Transformation Method for Pichia (60)Lithium Chloride Transformation Method (61)Total DNA Isolation from Pichia (62)Detection of Multiple Integration Events (63)Procedure for Total RNA Isolation from Pichia (64)β-Galactosidase Assay (65)Technical Service (67)References (69)vviMaterialsKit Contents Box 1: Spheroplast Module. Store at room temperature.Reagent Amount ComponentsSOS media 20 ml 1 M Sorbitol0.3X YPD10 mM CaCl2Sterile Water 2 x 125 ml Autoclaved, deionized waterSE 2 x 125 ml 1 M Sorbitol25 mM EDTA, pH 8.0SCE 2 x 125 ml 1 M Sorbitol10 mM Sodium citrate buffer, pH 5.81 mM EDTA1 M Sorbitol2 x 125 ml --CaS 2 x 60 ml 1 M Sorbitol10 mM Tris-HCl, pH 7.5;10 mM CaCl240% PEG 25 ml 40% (w/v) PEG 3350 (Reagent grade) in waterCaT 25 ml 20 mM Tris-HCl, pH 7.520 mM CaCl2Stab Vials: Pichia and E. coli stabs. Store at +4°C.Phenotype(Pichia only)GenotypeStrain Amountstab his4Mut+GS115 1stab arg4 his4 aox1::ARG4 Mut S, Arg+KM71 1GS115 Albumin 1 stab HIS4Mut SGS115 β-Gal 1 stab HIS4Mut+stab F´ {pro AB, lac I q, lac Z∆M15, Tn10 (Tet R)} mcr A,TOP10F´ 1∆(mrr-hsd RMS-mcr BC), φ80lac Z∆M15, ∆lac X74,deo R, rec A1, ara D139, ∆(ara-leu)7697, gal U,gal K, rps L (Str R), end A1, nup G λ-.Box 2: Spheroplast Module. Store at -20°C.ComponentsReagent AmountZymolyase 10 x 20 µl 3 mg/ml Zymolyase in water(100,000 units/g lytic activity)1 M DTT 10 x 1 ml 1 M dithiothreitol in watercontinued on next pageviiKit Contents,continuedVector Box. Store at -20°C.Reagent DescriptionpHIL-D210 µg, lyophilized in TE, pH 8.0Vector for intracellular expression in PichiapPIC3.510 µg, lyophilized in TE, pH 8.0Vector for intracellular expression in PichiapHIL-S110 µg, lyophilized in TE, pH 8.0 Vector for secreted expression in Pichia. Uses the PHO1 signal sequencepPIC910 µg, lyophilized in TE, pH 8.0 Vector for secreted expression in Pichia. Uses the α-factor signal sequencePrimer Box. Store at -20°C.5´ AOX1 sequencing primer2 µg (312 pmoles), lyophilized5´-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3´3´ AOX1 sequencing primer2 µg (314 pmoles), lyophilized5´-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3´α-Factor sequencing primer2 µg (315 pmoles), lyophilized5´-TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3´Media The following prepackaged media is included for your convenience. Instructions for use are provided on the package.Media Amount Yield YP Base Medium 2 pouches 2 liters of YP mediumYP Base Agar Medium 2 pouches 2 liters of YP mediumYeast Nitrogen Base 1 pouch 500 ml of 10X YNBFor transformation of Pichia by spheroplasting, the Pichia Spheroplast Module isavailable separately from Invitrogen (see below for ordering information).Product Reactions or Amount Catalog no.Pichia Spheroplast Module 10 spheroplast preparations(50 transformations)K1720-01continued on next pageviiiRequired Equip-ment and Supplies (not provided) • 30°C rotary shaking incubator• Water baths capable of 37°C, 45°C, and 100°C• Centrifuge suitable for 50 ml conical tubes (floor or table-top)• Baffled culture flasks with metal covers (50 ml, 250 ml, 500 ml, 1000 ml, and 3 L)• 50 ml sterile, conical tubes• 6 ml and 15 ml sterile snap-top tubes (Falcon 2059 or similar)• UVSpectrophotometer• Mini agarose gel apparatus and buffers• Polyacrylamide Gel Electrophoresis apparatus and buffers• Media for transformation, growth, screening, and expression (see Recipes, pages 53-58) • 5% SDS solution (10 ml per transformation)• Sterile cheesecloth or gauze• Breaking Buffer (see Recipes, page 58)• Acid-washed glass beads (available from Sigma)• Replica-plating equipment (optional)• BeadBreaker™ (optional)ixPurchaser NotificationIntroduction The Pichia Expression Kit is based on the yeast Pichia pastoris. Pichia pastoris wasdeveloped into an expression system by scientists at Salk Institute Biotechnology/ IndustryAssociates (SIBIA) and Phillips Petroleum for high-level expression of recombinantproteins. All patents for Pichia pastoris and licenses for its use as an expression system areowned by Research Corporation Technologies (RCT), Inc., Tucson, Arizona. Forinformation on commercial licenses, please see page x.The Nature of the Invitrogen License Invitrogen has an exclusive license to sell the Pichia Expression Kit to scientists for research purposes only, under the terms described below. Use of Pichia pastoris by commercial entities for any commercial purpose requires the user to obtain a commercial license as detailed below. Before using the Pichia Expression Kit, please read the following license agreement. If you do not agree to be bound by its terms, contact Invitrogen within 10 days for authorization to return the unused Pichia Expression Kit and to receive a full credit. If you do agree to the terms of this license agreement, please complete the User Registration Card and return it to Invitrogen before using the kit.Pichia pastoris Patents Pichia pastoris is covered by one or more of the following U.S. patents and corresponding foreign patents owned and licensed by Research Corporation Technologies:4,683,293 4,808,537 4,812,405 4,818,700 4,837,148 4,855,231 4,857,467 4,879,231 4,882,279 4,885,242 4,895,800 4,929,555 5,002,876 5,004,688 5,032,516 5,122,465 5,135,868 5,166,329Individual Pichia Expression Kit License Agreement Invitrogen Corporation ("Invitrogen") grants you a non-exclusive license to use the enclosed Pichia Expression Kit ("Expression Kit") for academic research or for evaluation purposes only. The Expression Kit is being transferred to you in furtherance of, and reliance on, such license. You may not use the Expression Kit, or the materials contained therein, for any commercial purpose without a license for such purpose from Research Corporation Technologies, Inc., Tucson, Arizona.Definition of Commercial Purpose Commercial purposes include:(a) any use of Expression Products in a Commercial Product(b) any use of Expression Products in the manufacture of a Commercial Product(c) any sale of Expression Products(d) any use of Expression Products or the Expression Kit to facilitate or advanceresearch or development of a Commercial Product(e) any use of Expression Products or the Expression Kit to facilitate or advance anyresearch or development program the results of which will be applied to thedevelopment of Commercial Products"Expression Products" means products expressed with the Expression Kit, or with the use of any vectors or host strains in the Expression Kit. "Commercial Product" means any product intended for sale or commercial use.Commercial entities may conduct their evaluation for one year at which time this license automatically terminates. Research Corporation Technologies will contact commercial entities during the evaluation period regarding their desire for a commercial license.continued on next pagexPurchaser Notification, continuedIndividual Responsibilities Access to the Expression Kit must be limited solely to those officers, employees and students of your institution who need access to perform the above-described research or evaluation. You must inform each such officer, employee and student of the provisions of this license agreement and require them to agree, in writing, to be bound by the provisions of this license agreement. You may not distribute neither the Expression Kit nor the vectors or host strains contained in it to others, even to those within your own institution. You may only transfer modified, altered, or original material from the Expression Kit to a third party following written notification of, and written approval from, Invitrogen so that the recipient can be licensed. You may not assign, sub-license, rent, lease or otherwise transfer this license agreement or any of the rights or obligation thereunder, except as expressly permitted by Invitrogen and RCT.Termination of License This license agreement is effective until terminated. You may terminate it at any time by destroying all Pichia expression products in your control. It will also terminate auto-matically if you fail to comply with the terms and conditions of the license agreement. You shall, upon termination of the license agreement, destroy all Pichia Expression Kits in your control, and so notify Invitrogen in writing.This License shall be governed in its interpretation and enforcement by the laws of the State of California.Contact for Commercial Licensing Bennett Cohen, Ph.D.Research Corporation Technologies 101 North Wilmot Road, Suite 600 Tucson, Arizona 85711-3335 Phone: (520) 748-4400Fax: (520)748-0025User Registration Card Please complete and return the enclosed User Registration Card for each PichiaExpression Kit that you purchase. This will serve as a record of your purchase and regis-tration and will allow Invitrogen to provide you with technical support and manualupdates. It will also allow Invitrogen to update you on future developments and improve-ments to the Pichia Expression Kit. The agreement outlined above becomes effectiveupon our receipt of your User Registration Card or 10 days following the sale of thePichia Expression Kit to you. Use of the kit at any time results in immediate obligation tothe terms and conditions stated in this license agreement.xiProduct QualificationIntroduction This section describes the criteria used to qualify the components in the PichiaExpression Kit.Vectors All expression vectors are qualified by restriction enzyme digestion. Restriction digests must demonstrate the correct banding pattern when electrophoresed on an agarose gel.Spheroplast Reagents The spheroplast reagents are qualified by spheroplast preparation of GS115 following the protocol provided in the Pichia Expression Kit manual. At least 70% of the Pichia pastoris cells must form spheroplasts in 30 minutes or less.Pichia Strains The Pichia strains are by demonstrating viability of the culture. Single colonies should arise within 48 hours after streaking on YPD medium from the stabPrimers Sequencing primers are lot tested by automated DNA sequencing experiments.Buffers andSolutionsAll buffers and solutions are extensively tested for sterility.Media All Pichia growth and expression media are qualified by growing the GS115 Pichiastrain.xiiIntroductionOverviewReview Articles The information presented here is designed to give you a concise overview of the Pichia pastoris expression system. It is by no means exhaustive. For further information, pleaseread the articles cited in the text along with recent review articles (Buckholz and Gleeson,1991; Cregg et al., 1993; Sreekrishna et al., 1988; Wegner, 1990). A general review offoreign gene expression in yeast is also available (Romanos et al., 1992).General Characteristics of Pichia pastoris As a eukaryote, Pichia pastoris has many of the advantages of higher eukaryotic expression systems such as protein processing, protein folding, and posttranslational modification, while being as easy to manipulate as E. coli or Saccharomyces cerevisiae. It is faster, easier, and less expensive to use than other eukaryotic expression systems such as baculovirus or mammalian tissue culture, and generally gives higher expression levels. As a yeast, it shares the advantages of molecular and genetic manipulations with Saccharomyces, and has the added advantage of 10- to 100-fold higher heterologous protein expression levels. These features make Pichia very useful as a protein expression system.Similarity to Saccharomyces Many of the techniques developed for Saccharomyces may be applied to Pichia including: • transformation by complementation• genedisruption• genereplacementIn addition, the genetic nomenclature used for Saccharomyces has been applied to Pichia. For example, the HIS4 gene in both Saccharomyces and Pichia encodes histidinol dehydrogenase. There is also cross-complementation between gene products in both Saccharomyces and Pichia. Several wild-type genes from Saccharomyces complement comparable mutant genes in Pichia. Genes such as HIS4, LEU2, ARG4, TRP1, and URA3 all complement their respective mutant genes in Pichia.Pichia pastoris as a Methylotrophic Yeast Pichia pastoris is a methylotrophic yeast, capable of metabolizing methanol as its sole carbon source. The first step in the metabolism of methanol is the oxidation of methanol to formaldehyde using molecular oxygen by the enzyme alcohol oxidase. This reaction generates both formaldehyde and hydrogen peroxide. To avoid hydrogen peroxide toxicity, methanol metabolism takes place within a specialized cell organelle called the peroxisome, which sequesters toxic by-products from the rest of the cell. Alcohol oxidase has a poor affinity for O2, and Pichia pastoris compensates by generating large amounts of the enzyme. The promoter regulating the production of alcohol oxidase drives heterologous protein expression in Pichia.Two Alcohol Oxidase Proteins The AOX1 and AOX2 genes code for alcohol oxidase in Pichia pastoris. The AOX1 gene product accounts for the majority of alcohol oxidase activity in the cell. Expression of the AOX1 gene is tightly regulated and induced by methanol to high levels, typically > 30% ofthe total soluble protein in cells grown with methanol as the carbon source. The AOX1 gene has been isolated and the AOX1 promoter is used to drive expression of the gene of interest (Ellis et al., 1985; Koutz et al., 1989; Tschopp et al., 1987a). While AOX2 is about 97% homologous to AOX1, growth on methanol is much slower than with AOX1. This slowgrowth allows isolation of Mut S strains (aox1) (Cregg et al., 1989; Koutz et al., 1989).continued on next page1Overview, continuedExpression Expression of the AOX1 gene is controlled at the level of transcription. In methanol-grown cells approximately 5% of the polyA+ RNA is from the AOX1 gene. The regulation of theAOX1 gene is a two step process: a repression/derepression mechanism plus an inductionmechanism (e.g. GAL1 gene in Saccharomyces (Johnston, 1987)). Briefly, growth onglucose represses transcription, even in the presence of the inducer methanol. For thisreason, growth on glycerol is recommended for optimal induction with methanol. Pleasenote that growth on glycerol (derepression) is not sufficient to generate even minute levelsof expression from the AOX1 gene. The inducer, methanol, is necessary for detectablelevels of AOX1 expression (Ellis et al., 1985; Koutz et al., 1989; Tschopp et al., 1987a).Phenotype of aox1 mutants Loss of the AOX1 gene, and thus a loss of most of the cell's alcohol oxidase activity, results in a strain that is phenotypically Mut S (Methanol utilization slow). This has in the past been referred to as Mut. The Mut S designation has been chosen to accurately describe the phenotype of these mutants. This results in a reduction in the cells' ability to metabolize methanol. The cells, therefore, exhibit poor growth on methanol medium. Mut+ (Methanol utilization plus) refers to the wild type ability of strains to metabolize methanol as the sole carbon source. These two phenotypes are used when evaluating Pichia transformants for integration of your gene (Experimental Outline, page 3).Intracellular and Secretory Protein Expression Heterologous expression in Pichia can be either intracellular or secreted. Secretion requires the presence of a signal sequence on the expressed protein to target it to the secretory pathway. While several different secretion signal sequences have been used successfully, including the native secretion signal present on some heterologous proteins, success has been variable. The secretion signal sequence from the Saccharomyces cerevisiaeα factor prepro peptide has been used most successfully (Cregg et al., 1993; Scorer et al., 1993).The major advantage of expressing heterologous proteins as secreted proteins is that Pichia pastoris secretes very low levels of native proteins. That, combined with the very low amount of protein in the minimal Pichia growth medium, means that the secreted heterologous protein comprises the vast majority of the total protein in the medium and serves as the first step in purification of the protein (Barr et al., 1992). Note: If there are recognized glycosylation sites (Asn-X-Ser/Thr) in your protein's primary sequence, glycosylation may occur at these sites.Posttranslational Modifications In comparison to Saccharomyces cerevisiae, Pichia may have an advantage in the glyco-sylation of secreted proteins because it may not hyperglycosylate. Both Saccharomyces cerevisiae and Pichia pastoris have a majority of N-linked glycosylation of the high-mannose type; however, the length of the oligosaccharide chains added posttranslationally to proteins in Pichia (average 8-14 mannose residues per side chain) is much shorter than those in S. cerevisiae (50-150 mannose residues) (Grinna and Tschopp, 1989; Tschopp et al., 1987b). Very little O-linked glycosylation has been observed in Pichia.In addition, Saccharomyces cerevisiae core oligosaccharides have terminal α1,3 glycan linkages whereas Pichia pastoris does not. It is believed that the α1,3 glycan linkages in glycosylated proteins produced from Saccharomyces cerevisiae are primarily responsible for the hyper-antigenic nature of these proteins making them particularly unsuitable for therapeutic use. Although not proven, this is predicted to be less of a problem for glycoproteins generated in Pichia pastoris, because it may resemble the glycoprotein structure of higher eukaryotes (Cregg et al., 1993).2Experimental OutlineSelection of Vector and Cloning To utilize the strong, highly inducible P AOX1 promoter for expression of your protein, four expression vectors are included in this kit. pHIL-D2 and pPIC3.5 are used for intracellular expression while pHIL-S1 and pPIC9 are used for secreted expression (see pages 14-19 for more information). Before cloning your insert, you must...• decide whether you want intracellular or secreted expression.• analyze your insert for the following restriction sites: Sac I, Stu I, Sal I, Not I, and Bgl II. These sites are recommended for linearizing your construct prior to Pichiatransformation. If your insert has all of these sites, see pages 28-29 for alternate sites.Transformation and IntegrationTwo different phenotypic classes of His+ recombinant strains can be generated: Mut+ and Mut S. Mut S refers to the "Methanol utilization slow" phenotype caused by the loss of alcohol oxidase activity encoded by the AOX1 gene. A strain with a Mut S phenotype has a mutant aox1 locus, but is wild type for AOX2. This results in a slow growth phenotype on methanol medium. Transformation of strain GS115 can yield both classes of transformants, His+ Mut+ and His+Mut S, while KM71 yields only His+ Mut S since the strain itself is Mut S. Both Mut+ and Mut S recombinants are useful to have as one phenotype may favor better expression of your protein than the other. Due to clonal variation, you should test 6-10 recombinants per phenotype. There is no way to predict beforehand which construct or isolate will better express your protein. We strongly recommend that you analyze Pichia recombinants by PCR to confirm integration of your construct (see page 40).Once you have successfully cloned your gene, you will then linearize your plasmid to stimulate recombination when the plasmid is transformed into Pichia. The table below describes the types of recombinants you will get by selective digestion of your plasmid. RestrictionEnzymeIntegration Event GS115 Phenotype KM71 PhenotypeSal I or Stu I Insertion at his4His+ Mut+ His+ Mut SSac I Insertion at 5´AOX1 regionHis+ Mut+ His+ Mut SNot I or Bgl II Replacement atAOX1 locusHis+ Mut SHis+ Mut+His+ Mut S (notrecommended, see page 11)Expression and Scale-up After confirming your Pichia recombinants by PCR, you will test expression of both His+Mut+ and His+ Mut S recombinants. This will involve growing a small culture of each recombinant, inducing with methanol, and taking time points. If looking for intracellular expression, analyze the cell pellet from each time point by SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). If looking for secreted expression, analyze both the cellpellet and supernatant from each time point. We recommend that you analyze your SDS-PAGE gels by both Coomassie staining and Western blot, if you have an antibody to your protein. We also suggest checking for protein activity by assay, if one is available. Not all proteins express to the level of grams per liter, so it is advisable to check by Western blotor activity assay, and not just by Coomassie staining of SDS-PAGE gels for production of your protein.Choose the Pichia recombinant strain that best expresses your protein and optimizeinduction based on the suggestions on pages 47-48. Once expression is optimized, scale-up your expression protocol to produce more protein.continued on next page3。
毕赤酵母表达系统简介
巴斯德毕赤酵母及启动子1.1 毕赤酵母表达系统简介随着蛋白异源表达的飞速发展，越来越多的表达系统被建立并得到应用。
酵母作为单细胞真核生物，因具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰能力，仍表现出不可比拟的优势。
以甲醇营养型酵母（Methylotrophic yeast）-毕赤酵母为代表的第二代酵母表达系统，是近年来被公认的最有效的外源蛋白表达系统之一，已有多种外源蛋白在该宿主系统中获得了成功表达[1]。
作为生产外源蛋白的重要宿主菌，依靠其各种不同功能的表达载体，已经得到广泛的应用。
表达的蛋白质包括酶、膜蛋白、抗原、抗体和调节蛋白等[2,3]。
毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统是近年来发展迅速、应用广泛的一种真表达系统。
它是甲醇营养型酵母菌，有两个乙醇氧化酶（alcohol oxidase，Aox）码基因AOX1和AOX2，两者序列相似，AOX1基因严格受甲醇诱导和调控。
当甲醇为唯一碳源时，AOX1启动子可被甲醇诱导，启动乙醇氧化酶的表达，从而用甲醇进行代谢[4]。
含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的因的表达。
随着Invitrogen公司开发的一系列毕赤酵母表达试剂盒的应用，目前用该统已成功表达出了数以千计的来自细菌、真菌、原生动物、植物、无脊椎动物、包括人在内的脊椎动物以及病毒等的具有生物学功能的外源蛋白或蛋白结构[5,6]。
1.1.1 P.Pastoris表达载体及其元件由于毕赤酵母没有稳定的附加质粒，表达载体需与宿主染色体发生同源重组，外源基因表达框架整合于染色体中以实现外源基因的表达整合表达的优点在于保持外源基因稳定性并可产生多拷贝基因。
典型的毕赤氏酵母表达载体含有醇氧化酶基因的调控序列，主要的结构包括：5′AOX1启动子片段、多克隆位点(MCS)、转录终止和polyA形成基因序列(TT)、筛选标记(His4或Zeocin)、3′AOX1基因片段，作为一个能在大肠杆菌中繁殖扩增的穿梭质粒，它还有部分pBR322质粒或COLE1序列。
毕赤酵母表达知识
很好，需要好好研究一下原文地址：毕赤酵母表达知识01转载于丁香作者：思时尔非a.配制500×BIOTIN stock solution（0.02％）有这么3种方案：1、懒人是将Biotin直接溶在去离子水中，放过夜，基本就能溶；2、急性子是将溶液配成0.02N的NaOH，就很容易溶解了；3、水浴加热，温度不能高于50度。
D－生物素是具有生物活性的生物素，也就是vitaminH。
在毕赤酵母代谢过程中，作为多种酶的辅基起作用。
天然培养基中一般可以不单独添加，因为YNB中、酵母粉、蛋白胨中均含有一定量的生物素，但是做高密度发酵还是必须要添加的。
b.有几个比较迷惑的问题请教大家：(很典型的小问题）1、制感受态细胞，OD多少比较好？pyrimidine 战友的方法：取1mlGS115过夜培养物(OD约6-10) 分装到1.5ml EP 管中。
说明书还有一些文献是说在1.3左右效率高，再高了效率会很低2、关于高效转化法，文献说用(LiAc)，而invitrogen的说明书说转化毕赤酵母用(LiAc)没用，要用LiCl。
Lithium acetate does not work with Pichia pastoris. Use only lithium chloride.3、YNB到底能高温灭么？有的说能有的说不能。
过滤灭菌的怎么操作？我是把滤器装好膜绑到瓶口用纱布盖上，报纸包上，瓶盖放烧杯里单灭。
然后把配好的溶液用注射器一点点推进去。
4、葡萄糖为什么在YPD里一起灭颜色很深，单灭则不会。
该115度还是121度灭？网上搜了下，都有人用！5、电转化参数用400欧还是200欧？有的用400，有的还专门说不是用400。
都是从园里看到的！电击参数：1.5KV，25uF，200欧姆（不是400）6、电转后，在MD平板上长的应该就是整合了目的基因的重组子了吧？如果不想筛高拷贝的，是否PCR验证一下即可？网友的回答：ynb最好不灭菌，我是0.22um过滤处理的。
毕赤酵母诱导表达实验步骤(1)
BMGY的配制（每200 mL）
Yeast extract 2 g
Peptone 4 g
K3PO4(pH 6.0) 20 mL
丙三醇 2 mL
定容至180 mL，121，灭20 min。
使用前再加入
10*YNB 20 mL（10%）（过滤除菌）
生物素0.4 mL（0.02%）（过滤除菌）
加入后，用紫外照射10 min左右再接菌。
BMMY的配制（每200 mL）
Yeast extract 2 g
Peptone 4 g
K3PO4(pH 6.0) 20 mL
定容至180 mL，121，灭20 min。
使用前再加入
10*YNB 20 mL（10%）（过滤除菌）
生物素0.4 mL（0.02%）（过滤除菌）
甲醇0.5%
加入后，用紫外照射10 min左右再接菌。
10*YNB的配制
酵母基础氮源培养基 3.4 g
硫酸铵10 g
双蒸水80 mL
定容至100 mL，过滤除菌（用0.22 μm滤膜过滤）。
毕赤酵母诱导表达
1.配BMGY和BMMY灭菌
2.使用前向BMGY按比例加入生物素、10*YNB，紫外照10 min。
3.接菌于BMGY，250 rpm，28℃摇24 h
4.向BMMY中按比例加入生物素、10*YNB、甲醇，紫外照10 min。
5.将含有菌液的BMGY转移至50 mL离心管，4℃5000 rpm 离心5 min，弃上
清。
6.用BMMY将沉淀菌体重悬，倒回瓶中，250 rpm，28℃，摇3 d。
每24 h补
一次甲醇。
2016.03.31毕赤酵母表达问答
2016.03.31毕赤酵母表达问答1.信号肽切割位点和目的基因核苷酸序列5’端的设计酶切位点问题1.1目的蛋白N端不要增加氨基酸：a-信号肽在kex2 和ste13处进行切割，若要目的蛋白不增加额外氨基酸，则需要在kex2对应核苷酸序列前的XhoI 作为酶切位点，并补齐信号肽切割所需的序列（酶切位点下游的信号肽对应的核苷酸序列）1.2目的蛋白N端可增加氨基酸。
则可以选用其他的酶切稳点，保证下游不出现移码突变就行了。
（具体参考具体酶切位点切割点，及其上游核苷酸数有否保证刚好是3的倍数）。
2.目的基因核苷酸序列3’端的设计酶切位点设计、终止密码子设计2.1如果不希望有c-myc和His-tag，可以在基因片段末尾加入终止密码子；3.载体构建问题3.1pPICZ系列比较容易操作，大肠和毕赤酵母均用抗Zeocin筛选，对于大小合适（30—50KD）的蛋白在产量上是pPIC9K无法比拟的3.2pPIC9K属于穿梭质粒，也可以在原核表。
PIC9K操作麻烦一点，大肠用amp抗性，而毕赤酵母先用His缺陷筛选阳性克隆，在利用G418筛选多拷贝），3.3位点不能出现在目的DNA片段中——如果片段长无法避免，可以采用平末端连接；3.4虽然α-factor可以自动切除，但是在设计表达的时候，如果在N端不能出现任何多余的aa（比如药物蛋白表达），需要特别留意（说明书上有详细说明：P13）；3.5有三种不同的读码框（对于pPICZα系列来说就是对上α-factor序列），在设计克隆的时候要反复确定自己的读码框是否正确，这可是致命的问题；3.6无论pPICZ还是pPICZα都有TGA（终止密码子），但是pPICZ系列没有ATG（起始密码子），有人认为酵母启动子与外源基因的ATG之间的距离越短对于表达的该基因越有利；3.7如果不希望有c-myc和His-tag，可以在基因片段末尾加入终止密码子；3.8 Pichia的密码子与酿酒酵母的相似，有关基因表达偏好密码子的问题有人认为没有必要更换，有人认为一定要换，个人认为以产量为主要目的的可以考虑更换基因密码子，而如果片段过长就比较麻烦，不过有许多真核保守蛋白其实是和酵母密码子相似的；3.9克隆菌株需要有recA，endA，试剂盒带有的TOP10挺好用的（其它像是DH5α都行），但是要注意带有筛选抗生素Zeocin的培养基要用低盐培养基（NaCl减半），这主要是因为怕影响到抗生素作用（Zeocin平板要避光保存）；3.10测序引物可以用α-factor信号引物，也可以用5'AOX1引物；3.11如果需要高量表达，可以考虑做克隆的时候串联基因片段进行表达，另外也可以在转化酵母的时候重复转化。
毕赤酵母分泌表达报告
实验报告毕赤酵母分泌表达报告订单号：«订单号»客户：«客__户»日期：«日__期»目录1 材料与方法 (1)1.1 菌株的保存与培养 (1)1.2 载体构建 (1)1.3 质粒电转毕赤酵母 (1)1.4 转化子筛选 (2)1.5 转化子表达小试 (4)1.6 最优转化子扩大表达 (6)1.7 蛋白鉴定与纯化 (7)2 结果与分析 (9)2.1 转化子筛选 (9)2.2 转化子表达小试 (9)2.3 最优转化子扩大表达 (10)2.4 蛋白纯化与浓度测定 (10)1．材料与方法1.1 菌株的保存与培养大肠杆菌（Eschrichia coli）菌株TOP10于LB培养液摇菌后保存成20%的甘油菌于-80℃冷冻保存。
大肠杆菌于37℃培养箱中培养。
毕赤酵母（Pichia pastoris）菌株X-33于YPD培养液摇菌后保存成25%的甘油菌于-80℃冷冻保存。
毕赤酵母于28℃培养箱中培养。
1.2 载体构建1）目的基因信号肽预测，采用SignalP 4.0和5.1预测，去除信号肽序列；2）根据毕赤酵母表达系统进行密码子优化，避开SacI酶切位点；3）基因合成至pPICZαA，目的基因紧挨着载体α-factor，C端带上6×His。
1.3 质粒电转毕赤酵母1.3.1 目的载体线性化1）按下表配制载体酶切体系：组分体积（ul）质粒（5-10 ug）6 ug10×buffer 5SacI 1 ulddH2O 补到502）37℃酶切过夜；3）琼脂糖凝胶电泳检测，以未酶切的质粒作为对照；4）检测酶切成功后，65℃ 20 min灭活。
1.3.2 线性化载体纯化回收1）按下表配置载体纯化体系：组分体积（ul）酶切产物50核酸助沉剂103 M NaAc，pH=5.2 6无水乙醇1652）-20℃静置35 min以上；3）4℃ 12000 rpm离心15 min，弃上清，此时可以观察到壁上有白色沉淀；4）加入400 ul预冷的80%乙醇重悬沉淀；5）4℃ 12000 rpm离心10 min，弃上清，开盖干燥；6）加入10 ul ddH2O溶解沉淀。
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Pichia酵母表达系统使用心得摘要：Pichia酵母表达系统广泛应用于外源基因表达。
本文搜集多位用户对Pichia的使用心得和注意事项，值得一看。
生物通编者按：甲醇酵母表达系统有不少优点，其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表达系统最为人熟知，并广泛应用于外源蛋白的表达。
虽然说酵母表达操作简单表达量高，但是在实际操作中，并不是每个外源基因都能顺利得到高表达的。
不少人在操作中会遇到这样那样的问题，生物通编者特地收集了部分用户在使用EasySelect Pichia Expression System这个被誉为最简单的毕赤酵母表达的经典试剂盒过程中的心得体会。
其中Xiang Yang是来自美国乔治城大学（Georgetown University）Lombardi癌症中心（Lombardi Cancer Center），部分用户来自国内。
甲基酵母部分优点与其他真核表达系统比较与原核表达系统比较1.属于真核表达系统，具有一定的蛋白质翻译后加工，有利于真核蛋白的表达优点-+2.AOX强效启动子，外源基因产物表达量高，可以达到每升数克表达产物的水平++++3.酵母培养、转化、高密度发酵等操作接近原核生物，远较真核系统简单，非常适合大规模工业化生产。
+++=4.可以诱导表达，也可以分泌表达，便于产物纯化。
=+5.可以甲醇代替IPTG作为诱导物，部分甲醇酵母更可以甲醇等工业产物替代葡萄糖作为碳源，生产成本低++++RealTime ready 智力大冲浪！答对5题，即获赠美国傲仕优质保温杯！+ 表示优胜于；- 表示不如；= 表示差不多EasySelect Pichia Expression System产品性能：优点--使用简单，表达量高，His-tag便于纯化缺点--酵母表达蛋白有时会出现蛋白切割问题全面产品报告及心得体会：巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是一种能高效表达重组蛋白的酵母品种，一方面由于其是属于真核生物，因此表达出来的蛋白可以进行糖基化修饰，另一方面毕赤酵母生长速度快，可以将表达的蛋白分泌到培养基中，方便蛋白纯化。
毕赤酵母表达载体pPICZ在多克隆位点（MCR）3'端带有his-tag和c-myc epitopes，这些tag有利于常规检测和纯化，而且在MCR5'端引入了alpha factor（α-factor）用以增加表达，并且在表达后α-factor可以自动被切除。
在进行克隆的时候，如果你选择的是EcoRI，那么只需在目标蛋白中增加两个氨基酸序列即可完成。
另外pPICZ系列选用的是Zeocin抗生素作为筛选标记，而诱导表达的载体需要甲醇--甲醇比一般用于大肠杆菌表达诱导使用的IPTG便宜。
第一步--构建载体Xiang Yang：pPICZ系列有许多克隆位点可供选择，同时也有三种读码框以便不用的用户需要。
红叶山庄：有关是选择pPIC9K还是pPICZ系列？pPIC9K属于穿梭质粒，也可以在原核表达，而pPICZ系列比较容易操作，大肠和毕赤酵母均用抗Zeocin筛选（PIC9K操作麻烦一点，大肠用amp抗性，而毕赤酵母先用His缺陷筛选阳性克隆，在利用G418筛选多拷贝），而且对于大小合适（30-50KD）的蛋白在产量上是pPIC9K无法比拟的。
leslie：要做毕赤酵母表达实验，首先当然就要了解这个可爱的酵母了（椭圆形，肥嘟嘟的，十分可爱），她和大肠杆菌长得有较大区别（大肠杆菌是杆状的），因此在培养的过程中要区别这两种菌体，除了气味，浓度，颜色以外，也可以取样到显微镜中观测。
大家做毕赤表达的时候应该都遇过这种情况吧，表达过程中染菌（我们实验室曾经污染过各种颜色形状的细菌，那真是一段可怕的经历），如果在不知情的情况下继续做下去，那可以就是浪费大把的时间了。
基本熟悉了毕赤酵母，了解了她生长的喜好（多糖偏酸环境），生长的周期等等情况后，当然更多的精力还是应该花在表达的目的蛋白上，我的表达蛋白有些恐怖，有100KD，本来当然应该放在大肠杆菌中表达，但是为了分泌表达（其实后来发现大肠杆菌pET系列分泌表达系列也不错）和糖基化修饰（主要是这个方面，因为我的蛋白是人源的，表达出来用于酵母双杂，因此需要有完备的糖基化修饰）。
这样我的DNA片段由于较长，所以在做克隆的时候也要非常小心，需要注意的是：①酶切位点不能出现在目的DNA片段中--如果片段长无法避免，可以采用平末端连接；②虽然α-factor可以自动切除，但是在设计表达的时候，如果在N端不能出现任何多余的aa（比如药物蛋白表达），需要特别留意（说明书上有详细说明：P13）；③有三种不同的读码框（对于pPICZα系列来说就是对上α-factor序列），在设计克隆的时候要反复确定自己的读码框是否正确，这可是致命的问题；④无论pPICZ还是pPICZα都有TGA（终止密码子），但是pPICZ系列没有ATG（起始密码子），有人认为酵母启动子与外源基因的ATG之间的距离越短对于表达的该基因越有利；⑤如果不希望有c-myc和His-tag，可以在基因片段末尾加入终止密码子；⑥Pichia的密码子与酿酒酵母的相似，有关基因表达偏好密码子的问题有人认为没有必要更换，有人认为一定要换，个人认为以产量为主要目的的可以考虑更换基因密码子，而如果片段过长就比较麻烦，不过有许多真核保守蛋白其实是和酵母密码子相似的；⑦克隆菌株需要有recA，endA，试剂盒带有的TOP10挺好用的（其它像是DH5α都行），但是要注意带有筛选抗生素Zeocin的培养基要用低盐培养基（NaCl减半），这主要是因为怕影响到抗生素作用（Zeocin平板要避光保存）；⑧测序引物可以用α-factor信号引物，也可以用5'AOX1引物；⑨如果需要高量表达，可以考虑做克隆的时候串联基因片段进行表达，另外也可以在转化酵母的时候重复转化。
⑩目的基因中最好不要含有pro-glu-ser-thr这样的序列，因为这个序列是激活蛋白水解酶的作用底物，会影响表达，另外也不要含有x-phe-x-arg-gln和gln-arg-x-phe-x这样的序列（x=任何氨基酸），因为这些序列容易受到容酶体的切割，而且目的蛋白末端最好是ala,asp,val,ser 这样的氨基酸。
除此之外许多高A+T含量的基因通常会由于提前终止而不能有效转录，也需要多加注意。
第二步就是将线性化的DNA转化入Pichia酵母中。
Xiang Yang：EasySelect试剂盒准备了三种菌株：X33，GS115和KM71H。
我倾向于选择X33，因为这个菌株转化率和表达量相对而言较高，如果你有电转仪（electroporator），可以尝试一下。
如果没有的话，EasySelect也准备了化学转化试剂--EasyComp Transformation，但是由于转化率的缘故，我建议使用电转仪。
leslie：在得到了正确的序列之后就可以准备转化毕赤酵母了，试剂盒携带有的是X-33，GS115和KM71H这三种毕赤酵母（另外常用的还有SMD1168），每种酵母的特点有些不尽相同（Manual上写的很清楚），其中X-33由于是野生型，因此耐受性比较好，如果担心转化率的话可以考虑这种酵母菌，而GS115与X33一样都是属于MUT＋表现型，也就是说可以在含甲醇的培养基中快速生长，但是据说会对外源基因表达有影响，KM71是MUT-型酵母，在甲醇培养基中生长缓慢，但是也有利于翻译后加工，比如形成二硫键，糖基化等等，另外SMD1168则是基因组中的Pep4基因发生突变，造成蛋白水解酶活性的丧失，可以保护表达产物免受降解，促进表达量的提高。
一般来说，如果是胞内表达，应尽量用Mut－细胞，这样得到的蛋白产物中醇氧化酶蛋白量较少而目的蛋白量相对较多(约占Pp总分泌蛋白量的30-90%，如人乙酰胆碱酯酶B变异链的含量占到90%，使下游纯化更易进行。
而对于分泌蛋白的表达，无论是甲醇利用慢(Mut-)还是甲醇利用快(Mut+)的细胞都可应用，如在人血清白蛋白(HSA)(为分泌型蛋白)的表达中就看不出两种类型的细胞之间有什么明显差别。
所以一般手册都会建议同时在这几种菌株中进行转化，这主要是因为不同的基因在不同的酵母菌中可能表达量截然不同，因此在最开始的时候建议多用几种酵母菌实验。
另外有个保存问题，原始酵母菌一定要保存好，因为酵母在传代多次后会影响其转化率和表达量，所以一方面分多管分装保存于-80℃，另一方面如果出现了转化或者表达的问题，在其它方面都没有出错的前提下可以考虑重新取出新菌液（每次都要涂平板挑菌）。
在准备酵母菌的同时也需要准备质粒，由于酵母菌转化对转化质粒的要求较高，量也较大（5-10ug），因此许多时候都会用PEG大提质粒，或者用大提试剂盒，总而言之要准备好足够量的质粒，并且不要忘记也要同时准备空载体以做对照。
在转化前质粒需要进行线性化，这主要是为了增加重组率（EasySelect试剂盒表达量高的一个重要原因也就在于其原理是将目的片段整合到载体上，大大的增加了目的片段的表达）。
线性化位点个人认为也会影响到表达量，对于基因片段不大的蛋白可以考虑用几个线性化位点同时进行转化筛选，但是如果片段大，就有可能供选择的机会少，而且也有可能遇上没有合适的线性化位点的情况，这个时候也不是说不能进行表达，但是准备的质粒就要增加10倍，另外也可以进行部分酶切（即先进行预实验，掐定时间和酶量保证被切开的质粒有部分是在线性化位点切开而基因片段保存完好）。
在线性化之后的质粒就可以酒精沉淀回收了--中间步骤需要使酶失活，说明书建议是热失活或者EDTA，个人认为前者比较好，主要是担心EDTA对于转化的影响，另外这三种酶失活的温度都是65℃/20min。
沉淀回收之后是离心10分钟，用80%的酒精洗涤后风干，这一步需要多加注意保证风干完全，因为有实验证明残留的酒精对于转化的影响颇大。
接下来就是酵母转化了，这是令许多人头疼的一步，也是影响实验决定表达的关键步骤。
转化方法有不少，例如电转，化学转化，原生质体转化，其方法的难易程度和转化率高低呈反向递减的，也就是说电转最容易，转化率较高（但要求有电转仪），而原生质体最麻烦，而且效果不好（比较传统），因此不建议使用，EasySelect说明书上这么建议，并且也详细说明了电转，化学转化（EasyComp和LiCl）方法的过程，可以按部就班。
需要注意的是：（电转过程）①最好每次都从平板上挑酵母菌，用培养过的酵母放置时间不要超过一个星期；②扩大培养的浓度一定要控制好，个人认为不需要OD600达到1.3-1.5，1.0-1.3的就好，这个时候的酵母比较新鲜，转化率比较高；③整个感受态制作过程中一定要在冰上操作，离心最好也用冷冻离心机，这是影响转化的关键--为了进一步保证这一点，无菌水可以是冰水混合物，另外山梨醇和电转杯都要预冷；④电转仪需要预热，所以准备感受态的时候就可以把电转仪打开了，电转后山梨醇的加入要快，曾有人做实验证明晚一秒就会降低转化的数量级，虽然不一定可信，但是我个人也认为这个过程要快，电转后可以看看时间，如果时间过短（比如〈4）就可能说明杂质较多，会影响转化率；⑤转化后温育是个增加同源重组，增加存活率的过程，需要注意不要感染了大肠杆菌，再加入培养基30℃摇一段时间，可以取部分涂板（不同浓度抗生素），或者也有人将菌短暂离心，弃去上清，剩余全部涂板以保证转化率。