2014酶工程第三章动植物发酵产酶课件
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酶工程 第三章酶的发酵生产 第一节酶生物合成的基本理论
转录是以DNA为模板，以核苷三磷酸为底物，在RNA聚合酶 （转录酶）的作用下，生成RNA的过程。
第一节 酶生物合成的基本理论
转录时，RNA聚合酶首先结合到DNA的特定位点（启动基因）上，DNA的 双螺旋链部分解开，以其中一条链为模板，通过碱基互补方式结合进第一个 核苷三磷酸，然后随着RNA聚合酶的移动，DNA双螺旋逐渐解开，按照模板上 的碱基顺序逐个加入与其互补的核苷三磷酸并聚合而生成多聚核苷酸链。在 RNA聚合酶后面生成的多聚核苷酸链立即与模板分开，DNA分子的两条链又重 新缠绕形成双螺旋。（图3-1）
第一节 酶生物合成的基本理论
三、酶生物合成的调节
如上所述，酶的生物合成要经过一系列的步骤，需要 诸多因素的参与。故此，在转录和翻译过程中，许多因素 都会影响酶的生物合成。那么，究竟哪些因素对酶的生物 合成起主要的调节控制作用呢？研究结果表明，至少在原 核生物中，甚至在所有生物中，转录水平的调节控制对酶 的生物合成是至为重要的。
的过程,称为酶生物合成的诱导作用。简称为诱导作用。 起诱导作用的物质，称为诱导剂。例如，乳糖诱导β—半 乳糖苷酶的合成等。
酶生物合成的诱导作用过程如图3-4所示。
第一节 酶生物合成的基本理论
第一节 酶生物合成的基本理论
(B)
图3-4酶生物合成的诱导作用 （A）-----无诱导物时 （B）----添加诱导物时
转录水平调节控制，又称为基因的调节控制。这种控 制理论最早是由雅各（Jacob）和莫诺德(Monod)于1960年 提出的操纵子学说来阐明的，1966年发现了启动基因，使 这一调节控制理论不断完善。
第一节 酶生物合成的基本理论
根据基因调节控制理论，在DNA分子中，与酶生物合 成有密切关系的基因有4种。它们是调节基因(Regulator gene)、启动基因(Promoter gene)、操纵基因(Operator gene)和结构基因(Strutural gene)。其中，结构基因与 酶有各自的对应关系，结构基因中的遗传信息可转录成 mRNA上的遗传密码，再经翻译成为酶蛋白的多肽链。操纵 基因可以特异性地与调节基因产生的边构蛋白（阻抑蛋白） 中的一种结构结合，从而操纵酶合成的时机及速度。结构 基因与操纵基因一起称为操纵子。启动基因决定酶的合成 能否开始，启动基因由两个位点组成，一个是RNA聚合酶 的结合位点，另一个是环腺苷酸（cAMP）与环腺苷酸接受 蛋白（CRP）的复合物（cAMP- CRP）的结合位点。只有在 cAMP- CRP复合物结合到启动基因的位点上时，RNA
第一节 酶生物合成的基本理论
转录时，RNA聚合酶首先结合到DNA的特定位点（启动基因）上，DNA的 双螺旋链部分解开，以其中一条链为模板，通过碱基互补方式结合进第一个 核苷三磷酸，然后随着RNA聚合酶的移动，DNA双螺旋逐渐解开，按照模板上 的碱基顺序逐个加入与其互补的核苷三磷酸并聚合而生成多聚核苷酸链。在 RNA聚合酶后面生成的多聚核苷酸链立即与模板分开，DNA分子的两条链又重 新缠绕形成双螺旋。（图3-1）
第一节 酶生物合成的基本理论
三、酶生物合成的调节
如上所述，酶的生物合成要经过一系列的步骤，需要 诸多因素的参与。故此，在转录和翻译过程中，许多因素 都会影响酶的生物合成。那么，究竟哪些因素对酶的生物 合成起主要的调节控制作用呢？研究结果表明，至少在原 核生物中，甚至在所有生物中，转录水平的调节控制对酶 的生物合成是至为重要的。
的过程,称为酶生物合成的诱导作用。简称为诱导作用。 起诱导作用的物质，称为诱导剂。例如，乳糖诱导β—半 乳糖苷酶的合成等。
酶生物合成的诱导作用过程如图3-4所示。
第一节 酶生物合成的基本理论
第一节 酶生物合成的基本理论
(B)
图3-4酶生物合成的诱导作用 （A）-----无诱导物时 （B）----添加诱导物时
转录水平调节控制，又称为基因的调节控制。这种控 制理论最早是由雅各（Jacob）和莫诺德(Monod)于1960年 提出的操纵子学说来阐明的，1966年发现了启动基因，使 这一调节控制理论不断完善。
第一节 酶生物合成的基本理论
根据基因调节控制理论，在DNA分子中，与酶生物合 成有密切关系的基因有4种。它们是调节基因(Regulator gene)、启动基因(Promoter gene)、操纵基因(Operator gene)和结构基因(Strutural gene)。其中，结构基因与 酶有各自的对应关系，结构基因中的遗传信息可转录成 mRNA上的遗传密码，再经翻译成为酶蛋白的多肽链。操纵 基因可以特异性地与调节基因产生的边构蛋白（阻抑蛋白） 中的一种结构结合，从而操纵酶合成的时机及速度。结构 基因与操纵基因一起称为操纵子。启动基因决定酶的合成 能否开始，启动基因由两个位点组成，一个是RNA聚合酶 的结合位点，另一个是环腺苷酸（cAMP）与环腺苷酸接受 蛋白（CRP）的复合物（cAMP- CRP）的结合位点。只有在 cAMP- CRP复合物结合到启动基因的位点上时，RNA
《酶工程》课件-动植物细胞培养产酶
（6）动物细胞、植物细胞和微生物细胞用于生产的主要产物 各不相同。
3
动、植物细胞培养产酶
一、植物细胞培养产酶 （二）植物细胞培养的特点
植物细胞培养生产各种天然产物，与从植物中提取分离 这些物质相比，具有如下列特点：
1、提高产率。 使用优良的植物细胞进行培养生产天然产物，可
以明显提高天然产物的产率。
一般植物从发芽、生长到收获，短则几个月，长则数 年或更长时间。而植物细胞生长的倍增时间一般为12— 60h，一般生产周期l 5-30天，植物细胞培养可大大地缩短 生产周期。
5
动、植物细胞培养产酶
一、植物细胞培养产酶 （二）植物细胞培养的特点
植物细胞培养生产各种天然产物，与从植物中提取分离 这些物质相比，具有如下列特点：
7、原代细胞继代培养50代后，就会退化死亡，需要重
新分离细胞。
8
一、植物细胞培养产酶 2、植物细胞的特性
（一）植物细胞的特性
植物细胞与微生物细胞和动物细胞相比主要有以下特性：
（1）植物细胞比微生物细胞大得多；植物细胞也比动物细 胞大。
（2）植物细胞的生长和代谢速率比微生物细胞低，生长倍增 时间和生产周期也比微生物长 。
（3）植物细胞和微生物细胞的营养要求较为简单。
3、易于管理，减轻劳动强度。
植物细胞培养在人工控制条件的生物反应器中进行生产， 不受地理环境和气候条件等的影响，易于操作管理，大大减 轻劳动强度，改善劳动条件。
4、提高产品质量。
植物细胞培养的产物杂质较少，在严格控制条件的生物
反应器中生产，可以减小环境中有害物质的污染和微生物、
昆虫的侵蚀，产物易于分离纯化。
例如：日本三井石油化学工业公司于1983年在世
界上首次成功地用紫草细胞培养生产紫草宁。他们用
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动、植物细胞培养产酶
一、植物细胞培养产酶 （二）植物细胞培养的特点
植物细胞培养生产各种天然产物，与从植物中提取分离 这些物质相比，具有如下列特点：
1、提高产率。 使用优良的植物细胞进行培养生产天然产物，可
以明显提高天然产物的产率。
一般植物从发芽、生长到收获，短则几个月，长则数 年或更长时间。而植物细胞生长的倍增时间一般为12— 60h，一般生产周期l 5-30天，植物细胞培养可大大地缩短 生产周期。
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动、植物细胞培养产酶
一、植物细胞培养产酶 （二）植物细胞培养的特点
植物细胞培养生产各种天然产物，与从植物中提取分离 这些物质相比，具有如下列特点：
7、原代细胞继代培养50代后，就会退化死亡，需要重
新分离细胞。
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一、植物细胞培养产酶 2、植物细胞的特性
（一）植物细胞的特性
植物细胞与微生物细胞和动物细胞相比主要有以下特性：
（1）植物细胞比微生物细胞大得多；植物细胞也比动物细 胞大。
（2）植物细胞的生长和代谢速率比微生物细胞低，生长倍增 时间和生产周期也比微生物长 。
（3）植物细胞和微生物细胞的营养要求较为简单。
3、易于管理，减轻劳动强度。
植物细胞培养在人工控制条件的生物反应器中进行生产， 不受地理环境和气候条件等的影响，易于操作管理，大大减 轻劳动强度，改善劳动条件。
4、提高产品质量。
植物细胞培养的产物杂质较少，在严格控制条件的生物
反应器中生产，可以减小环境中有害物质的污染和微生物、
昆虫的侵蚀，产物易于分离纯化。
例如：日本三井石油化学工业公司于1983年在世
界上首次成功地用紫草细胞培养生产紫草宁。他们用
酶工程酶的发酵生产课件
该中心保藏有细菌10500株，真菌45000株，酵母 14500株，放线菌9500株。
第十四页，共49页。
DSMZ
DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und
Zellkulturen GmbH) 德国微生物菌种保藏中心 DSMZ成立于1969年，是德国的国家菌种保藏中心。
第五页，共49页。
第二节 酶发酵生产常用的微生物 （酶的生产菌种）
一、产酶菌种的要求
二、常用的产酶微生物 三、利用微生物产酶的优点 四、高纯菌种的获取
第六页，共49页。
一、产酶菌种的要求
1、发酵周期短，产量高；
2、容易培养和管理； 3、产酶稳定性好，不易变异退化，不易被感染； 4、有利于酶的分离和纯化； 5、安全性可靠，非致病菌。
产酶促进剂 —— 少量加入之后能显著增加酶产量的物质。一般都是酶
的诱导物或表面活性剂。例如纤维素能诱导纤维素酶，吐温80可提高多
种酶的产量。表面活性剂提高酶产量的作用机制目前还未完全了解，使 用时必须考虑其对微生物是否有毒性。生产上提高胞外酶的活力，一般 都采用非离子表面活性剂。
第二十九页，共49页。
转录是以DNA为模板，以核苷三磷酸为 底物，在RNA聚合酶（转录酶）的作 用下，生成RNA的过程。
转录速度表达式?
第四页，共49页。
二、蛋白质的生物合成—翻译
翻译：以mRNA为模板，以氨基酸为底物， 在核糖体上通过各种tRNA，酶和辅助因子 的作用，合成多肽的过程。
四个阶段 1、氨基酸活化生成氨酰－tRNA 2、肽链合成的起始 3、肽链的延伸 4、肽链合成的终止 思考:密码子偏爱性与翻译速率?
美国农业研究菌种保藏中心
第十四页，共49页。
DSMZ
DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und
Zellkulturen GmbH) 德国微生物菌种保藏中心 DSMZ成立于1969年，是德国的国家菌种保藏中心。
第五页，共49页。
第二节 酶发酵生产常用的微生物 （酶的生产菌种）
一、产酶菌种的要求
二、常用的产酶微生物 三、利用微生物产酶的优点 四、高纯菌种的获取
第六页，共49页。
一、产酶菌种的要求
1、发酵周期短，产量高；
2、容易培养和管理； 3、产酶稳定性好，不易变异退化，不易被感染； 4、有利于酶的分离和纯化； 5、安全性可靠，非致病菌。
产酶促进剂 —— 少量加入之后能显著增加酶产量的物质。一般都是酶
的诱导物或表面活性剂。例如纤维素能诱导纤维素酶，吐温80可提高多
种酶的产量。表面活性剂提高酶产量的作用机制目前还未完全了解，使 用时必须考虑其对微生物是否有毒性。生产上提高胞外酶的活力，一般 都采用非离子表面活性剂。
第二十九页，共49页。
转录是以DNA为模板，以核苷三磷酸为 底物，在RNA聚合酶（转录酶）的作 用下，生成RNA的过程。
转录速度表达式?
第四页，共49页。
二、蛋白质的生物合成—翻译
翻译：以mRNA为模板，以氨基酸为底物， 在核糖体上通过各种tRNA，酶和辅助因子 的作用，合成多肽的过程。
四个阶段 1、氨基酸活化生成氨酰－tRNA 2、肽链合成的起始 3、肽链的延伸 4、肽链合成的终止 思考:密码子偏爱性与翻译速率?
美国农业研究菌种保藏中心
酶工程 第三章酶的发酵生产 第三节发酵工艺条件及控制
为了获得足够多的能量，以满足细胞生长和发酵产酶 的需要，培养基中的能源（一般是碳源提供）必须经有氧 解才能产生大量的ATP。为此，必须供给充足的氧气。
第三节 发酵工艺条件及控制
无机元素是通过添加无机盐来提供的，一般采用水溶 性的硫酸盐、磷酸盐或盐酸盐等。有时也使用硝酸盐，在 提供无机氮的同时，提供无机元素。
4．生长因素 生长因素是指细胞生长繁殖所必不可缺的微量有机化 合物主要包括各种氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素，以及动 植物生长激素等。各种氨基酸是蛋白质和酶的组分；嘌呤 和嘧啶是核酸和某些辅酶的组分；维生素主要起辅酶作用； 动植物生长激素则分别对动物细胞和植物细胞的生长、分 裂起调节作用。有的细胞能够自己合成各种生长因素，而 有的细胞则缺少合成一种或多种生长因素的能力，需由外 界供给，才能正常生长繁殖，这样的细胞称为营养缺陷型。
第三节 发酵工艺条件及控制
在酶的发酵生产中，通常在培养基中加进玉米浆、酵 母膏等，以提供各种必需的生长因素。有时，也加进纯化 的生长因素，以供细胞生长繁殖之需。
现举例几种酶发酵培养基： （1）枯草杆菌BF7658α—淀粉酶发酵培养基：玉米粉 8%，豆饼粉4%，磷酸氢二钠0.8%，硫酸铵0.4%，氧化钙 0.2%，氯化铵0.15%。 （2）枯草杆菌AS1.398中性蛋白酶发酵培养基：玉米 粉4%，豆饼粉3%，麸皮3.2%，米糠1%，磷酸氢二钠0.4%， 磷酸二氢钾0.03%。 （3）黑曲霉糖化发酵培养基：玉米粉10%，豆饼粉4%， 麸皮1%（PH4.4—5.0）。
第三节 发酵工艺条件及控制
不同细胞生长繁殖的最适PH有所不同。一般细胞和放 线菌的生长最适PH为中性或微碱性（PH6.5—8.0）；霉菌 和酵母的生长最适PH为偏酸性（PH4.0—6.0）；植物细胞 生长的最适PH为5—6。
第三节 发酵工艺条件及控制
无机元素是通过添加无机盐来提供的，一般采用水溶 性的硫酸盐、磷酸盐或盐酸盐等。有时也使用硝酸盐，在 提供无机氮的同时，提供无机元素。
4．生长因素 生长因素是指细胞生长繁殖所必不可缺的微量有机化 合物主要包括各种氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素，以及动 植物生长激素等。各种氨基酸是蛋白质和酶的组分；嘌呤 和嘧啶是核酸和某些辅酶的组分；维生素主要起辅酶作用； 动植物生长激素则分别对动物细胞和植物细胞的生长、分 裂起调节作用。有的细胞能够自己合成各种生长因素，而 有的细胞则缺少合成一种或多种生长因素的能力，需由外 界供给，才能正常生长繁殖，这样的细胞称为营养缺陷型。
第三节 发酵工艺条件及控制
在酶的发酵生产中，通常在培养基中加进玉米浆、酵 母膏等，以提供各种必需的生长因素。有时，也加进纯化 的生长因素，以供细胞生长繁殖之需。
现举例几种酶发酵培养基： （1）枯草杆菌BF7658α—淀粉酶发酵培养基：玉米粉 8%，豆饼粉4%，磷酸氢二钠0.8%，硫酸铵0.4%，氧化钙 0.2%，氯化铵0.15%。 （2）枯草杆菌AS1.398中性蛋白酶发酵培养基：玉米 粉4%，豆饼粉3%，麸皮3.2%，米糠1%，磷酸氢二钠0.4%， 磷酸二氢钾0.03%。 （3）黑曲霉糖化发酵培养基：玉米粉10%，豆饼粉4%， 麸皮1%（PH4.4—5.0）。
第三节 发酵工艺条件及控制
不同细胞生长繁殖的最适PH有所不同。一般细胞和放 线菌的生长最适PH为中性或微碱性（PH6.5—8.0）；霉菌 和酵母的生长最适PH为偏酸性（PH4.0—6.0）；植物细胞 生长的最适PH为5—6。
南京林业大学酶工程-3 动、植物细胞发酵产酶讲解
一般为无机氮源。 一般以蔗糖为碳源。
植物细胞培养的工艺条件及其控制（续）
（三）温度的控制 室温（25℃）、 （四）pH值的控制 微酸性（pH5～6） （五）溶解氧的调节控制 代谢慢，耗氧少，对剪切力敏感，搅拌不宜强烈。 （六）光照的控制 （七）前体的添加 提高次级代谢物的产量。 （八）刺激剂(electior)的应用 强化次级代谢产物的生物合成。常用微生物细胞 壁碎片和胞外酶。
动、植物细胞培养与微生物培养区别
动物细胞无细胞壁，且大多数哺乳动物细胞附着在固 体或半固体的表面才能生长；对营养要求严格，除氨 基酸、维生素、盐类、葡萄糖或半乳糖外，还需有血 清。动物细胞对环境敏感，包括pH、溶氧、温度、剪 切应力都比微生物有更严的要求，一般须严格的监测 和控制。 植物细胞对营养要求较动物细胞简单。但由于植物细 胞培养一般要求在高密度下才能得到一定浓度的培养 产物，以及植物细胞生长较微生物要缓慢，长时间的 培养对无菌要求及反应器的设计也提出特殊的要求。
紫草宁及其结构
植物细胞培养的特点（续）
ห้องสมุดไป่ตู้
（2）缩短周期 发酵周期10～30天，种植周期几个月～几年。 （3）易于管理 减低劳动强度；不受地理环境和气候条件等影响。 （4）提高产品质量 主要产物浓度高，易于分离纯化，减少环境中各种有 害物质污染和侵蚀。 （5）其它 生物反应器的设计工艺条件注意的问题。
主要产物
醇类，有机酸， 色素，香精， 激素，疫苗， 氨基酸，抗生素， 药物，酶 单克隆抗体， 酶，核苷酸 酶
二、植物细胞培养的特点
（1）提高产率
例如,紫草宁(shikonin) 生产，发酵细胞中的紫 草宁比 紫菜根 (Lithospermum erythrorhizon)中高10 倍，比产率达到种植紫 草的830倍。
第三章酶的发酵生产PPT课件
trp 密码子 序列3、4不能形成衰减子结构
•当色氨酸浓度低时
27
细胞周期与酶的合成
可能的三种模式：
合成伴着生长进行， 进入静止期，合成降 低
对数生长期合成降低， 静止期合成增加
中间类型
28
三、酶发酵动力学
主要研究在发酵过程中细胞生长速率，产物 形成速率以及环境因素对速率的影响.
在酶的发酵生产中,研究酶发酵动力学对于了 解酶生物合成模式；发酵条件的优化控制,提 高酶产量具有重要的理论指导意义。
钮经义（1920-1995)
8
目前，应用于工业的酶类，主 要来自于微生物发酵。
9
什么是发酵？
利用微生物，在适宜的条件下，将原料经过 特定的代谢途径转化为人类所需要的产物的 过程。
10
发酵工业经历了哪几个阶段？
原始发展阶段（发酵技术原始，顶多是家庭小制作，技术 进步缓慢，完全是经验式的，并不知道其中的原理 。）
1、某些微生物因争夺生存环境或营养物，会产生抗 生素将其他种类的微生物杀死。
2、微生物会产生蛋白酶、纤维素酶和淀粉酶，将营 养物质水解成可吸收的小分子的多肽或氨基酸、葡 萄糖 。
3、微生物细胞会通过合成或分解代谢生产它必需的 一些物质，包括氨基酸、核苷酸等。
6
微生物作为酶来源的优越性：
1）种类繁多（＞20万种） 2）易于人工控制，获得高产酶的菌种 3）微生物生长周期短，繁殖迅速，培养
发酵工程
12
二、酶的生物合成
Central dogma
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酶合成的基本过程
转录
翻译
调控
基因表达的调控
•基因表达在全过程的各水平上都可以受调控：
染色质 活化
转录起始、延长、终止 转录后加工
酶工程 第三章酶的发酵生产 第四节固定化细胞发酵产酶
第四节 固定化细胞发酵产酶
二、固定化细胞发酵产酶的工艺条件控制
固定化发酵产酶的基本工艺条件与游离细胞发酵大同 小异，已在本章第三节中阐述。这里仅仅介绍固定化细胞 发酵产酶过程中特别需要注意的几个工艺条件控制问题。
1、固定化细胞的预培养 固定化细胞制备好以后，一般要进行预培养，以使固 定在载体上的细胞生长繁殖。待长好后，才用于发酵产酶。 为了使固定化细胞生长良好，预培养应采用利于生长的生 长培养基和工艺条件。然后改换成有利于产酶的发酵培养 基和最佳发酵工艺条件。有时也可采用相同的培养基和工 艺条件进行预培养和发酵。
第四节 固定化细胞发酵产酶
固定化细胞又称固定化活细胞或固定化增殖细胞，是 指用各种方法固定在载体上又能进行生长、繁殖和新陈代 谢的细胞。
固定化细胞是20世纪70年代后期才发展起来的技术， 有关细胞固定化方法及其特性，留待本书第六章阐述。本 节仅介绍其发酵产酶的特点。
固定化细胞产酶是从1978年开始的，十几年来，国内 外均开展了大量研究，取得了可喜进展。利用固定化细胞 发酵生产α-淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、果胶酶、纤维素 酶、溶菌酶、天冬酰胺酶等胞外酶的研究均取得了成功。
第四节 固定化细胞发酵产酶
4．培养基成分的控制 固定化细胞发酵培养基，一般与游离细胞发酵的培养 基没有多大差别。但是某些固定化载体的结构会受到某些 成分的影响，所以在配制培养基时要加以注意。例如：用 海藻酸钙凝胶制备的固定化细胞，过量的磷酸盐会使其结 构破坏，故要在培养基中限制磷酸盐浓度，同时要在培养 基中加进一定浓度的钙离子，以保持其稳定性。此外，为 了有利于氧的溶解和传递，培养基浓度不宜过高，尤其是 培养基的粘度应尽量的低些为好。 此外，为了适应回定化细胞发酵产酶的工艺要求，还 必须在固定化细胞反应器的研制，固定化载体和固定化技 术等方面下功夫。
《酶工程》课件-微生物发酵产酶
05
微生物发酵产酶存在问题与挑战
产量问题
微生物发酵产酶产量低
由于微生物发酵过程中受到多种因素 的影响，如营养物质的供应、发酵条 件、微生物菌种等，导致酶的产量较 低。
发酵周期长
微生物发酵产酶通常需要较长的发酵 周期，这增加了生产成本和时间成本。
稳定性问题
酶稳定性差
许多酶在发酵过程中容易受到温度、pH值、金属离子等因素的影响，导致酶的稳定性降低。
04
微生物发酵产酶应用实例
工业应用
洗涤剂制造
微生物发酵产生的酶可用于制造 洗涤剂，如蛋白酶用于去除蛋白 质污渍，淀粉酶用于去除淀粉污
渍。
纺织工业
利用微生物发酵产生的酶处理纺织 品，可以改善其质地、手感和外观， 如纤维素酶用于棉织物的生物抛光。
造纸工业
通过微生物发酵产酶技术，可以改 进造纸工艺，提高纸张质量和降低 环境污染，如木聚糖酶用于纸浆漂 白。
过程优化与控制
通过人工智能技术，对微生物发酵产酶过程进行建模和优化，提高 目标酶的产量和质量。
个性化定制酶
结合人工智能和基因工程技术，实现个性化定制酶的合成，满足不 同领域的需求。
THANKS
感谢观看
《酶工程》课件-微生物发酵 产酶
• 微生物发酵产酶概述 • 微生物发酵产酶原理与过程 • 微生物发酵产酶技术与方法
• 微生物发酵产酶应用实例 • 微生物发酵产酶存在问题与挑战 • 未来发展趋势与展望
01
微生物发酵产酶概述
酶工程简介
酶工程定义
酶工程是生物工程的重要组成部分，是利用酶或者微生物细胞、动植物细胞、 细胞器等具有的生物催化功能，借助工程手段来生产有用物质、设计改造酶或 者生产细胞、器官乃至整个生物体的一门科学技术。
酶工程第三章 动植物细胞培养产酶
制备微载体的材料主要有：
葡聚糖（DEAE—Sephadex A50及A25 ） 塑料 明胶 玻璃 纤维素
四、动物细胞培养的工艺条件及其控制
种质细胞：体细胞、杂交瘤细胞； 工艺过程：
胰蛋白酶
种质 细胞
悬浮 细胞
悬浮培 养或贴 壁培养
收集培 养液、 分离纯 化
（一）动物细胞培养基组成成分
生产组织纤溶酶原活化剂的工艺过程
１、人黑色素瘤细胞培养基；
２、人黑色素瘤细胞培养；
３、组织纤溶酶原激活剂的分离纯化。
动、植物细胞培养与微生物培养区别
动物细胞无细胞壁，且大多数哺乳动物细胞附着在固 体或半固体的表面才能生长；对营养要求严格，除氨 基酸、维生素、盐类、葡萄糖或半乳糖外，还需有血 清。动物细胞对环境敏感，包括pH、溶氧、温度、剪 切应力都比微生物有更严的要求，一般须严格的监测 和控制。 植物细胞对营养要求较动物细胞简单。但由于植物细 胞培养一般要求在高密度下才能得到一定浓度的培养 产物，以及植物细胞生长较微生物要缓慢，长时间的 培养对无菌要求及反应器的设计也提出特殊的要求。
1、氨基酸：各种必需氨基酸，谷氨酰胺等， 作为碳源和能源利用； 2、维生素：血清中，B族和维C； 3、无机盐：调节渗透压； 4、葡萄糖：作为碳源和能源； 5、激素：胰岛素、生长激素、氢化可的松； 6、生长因子：如表皮生长因子、神经生长 因子、成纤维细胞生长因子。
（二）动物细胞培养基的配制
首先配制各类母液，使用前混合过滤除菌， 使用时稀释至所需浓度； 各种动物培养基已商品化。
（六）溶解氧的控制
溶解氧的供给对动物细胞培养至关重要； 采用调节混合气体的量与比例的方法。
酶的发酵工程PPT课件
在核糖体上合成多肽（三阶段）
1、起始阶段 2、延伸阶段 3、终止阶段
肽链合成的起始阶段
1.mRNA与小亚基结合：形成30S-mRNA-IF3复合物
2.AUG与蛋氨酰-tRNA结合：
30S-mRNA-IF3
fMet-tRNA-IF2-GTP
IF1
30S起始复合物
fMet-tRNA正好位于mRNA的起始密码子上（AUG）。
延长部位
（二）蛋白质的生物合成--翻译(translation)
定义 以mRNA为模板，以氨基酸为底物，在核糖 体上通过各种tRNA、酶和辅助因子的作用，合 成多肽链的过程。
酪
5’
酪氨酰- tRNA
5’
AUG GUU UAC ACA
反密码
3’ mRNA
密码与反密码的碱基配对
给位 (P位) 大亚基
第二章
酶的生物合成与发酵生产
提取分离法 微生物细胞发酵产酶
酶的生产方法
生物合成法
化学合成法
植物细胞发酵产酶
动物细胞发酵产酶
第一节
酶生物合成及调节
一、酶的生物合成
遗传信息传递的中心法则
转 录 复制 传 DNA 递 转录 给 R N 逆转录 A 蛋白质 RNA ， 翻译 再 复制 由 R N
（一）RNA的生物合成--转录(transcription)
µ max：最大比生长速率（1/h） S：营养物浓度（生长限制基质浓度） 克/L 或 mol/L
Ks：莫诺德常数或饱和常数或营养物利用常数 克/L，
蛋 苏
Mg+ K+
移位
GTP
UAC UGU AUG ACA GUU 3’ 5’
转肽
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第二节 植物细胞培养产酶
植物细胞培养产酶 – 1902年，Haberlandt首次提出分离植物单细胞并 培养成植株的设想 – 植物细胞的全能性
Haberlandt
植 物 细 胞 培 养 产 酶
– 植物细胞培养产酶种类
产酶植物细胞 胡萝卜细胞 紫苜蓿细胞 糖苷酶 产酶品种
-半乳糖苷酶
过氧化物酶、酸性/碱性转化酶、糖化酶
植 物 细 胞 培 养 产 酶
2.获取植物细胞：愈伤组织诱导法（分散细胞） （利用细胞的全能性）
• 愈伤组织（callus） – 由外植体组织增生的细胞产生的团状不定型的疏散 排列的薄壁细胞群体；本意是指植物体的局部受到 创伤刺激后，在伤口表面新生的可帮助伤口愈合的 组织 • 诱导过程 – 配制半固体诱导培养基 – 灭菌、植入外植体 – 1～3周后继代培养
2.基因扩增加速酶的合成
• 通过增加基因的数量调节基因表达，可以发生在个体发
育某一阶段或细胞分化某一过程
• 细胞的一种应急方式
• 基因扩增可以由选择压力引起
– 耐药性细胞的抗药性产生
– 例：CHO 细胞为对抗氨甲基喋呤对二氢叶酸还原酶
的抑制，编码这种酶的基因急剧扩增
3.增强子促进酶的生物合成
• 增强子（modulator）—— 能高效增强或促进基因转录 的一段DNA 序列 • 增强子能促进同源或异源启动基因的转录活性，可高效
过氧化物酶、苯丙氨酸裂合酶 苯丙氨酸裂合酶 漆酶
甜菜细胞
大豆细胞 花生细胞 假挪威槭细胞 利马豆细胞 番木瓜细胞
-葡萄糖苷酶
木瓜蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶
大蒜细胞
菠萝细胞 剑麻细胞
超氧化物歧化酶
菠萝蛋白酶 剑麻蛋白酶
植 物 细 胞 培 养 产 酶
一、植物细胞的主要特点
体积较大：比动物细胞和微生物细胞都大 细胞生长速率和代谢速率低于微生物细胞，生长周期长 营养要求简单（较动物细胞） 细胞生长及合成次级代谢产物需要光照条件 对剪切力较敏感
– 有关微生物细胞中酶合成的调节理论也基本适用于
动植物细胞
– 动植物细胞具有比微生物更多的调节方式
• 转录水平调节
• 翻译水平调节 • 激素、神经调节
第一节 动植物细胞中酶生物合成的调节
1.细胞分化改变酶的生物合成 —— 端粒（telomere）
• 端粒是真核生物染色体的末端结构 • 由富含 G、T 的 DNA 简单重复序列不断重复而成 – 人端粒序列：……TTAGGG…… • 保护真核生物染色体免遭破坏 – 牺牲自我，填补 DNA 复制后在5’-端留下的空隙 – 端粒随细胞年龄的增长而逐渐缩短 • 端粒酶（telomerase）—— 催化端粒合成和延长 – 核糖核蛋白，其中的 RNA 部分含核苷酸模板序列， 可构建端粒重复序列 – 端粒酶一般存在于分化程度较低的细胞中
主要用于产天然产物、色素、香精等有机物（次级代谢物）
项目
大小（μm） 悬浮生长 营养要求
微生物
1-10 可以 简单
动物细胞
10-100 大部分附着 非常复杂
植物细胞
20-300 可以，易成团 较复杂
生长速率
代谢调节
快，0.5-5h
内部
慢，15-100h
内部、激素
慢，24-74h
内部、激素
环境敏感
植 物 细 胞 培 养 产 酶
2.获取植物细胞：直接分离法即直接从外植体中分离 （分散细胞）
• 机械法 – 将外植体捣碎，过滤或离心分离细胞 – 质壁未分离；细胞破碎率高，完整细胞数量少
• 酶解法
– 利用果胶酶、纤维素酶等处理外植体，分离具有代
谢活性的细胞
– 能降解细胞壁，必须对细胞给予渗透压保护
半抗原诱导法
A. 酯酶的底 物 –酯 B.酯的羧基碳 原子受到亲核 攻击形成四面 体过渡态 C.设计的磷酸 酯类似物,作 为抗原去免疫 实验动物 磷酸酯类似物 免疫 (半抗原) 动物免 疫接种
免疫反应
对酯水解反应有催化 作用的单克隆抗体
酶蛋白诱导法（拷贝法）
用酶作为抗原免疫动物得到抗酶的抗体，再将此抗体免疫动 物，并进行单克隆化，获得单克隆的抗体。对抗体进行筛选， 获得具有原来酶活性的抗体酶。 具有一定的盲目性和偶然性，并且不能产生新酶。
三、植物细胞发酵产酶的工艺条件控制
（一）植物细胞培养的工艺流程
胚培养、器官培养、愈伤组织培养、细胞培养
1.外植体选择和处理
• 外植体（explant） – 从植株取出，经预处理后用于组织和细胞培养的植 物组织片段或小块 – 根、茎、叶、芽、花、果实、种子等 • 选择：无病虫害、生长旺盛、生长有规则 • 切片：0.5～1 cm • 消毒： – 70% 乙醇 – 5% 次氯酸钠 / 10% 漂白粉 – 0.01～0.1% HgCl2
细胞分化 剪切力敏感
能忍受广范围
无 低
非常敏感（无细胞壁）
有 非常高
能忍受广泛范围
有 高
传统变异、筛选
细胞或产物浓度
广泛使用
较高
不常使用
低
有时使用
低
二、植物细胞发酵的特点
– 优势 • 提高目标物的产率 • 缩短生产周期 – 木瓜蛋白酶：木瓜生长期8个月，木瓜细胞培养约1 个月 • 易于管理，不受自然因素控制 • 可以提高产物质量 – 通过严格的培养条件控制，减少植株病虫害和污染 – 缺点 • 培养条件要求高 —— 光照、剪切力影响显著 • 植物细胞生长缓慢 —— 相对于微生物
酶工程
动植物发酵产酶
第三章 动植物发酵产酶
第一节 动植物细胞中酶生物合成的调节
第二节 植物细胞培养产酶
第三节 动物细胞培养产酶
动 植 物 细 胞 培 养 产 酶
动植物细胞中酶生物合成的调节 – 从基因到蛋白质
复制
DNA
转录 逆转录
RNA
翻译 ？
Protein
பைடு நூலகம்
折叠
Active Enzyme
植 物 细 胞 培 养 产 酶
2.获取植物细胞：原生质体再生法（分散细胞） ---对于细胞质融合技术来说，这种培养方式更普遍
增强某些酶基因的表达
• 具有细胞或组织特异性，在不同细胞或组织中增强效果 不同
4.抗原诱导抗体酶的生物合成
抗体酶（abzyme）：催化性抗体，是具有 生物催化功能的抗体分子，是人工改造 的对抗体可变区赋予催化特性的特殊抗 体
抗体酶生产方法： 1）修饰法 在抗体与抗原结合部位引进催化基团 2）诱导法（主要方法） -半抗原诱导 -酶蛋白诱导