糖化酶活力测定

实验三　糖化酶活力测定



1.定义

1g固体酶粉（或1ml液体酶），于40℃、pH值为4.6的条件下，1h分解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖，即为1个酶活力单位，以u/g（u/ml）表示。

2.原理

糖化酶有催化淀粉水解的作用，能从淀粉分子非还原性末端开始，分解α-1,4-葡萄糖苷键生成葡萄糖。葡萄糖分子中含有醛基，能被次碘酸钠氧化，过量的次碘酸钠酸化后析出碘，再用硫代硫酸钠标准溶液滴定，计算酶活力。

3.试剂和溶液

（1）乙酸－乙酸钠缓冲溶液（pH为4.6）。

称取乙酸钠（CH3COONa·3H2O）6.7g，溶于水中，加冰乙酸（CH3COOH）2.6ml，用水定容至1000ml。配好后用pH计校正。

（2）硫代硫酸钠标准溶液（Na2S2O3，0.05mol/L）。

（3）碘溶液（1/2I2，0.1mol/L）。

（4）氢氧化钠溶液（NaOH，0.1mol/L）。

（5）200g/L可溶性氢氧化钠溶液。

（6）硫酸溶液（2mol/L）。

（7）20g/L可溶性淀粉溶液。

（8）10g/L淀粉指示液。

4.仪器和设备

恒温水浴锅、秒表、比色管、玻璃仪器。

5.步骤

（1）待测酶液的制备　称取酶粉1～2g，精确至0.0002g（或吸取液体酶1.00ml），先用少量的乙酸缓冲液溶解，并用玻璃棒捣研，将上清液小心倾入容量瓶中。沉渣部分再加入少量缓冲液，如此捣研3～4次，最后全部移入容量瓶中，用缓冲液定容至刻度（估计酶活力在100～250u/ml范围内），摇匀。通过4层纱布过滤，滤液供测定用。

（2）测定　于甲、乙两支50ml比色管中，分别加入可溶性淀粉25ml及缓冲液5ml，摇匀后，于40℃恒温水浴中预热5min。在甲管（样品）中加入待测酶液2ml，立刻摇匀，在此温度下准确反应30min，立刻各加入氢氧化钠溶液0.2ml，摇匀，将两管取出迅速冷却，并于乙管（空白）中补加待测酶液2ml，吸取上述反应液与空白液5ml，分别置于碘量瓶中，准确加入碘溶液10ml，再加氢氧化钠溶液15ml，摇匀，密塞，于暗处反应15min。取出，加硫酸溶液2ml，立即用硫代硫酸钠标准溶液滴定，直至蓝色刚好消失为其终点。

（3）计算

X＝（A－B）c×90.05×32.2/5×1/2×n×2＝579.9×（A－B）c×n

式中　X——样品的酶活力（u/g或u/ml）

A——空白消耗硫代硫酸钠溶液的体积（ml）

B——样品消耗硫代硫酸钠溶液的体积（ml）

c——硫代硫酸钠溶液的浓度（mol/L）

90.05——与1ml硫代硫酸钠标准溶液（1mol/L）相当的以克表示的葡萄糖的质量

32.2——反应液的总体积（ml）

5——吸取反应液的体积（ml）

1/2——吸取酶液2ml，换算为1ml

n——稀释倍数

2——反应30min，换算成1h的酶活力系数所得的结果表示至整数